用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒及其使用方法和应用与流程

[0001]
本发明涉及细胞生物学技术领域，是一种用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒及其使用方法和应用。


背景技术：

[0002]
缺血性心脏疾病——心脏肌肉供血不足——是世界的首要死亡原因，包括大多数低收入和中等收入国家。对于缺血性心脏病，现今的治疗策略包括恢复心脏再灌注和药物改善慢性疾病症状，而干细胞和祖细胞的发现对治疗缺血性心脏病已经变革了实验研究并引领了对临床研究的探索。近来脂肪源干细胞成为其热点之一，许多研究者均证明了脂肪源干细胞有多向分化的潜能，经诱导可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞以及心肌细胞等，然而，由于研究者采用不同物种的脂肪组织提取脂肪干细胞并且消化脂肪方式方法不尽相同，在细胞产量、质量，消化时间等方面存在较大差异，如katja schenke-layland，采用的是celase 1消化大鼠脂肪组织，消化时间为45分钟至60分钟；so-jung gwak 采用的是
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型collagenase消化大鼠脂肪组织，时间为60分钟；won-serk kim 采用的是ⅱ型collagenase，消化人类脂肪组织，消化时间为60分钟；zhang duan-zhen等采用的是trypsin和collagenase混合消化新西兰兔脂肪组织，而christian valina 采用的是
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型collagenase消化猪的脂肪组织，消化时间为2小时。国内学者屈长清对此也有更详尽的归纳总结。
[0003]
由于物种不同，脂肪组织的致密程度也不尽相同，因此，消化方法及消化酶的选择多种多样，消化时间也是不尽相同；目前市售各种消化酶价格均在3000元至8000元人民币之间，造价相对较高。鉴于以上原因，寻找一种相对稳定的酶消化方法、统一消化时间以及如何节约成本成为众多基础医学研究者探寻的内容之一。


技术实现要素：

[0004]
本发明提供了一种用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒及其使用方法和应用，克服了上述现有技术之不足，提供一种可用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒，其能有效解决现有试剂盒只能分离一种脂肪干细胞的问题。
[0005]
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒，包括脂肪组织软化液、胶原酶液、分散酶液、胰蛋白酶液，细胞消化保养液和酶中和液。
[0006]
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：上述脂肪组织软化液为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢钠及乙二胺四乙酸二钠、青霉素及链霉素组成的混合溶液，混合溶液的ph值为7至8。
[0007]
上述胰蛋白酶液是指由胰蛋白酶、青霉素及链霉素组成的混合溶液。
[0008]
上述细胞消化保养液为无水氯化钙、硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、丁二酸丁二酸钠、l-盐酸精氨酸、l-盐酸胱氨酸、甘氨酸及l-异亮氨酸组成的混合溶液。
[0009]
上述酶中和液为含体积浓度为10%的胎牛血清的细胞培养液。
[0010]
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒的使用方法，按照下述步骤进行：第一步，将所需量离体的脂肪组织置于脂肪组织软化液中8分钟至15分钟，使得脂肪组织充分软化；第二步，软化后的脂肪组织剪碎成碎块，与所需量的胶原酶液、分散酶液、胰蛋白酶、细胞消化保养液混合后得到的第一混合溶液，置于37℃孵箱中30分钟至40分钟，并使用吸管间隔的吹打第一混合溶液；第三步，将吹打后的第一混合溶液与所需量的酶中和液均匀混合中和消化酶活性后，过滤得到滤液，将滤液离心除去上清液，得到沉淀物；第四步，将所得沉淀物置于干细胞培养液中培养，得到多物种脂肪干细胞。
[0011]
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：上述第二步中，吸管每间隔10分钟吹打第一混合溶液一次。
[0012]
上述第三步中，过滤时使用200目筛网。
[0013]
上述第三步中，离心时滤液离心速率为800g/8分钟。
[0014]
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒在制备治疗缺血性心脏病的脂肪干细胞中的应用。
[0015]
本发明可以应用于不同物种脂肪组织提取相对较稳定的脂肪干细胞，用于制备治疗缺血性心脏病的脂肪干细胞。本发明使用方法简单，易于推广，造价相对低廉，可以工业化生产。
附图说明
[0016]
附图1为本发明中大鼠脂肪干细胞sem图。
[0017]
附图2为本发明中家猪脂肪干细胞sem图。
[0018]
附图3为本发明中新西兰兔脂肪干细胞sem图。
[0019]
附图4为本发明中人脂肪干细胞sem图。
具体实施方式
[0020]
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。
[0021]
下面结合实施例对本发明作进一步描述：实施例1：该用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒，包括脂肪组织软化液、胶原酶液、分散酶液、胰蛋白酶液，细胞消化保养液和酶中和液。
[0022]
本发明用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒还包括现有公知技术中用于盛放用于分离多物种脂肪干细胞的盒子。
[0023]
本发明用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒，通过同一种消化方式消化不同物种脂肪组织，从而获取不同物种脂肪干细胞技术；本发明能够较为稳定的分离不同物种的脂肪干细胞，所分离的脂肪干细胞状态稳定，扩增效果较为理想。
[0024]
本发明用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒可工业化生产，以实现同一种消化方式消化不同物种脂肪组织，获取脂肪干细胞技术的推广，以便运用与医学基础研究领域、细胞移植和再生医学领域及组织工程领域。
[0025]
实施例2：作为上述实施例的优化，脂肪组织软化液为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢钠及乙二胺四乙酸二钠、青霉素及链霉素组成的混合溶液，混合溶液的ph值为7至8。
[0026]
本发明中，将氯化钠0.804g，氯化钾0.02g,磷酸二氢钾0.02g，磷酸氢钠0.156g，乙二胺四乙酸二钠0.04g, 青霉素10000u，链霉素1mg，溶于10ml超纯水中得到脂肪组织软化液。
[0027]
实施例3：作为上述实施例的优化，胰蛋白酶液是指由胰蛋白酶、青霉素及链霉素组成的混合溶液。
[0028]
实施例4：作为上述实施例的优化，细胞消化保养液为无水氯化钙、硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、丁二酸丁二酸钠、l-盐酸精氨酸、l-盐酸胱氨酸、甘氨酸及l-异亮氨酸组成的混合溶液。
[0029]
实施例5：作为上述实施例的优化，酶中和液为含体积浓度为10%的胎牛血清的细胞培养液。
[0030]
本发明中，胶原酶液和分散酶液分别为现有公知商售质量浓度为1%的胶原酶和分散酶。
[0031]
实施例6：该用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒的使用方法，按照下述步骤进行：第一步，将所需量离体的脂肪组织置于脂肪组织软化液中8分钟至15分钟，使得脂肪组织充分软化；第二步，软化后的脂肪组织剪碎成碎块，与所需量的胶原酶液、分散酶液、胰蛋白酶、细胞消化保养液混合后得到的第一混合溶液，置于37℃孵箱中30分钟至40分钟，并使用吸管间隔的吹打第一混合溶液；第三步，将吹打后的第一混合溶液与所需量的酶中和液均匀混合中和消化酶活性后，过滤得到滤液，将滤液离心除去上清液，得到沉淀物；第四步，将所得沉淀物置于干细胞培养液中培养，得到多物种脂肪干细胞。
[0032]
本发明中，干细胞培养液为为现有公知商售的常规含胎牛血清的细胞培养液。
[0033]
实施例7：作为上述实施例的优化，第二步中，吸管每间隔10分钟吹打第一混合溶液一次。
[0034]
实施例8：作为上述实施例的优化，第三步中，过滤时使用200目筛网。
[0035]
实施例9：作为上述实施例的优化，第三步中，离心时滤液离心速率为800g/8分钟。
[0036]
实施例10：该用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒在制备治疗缺血性心脏病的脂肪干细胞中的应用。
[0037]
实施例11：该用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒的使用方法，按照下述步骤进行：第一步，将1g大鼠脂肪组织置于脂肪组织软化液中10分钟，使得脂肪组织充分软化；第二步，软化后的脂肪组织剪碎成1mm3的碎块，与2ml胶原酶液、2ml分散酶液、1ml胰蛋白酶、7.5ml细胞消化保养液混合后得到的第一混合溶液，置于37℃孵箱中30分钟，并使用吸管每隔10分钟吹打第一混合溶液一次；第三步，将第一混合溶液与5ml酶中和液均匀混合中和消化酶活性后，使用200目筛网过滤得到滤液，将滤液以800g/8分钟的速率离心除去上清液，得到沉淀物；第四步，将所得沉淀物置于干细胞培养液中培养，得到大鼠脂肪干细胞。
[0038]
实施例12：该用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒的使用方法，按照下述步骤进行：第一步，将1g家猪脂肪组织置于脂肪组织软化液中8分钟，使得脂肪组织充分软化；第二步，软化后的脂肪组织剪碎成1mm3的碎块，与1ml胶原酶液、1ml分散酶液、0.5ml胰蛋白酶、5ml细胞消化保养液混合后得到的第一混合溶液，置于37℃孵箱中40分钟，并使用吸管每隔10分钟吹打第一混合溶液一次；第三步，将第一混合溶液与5ml酶中和液均匀混合中和消化酶活性后，使用200目筛网过滤得到滤液，将滤液以800g/8分钟的速率离心除去上清液，得到沉淀物；第四步，将所得沉淀物置于干细胞培养液中培养，得到家猪脂肪干细胞。
[0039]
实施例13：该用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒的使用方法，按照下述步骤进行：第一步，将1g新西兰兔脂肪组织置于脂肪组织软化液中8分钟，使得脂肪组织充分软化；第二步，软化后的脂肪组织剪碎成1mm3的碎块，与1ml胶原酶液、1ml分散酶液、0.5ml胰蛋白酶、5ml细胞消化保养液混合后得到的第一混合溶液，置于37℃孵箱中40分钟，并使用吸管每隔10分钟吹打第一混合溶液一次；第三步，将第一混合溶液与5ml酶中和液均匀混合中和消化酶活性后，使用200目筛网过滤得到滤液，将滤液以800g/8分钟的速率离心除去上清液，得到沉淀物；第四步，将所得沉淀物置于干细胞培养液中培养，得到新西兰兔脂肪干细胞。
[0040]
实施例14：该用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒的使用方法，按照下述步骤进行：第一步，将1g人脂肪组织置于脂肪组织软化液中10分钟，使得脂肪组织充分软化；第二步，软化后的脂肪组织剪碎成1mm3的碎块，与2ml胶原酶液、2ml分散酶液、1ml胰蛋白酶、7.5ml细胞消化保养液混合后得到的第一混合溶液，置于37℃孵箱中30分钟，并使用吸管每隔10分钟吹打第一混合溶液一次；第三步，将第一混合溶液与5ml酶中和液均匀混合中和消化酶活性后，使用200目筛网过滤得到滤液，将滤液以800g/8分钟的速率离心除去上清液，得到沉淀物；第四步，将所得沉淀物置于干细胞培养液中培养，得到人脂肪干细胞。
[0041]
本发明中根据实施例11得到的大鼠脂肪干细胞如图1所示，根据实施例12得到的家猪脂肪干细胞如图2所示，根据实施例13得到的新西兰兔脂肪干细胞如图3所示，根据实施例14得到的人脂肪干细胞如图4所示。通过图1、图2、图3和图4可以看出，本发明用于分离多物种脂肪干细胞的试剂盒，可以稳定的分离出不同物种脂肪肝细胞，且所分离得到的大鼠脂肪干细胞、家猪脂肪干细胞、新西兰兔脂肪干细胞和人脂肪干细胞状态稳定，扩增效果好。
[0042]
综上所述，本发明可以应用于不同物种脂肪组织提取相对较稳定的脂肪干细胞，用于制备治疗缺血性心脏病的脂肪干细胞。本发明使用方法简单，易于推广，造价相对低廉，可以工业化生产。
[0043]
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

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