一种用地高辛标记寡核苷酸着丝粒探针应用于原位杂交的方法与流程

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本发明涉及分子生物学核酸标记领域，具体涉及寡核苷酸探针的标记，将地高辛分子标记到寡核苷酸着丝粒探针上，继续用于原位杂交检测着丝粒的应用。


背景技术：

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在分子生物领域内，核酸探针标记已经在70年代被发现，但是具体到实验室或试剂研发内部工作，其技术尚不成熟、环节多，往往失败。主要原因是其步骤较多，用到的试剂多且复杂。从放射性标记的发展，到如今的非放射性技术的广泛应用。探针标记的需求日益增多。因此，寻找便捷快速的探针标记技术成为迫切解决的问题。基因组被破解，基因序列正在被解释，各种核酸探针的需求日益增多。但核酸探针的制备非常复杂，制备方法也很多。非放射性标记被广泛用于研究，寡核苷酸合成日益增多，获得大量的寡核苷酸不是一件困难的事情。公认的传统的核酸标记是利用核酸的5端和3端，随机引物，寡核苷酸合成等，但是步骤繁琐，大部分实验室都在标记实验中失败多，不能很好的完成探针的标记。国外某品牌标记地高辛dna核酸或寡核酸需要对标本进行复杂的处理步骤。
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鉴于上述原因，我们在合成寡核苷酸中进行了nh2修饰，hplc纯化后，采用中和法，进行地高辛标记。将其应用于fish检测，获得良好的效果。我们验证多次，容易获得成功，该方法是一种快速的地高辛探针标记寡核苷酸的方法，值得在分子生物学中和诊断学中应用。
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技术实现要素：

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本发明的目的：在于提供一种地高辛标记寡核苷酸着丝粒探针，然后将其应用于fish检测方法中观察着丝粒的变化。
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发明人利用nh2和digoxion-nhs反应原理以及碱基互补的原理，采用中和法对标记地高辛的寡核苷酸处理，标记着丝粒探针，然后进行原位杂交，对获得着丝粒的fish探针进行验证。上述发明满足了分子生物学或诊断实验的需要。简化了既往标记地高辛前反复纯化寡核苷酸的步骤。
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发明过程发明人通过优化标记的几种溶液，如下。
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通过优化a溶液，具体浓度：0.2mol/l nahco3(ph8.8)。
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进一步地，优化b溶液和cy3染料：具体浓度：3mol/l醋酸钠（ph5.5）。进行标记。
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进一步地，利用上述标记的探针对中期染色体进行检测。案例一。
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综上分析：本发明成功获得了地高辛标记着丝粒探针应用于原位杂交的方法，且本发明已证明该过程能有效标记地高辛分子到寡核苷酸探针，可作为标记寡核苷酸的方法，应用于基础和分子诊断试剂的研究。
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本发明的检测效果：本发明能将标记地高辛分子到寡核苷酸上，可作为研究分子标记和临床分子诊断的研究。
附图说明
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图1为标记的探针验证外周血的染色体结果，红色信号是探针信；
具体实施方式
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、探针标记溶液的配制过程：a溶液：0.2mol/l nahco3(ph8.7)首先配制0.1mol/l na2co3溶液：用分析天平称取5.3g碳酸钠粉末，加入500ml水，用玻璃棒搅拌溶解。用分析天平称取8.4g碳酸氢钠粉末，加入500ml医用生理注射水。用玻璃棒搅拌溶解。接着加入10-30ml 0.1mol/l na2co3溶液，使其ph调至8.8左右。
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溶液：3mol/l醋酸钠溶液（ph5.5）用分析天平称取4.0g三水合乙酸钠粉末，接着加入8ml蒸馏水。用玻璃棒搅拌溶解。再加入1ml冰醋酸。混匀。用ph试纸测一下ph值。通过一滴一滴加入冰醋酸来调节ph为5.5。最后加入水定容至10ml即可。
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、地高辛探针的标记操作过程（1）1-2mg dig-nhs染料12000转离心2min，加入40-50μl dmso溶解。
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（2）合成的oligo引物12000转离心2min ，加入100μl无核酸酶水，溶解，加入nh2中和试剂，即适合浓度的盐酸溶液，加热10分钟。然后吸取25μl到一个管子中，加入dig-nhs染料20μl，混匀，再加入0.2mol/l nahco3(ph8.8) 10-15μl, 混匀, 放于30℃反应过夜。
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3、探针纯化操作过程往标记反应管中加入十分之一体积3mol/l醋酸钠溶液6μl，混匀。然后加入约2.5倍体积的无水乙醇155μl。混匀。放入液氮中90min。然后4℃最大转速离心30min，吸去上清，沉淀再加入75%乙醇。最大转速离心2min，吸去上清，加入了50μl水溶解。放于-20℃冻存。
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、fish标记应用以及检测。
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制备染色体：（1）当细胞系的融合达到约75-90%时，于每5ml的培养基细胞中加入25-50ul秋水仙素，继续培养30min至2小时（培养时间决定于细胞的生长速度及不同种细胞系间的差异）。
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（2）按照常规的方法用胰蛋白酶消化细胞。
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（3）将0.075mol/lkcl溶液于37℃水浴中预热。
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（4）低渗：加入10ml 0.075mol/lkcl溶液，轻轻吹打散开，37℃水浴低渗30min，期间用移液枪吹打细胞，使细胞分散。
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（5）预固定：加1.5ml固定液并用移液器轻轻吹匀。
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（6）离心：1250转离心8分钟，丢弃上清。
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（7）固定：沿管壁慢慢加入固定液6ml，用移液器吹打细胞悬液后，37℃水浴20min。
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（8）离心：1000转离心10min，丢弃上清液。加入0.3-0.5ml固定液，吹打细胞悬液。
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（9）滴片：用吸管取细胞悬液，高度30-40cm，滴于预冷的载玻片上，室温晾干，然后75℃烤片30min。
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探针杂交：（1）用100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇，分别浸泡载玻片3min。然后室温晾干片子。
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（2）探针稀释：探针与杂交液以1:50稀释，加到载玻片上，盖上盖玻片，用fish封片胶将四周封上，放于杂交仪中，85℃变性8分钟。37℃杂交16-48小时。
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（3）2*ssc洗涤标本3次，每次5min。
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（4）3%bsa封闭蛋白30分钟。
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（5）二抗孵育：抗地高辛的cy3或者fitc与1%bsa以1:100稀释。37℃孵育标本1小时.（6）pbs洗涤标本3次，每次5min。加入dapi，盖上盖玻片，显微镜观察结果。

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