人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物及其制备方法与应用与流程

[0001]
本发明属于生物制药领域，涉及人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物及其制备方法与应用。


背景技术：

[0002]
白细胞介素-2(interleukin2，il-2，常被简称白介素2)是由活化的i型辅助性t淋巴细胞(th1)产生的一种重要免疫调节因子，曾被称为t细胞生长因子，其主要生物学功能以刺激和抗凋亡双重方式促进t细胞(包括cd4+和cd8+t细胞)的生长、增殖、分化，并促进细胞因子进一步分泌。除此之外，白介素2还刺激nk细胞增殖，增强nk杀伤活性及产生细胞因子，诱导lak细胞产生；促进b细胞增殖和分泌抗体；因此，白介素2对机体的免疫应答和抗病毒感染等具有重要作用(gaffena s.l.，cytokine 28：109e123，2004)。
[0003]
自1976年morgan等首次发现il-2以来，其在临床上得到了广泛的应用。1991年，美国cetus生产的rhil-2(产品名：aldesleukin)被fda批准上市，广泛应用于肾细胞癌、恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤等恶性肿瘤(proleukin说明书)，且在乙肝、丙肝感染的辅助治疗方面也有潜在效果(tomova r.等，anticancer research，29:5241-5244，2009)。我国至今有10余家重组人白介素2生物制品投产上市，广泛应用于肾细胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、直肠癌、淋巴癌、肺癌等恶性肿瘤的治疗，用于癌性胸腹水的控制，用于手术、放疗及化疗后的肿瘤患者增强机体免疫功能，用于先天或后天免疫缺陷症患者提高细胞免疫功能和抗感染能力，用于各种自身免疫病的治疗，如类风湿性关节炎，系统性红班狼疮，干燥综合症等，且对某些病毒性，杆菌性疾病，胞内寄生菌感染性疾病，如乙型肝炎，麻风病，肺结核，白色念珠菌感染等具有一定的治疗作用。
[0004]
人il-2前体由153个氨基酸残基组成，在分泌出细胞时，其信号肽(含20个氨基酸残基)被切除，产生了133个氨基酸的成熟il-2，其相对分子量为15.4kd。il-2对效应细胞的激活作用是通过与细胞表面的il-2受体(il-2r)结合来实现。现已发现，il-2受体包括il-2rα、il-2rβ和il-2rγ三种，三者可形成具高亲和力的异多聚体糖蛋白功能复合物il-2rαβγ(kd＝10-11
mol/l)。il-2rβ和il-2rγ可形成中等亲和力的受体复合物il-2rβγ(kd＝10-9
mol/l)，受il-2激活后有生物学活性；il-2rα亚基是低亲和力受体形式(kd＝10-8
mol/l)，它与il-2的结合无法传导细胞内增殖信号；虽然il-2rα和il-2rβ也可形成高亲和力受体复合物，但无生物学功能也不能被il-2活化。在不同细胞、同种细胞不同发育阶段以及疾病的不同状态下，il-2受体种类表达的程度不同，从而形成不同的受体复合物。例如，lak细胞前体表达高水平的il-2rβγ复合物，受il-2活化后可攻击和裂解癌细胞；巨噬细胞也表达il-2rβγ复合物，也可被il-2激活；单核细胞表达大量il-2rγ和小量il-2rβ，而nk细胞表达大量il-2rβ和小量il-2rγ，它们分别形成中等亲和力的il-2rβγ受体，与高浓度il-2结合形成三聚体后激活单核细胞或nk细胞；活化的t细胞表面表达il-2rα、il-2rβ和il-2rγ，过量的il-2rα有利于和il-2rβ先聚合，il-2rαβ与il-2结合后再结合il-2rγ形成高亲和力受体-il-2复合物，进而传递信号，引起细胞增殖反应。细胞反应后，il-2rα、il-2rβ和il-2rγ
解离，细胞对il-2不再敏感；人肿瘤细胞也有il-2受体表达，il-2与肿瘤细胞上的受体复合物结合后可抑制肿瘤细胞的增殖，由于不同的癌细胞表达各自特殊的il-2受体复合物，故改进il-2结构，使其只对特异肿瘤表面的对应受体起作用，可实现只攻击癌细胞，减少对正常细胞的损害。
[0005]
以该研究理论为基础，众多研究者针对il-2进行了不同方向的改造，增强其结合抗肿瘤相关效应细胞表面的特异受体复合物(如il-2rβγ复合物)，活化与肿瘤杀伤相关的细胞类型，同时尽量减少与负向免疫调节t细胞(如treg细胞)表面高表达的il-2rαβγ复合物的结合，这样既可达到增强药效，同时降低药物的副作用。现有的对il-2的改造包括：设计特异的il-2变异蛋白，改变与il-2rα、il-2rβ或者il-2rγ结合位点的氨基酸序列使其空间结构不利于与il-2rα相互作用，或者加强与il-2rβ或者il-2rγ的相互作用；设计il-2/抗il-2抗体复合物，利用抗il-2抗体特异性掩盖与il-2r的结合位点，实现il-2功能的改变以及体内半衰期的延长；将il-2与fc或人血清白蛋白(hsa)进行融合表达以实现il-2在体内的半衰期延长；对il-2进行非定点偶联peg化延长il-2半衰期。
[0006]
现有的对il-2的改造研究存在如下缺陷：
[0007]
1、单纯的氨基酸定点突变可以实现减弱与il-2rα的结合能力，或者增强与il-2rβ或il-2rγ的结合能力，但不能有效延长分子半衰期，且突变产物容易在体内产生免疫源性反应，容易降低产物生物学活性，并产生较大的毒性风险。
[0008]
2、单纯的融合表达(如与fc或hsa融合)或il-2修饰尽管能延长分子的半衰期，但在实际使用效果上与未经修饰的il-2相比没有产生明显的优势。
[0009]
3、定点突变结合融合表达的il-2在实际应用上没有表现出特殊的优势。
[0010]
4、常规的非定点偶联peg化il-2实际应用上并没有表现出特殊的优势，综合减弱il-2rα结合能力的peg化il-2取得了阶段性的成功，但非定点偶联工艺特点使其存在生产工艺和质量上难以控制、分子结构复杂、作用机制复杂等缺陷。
[0011]
遗传密码扩展技术
[0012]
常见天然生物体内所有蛋白质都是由三联密码子编码的20种天然氨基酸所组成。1986年，英国科学家i.chambers和德国科学家f.zinoni分别领导的团队发现原核、真核生物体内含硒酶中的硒代半胱氨酸，被称为“第21种氨基酸”；2002年美国科学家srinivasan和hao撰文称在巴氏甲烷八叠球菌中发现了吡咯赖氨酸，被称为“第22种氨基酸”。该两种氨基酸的发现突破了人们对生物体编码氨基酸的认知，并开始尝试应用非天然氨基酸开展科学研究。
[0013]
通过研究发现，硒代半胱氨酸以终止密码uga进行编码，吡咯赖氨酸以终止密码uag进行编码。在含有该两种氨基酸的生物体内分别有对应的trna以及氨酰-trna合成酶，共同完成对应氨基酸残基引入到蛋白质序列中。而对应的trna以及氨酰-trna合成酶与生物体内其他trna以及氨酰-trna合成酶不产生交互反应，非天然氨基酸、对应trna以及氨酰-trna合成酶这一严格的匹配反应也被称为正交反应。
[0014]
20种天然氨基酸只含有一些有限的功能基团，如羟基、羧基、氨基、烷基和芳香基团等。为了使蛋白质产生更加丰富或者特殊的功能基团，科学家们尝试以硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸的翻译机制将其他种类的非天然氨基酸编码至蛋白质中。随着研究和应用的深入及扩大，目前人们已开发出数十种trna/氨酰-trna合成酶正交系统，实现了上百种非天
然氨基酸在重组蛋白中的表达(杜方川等，杭州师范大学学报(自然科学版)，12:437-445，2013)。
[0015]
click反应
[0016]
click chemistry(点击化学)这一概念是在2001年，由诺贝尔化学奖得主、美国scripps研究所的k.barry sharpless教授和他的同事们首次提出，试图利用点击化学这类反应，模块化、高区域选择性、快速构建新的化学分子库。点击化学具有以下特征：反应原料易得，反应非常可靠，对氧气、水不敏感，产物立体选择性好、产率高，反应后处理及产物分离简单方便，一般不需要柱层析，反应副产物对环境友好。
[0017]
点击化学中最重要，应用最广泛的一种反应类型就是sharpless等人发现的以叠氮基(azide)和炔基(alkyne)在cu(i)催化下发生huisgen l，3-偶极环加成，形成稳定的l，2，3-三氮唑化合物，即“cuaac”反应。huisgen 1，3-偶极环加成反应是将两种具有不同不饱和键的反应底物结合成为新的种类和性质截然不同的五元杂环化合物的反应历程。叠氮配体与炔基配体的环加成就是一个最典型的例子。
[0018]
然而，对于体内应用来说，过渡金属(铜盐)的存在对细菌和人体细胞都会造成毒性。为避免添加铜盐，有课题组开发了一种新的点击化学方法，即制备了一种环辛炔的衍生物，它与叠氮基团进行变形促进的[3+2]环加成反应(strain-promoted[3+2]cycloaddition，即spaac反应)。这种不含铜的新型点击化学方法不会对活体细胞产生明显毒性，并能用于糖生物学的许多方面。例如，在细胞刺激或药物干预的条件下，聚糖运输造影可以在细胞、组织甚至整个生物体中进行。


技术实现要素：

[0019]
针对现有的对il-2的改造方面存在的缺陷，本发明提供一种人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物，其可以通过密码子扩展或者化学合成技术用非天然氨基酸定点突变重组人白细胞介素2氨基酸序列中的某一个或多个天然氨基酸，再将一定分子量的peg经连接子通过click反应定点偶联在上述非天然氨基酸的侧链上而成，本发明的人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物可以用于治疗恶性实体瘤和血液肿瘤。
[0020]
在一个方面，本发明提供一种人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物，其包含含有至少一个非天然氨基酸的重组人白细胞介素2和偶联在所述至少一个非天然氨基酸上的peg；
[0021]
其中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自对应于seq id no:2的l36、m39、l40、m46、p47、l63、l66、e67、l70和a73中的一个或多个位点；
[0022]
所述重组人白细胞介素2为seq id no:3所示的蛋白或其功能活性片段；
[0023]
与野生型il-2(例如，泉奇(市售野生型的重组人il-2))相比，该偶联物具有降低的与il-2rα之间的结合，并保留与il-2rβγ的结合活性，通过il-2rβγ复合物对cd8+t细胞的激活保留激活和扩充cd8+t细胞的能力，同时能抑制treg细胞的扩充，在体内具有显著延长的半衰期，能够有效促进免疫、抑制肿瘤。
[0024]
在一些实施方案中，上述人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物中，所述非天然氨基酸为含有叠氮基的赖氨酸类似物。
[0025]
在一些实施方案中，上述任一所述的人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物中，所述含有叠氮基的赖氨酸类似物为nε-2-叠氮乙氧羰基-l-赖氨酸(naek)，结构式为：
[0026][0027]
在一些实施方案中，上述任一所述的人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物中，所述peg的分子量为20kd至50kd，例如20kd、30kd、40kd和50kd。
[0028]
在一些实施方案中，上述任一所述的人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物中，所述peg是通过连接子偶联在所述至少一个非天然氨基酸的侧链上的，所述连接子为bcn或其衍生物。
[0029]
在第二个方面，本发明提供制备上述任一所述的人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物的方法，包括如下步骤：通过密码子扩展技术或者化学合成的方式制备所述含有至少一个非天然氨基酸的重组人白细胞介素2，将所述peg偶联在所述至少一个非天然氨基酸上；
[0030]
其中，所述至少一个非天然氨基酸的位置选自对应于seq id no:2的l36、m39、l40、m46、p47、l63、l66、e67、l70和a73中的一个或多个位点；
[0031]
所述重组人白细胞介素2为seq id no:3所示的蛋白或其功能活性片段。
[0032]
在一些实施方案中，上述方法中，所述含有至少一个非天然氨基酸的重组人白细胞介素2通过密码子扩展技术进行制备。
[0033]
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述密码子扩展技术在大肠杆菌中实现。
[0034]
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述非天然氨基酸为含有叠氮基的赖氨酸类似物，优选为nε-2-叠氮乙氧羰基-l-赖氨酸。
[0035]
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述密码子扩展技术具体包括如下步骤：突变重组人白细胞介素2的核酸分子，与编码重组人白细胞介素2的核酸分子相比，突变后的核酸分子的区别在于：对应于seq id no:2的l36、m39、l40、m46、p47、l63、l66、e67、l70和a73中的至少一个位点的氨基酸的密码子被突变为琥珀密码子uag；使突变后的核酸分子在大肠杆菌中表达，同时通过正交trna合成酶/trna对将含有叠氮基的赖氨酸类似物(如nε-2-叠氮乙氧羰基-l-赖氨酸)掺入表达的重组人白细胞介素2中；
[0036]
该密码子扩展系统的工作原理为：trna
pyl
不能利用宿主细胞的赖氨酰trna酶，只能被trna
pyl rs酰化，trna
pyl rs只能酰化trna
pyl
，不能酰化其它trna，即trna
pyl
和trna
pyl rs之间具有正交性，只有trna
pyl rs可以把相应的非天然氨基酸(如含有叠氮基的赖氨酸类似物)酰化到这种正交的trna上，且只能酰化这种trna，而不能酰化其它的trna。本密码子扩展系统可使含有叠氮基的赖氨酸类似物与琥珀密码子uag相对应(即trna
pyl
对应的密码子为uag)，从而将含有叠氮基的赖氨酸类似物定点引入到il-2中。
[0037]
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，在大肠杆菌中表达所述突变的重组人白细胞介素2之后还包括蛋白变性、复性、超滤的步骤。
[0038]
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述peg的分子量为20kd至50kd，例如20kd、30kd、40kd和50kd。
[0039]
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述peg通过click反应由连接子偶联在所述至少一个非天然氨基酸的侧链上，所述连接子为bcn或其衍生物；例如使用稀盐酸调整所述突变的重组人白细胞介素2溶液的ph到3，将bcn-peg固体投入突变的重组人白细
胞介素2溶液中，充分溶解，密封，在恒温摇床中摇晃反应。
[0040]
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，上述偶联之后，反应溶液中包含部分未反应的il-2、杂蛋白、未反应完全的peg，采用阳离子交换层析进一步纯化；例如，层析介质：cm sepharose ff；平衡缓冲液：20mm醋酸钠缓冲液(ph3.0)，洗脱缓冲液：20mm醋酸钠缓冲液-1m nacl(ph4.5)，具体包括将偶联反应液用平衡缓冲液调节ph3.0
±
0.2，电导率≤2.5ms/cm，上样至cm sepharose ff，使用洗脱缓冲液进行线性洗脱(0-30％的洗脱缓冲液，15cv)，收集目的蛋白组分。
[0041]
在第三个方面，本发明提供上述任一所述的人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物在制备促进免疫、治疗恶性实体瘤和血液肿瘤和/或扩充cd8+t细胞的药物中的用途。
[0042]
在一些实施方案中，上述用途中，所述实体瘤为膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、眼癌、头颈癌、肾癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。
[0043]
在一些实施方案中，上述用途中，所述血液肿瘤为慢性淋巴细胞白血病(cll)、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、滤泡性淋巴瘤(fl)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区b细胞淋巴瘤、结边缘区b细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高恶性b细胞淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤(pmbl)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞淋巴瘤、b细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵膈(胸腺)大b细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。
[0044]
在第四个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含上述任一所述的人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物。
[0045]
在第五个方面，本发明提供一种治疗恶性实体瘤或血液肿瘤的方法，包括向有需要的患者施用治疗有效量的上述任一所述的人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物的步骤。
[0046]
在一些实施方案中，上述方法中，所述实体瘤为膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、眼癌、头颈癌、肾癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。
[0047]
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述血液肿瘤为慢性淋巴细胞白血病(cll)、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、滤泡性淋巴瘤(fl)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区b细胞淋巴瘤、结边缘区b细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高恶性b细胞淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤(pmbl)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞淋巴瘤、b细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵膈(胸腺)大b细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。
[0048]
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物可以单独施用或者与抗肿瘤药物联用。
[0049]
通过spr法分析本发明的偶联物与il-2r的结合活性，显示相对于野生型il-2，本发明的偶联物与il-2rα的结合活性均有不同程度降低，但基本保留与il-2rβ的结合活性；分别使用ctll-2细胞和yt细胞，通过分析样品与细胞表面il-2r结合，激活jak-stat信号通路的情况，综合实验结果显示本发明获得的偶联物与il-2rα的结合活性相对于il-2rβ的结合活性均有不同程度降低；另外药代动力学和药效学研究表明，与野生型il-2相比，本发明的偶联物具有显著延长的半衰期，能显著抑制肿瘤，扩充cd8+t细胞，抑制treg细胞，促进免
疫。
[0050]
本发明最重要的改进在于，
[0051]
(1)通过密码子扩展技术，将非天然氨基酸引入至指定位点，从而实现peg与白介素-2的精确定点偶联，克服了传统随机偶联方式无法精确偶联的缺点，且产物均一性高。
[0052]
(2)有别于传统突变位点选择与受体相互作用的il-2分子结构域表面氨基酸残基，本发明选择性突变与α受体相互作用的il-2结构域内部折叠与表面暴露的边缘区域的氨基酸残基。通过突变位点的设计与筛选，获得可降低il-2rα结合活性，并保持il-2rβ和il-2rγ结合活性相对不变的白介素-2突变位点，使得该定点修饰的人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物在肿瘤微环境中特异性促进cd8+t细胞的增殖，而对cd4+t细胞的增殖无明显作用，从而有利于肿瘤的免疫治疗。并且突变的氨基酸位点不在突出表面，降低可能的免疫原性。氨基酸位点不参与白介素-2的整体结构维持，但对于蛋白质局部三级结构有维持作用，替换为naek后降低局部蛋白质结构的稳定性，降低与α受体亲和力。
[0053]
(3)peg的偶联进一步改变局部三级结构，降低与α受体亲和力。
[0054]
(4)peg的偶联实现了il-2在体内半衰期的延长，降低患者给药频率。
附图说明
[0055]
图1为表达质粒nb1s3-wt示意图。
[0056]
图2为辅助质粒nb1w示意图。
[0057]
图3为各个菌株的sds-page电泳图。其中，a：rhil2-l36-bl21菌体破碎、离心后沉淀；b：rhil2-m39-bl21菌体破碎、离心后沉淀；c：rhil2-l40-bl21菌体破碎、离心后沉淀；d：rhil2-m46-bl21菌体破碎、离心后沉淀；e：rhil2-l63-bl21菌体破碎、离心后沉淀；f：rhil2-a73-bl21菌体破碎、离心后沉淀；g：rhil2-l63-bl21包涵体；箭头指示为表达的突变型rhil-2。
[0058]
图4为突变型rhil-2与peg偶联前后的sec-hplc图谱。其中，a：偶联前的各个突变型rhil-2；b：偶联后的各个突变型rhil-2，peg均为30kd peg。
[0059]
图5为各30kd peg-rhil2在b16-f10同种移植瘤模型中的肿瘤抑制效果。
[0060]
图6为各30kd peg-rhil2在b16-f10同种移植瘤模型中的肿瘤抑制效果现场照片。
[0061]
图7为给药后小鼠肿瘤组织样本各免疫细胞群比例的变化。
具体实施方式
[0062]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0063]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0064]
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0065]
人yt细胞在文献“yodoi,j.等.(1985).tcgf(il 2)-receptor inducing factor(s).i.regulation of il 2receptor on a natural killer-like cell line(yt cells).journal of immunology,134(3),1623-1630”中公开过，公众可从浙江新码生物医药有限公司获得。
[0066]
实施例1：表达非天然氨基酸定点插入的重组人il-2(rhil-2)的表达菌株的构建
[0067]
1、野生型重组人il-2的表达质粒nb1s3-wt的获得
[0068]
从美国国立生物技术信息中心(ncbi)获得智人il-2的前体蛋白质序列(genbank id:caa25292.1)，如seq id no:1所示。该前体序列的n端包含一段20个氨基酸组成的信号肽序列，在il-2蛋白分子加工成熟的过程中会被切除，因此去掉该信号肽序列后，得到成熟的智人il-2的蛋白质序列(seq id no:2)。根据文献报道(liang s.m等.journal of biological chemistry,261(1):334-337，1986)成熟的智人il-2的蛋白质序列中包含3个半胱氨酸cys，其中第58位和第105位的两个cys会形成二硫键，它们对于智人il-2的生物活性非常重要。第125位的cys不参与形成二硫键，反而会干扰重组智人il-2的蛋白质包涵体的复性过程中正常二硫键的形成，因此可以将第125位的cys突变为丝氨酸ser，在不显著影响其活性的情况下提高复性的效率。同时为了在大肠杆菌中表达重组蛋白，需要在蛋白质序列的n端添加甲硫氨酸met用于起始蛋白质的翻译，因此得到成熟的重组人il-2的蛋白质序列(seq id no:3)。通过氨基酸和密码子的反向翻译过程，并通过密码子优化得到编码重组人il-2的基因序列(seq id no:4)，经全基因合成获得该重组人il-2的编码基因。然后通过一步亚克隆将其连接在nb1s3表达载体中(该表达载体改造自商业化载体pet-21a，其氨苄青霉素抗性基因筛选标记由通过pcr方式从商业化载体pcdf-duet1中扩增得到的壮观霉素抗性基因替换)，获得野生型重组人il-2的表达质粒nb1s3-wt(见图1)，序列如seq id no:5所示。
[0069]
seq id no:1
[0070]
myrmqllscialslalvtnsaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistlt
[0071]
seq id no:2
[0072]
aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistlt
[0073]
seq id no:3
[0074]
maptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfsqsiistlt
[0075]
seq id no:4
[0076]
atggcgcctacatccagctcgaccaaaaagacgcagctgcaactggaacacctgctcctggatctgcaaatgattcttaacggtatcaataactacaaaaatccgaaactgacccgtatgctgacgtttaaattctatatgccaaagaaagcgaccgagctgaaacatctgcagtgcctggaagaggaactgaaaccgctggaggaagttttgaacctggctcagtctaaaaactttcacctgcgccctcgtgacctgatttccaatatcaacgtgattgttctggaactgaaaggctctgaaaccacgtttatgtgcgagtacgccgatgaaaccgccacgattgtggaatttctgaatcgctggatcaccttctcccagagcattattagcacgctgacctaa
[0077]
2、定点突变位点的选择
[0078]
根据il-2的晶体结构，il-2与其受体的结合位点，不同il-2亚型的保守序列以及氨基酸暴露范围，并综合考虑抗原表位、酶解位点等信息，选取了几个适合位点进行修饰，其主要基于以下因素：(1)氨基酸位点在白介素-2与受体复合物的晶体结构中相对靠近α受体而远离β和γ受体；(2)氨基酸位点不在表面凸出，降低可能的免疫原性；(3)氨基酸位点
不影响白介素-2的整体结构，但对于蛋白质局部三级结构有一定影响，替换为naek(nε-2-叠氮乙氧羰基-l-赖氨酸)后降低局部蛋白质结构的稳定性，降低与α受体亲和力；(4)偶联peg后能进一步改变局部三级结构，降低与α受体亲和力。选取seq id no:2的l36、m39、l40、m46、p47、l63、l66、e67、l70和a73进行定点突变。
[0079]
3、定点突变的引物设计以及突变载体的构建
[0080]
针对seq id no:2的l36、m39、l40、m46、p47、l63、l66、e67、l70和a73，分别设计能够使编码所述氨基酸的密码子突变为琥珀密码子的突变引物，具体引物如表1所示。
[0081]
表1突变引物列表
[0082]
[0083][0084]
以限制性dna内切酶xbai和xhoi双酶切质粒nb1s3-wt，得到线性化dna质粒，以其为模板，利用高保真dna聚合酶(购自takara，货号为r045a)，以表1的引物xbai-f配对各位点的引物r，表1的引物xhoi-r配对各位点的引物f，通过pcr扩增和重叠pcr方法获得il-2的l36、m39、l40、m46、p47、l63、l66、e67、l70和a73这几个位点的氨基酸密码子突变为琥珀终止密码子的突变基因(例如，以线性化质粒nb1s3-wt为模板，以xbai-f和l36-r为引物对进行pcr扩增，得到l36位点突变的上游片段；以线性化质粒nb1s3-wt为模板，以xhoi-r和l36-f为引物对进行pcr扩增，得到l36位点突变的下游片段；然后以上述获得的l36位点突变的上游片段和l36位点突变的下游片段为模板，以xbai-f和xhoi-r为引物对进行重叠pcr扩
增，得到l36位点突变的全长基因)，再利用高保真dna组装克隆试剂盒(购自neb，货号为e5520s)，按说明书操作将获得的突变基因分别替换nb1s3-wt质粒的xbai和xhoi两个酶切位点之间的片段，构建得到10种表达质粒nb1s3-l36、nb1s3-m39、nb1s3-l40、nb1s3-m46、nb1s3-p47、nb1s3-l63、nb1s3-l66、nb1s3-e67、nb1s3-l70和nb1s3-a73，经测序验证突变成功。
[0085]
4、定点突变的rhil-2表达株的构建
[0086]
参考文献(chatterjee,a.等，biochemistry,52(10),1828-1837,2013)记载的质粒pultra结构，通过基因全合成方式获得含有特异识别非天然氨基酸lys-azido的trna和trna合成酶编码基因(野生型古甲烷球菌吡咯赖氨酸合成酶和对应trna的编码基因，lys-azido为吡咯赖氨酸类似物)和氯霉素抗性基因(seq id no:28)，再通过pcr扩增方式从商业化载体pcdf-duet1中扩增出包含clodf13复制起始位点的dna片段(seq id no:29)，利用高保真dna组装克隆试剂盒一步亚克隆连接两个dna片段，得到辅助质粒nb1w(见图2，以下简称该质粒为辅助质粒)，该质粒的筛选标记为氯霉素抗性。分别将辅助质粒和步骤3得到的表达质粒(壮观霉素抗性)，共同转化大肠杆菌bl21(de3)，经壮观霉素抗性和氯霉素抗性平板筛选出双阳性菌株(双阳性菌株表示同时获得壮观霉素抗性和氯霉素抗性的菌株)rhil2-l36-bl21、rhil2-m39-bl21、rhil2-l40-bl21、rhil2-m46-bl21、rhil2-p47-bl21、rhil2-l63-bl21、rhil2-l66-bl21、rhil2-e67-bl21、rhil2-l70-bl21和rhil2-a73-bl21。
[0087]
包含野生型古甲烷球菌吡咯赖氨酸合成酶编码基因、对应trna编码基因以及氯霉素抗性基因的dna片段(seq id no:28)如下：
[0088]
ccttatgcgactccctgcattagggagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacaaaggaggtcatatggataaaaagcctctgaacactctgatttctgcgaccggtctgtggatgtcccgcaccggcaccatccacaaaatcaaacaccatgaagttagccgttccaaaatctacattgaaatggcttgcggcgatcacctggttgtcaacaactcccgttcttctcgtaccgctcgcgcactgcgccaccacaaatatcgcaaaacctgcaaacgttgccgtgttagcgatgaagatctgaacaaattcctgaccaaagctaacgaggatcagacctccgtaaaagtgaaggtagtaagcgctccgacccgtactaaaaaggctatgccaaaaagcgtggcccgtgccccgaaacctctggaaaacaccgaggcggctcaggctcaaccatccggttctaaattttctccggcgatcccagtgtccacccaagaatctgtttccgtaccagcaagcgtgtctaccagcattagcagcatttctaccggtgctaccgcttctgcgctggtaaaaggtaacactaacccgattactagcatgtctgcaccggtacaggcaagcgccccagctctgactaaatcccagacggaccgtctggaggtgctgctgaacccaaaggatgaaatctctctgaacagcggcaagcctttccgtgagctggaaagcgagctgctgtctcgtcgtaaaaaggatctgcaacagatctacgctgaggaacgcgagaactatctgggtaagctggagcgcgaaattactcgcttcttcgtggatcgcggtttcctggagatcaaatctccgattctgattccgctggaatacattgaacgtatgggcatcgataatgataccgaactgtctaaacagatcttccgtgtggataaaaacttctgtctgcgtccgatgctggccccgaacctgtacaactatctgcgtaaactggaccgtgccctgccggacccgatcaaaattttcgagatcggtccttgctaccgtaaagagtccgacggtaaagagcacctggaagaattcaccatgctgaacttttgccagatgggtagcggttgcacgcgtgaaaacctggaatccattatcaccgacttcctgaatcacctgggtatcgatttcaaaattgttggtgacagctgtatggtgtacggcgatacgctggatgttatgcacggcgatctggagctgtcttccgcagtagtgggcccaatcccgctggatcgtgagtggggtatcgacaaaccttggatcggtgcgggttttggtctggagcgtctgctgaaagtaaaacacgacttcaagaacatcaaacgtgctgcacgttccgagtcctattacaatggtatttctactaacctgtaactagtgtctccagcttggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatc
agaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgagcactgcagcggctaactaagcggcctgctgactttctcgccgatcaaaaggcattttgctattaagggattgacgagggcgtatctgcgcagtaagatgcgccccgcattggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgccaaattcgaaaagcctgctcaacgagcaggcttttttgcatctcgagcagctcagggtcgaatttgctttcgaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcaggcgtagcaaccaggcgtttaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacggaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcggcgcaaagtgcgtcgggtgatgctgccaacttactgatttagtgtatgatggtgtttttgaggtgctccagtggcttctgtttctatcagctgtccctcctgttcagctactgacggggtggtgcgtaacggcaaaagcaccgccggacatcagcgcgcgctgcggacac
[0089]
clodf13复制起始位点的dna片段(seq id no:29)如下：cggacatcagcgcgcgctgcggacacatacaaagttacccacagattccgtggataagcaggggactaacatgtgaggcaaaacagcagggccgcgccggtggcgtttttccataggctccgccctcctgccagagttcacataaacagacgcttttccggtgcatctgtgggagccgtgaggctcaaccatgaatctgacagtacgggcgaaacccgacaggacttaaagatccccaccgtttccggcgggtcgctccctcttgcgctctcctgttccgaccctgccgtttaccggatacctgttccgcctttctcccttacgggaagtgtggcgctttctcatagctcacacactggtatctcggctcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtaagcaagaactccccgttcagcccgactgctgcgccttatccggtaactgttcacttgagtccaacccggaaaagcacggtaaaacgccactggcagcagccattggtaactgggagttcgcagaggatttgtttagctaaacacgcggttgctcttgaagtgtgcgccaaagtccggctacactggaaggacagatttggttgctgtgctctgcgaaagccagttaccacggttaagcagttccccaactgacttaaccttcgatcaaaccacctccccaggtggttttttcgtttacagggcaaaagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctactgaaccgctctagatttcagtgcaatttatctcttcaaatgtagcacctgaagtcagccccatacgatataagttgtaattctcatgttagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgcta
tcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactc
[0090]
实施例2：定点突变插入非天然氨基酸的rhil-2的表达和纯化
[0091]
1、突变型rhil-2的非天然氨基酸掺入表达
[0092]
将实施例1获得的10种表达菌株rhil2-l36-bl21、rhil2-m39-bl21、rhil2-l40-bl21、rhil2-m46-bl21、rhil2-p47-bl21、rhil2-l63-bl21、rhil2-l66-bl21、rhil2-e67-bl21、rhil2-l70-bl21和rhil2-a73-bl21分别接种至lb培养基(酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，含100mg/l壮观霉素和37.5mg/l氯霉素)中，37℃培养5-8小时后进行二级扩种(培养基组成与之前相同)至菌液od
600
为2.0
±
0.2，得到二级种子液。
[0093]
将上述二级种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，在5l发酵罐中实施，培养体积为2l，培养基为2
×
yt培养基(酵母提取物16g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl 5g/l)，接种量：5％(v/v)；培养温度：37℃；ph控制：6.90
±
0.05，必要时自动流加氨水或h3po4；do控制：30％，do关联转速；菌液od
600
至20.0
±
2.0时，添加iptg和非天然氨基酸naek，终浓度均为1mm，同时开始补料50％甘油，补料速度0.6
±
0.1ml/min；诱导表达5-6小时后收集菌体。各个菌株的sds-page电泳图见图3。
[0094]
2、突变型rhil-2的分离提取
[0095]
将上述收集的菌体分别用缓冲液(25mm tris，6mm edta，1mm dtt，ph8.0)重悬，加入1％dna酶(1mg/ml)、0.5％pmsf，混合均匀，用超高压均质机在50-80mpa压力下均质3次；将均质液10000rpm离心20min，收集下层包涵体粗体。
[0096]
将得到的包涵体粗体用洗涤缓冲液(20mm tris-hcl，100mm nacl，2％tritonx-100，ph8.0)清洗两次后，再用超纯水清洗一次，获得纯化包涵体。
[0097]
将纯化包涵体用变性缓冲液(20mm tris-hcl，100mm nacl，6m盐酸胍，1mm dtt，ph8.0)溶解，30min后10000rpm离心，收集上清即为变性蛋白溶液。将4倍体积的复性缓冲液(20mm tris-hcl，100mm nacl，ph8.0)加入收集的变性蛋白溶液中，充分搅拌后静置12h，10000rpm离心收集上清即为复性蛋白溶液。
[0098]
将复性蛋白溶液用截留分子量为5kda的超滤膜包(millipore，biomax-5)浓缩至原体积1/4，使用置换缓冲液(20mm tris-hcl，ph8.0)换液至电导约为2ms/cm，并进一步浓缩至蛋白浓度约为0.5-1mg/ml，10000rpm离心后收集上清即为突变型rhil-2粗蛋白rhil2-l36、rhil2-m39、rhil2-l40、rhil2-m46、rhil2-p47、rhil2-l63、rhil2-l66、rhil2-e67、rhil2-l70和rhil2-a73，可直接用于后续peg偶联。
[0099]
实施例3：peg-连接子的制备
[0100][0101]
如式1所示，将一定量通式为bcn-peg
n-nhs(琥珀酰亚胺活化-聚乙二醇-八元环烯)的环炔和30kd的peg以1:1.2当量的比例混合后用二氯甲烷溶解至澄清，然后加入环炔10倍当量的tea作为缚酸剂，在25℃下搅拌进行反应，反应时间为18-24h，tlc检测原料反应完全后将反应液减压浓缩，然后加入甲基叔丁基醚，产物bcn-peg以白色固体的形式析出，过滤并干燥后备用。该反应收率在95％以上。
[0102]
实施例4：peg与定点突变插入非天然氨基酸的rhil-2的定点偶联
[0103][0104]
如式2所示，通过click反应将bcn-peg与定点突变的rhil-2的naek定点偶联。
[0105]
以30kd peg click反应偶联rhil2-m39为例，反应体系如下：
[0106]
rhil2-m39
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1eq
[0107]
30kd bcn-peg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15eq
[0108]
tris-hcl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20mm(ph≈3)
[0109]
使用稀盐酸调整rhil2-m39溶液的ph到3，将bcn-peg固体投入rhil2-m39溶液中，充分摇晃溶解，得到澄清透明的溶液，之后将反应液密封，在恒温摇床(25℃，70rpm)中摇晃反应。每隔一段时间，取样用sds-page检测反应结果，48h后反应停止，转化率约50％-80％。
[0110]
经过click反应，得到30kd peg-rhil2-l36、30kd peg-rhil2-m39、30kd peg-rhil2-l40、30kd peg-rhil2-m46、30kd peg-rhil2-p47、30kd peg-rhil2-l63、30kd peg-rhil2-l66、30kd peg-rhil2-e67、30kd peg-rhil2-l70和30kd peg-rhil2-a73偶联反应液。
[0111]
实施例5：定点修饰的30kd peg-rhil2的纯化
[0112]
层析介质采用cm sepharose ff(购自ge公司)，平衡缓冲液为20mm醋酸钠缓冲液(ph3.0)，洗脱缓冲液为20mm醋酸钠缓冲液-1m nacl(ph4.5)。将实施例4得到的各偶联反应液用平衡缓冲液调节ph3.0
±
0.2，电导率≤2.5ms/cm，上样至cm sepharose ff层析柱，使用洗脱缓冲液进行线性洗脱(0-30％的洗脱缓冲液，15cv)，收集目的蛋白组分，即可得到纯
度大于95％的目的蛋白样品。纯化后的偶联物30kd peg-rhil2-l36、30kd peg-rhil2-m39、30kd peg-rhil2-l40、30kd peg-rhil2-m46、30kd peg-rhil2-l63和30kd peg-rhil2-a73以及偶联前的rhil2-l36、rhil2-m39、rhil2-l40、rhil2-m46、rhil2-l63和rhil2-a73的sec-hplc图谱见图4。
[0113]
图4中，rhil2-v91是按照实施例1的方法，构建得到rhil2-v91-bl21，再经过实施例2的表达和纯化得到的一种突变型rhil-2；构建过程中用到的引物如下：
[0114]
v91-f：5
’-
gatttccaatatcaactagattgttctggaactga-3
’
(seq id no:30)
[0115]
v91-r：5
’-
tcagttccagaacaatctagttgatattggaaatc-3
’
(seq id no:31)
[0116]
30kd peg-rhil2-v91是按照实施例4的方法以30kd peg click反应偶联rhil2-v91，再按照上述步骤纯化后的偶联物。
[0117]
实施例6：定点修饰的30kd peg-rhil2的体外活性评价
[0118]
1、结合活性
[0119]
采用spr法检测各定点修饰的30kd peg-rhil2与rhil-2rα和rhil-2rβ的结合活性，参比品选用solarbio公司的重组人il-2(solarbio,p00020-1mg)。方法如下：首先，cm5芯片(购自ge,货号：br-1008-30)的表面用400mm 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和100mm n-羟基丁二酰亚胺以10μl/min的流速进行420s的活化。其次，将鼠抗his抗体(购自ge，货号28-9950-56)用固定试剂(10mm醋酸钠，ph 4.5)稀释到50μg/ml，以10μl/min的流速注入到实验通道(fc4)约420s，固定量约为9000至14000ru。最后，芯片用1m乙醇胺以10μl/min进行420s封闭。共制备两个通道，参比通道(fc3)与实验通道(fc4)进行上述相同的操作以制备cm5芯片。将rhil-2rα(购自acro,产品目录号为ila-h52h9)和rhil-2rβ(购自acro,产品目录号为cd2-h5221)原液样品用运行试剂(含10mm hepes，150mm nacl，3mm edta，0.005％tween-20，ph调节至7.4)稀释至4μg/ml，并以10μl/min的流速注入到实验通道(fc4)约500ru。参比通道(fc3)不需要进行配体的捕获，参比通道作为对照通道，可以监控分析物与芯片的结合情况，并可在拟合时进行扣减。将不同的30kd peg-rhil2样品用相应运行试剂进行2倍倍比稀释，并设置样品零浓度的阴性对照，可以监控运行试剂与芯片的结合情况，并可在拟合时进行扣减。将稀释后的样品依次以30μl/min的流速按照60s结合时间和90s解离时间注入到实验通道与参比通道。每一个浓度分析后，芯片需要用ph值为1.5的甘氨酸盐酸以30μl/min的流速再生60s，洗掉配体以及未解离的分析物。进行下一个浓度分析时，实验通道需要重新捕获相同量的配体。使用biacore 8k(ge,ge healthcare life sciences)分析软件计算每个蛋白分子的kd值，参比通道(fc3)与分析物零浓度可用于背景的扣减，结果见表2。各样品与rhil-2rα结合亲和力排序为：参比品＞30kd peg-rhil2-v91＞30kd peg-rhil2-l40＞30kd peg-rhil2-m46；各样品与rhil-2rβ结合亲和力排序为：参比品＞30kd peg-rhil2-l40＞30kd peg-rhil2-m46＞30kd peg-rhil2-v91。各样品的β/α的结合亲和力之比为：参比品：0.064，30kd peg-rhil2-l40：1.137,30kd peg-rhil2-m46：5.231,对照30kd peg-rhil2-v91：0.068。
[0120]
表2参比品、定点修饰的30k peg-rhil2与rhil-2rα、rhil-2rβ的结合活性检测
[0121][0122]
2、细胞活性(stat5磷酸化实验)
[0123]
本方法采用两种细胞株，小鼠ctll-2细胞为含有il-2rαβγ的细胞株，人yt细胞为含有il-2rβγ的细胞株，rhil-2通过与细胞表面il-2r结合，激活jak-stat信号通路。各样品的修饰位点不同，对两种细胞的相对活性不同，yt细胞相对活性/ctll-2细胞相对活性值越高，样品可促进免疫功能的效果越好；相反，则抑制免疫功能的效果越好。
[0124]
具体过程如下：小鼠ctll-2细胞(购自american type culture collection)和人yt细胞用各自培养基(ctll-2细胞培养基：rpmi 1640+10％fbs+400iu/ml rhil-2、2mm l-谷氨酰胺、1mm丙酮酸钠；yt细胞培养基：rpmi 1640+10％fbs+1mm non-essential amino acids solution(购自gibco,产品目录号为11140050))于37℃、5％二氧化碳条件下培养至足够量，在检测前饥饿4h，然后调整细胞密度为1
×
106细胞/ml备用。将各定点修饰的30kd peg-rhil2样品梯度稀释，共6个浓度，37℃刺激细胞10分钟，然后裂解细胞，进行western blot实验，采用pstat5抗体(购自cst,产品目录号为9359l)和β-actin(购自cst,产品目录号为8457s)杂交，检测细胞裂解液中pstat5和β-actin蛋白量，根据pstat5/β-actin灰度结果和样品浓度计算ec50。结果见表3。结果表明，m39、l40、m46、l63位点插入非天然氨基酸并偶联30kd peg的rhil2达到了最初的设计要求，而l36和a73位点的效果没有达到预期。
[0125]
表3突变型rhil-2、30kd peg-rhil2在ctll-2和yt细胞上开展stat5磷酸化实验结果
2和30k peg-rhil2-m46的浓度和单位，二者各拟合一条曲线，计算待测血清的血药浓度。根据das软件的非房室模型(统计矩参数)算出泉奇rhil-2和30kd peg-rhil2-m46的平均半衰期t
1/2
分别为0.796h和17.7h。泉奇rhil-2和30kd peg-rhil2-m46的药动学参数见表4。
[0130]
表4泉奇rhil-2和30kd peg-rhil2-m46的药动学参数(n＝5)
[0131][0132]
实施例8：小鼠体内的药效学研究——抗肿瘤活性
[0133]
实验采用雌性c57bl/6小鼠(spf级，浙江维通利华实验动物技术有限公司)，将8
×
104/0.1ml/小鼠b16-f10(购自atcc,产品目录号为crl-6475)细胞悬液接种至小鼠右侧背部皮下，在肿瘤体积达到50mm3左右时，随机分组，每组10只小鼠，分别给予溶媒(1
×
pbs)、对照药物泉奇rhil-2、30kd peg-rhil2-l40、30kd peg-rhil2-m46和30kd peg-rhil2-l63(给药体积为10ml/kg)。实验期间每周3次测定动物体重和肿瘤体积，给药方式和实验结果见表5和图5。相对肿瘤体积(relative tumor volume，rtv)计算公式为：v
t
/v0，其中v0为分组时的肿瘤体积，v
t
为每一次测量时的肿瘤体积。相对肿瘤增殖率t/c(％)计算公式为：t
rtv
/c
rtv
×
100％，其中t
rtv
为治疗组rtv，c
rtv
为阴性对照组rtv。
[0134]
结果表明，相比溶媒组，泉奇rhil-2、30kd peg-rhil2-l40、30kd peg-rhil2-m46和30kd peg-rhil2-l63对小鼠黑色素瘤b16-f10同种移植瘤均有显著的抑制作用。且与泉奇rhil-2相比，30kd peg-rhil2-l40、30kd peg-rhil2-m46和30kd peg-rhil2-l63肿瘤体积均值均小于泉奇rhil-2，具有显著性差异。
[0135]
表5受试物在b16-f10同种移植瘤模型中的给药方式及对动物肿瘤体积的影响
[0136][0137]
注：*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001，与溶媒组相比。
[0138]
当受试的每组小鼠肿瘤平均体积超过2000mm3时处死小鼠，并解剖取肿瘤拍照，如图6所示。
[0139]
实施例9：小鼠体内的药效学研究——免疫细胞群的表达
[0140]
实验采用雌性c57bl/6小鼠(spf级，浙江维通利华实验动物技术有限公司)，将8
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104/0.1ml/小鼠b16-f10细胞悬液接种至小鼠右侧背部皮下，在肿瘤体积达到100mm3左右时，随机分组，每组6只小鼠，按表6分别给予各受试物(给药体积为10ml/kg)。在day5和day7时，每组选取3只动物收取各组血液和肿瘤组织样本进行流式检测各免疫细胞群比例的变化，day5结果如图7所示。
[0141]
表6受试物在b16-f10同种移植瘤模型中的给药方式
[0142][0143][0144]
与泉奇rhil-2相比，30kd peg-rhil2-l40、30kd peg-rhil2-m46和30kd peg-rhil2-l63的cd8+t细胞比例显著增加，treg细胞比例显著减小，cd8+t/treg的比例显著增加，表现出很好的增强免疫的药效。

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