一种试剂盒、样本标记方法、单细胞测序方法与流程

一种试剂盒、样本标记方法、单细胞测序方法
[0001]
本申请要求2020年04月07日申请的，申请号为202010268124.3，发明名称为“一种试剂盒、样本标记方法、单细胞测序方法”中国专利申请的优先权。
技术领域
[0002]
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种试剂盒、样本标记方法、单细胞测序方法。


背景技术：

[0003]
单细胞测序技术极大地推进了基因组学领域，通过揭示每个细胞独特的微妙变化，使不同细胞类型得以精细区分，使得科学家们在单细胞水平进行分子机制研究成为可能。
[0004]
随着技术的发展，在单次单细胞测序实验中，可以同时捕获1-10万个的单细胞，由于单次单细胞测序实验的成本较高，如果要降低每个细胞的测序成本，就只能让单细胞测序的通量越高。然而，对于某些单细胞测序实验，少量的细胞便能达到实验的需求或者测序样本的细胞数量本身就不多，为了降低成本，现在常用的做法是将不同的单细胞测序样本混合在一起进行高通量的单细胞测序实验。
[0005]
为了在后续分析中准确的区分来自不同单细胞测序样本的细胞，在混合不同的单细胞测序样本前必须对细胞进行标记。现在常用的标记方法主要有两种：其一，通过在细胞中表达特定的核酸标签；其二，利用带有特定的核酸标签的抗体对细胞进行标记。
[0006]
现在常用的标记方法主要有以下缺点：第一种方法需要对细胞进行长时间的预处理，操作复杂，且不能用于从组织新鲜分离的单细胞。第二种方法需要事前了解不同细胞表面的抗原表达情况，若两种细胞区分不大则不能使用；此外，该类标签生产成本高，且不能用于细胞核的标记。


技术实现要素：

[0007]
本发明的主要目的是提供一种试剂盒，通过该试剂盒标记单细胞测序样本的方法操作简单，成本低，效果好，且能通用于细胞和细胞核的标记。
[0008]
为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种试剂盒，包括：
[0009]
试剂一，所述试剂一包括样本标签序列，所述样本标签序列包括特异标记样本的条形码核苷酸序列，所述条形码核苷酸序列的任一端连接细胞标签结合序列，所述样本标签序列的任一端标记有生物素或其类似物；
[0010]
试剂二，所述试剂二包括通过生物素或其类似物标记的刀豆蛋白a或其类似物；
[0011]
试剂三，所述试剂三包括亲和素或其类似物，所述亲和素或其类似物用于连接所述试剂一中的生物素或其类似物，以及所述试剂二中的生物素或其类似物。
[0012]
第二方面，本发明还提出另一种试剂盒，包括：
[0013]
样本标签序列，所述样本标签序列包括特异标记样本的条形码核苷酸序列，所述
条形码核苷酸序列的任一端连接细胞标签结合序列，所述样本标签序列的任一端标记有生物素或其类似物；
[0014]
刀豆蛋白a或其类似物与亲和素或其类似物的融合蛋白，所述融合蛋白用于与所述样本标签序列中的生物素或其类似物连接。
[0015]
第三方面，本发明还提出又一种试剂盒，包括：
[0016]
样本标签序列，所述样本标签序列包括特异标记样本的条形码核苷酸序列，所述条形码核苷酸序列的任一端连接细胞标签结合序列，所述样本标签序列的任一端标记有生物素或其类似物，所述样本标签序列通过亲和素或其类似物与生物素或其类似物标记的刀豆蛋白a或其类似物连接。
[0017]
可选地，所述条形码核苷酸序列的另一端连接第一引物结合序列。
[0018]
可选地，所述细胞标签结合序列包括第二引物结合序列或多聚腺苷酸尾序列。
[0019]
可选地，所述亲和素为链霉亲和素。
[0020]
第四方面，本发明还提出一种样本标记方法，包括，
[0021]
将细胞样本或细胞核样本在缓冲液中进行重悬，得到待标记的样本；
[0022]
向所述待标记的样本中加入第三方面所述的试剂盒中的试剂进行孵育，得到标记好的样本。
[0023]
第五方面，本发明还提出一种单细胞测序方法，所述单细胞测序的样本使用第一到第三方面任一所述试剂盒进行预处理。
[0024]
可选地，所述单细胞测序为单细胞mrna测序。
[0025]
可选地，所述单细胞测序为单细胞atac测序。
[0026]
本发明技术方案通过设计一种试剂盒，该试剂盒包括带有生物素标记的样本标签序列，样本标签序列带有特异标记样本的条形码核苷酸序列，还包括生物素标记的刀豆蛋白a或其类似物，以及用于连接样本标签序列和刀豆蛋白a或其类似物的亲和素，在单细胞测序混合样本之前，使用试剂盒对样本进行预处理，使得连接有样本标签序列的刀豆蛋白a或其类似物连接在细胞膜或细胞核膜上，从而使每个样本的细胞带有不同的样本标签序列，从而在后续的单细胞测序结果中能够清楚的分辨出细胞来自哪个样本，该方案操作简单，成本低，效果好，且能通用于细胞和细胞核的标记，降低单细胞测序的成本。
附图说明
[0027]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
[0028]
图1为本发明一实施例的样本标签序列示意图；
[0029]
图2为本发明另一实施例的样本标签序列示意图；
[0030]
图3为本发明实施例标记样本的复合物结合膜的结构示意图；
[0031]
图4为本发明实施例标记样本的复合物标记hek293细胞的实验结果图；
[0032]
图5为本发明实施例标记样本的复合物标记细胞后的单细胞mrna测序结果图；
[0033]
图6为本发明实施例标记样本的复合物标记mef细胞核的实验结果图；
[0034]
图7为本发明实施例标记样本的复合物标记细胞核后的单细胞atac测序结果图；
[0035]
图8为本发明实施例单体型链霉亲和素－刀豆蛋白a融合蛋白的纯化表达结果图；
[0036]
图9为本发明实施例单体型链霉亲和素－刀豆蛋白a融合蛋白标记细胞的实验结果图；
[0037]
图10为检测本发明实施例标记样本的复合物交叉污染的实验结果图。
[0038]
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
[0039]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0040]
本发明提出一种试剂盒，包括试剂一，所述试剂一包括样本标签序列，所述样本标签序列包括特异标记样本的条形码核苷酸序列，所述条形码核苷酸序列的任一端连接细胞标签结合序列，所述样本标签序列的任一端标记有生物素或其类似物；试剂二，所述试剂二包括通过生物素或其类似物标记的刀豆蛋白a或其类似物；试剂三，所述试剂三包括亲和素或其类似物，所述亲和素或其类似物用于连接所述试剂一中的生物素或其类似物，以及所述试剂二中的生物素或其类似物。
[0041]
本发明技术方案通过在单细胞测序混合样本之前，使每个样本的细胞带有不同的样本标签序列，从而在后续的单细胞测序结果中能够清楚的分辨出细胞来自哪个样本，该方案操作简单，成本低，效果好，且能通用于细胞和细胞核的标记，降低单细胞测序的成本。
[0042]
具体的，参见图1和图2，该样本标签序列的实质为一个核酸标签，所述条形码核苷酸序列每个位置可以为a、t、c、g任一的碱基，通过碱基的随机排列，得到不同的条形码核苷酸序列，条形码核苷酸序列为样本标签序列的特征序列，其长度可以随意设计，优选为8-10个碱基长度，条形码核苷酸序列太短会造成标签种类不够多，太长会造成不必要的浪费。
[0043]
具体的，所述细胞标签结合序列用于后续与单细胞测序中的细胞标签进行连接，细胞标签分别连接细胞内的测序物质和样本标签序列，并分别进行测序，最后根据带有相同细胞标签的测序物质和样本标签序列知道所述测序物质来自于哪个样本。细胞标签序列可以连接在条形码核苷酸序列的5
’
端或3
’
端。
[0044]
可选地，所述样本标签序列还包括第一引物结合序列，所述第一引物结合序列用于后续对样本标签序列进行pcr扩增，长度一般在16-28个碱基之间，第一引物结合序列设计需要遵循引物设计原则。相应的，第一引物结合序列连接在条形码核苷酸序列没有连接细胞标签序列的一端。
[0045]
可选地，参见图1，所述细胞标签结合序列为第二引物结合序列，该第二引物结合序列同样需要遵循引物设计原则，该第二引物结合序列用于后续与单细胞测序中的细胞标签通过碱基互补配对进行连接，在单细胞测序的过程中，细胞标签分别连接细胞内的测序物质和样本标签序列，并分别进行测序，最后根据带有相同细胞标签的测序物质和样本标签序列知道所述测序物质来自于哪个样本。
[0046]
更进一步的，所述第一引物结合序列与条形码核苷酸序列之间以及第二引物结合
序列与条形码核苷酸序列之间还可以包括用于增加样本标签序列长度的随机序列，这样可以增加后续单细胞测序中样本标签序列的回收效率。
[0047]
可选地，参见图2，所述细胞标签结合序列为多聚腺苷酸序列尾，该样本标签序列专用于mrna测序，由于单细胞mrna测序中的细胞标签带有一段多聚t尾序列，从而使得该样本标签序列可以和细胞标签序列结合，从而分别对带有细胞标签的测序物质和带有细胞标签的样本标签序列进行测序，根据相同的细胞标签得知测序物质来自于哪种样本。
[0048]
具体的，每个亲和素分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。优选地，所述亲和素为链霉亲和素，链霉亲和素与生物素的结合特异性更高。参见图3，链霉亲和素是四聚体蛋白，大小为66kda。一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，两者之间的亲和力极为强烈，链霉亲和素-生物素复合物的解离常数处于10-14
mol/l数量级。
[0049]
刀豆蛋白a是一种糖类结合蛋白质，为四聚体球蛋白，分子量为102000，每个亚基含237个氨基酸残基，分子量25500，含一个糖结合部位。由于细胞膜或核膜表面带有大量的糖蛋白，因此，刀豆蛋白a可以与细胞膜或核膜上的糖蛋白结合，从而将核酸标签即样本标记序列标记到细胞膜或核膜表面。可以理解的是，该复合物不仅限于使用刀豆蛋白a，包括与刀豆蛋白a具有类似功能的其他功能蛋白也可以使用。
[0050]
优选地，所述链霉亲和素与所述样本标签序列、所述生物素标记的刀豆蛋白a或其类似物的摩尔比为1：1：1。
[0051]
由于带有生物素的核酸标签与带有生物素的刀豆蛋白a在结合链霉亲和素时会相互竞争，因此1：1：1的比例是该复合物最稳定的配比。可以理解的是，链霉亲和素与所述生物素标记的核酸标签、所述生物素标记的刀豆蛋白a 的分子比也可以为其他比值，只要不影响该复合物的功能即可。
[0052]
具体的，在使用该试剂盒的时候，将亲和素和生物素标记的刀豆蛋白a溶解于50％的甘油中，将生物素标记的样本标签序列溶解于双蒸水中，先分别配置合适的浓度，将亲和素与生物素标记的样本标签序列进行孵育，孵育条件可以为室温孵育5分钟，再加入生物素标记的刀豆蛋白a进行孵育，得到如图3 所示的标记样本的复合物，该复合物与样本进行孵育，从而使得细胞或细胞核样本带有样本标签序列。
[0053]
第二方面，本发明还提出一种试剂盒，包括：
[0054]
样本标签序列，所述样本标签序列包括特异标记样本的条形码核苷酸序列，所述条形码核苷酸序列的任一端连接细胞标签结合序列，所述样本标签序列的任一端标记有生物素或其类似物；
[0055]
刀豆蛋白a或其类似物与亲和素或其类似物的融合蛋白，所述融合蛋白用于与所述样本标签序列中的生物素或其类似物连接。
[0056]
具体的，与上述第一方面实施例不同的是，本实施例的试剂盒中将刀豆蛋白a或其类似物与亲和素进行融合表达，从而得到具有刀豆蛋白a的膜结合功能和亲和素的与生物素结合功能的融合蛋白，从而使得该融合蛋白不需要进行生物素标记就可以与生物素标记的样本标签序列连接。
[0057]
具体的，在使用的时候，先将该融合蛋白与样本标签序列进行孵育得到类似于图3所示的标记样本的复合物，通过该复合物与细胞或细胞核样本进行孵育，从而对样本进行
标记。
[0058]
第三方面，本发明还提出又一种试剂盒，包括：
[0059]
样本标签序列，所述样本标签序列包括特异标记样本的条形码核苷酸序列，所述条形码核苷酸序列的任一端连接细胞标签结合序列，所述样本标签序列的任一端标记有生物素或其类似物，所述样本标签序列通过亲和素或其类似物与生物素或其类似物标记的刀豆蛋白a或其类似物连接。
[0060]
具体的，与上述第一和第二方面实施例不同的是，该实施例中试剂盒中的试剂为一个复合物，该复合物的制备方法包括，将亲和素与生物素标记的样本标签序列进行孵育，得到第一混合物，向所述第一混合物中加入生物素标记的刀豆蛋白a或其类似物进行孵育，得到标记样本的复合物。
[0061]
具体的，亲和素和生物素标记的刀豆蛋白a溶解于50％的甘油中，生物素标记的样本标签序列溶解于双蒸水中，先分别配置合适的浓度，再按照上述方法进行孵育，孵育条件可以为室温孵育5分钟。
[0062]
第四方面，本发明还提出一种样本标记方法，包括，
[0063]
将细胞样本或细胞核样本在缓冲液中进行重悬，得到待标记的样本；
[0064]
向所述待标记的样本中加入上述第三方面实施例试剂盒中的试剂进行孵育，得到标记好的样本。
[0065]
具体的，如果为细胞核样本需要先进行细胞核提取，细胞核提取方法参照现有技术进行。所述缓冲液可以为磷酸盐缓冲液或细胞核的缓冲液。对样本进行重悬得到单细胞悬液或者单细胞核悬液，以方便后续在细胞膜或细胞核膜上标记样本标签序列。
[0066]
可选地，所述孵育条件为冰上放置10分钟。
[0067]
第五方面，本发明还提出一种单细胞测序方法，所述单细胞测序的样本使用第一到第三方面任一实施例所述试剂盒进行预处理，具体的使用方法参照上述第一到第三方面实施例所述。
[0068]
具体的，上述第一方面到第三方面实施例试剂盒对细胞或细胞核进行标记之后，使得细胞或细胞核带有样本标签序列，从而在后续的单细胞测序中能够清楚的分辨出测序结果来自哪个样本的细胞或细胞核，同时采用现有的单细胞测序标记方法，可以清楚的分辨出测序结果来自哪个细胞，从而方便在测序样本数量少的情况下将样本进行混合以进行大通量的单细胞测序，从而降低单细胞测序的成本。
[0069]
可选地，当样本标签序列的3
’
端设计为多聚a尾时，所述样本标签序列用于单细胞mrna测序。此时，单细胞测序的细胞标签序列为多聚t尾，因此细胞标签序列可以分别和样本标签序列以及mrna结合，从而根据引物结合序列进行扩增，分别进行测序，由于样本标签序列和mrna都带有细胞标签序列，通过相同的细胞标签序列即可知道测序结果mrna来自哪个样本的哪个细胞。
[0070]
可选地，当样本为细胞核时，所述单细胞测序为单细胞atac测序。atac 测序为测序细胞核中染色质的开放区域，样本标签序列的设计参照图1所示，在此不再赘述。
[0071]
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，
均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0072]
实施例1样本标签序列的设计
[0073]
分别设计针对mrna单细胞测序和针对细胞核atac测序的样本标签序列，结果分别为siq id no.1和siq id no.2，5
’
端带有生物素标记，其中条形码核苷酸序列为8个碱基组成，在合成的时候进行随机排列，atac测序的样本标签序列的第34-56个碱基以及第65-175个碱基为增加样本标签序列长度的随机序列。
[0074]
实施例2标记样本的复合物的制备
[0075]
1、准备制作标记样本的复合物的三个组分：生物素标记的刀豆蛋白a购于sigma-aldrich，货号c2272；链霉亲和素购于北京酷来搏科技有限公司，货号cs10471；生物素标记的样本标签核苷酸序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0076]
2、将生物素标记的刀豆蛋白a和链霉亲和素以1.6um的浓度溶解于50％的甘油中，将生物素标记的样本标签核苷酸序列以0.1um的浓度溶解于双蒸水中。
[0077]
3、制作分子标签：首先将链霉亲和素分子和生物素标记的样本标签核苷酸序列以1：1的摩尔比进行混合，混匀后室温放置5分钟。然后加入生物素标记的刀豆蛋白a，使其和链霉亲和素的摩尔比达到1：1，混匀后室温放置 5分钟。
[0078]
实施例3标记样本的复合物标记细胞
[0079]
1、准备细胞：将hek293细胞以单细胞的方式重悬于0.5ml的磷酸盐缓冲液中得到单细胞悬浮液，一共设置6组单细胞悬浮液。
[0080]
2、标记细胞：向1中准备好的6组单细胞悬液中分别加入制作好的分子标签0μl、1.25μl、2.5μl、5μl、10μl、20μl，混匀后冰上放置10分钟。
[0081]
3、洗去多余的分子标签：用1ml的磷酸盐缓冲液洗细胞两遍后将细胞重悬在磷酸盐缓冲液里。
[0082]
4、测量细胞上结合分子标签的数量：首先利用荧光定量pcr绘制生物素标记的核酸标签的标准曲线。将标记后的细胞直接放入荧光定量pcr反应体系(2000个细胞每个反应)进行测量，最后根据标准曲线计算出每个细胞上分子标签的数量。
[0083]
结果如图4所示，每组单细胞悬液中平均每个细胞上分子标签的数量随着分子标签的用量增大而增多，分子标签的数量可多达5万个，证明实施例2 中得到的复合物分子标签对细胞的标记效果很好。
[0084]
实施例4对标记后的细胞进行单细胞mrna测序
[0085]
1、准备细胞：将不同种类的细胞以单细胞的方式重悬于0.5ml的磷酸盐缓冲液中得到单细胞悬浮液，一共设置20组单细胞悬浮液。
[0086]
2、标记细胞：向1中准备好的20组单细胞悬液中分别加入制作好的20 种带有不同序列的样本标签2.5μl，混匀后冰上放置10分钟。
[0087]
3、洗去多余的样本标签：用1ml的磷酸盐缓冲液洗细胞两遍后将细胞重悬在磷酸盐缓冲液里。
[0088]
4、测量细胞上结合样本标签的种类：利用单细胞mrna测序试剂盒捕获细胞上的样本标签，并利用二代测序分析每个细胞上所结合的样本标签的种类。
[0089]
结果如图5所示，每组单细胞样本所结合的分子标签都能被二代测序检测到，含有1个以上分子标签的细胞被认为是细胞双包。
[0090]
实施例5标记样本的复合物标记细胞核
[0091]
1、准备细胞核：将mef细胞的细胞核以单细胞核的方式重悬于0.5ml 的细胞核提取液中得到单细胞核悬浮液，一共设置6组单细胞核悬浮液。
[0092]
2、标记细胞核：向1中准备好的6组单细胞核悬浮液中分别加入制作好的分子标签0μl、1.25μl、2.5μl、5μl、10μl、20μl，混匀后冰上放置10分钟。
[0093]
3、洗去多余的分子标签：用1ml的细胞核清洗缓冲液洗细胞两遍后将细胞重悬在细胞核清洗缓冲液里。
[0094]
4、测量细胞核上结合分子标签的数量：首先利用荧光定量pcr绘制生物素标记的核酸标签的标准曲线。将标记后的细胞核直接放入荧光定量pcr反应体系(2000个细胞核每个反应)进行测量，最后根据标准曲线计算出每个细胞核上分子标签的数量。
[0095]
结果如图6所示，每组单细胞核悬液中平均每个细胞核上分子标签的数量随着分子标签的用量增大而增多，平均每个细胞核的分子标签的数量可多达12万个，证明实施例2中得到的复合物分子标签对细胞核的标记效果很好。
[0096]
实施例6对标记后的细胞核进行单细胞atac测序
[0097]
1、准备细胞：将不同种类的细胞以单细胞核的方式重悬于0.5ml的磷酸盐缓冲液中得到单细胞悬浮液，一共设置8组单细胞悬浮液。
[0098]
2、标记细胞：向1中准备好的8组单细胞悬液中分别加入制作好的8种带有不同序列的样本标签2.5μl，混匀后冰上放置10分钟。
[0099]
3、洗去多余的样本标签：用1ml的磷酸盐缓冲液洗细胞两遍后将细胞重悬在磷酸盐缓冲液里。
[0100]
4、测量细胞上结合样本标签的种类：利用单细胞atac测序试剂盒捕获细胞核上的样本标签，并利用二代测序分析每个细胞核上所结合的样本标签的种类。
[0101]
结果如图7所示，每组单细胞样本所结合的分子标签都能被二代测序检测到，含有1个以上分子标签的细胞被认为是细胞双包。
[0102]
实施例7制备“单体型链霉亲和素－刀豆蛋白a”融合蛋白
[0103]
1、准备原核表达载体：将单体型链霉亲和素和刀豆蛋白a的蛋白编码序列插入pgex6p1原核表达载体的多克隆位点，两段序列由三个ggggs连接肽隔开，和上游的gst蛋白编码序列在同一编码框。
[0104]
2、原核表达：将表达载体转入大肠杆菌细胞并培养，用iptg诱导融合蛋白的表达。
[0105]
3、融合蛋白的纯化：将表达融合蛋白的大肠杆菌破碎，用gst标签蛋白纯化柱对融合蛋白进行纯化。其后，对洗脱的蛋白进行透析和浓缩。最终，利用sds-page和考马斯亮蓝对融合蛋白进行鉴定，结果如图8所示，带有 gst标签的融合蛋白大小在70kda左右，符合预期大小。
[0106]
实施例8利用单体型链霉亲和素－刀豆蛋白a融合蛋白标记细胞
[0107]
1、将融合蛋白以400nm的浓度溶解于50％的甘油中，将生物素标记的样本标签核苷酸序列以0.1μm的浓度溶解于双蒸水中。
[0108]
2、准备细胞：将hek293细胞以单细胞的方式重悬于0.2ml的磷酸盐缓冲液中得到单细胞悬浮液，一共设置7组单细胞悬浮液。
[0109]
3、融合蛋白标记细胞：向2中准备好的7组单细胞悬液中分别加入制作好的融合蛋
白2.5μl，混匀后冰上放置10分钟。
[0110]
4、洗去多余的融合蛋白：用1ml的磷酸盐缓冲液洗细胞一遍后将细胞重悬在磷酸盐缓冲液里。
[0111]
5、核酸标签标记细胞：向4中准备好的7组单细胞悬液中分别加入制作好的生物素标记的核酸标签0μl、0.625μl、1.25μl、2.5μl、5μl、10μl、20μl，混匀后冰上放置10分钟。
[0112]
6、洗去多余的核酸标签：用1ml的磷酸盐缓冲液洗细胞一遍后将细胞重悬在磷酸盐缓冲液里。
[0113]
7、测量细胞上结合分子标签的数量：首先利用荧光定量pcr绘制生物素标记的核酸标签的标准曲线。将标记后的细胞直接放入荧光定量pcr反应体系(200个细胞每个反应)进行测量，最后根据标准曲线计算出每个细胞上分子标签的数量。
[0114]
结果如图9所示，每组单细胞悬液中平均每个细胞上核酸标签的数量随着核酸标签的用量增大而增多，核酸标签的数量可多达5万个，证明实施例7 获得的融合蛋白对细胞的标记效果很好。
[0115]
实施例9样本标签序列的交叉污染实验
[0116]
为了检测该样本标签序列标记的样本混合后交叉污染的可能性，将标记和非标记的细胞进行混合，再将细胞分开，分别检测细胞上核酸标签的数量。如图10所示，核酸标签不会从标记细胞上脱落并污染未标记的细胞，证明样本标签序列的稳定性很好。
[0117]
以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

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