一种溶磷菌、溶磷菌剂、生物菌肥及应用的制作方法

[0001]
本发明属于微生物领域，涉及溶磷菌和溶磷菌剂和它的用途。


背景技术：

[0002]
磷作为土壤中一种重要的矿质营养元素，参与植物的整个生命周期，在生态系统中扮演着重要的角色。自然界中的磷素存在含量很高，占地壳中的0.28％左右，一般土壤中是不缺乏磷素的，但土壤中缺少可以被植物利用的磷素，通常土壤中95％为无效磷。在我国南方丘陵地区土壤类型多以红壤和黄棕壤为主，土壤中含有较高的铁、铝离子，对磷素具有很强的共价吸附作用，可以降低土壤中磷素的生物有效性从而使植物难以吸收。此外，随着化肥产业的更加成熟也加大了土壤中磷肥的施用，人们没有科学合理的施用磷肥，导致土壤中难利用磷素大量积累，不仅造成了资源浪费更造成了环境污染。如何通过溶磷菌剂高效而绿色的提高土壤中磷素利用效率，已成为世界科学家关注的热点问题。
[0003]
溶磷菌是一种具有溶磷作用的一类菌，对土壤磷素的转化和有效性影响很大。溶磷菌是土壤的重要组成部分，参与土壤生态系统的物质循环，使其具有动态的营养转换和可持续的植物生产。它们可以通过分泌植物生长素，直接促进植物的生长，也可以通过产生有机酸、酶等小分子物质，活化难溶性磷等土壤物质，间接的促进植物的生长发育。目前已发现的溶磷微生物很多，包括细菌、真菌、放线菌等，但已报道的仍只占溶磷微生物的一小部分，亟需发掘溶磷能力更强、促生效果更好的溶磷菌株。


技术实现要素：

[0004]
鉴于此，本发明目的在于提供一种溶磷能力强、促生效果好的新溶磷菌株。
[0005]
本发明的又一目的在于提供一种溶磷能力强、促生效果好的溶磷菌剂。
[0006]
本发明的又一目的在于提供一种溶磷能力强、促生效果好的溶磷菌肥。
[0007]
本发明的又一目的在于提供一种溶磷菌株。
[0008]
发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种溶磷菌，溶磷菌菌株xqp53为伯克霍尔德菌 (burkholderia sp.)，生物保藏编号为：cctcc m 2020254。保藏日期：2020年6月30日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学。
[0009]
本发明还提供了一种溶磷菌剂，用于活化土壤中难溶性磷，促进植物生长，包括前述溶磷菌，溶磷菌菌株xqp53为伯克霍尔德菌(burkholderia)，生物保藏编号为：cctcc m 2020254；将溶磷菌液经离心后，用无菌水洗出菌体并调节菌悬液浓度为 4
×
108cfu/g～6
×
108cfu/g，得到溶磷菌剂。
[0010]
优选地，所述土壤为黄棕壤、红壤中的一种。
[0011]
优选地，所述土壤为黄棕壤。
[0012]
优选地，所述植物为玉米。
[0013]
本发明还提供了一种生物菌肥，施于植物根际土壤，用于活化土壤中难溶性磷，用
于促进植物生长，包括溶磷菌菌株xqp53，为伯克霍尔德菌(burkholderia)，生物保藏编号为： cctcc m 2020254。
[0014]
优选地，所述土壤为黄棕壤、红壤中的一种。
[0015]
优选地，所述土壤为黄棕壤。
[0016]
优选地，所述植物为玉米。
[0017]
本发明还提供了前述溶磷菌活化土壤中难溶性磷的应用。
[0018]
优选地，所述土壤为黄棕壤、红壤中的一种。
[0019]
优选地，所述土壤为黄棕壤。
[0020]
与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
[0021]
a)溶磷菌xqp53可以提高玉米地径、株高、叶绿素含量；提高土壤养分，增加土壤中性磷酸酶，提高土壤中水溶性磷、碳酸氢钠无机磷的含量，减少土壤中残余态磷含量，促进土壤中活性态、低活性态磷素向活性态磷素转化。
[0022]
b)菌剂xqp53具有促进玉米生长、提高土壤养分、转化磷素的作用，具有植物生产上的应用价值。
[0023]
c)不同溶磷菌与不同土壤的适配性不同，提高磷素有效性的能力也不同。溶磷菌 xqp53在黄棕壤和中红壤均具有促生作用，通过试验证明在黄棕壤效果更好。
[0024]
说明书附图
[0025]
图1是施用不同菌剂土壤有效磷的动态变化。
[0026]
图2是施用不同菌剂对红壤、棕黄壤土壤酶活的影响。
[0027]
图中，p53即xqp53，p81即sqp81。
具体实施方式
[0028]
下面结合具体实施例进行说明。
[0029]
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
[0030]
本实施例从土壤中筛选的两株新溶磷菌：伯克霍尔德菌xqp53(burkholderia)、克雷伯氏菌sqp81(klebsiella)以及em菌为材料，对比他们对植物生长、土壤养分、磷素形态的影响，以充分说明伯克霍尔德菌作为溶磷菌的功效。
[0031]
伯克霍尔德菌(burkholderia)，生物保藏编号为：cctcc m 2020254。保藏日期：2020 年6月30日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学。
[0032]
克雷伯氏菌(klebsiella)，生物保藏编号为：cctcc m 2020253，已同日另行提交专利申请。保藏日期：2020年6月30日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学。
[0033]
溶磷菌xqp53、sqp81可用于制备溶磷菌剂和生物菌肥。
[0034]
1材料与方法
[0035]
1.1实验材料
[0036]
供试玉米：玉米种子为郑单958。
[0037]
供试菌剂：试验选用溶磷菌株为xqp53、sqp81，由申请人在土壤中筛选获得，经16s rdna 序列相似性分析确定xqp53为伯克霍尔德菌(burkholderia)，sqp81为克雷伯氏菌 (klebsiella)。部分(gene0059 57427 58962chr_rrna01 57427 58962)xqp53基因序列如 seqidno.1所示。
[0038]
em菌为河南农富康生物科技有限公司生产的em菌液，其中活性菌为2
×
10
10
cfu/g。
[0039]
供试土壤：红壤采自江西农业大学气象站实验基地，土壤理化性质为有效磷13.65mg
·
kg-1
、速效钾77.01mg
·
kg-1
、全磷609.26mg
·
kg-1
、有机质16.66g
·
kg-1
、ph值4.61。黄棕壤采于九江市瑞昌市横港镇的，土壤理化性质为有效磷6.56mg
·
kg-1
、速效钾87.36mg
·
kg-1
、全磷532.65 mg
·
kg-1
、有机质4.74g
·
kg-1
、ph值6.08。
[0040]
1.2试验处理
[0041]
将玉米种子用75％酒精浸泡1分钟，用4％次氯酸钠浸泡30分钟进行表面消毒，用无菌蒸馏水冲洗3次后，转入25℃温箱培养中灭菌纱布上进行催芽后使用。
[0042]
盆栽用盆规格为18cm
×
15cm
×
15cm，土壤过5mm筛按每盆10kg土壤(换算成干重)装盆。将保存好的溶磷菌剂接种到nbrip固体培养基上，再转接到lb液体培养基上培养，培养24h 后低温保存备用。
[0043]
溶磷菌菌液和em菌液经离心后，用无菌水洗出菌体并调节菌悬液浓度成5
×
108cfu/g(采用平板计数法)的菌剂。
[0044]
按每盆土质量的2％量施用菌剂，采用根部滴灌的方式施入土壤，ck处理加入200ml无菌水代替菌剂。试验采用完全随机设计方案，2种土壤(红壤、黄棕壤)、4种菌液(xqp53、 sqp81、em、ck)共8个处理，4次重复，共计32盆盆栽。每盆播种4粒玉米种子，出苗后保留2株生长均匀一致种苗，温室种植，盆栽日程管理均按照常用方法，保持土壤湿度在 65％～75％。
[0045]
1.3试验方法
[0046]
试验于2019年8月17日至11月25日在江西农业大学中药园温室进行，玉米叶片叶绿素的测量使用spad502叶绿素仪测定，每盆中随机选取8个点测量，取其平均值。全磷、no
3--
n和 nh
4+-n使用全自动智能化学分析仪测定，有效磷采用钼锑抗比色法测定(参考《土壤农化分析》)。
[0047]
潜在硝化速率的测定：称取10.00g(等同于烘干土的质量)土壤均匀铺于70ml灭菌的离心管，添加(nh4)2so4使得土壤中nh
4+-n含量达到100mg n kg-1
干土，用蒸馏水调节至水分含量60％，置于25℃条件下避光培养并每天添加蒸馏水以保持同样的水分含量，培养7天后立即测定no
3—
n含量，潜在硝化速率用培养前后no
3—
n变化进行计算。
[0048]
土壤过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法；土壤脲酶活性测定采用苯酚钠-次氯酸钠比色法；土壤磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法。
[0049]
土壤磷分级采用sui等修正hedley的土壤磷素分级法：称取0.5g过2mm筛的风干土样于50ml的离心管中，逐级加入30ml的去离子水、0.5mol
·
l
－1
nahco3、0.1mol
·
l
－1
naoh、 1mol
·
l
－1
hcl提取出土壤中各级土壤磷素形态，无机磷采用钼锑抗比色法直接对浸提液测定，有机磷含量则需先采用硫酸-高氯酸消解，再用钼锑抗比色法测定各级浸提液的磷素总
量，再减去相对应的无机磷含量求得，残留土壤样品采用硫酸-高氯酸高温消解测定残留磷含量。
[0050]
1.4数据处理与分析
[0051]
数据整理与计算用microsoft excel 2010软件，用spss22.0统计分析软件进行单因素 (one-way anova)方差分析和多重比较(α＝0.05)，对土壤酶和各形态磷素等指标进行pearson 相关分析，图表中数据为平均值
±
标准误。
[0052]
2结果与分析
[0053]
2.1施用菌剂对红壤、黄棕壤上玉米生长及叶片磷含量的影响
[0054]
如表1所示，黄棕壤处理相较红壤处理生长状况较好，两种土壤施用菌剂后相较ck都表现出了较好的促进生长能力。
[0055]
红壤中菌剂处理的地径、株高、叶绿素、叶面积、干质量、叶片全磷等指标均高于ck 对照，其中株高、叶绿素、干质量达到了显著性差异水平，且溶磷菌剂sqp81处理为最大值，分别为40.34cm、26.18、4.04g，相较ck增加158.26％、129.73％、136.03％。
[0056]
施用溶磷菌剂可以提高叶片全磷，其中xqp53处理全磷含量最高为4.00mg/g，相较ck 处理提高了133.33％。黄棕壤上施用溶磷菌剂xqp53、sqp81相较ck处理地径、株高、叶绿素、叶面积、干质量等指标均表现出显著性差异，其中xqp53处理地径、株高、叶面积、干质量均为最大值，分别为6.30mm、90.53cm、108.63cm2、9.13g，相较ck增加130.17％、 122.31％、176.26％、159.06％。
[0057]
在棕黄壤中溶磷菌剂sqp81处理下，叶片全磷与其他处理有显著性差异且为最大值 3.78mg/g。
[0058]
这些结果表明，施用溶磷菌剂xqp53、sqp81和em菌均可以促进玉米的生长，xqp53 在黄棕壤中促生效果更好，sqp81在红壤中促生效果更好，em菌在两种土壤类型中都有一定的促生效果，但相较施用溶磷菌剂效果较差。
[0059]
表1菌剂对红壤、黄棕壤上玉米生长及叶片磷含量的影响
[0060][0061]
2.2施用菌剂对土壤养分的影响
[0062]
由表2可知，施用菌剂后一定程度上提高了土壤的有效养分，降低了土壤全磷、全氮的含量，同种菌剂在不同类型的土壤中具有不同的效果。
[0063]
在红壤中，施用溶磷菌菌剂xqp53、sqp81后，显著提高了土壤中硝态氮、矿质氮、潜
在硝化速率，其中sqp81处理矿质氮、潜在硝化速率最高为18.04mg/kg、76.91μg
·
kg-1
·
d-1
，相较对照提高140.72％、225.41％，虽然菌剂处理一定程度上降低了土壤全磷的含量未有显著差异。
[0064]
在黄棕壤中，施用菌剂一定程度提高了土壤有效养分，其中溶磷菌剂sqp81处理铵态氮含量最高为1.67mg/kg，相较对照提高157.55％，土壤全磷xqp53、sqp81相较对照处理降低了90.9％、81.4％。
[0065]
综上所述，施用三种菌剂在一定程度上提高了土壤的有效养分，活化了植物难以吸收被土壤所固定的养分。
[0066]
表2菌剂对红壤、黄棕壤土壤养分的影响表
[0067][0068]
2.3施用不同菌剂土壤有效磷的动态变化
[0069]
由图1可知，施用溶磷菌剂xqp53、sqp81在红壤和黄棕壤中可以有效提高土壤有效磷含量，且在五次取样中与ck处理均有显著性差异。
[0070]
在红壤中，xqp53处理土壤最大有效磷含量为16.85mg
·
kg-1
，sqp81处理土壤最大有效磷含量为16.83mg
·
kg-1
，相较ck处理的最高有效磷含量增加119.4％、119.3％。
[0071]
在黄棕壤中，施用菌剂xqp53土壤有效磷含量较高，最高为7.70mg
·
kg-1
，em菌处理有效磷含量较低，最低为3.59mg
·
kg-1
。
[0072]
综上所述，溶磷菌剂的施用在两种土壤类型中有一定提高土壤有效磷的能力，em菌在红壤中具有一定的提高土壤有效磷的能力，但在黄棕壤中降低了土壤的有效磷。
[0073]
2.4施用菌剂对红壤、棕黄壤土壤酶活的影响
[0074]
由图2可知，在红壤中施用溶磷菌剂xqp53、sqp81可以提高土壤中的脲酶、过氧化氢酶、中性磷酸酶、酸性磷酸酶，其中溶磷菌剂sqp81提高最多，相较ck处理提高124.3％、 105.3％、124.3、120.9％。
[0075]
在土壤过氧化氢酶中溶磷菌剂xqp53、sqp81与ck处理具有显著性差异，相较ck提高105.3％、105.3％，施用em菌剂虽然在一定程度上增加了土壤酶活，但较xqp53、sqp81 低，与ck处理没有显著性差异。在黄棕壤中，3种菌剂均能在一定程度上提高土壤中的脲酶、过氧化氢酶活性，最高分别为1.31mg
·
(g
·
d)-1
、4.33ml
·
g-1
。中性磷酸酶中xqp53、sqp81、em菌剂较ck处理具有显著性差异，xqp53、sqp81分别提高126.3％、121.1％，em菌剂降低129.5％。
[0076]
溶磷菌剂xqp53、sqp81对土壤酸性磷酸酶有一定程度提高，但未有显著性差异。
[0077]
2.5施用菌剂对红壤、黄棕壤土壤磷素形态含量的影响
[0078]
土壤磷素形态含量不同，活性磷、中活性磷、低活性磷的含量影响着土壤的供磷能力。
[0079]
由表4可知，在红壤中，3种溶磷菌剂的施用有效提高了土壤活性磷、中活性磷、低活性磷。其中sqp81水溶性磷最高为9.34mg/kg，相较ck提高166.7％具有显著性差异，xqp53 处理碳酸氢钠无机磷、氢氧化钠无机磷含量最高，分别是17.59mg/kg、120.7mg/kg，与ck 处理具有显著性差异。
[0080]
在黄棕壤中，xqp53、sqp81处理的水溶性磷、碳酸氢钠无机磷、氢氧化钠有机磷与ck 相比均具有显著性差异，分别提高了128.2％～129.4％、107.9％～122.4％、110.3％～116.0％， em菌的施用一定程度上降低了土壤活性磷和中活性磷的含量，可能与改变溶磷微生物的群落有关。
[0081]
在红壤和黄棕壤中，施用3种菌剂均有效降低了残余态磷，相对于ck残余态磷降低了 3.2％～26.3％。
[0082]
表3菌剂对红壤、黄棕壤土壤磷素形态含量的影响(mg/kg)
[0083][0084]
2.6土壤磷酸酶与各形态磷素的相关系数
[0085]
由表4～表5可知，在红壤和黄棕壤中中性磷酸酶、酸性磷酸酶、100d有效磷、水溶性磷、碳酸氢钠无机磷之间存在正相关关系，而且在黄棕壤中相关性显著(p≤0.05)。在红壤中，100d 有效磷与碳酸氢钠无机磷、氢氧化钠无机磷显著性正相关，可能与有机磷向无机磷转化有关。
[0086]
黄棕壤中氢氧化钠无机磷与中性磷酸酶、酸性磷酸酶、100d有效磷、水溶性磷、碳酸氢钠无机磷之间存在极显著正相关关系(p≤0.01)，残余态磷与各项指标均为负相关关系，未表达出显著关系(p≥0.05)。
[0087]
表4红壤中磷酸酶与各形态磷素的相关系数
[0088][0089]
表5黄棕壤中磷酸酶与各形态磷素的相关系数
[0090][0091]
3讨论与结论
[0092]
3.1施用菌剂对玉米的促生作用
[0093]
本研究表明施用溶磷菌剂对玉米生长有一定的促生作用，施用三种菌剂在一定程度上提高了玉米表型指标，红壤中玉米地径、株高、叶面积相对ck提高120％～123.3％、128.1％～ 158.3％、113.7％～138.7％。
[0094]
黄棕壤中施用溶磷菌剂xqp53、sqp81提高了玉米地径、株高、叶面积，但em菌剂降低了玉米地径、叶绿素含量、叶片全磷含量，同时em菌剂也降低了土壤中有效磷的含量，提高了土壤中氮素的活性。这可能与em菌自身是由多种促生菌组合而成有关，em菌的施用改变了土壤微生物群落中具有溶磷作用菌群对磷素活化的效果。
[0095]
在红壤和黄棕壤中，菌剂处理相对ck玉米干质量分别提高116.8％～136.0％、108.7～ 159.1％，说明三种菌剂均具有促生作用可以提高玉米产量。
[0096]
3.2施用菌剂对土壤养分和速效磷的影响
[0097]
土壤有效磷能够直接被植物吸收利用，是表征土壤养分和磷素有效性的重要指标，影响着植物的生长和生理。
[0098]
在玉米的生长周期中，有效磷的动态变化表明施用溶磷菌xqp53、sqp81可以有效提高土壤中有效磷含量，在红壤中溶磷菌剂xqp53和sqp81处理有效磷含量差异不大，但在黄棕壤中xqp53的有效磷含量远远高于sqp81，说明不同溶磷菌与不同土壤的适配性不同，提高磷素有效性的能力不同，这与前期在溶磷培养基中的xqp53溶磷能力较强是不一致的，所以探究溶磷菌在土壤的适配性更能说明溶磷菌的实际应用价值。
[0099]
在红壤和黄棕壤中有效磷含量随时间变化慢慢降低，可能与土壤中溶磷菌的数量随时间降低有关。
[0100]
溶磷菌是一类具有溶磷作用的微生物，一些溶磷菌属兼具溶磷解钾固氮的能力。
[0101]
本发明中，溶磷菌剂xqp53、sqp81能增加红壤、棕黄壤中铵态氮、硝态氮、矿质氮、潜在硝化速率，相较ck处理分别增加137.8％～157.5％、109.7～140.01％、121.5～140.7％、 177.5％～222.7％。
[0102]
植物对氮磷的吸收常存在一定的协同作用，溶磷菌对土壤氮素、磷素的有效性的增加，能更好的发挥协同作用而促进玉米的生长。
[0103]
3.3施用菌剂对土壤酶活和土壤磷素形态的
[0104]
土壤酶活性是评价土壤微生物生态系统的一项重要指标，土壤酶活性能反映土壤生物活性以及土壤生化反应强度、土壤养分状况。
[0105]
本实施例中em、xqp53、sqp81菌剂在红壤、黄棕壤中均提高了过氧化氢酶、脲酶活性，表明菌剂的添加可以提高土壤微生物群落的活动，加快土壤微生物环境的代谢，增加土壤养分。
[0106]
黄棕壤中施用三种菌剂的中性磷酸酶与ck相比均有显著性差异，xqp53、sqp81增加中性磷酸酶活性，em降低中性磷酸酶活性，这与土壤中有效磷的变化规律是相一致的。 xqp53、sqp81在一定程度上增加了酸性磷酸酶含量，但未表达出显著性差异。
[0107]
在sui的磷分级体系将磷素分为无机态磷和有机态磷两部分，其s中无机磷主要由水溶态磷、矿物态磷和吸附态磷，部分可被植物吸收利用；有机磷主要由磷酸肌醇、磷酯、核酸、磷蛋白、磷酸糖以及微生物生物量磷，可在酶的作用下矿化分解成无机态的磷素。
[0108]
发明人发现在红壤和黄棕壤中性磷酸酶、酸性磷酸酶、100d有效磷、水溶性磷、碳酸氢钠无机磷之间存在正相关关系，而且在黄棕壤中相关性显著(p≤0.05)，说明磷酸酶活
化了土壤磷素，增加了土壤可利用态磷。
[0109]
黄棕壤中残余态磷与其他指标具有负相关关系，说明在有效磷活化过程中，残余态磷向着有效态磷素转化。
[0110]
溶磷菌xqp53、sqp81具有促进红壤、黄棕壤上玉米生长的作用，可以提高玉米的磷含量和生物量；可以活化土壤中氮素、磷素，提高土壤中氮素、磷素的养分；可以提高土壤中酶的活性，加速土壤物质转化，提高土壤养分。
[0111]
以从土壤中筛选的新溶磷菌株xqp53【生物保藏编号cctcc m 2020254,保藏日期 2020.6.30】伯克霍尔德菌(burkholderia)、sqp81克雷伯氏菌【生物保藏编号cctcc m2020253】(klebsiella)为研究对象，采用sui修正后的hedley磷素分级法等方法，探究施菌剂xqp53、sqp81对红壤、黄棕壤上玉米生长、土壤养分、酶活性、磷素形态的影响，揭示了溶磷菌株作为生物菌剂的应用效果。
[0112]
试验结果表明：溶磷菌剂xqp53、sqp81可以提高玉米地径、株高、叶绿素含量，植株干重提高132.0％～159.1％。施用菌剂都可以提高土壤养分，其中溶磷菌剂xqp53、sqp81 相对ck提高土壤有效磷含量108.7％～152.8％，提高土壤中性磷酸酶120.1％～126.4％，均有显著性差异水平。
[0113]
溶磷菌剂xqp53、sqp81提高了土壤中水溶性磷、碳酸氢钠无机磷的含量，减少了土壤中残余态磷含量，促进中活性态、低活性态磷素向活性态磷素转化。
[0114]
综上，菌剂xqp53、sqp81具有促进玉米生长、提高土壤养分、转化磷素的作用，具有植物生产上的应用价值。
[0115]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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