一种在大肠杆菌中发酵生产酯酶的方法与流程

[0001]
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种在大肠杆菌中发酵生产酯酶的方法。


背景技术：

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脂肪酶已有一百多年的研究史，成为研究最为透彻的酶类之一，它不仅能够能催化水解反应和酯化反应，还能催化酯交换反应、醇解反应、酯转化反应、酸解反应以及氨解反应等，因此被广泛应用于工业领域。但是目前工业化生产中酯酶的生产工艺优化程度不高，其产物的产量交底并且稳定性较差。
[0003]
因此本领域内技术人员不断地对发酵制备酯酶的工艺进行优化，以改善其产量及稳定性。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种在大肠杆菌中发酵生产酯酶的方法，提高酯酶的稳定性和表达量。
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为实现上述目的，本发明提供了一种在大肠杆菌中发酵生产酯酶的方法，所述方法包括如下步骤：
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步骤1、将携带酯酶基因片段的大肠杆菌种子液加入一号培养液中进行发酵处理，得到发酵液一；
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步骤2、当发酵液一的溶氧低于20％时，向发酵液一中补入二号培养液并调节发酵液一的ph到6.9-7.1，继续培养获得发酵液二；
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步骤3、当步骤2中的发酵液二的od600＞30时，向发酵液二中加入诱导剂，并控制温度为24-26℃，继续发酵10-18h，得到酯酶；
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进一步地，酯酶为肌氨酸氧化酶。
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进一步地，大肠杆菌种子液以1％-2％的比例接种。
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进一步地，步骤1中，一号培养液中包括1.5％-2.5％酵母抽提粉，0.5％-1％nacl，0.5％-1％葡萄糖，0.15％-0.25％kh2po4，0.3％-0.4％k2hpo4，0.05％-0.1％mgso4，0.5-1％(nh4)2so4，0.01-0.05％硫胺素。
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进一步地，一号培养液的ph为6.9-7.1。
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进一步地，步骤1中，大肠杆菌的培养条件为转速100-120rpm，通气量0.5-1.0vvm，温度37℃，罐压0.03-0.07mpa。
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进一步地，步骤2中，二号培养液包括30-50％葡萄糖，0.4％-0.8％znso4，0.3％-0.5％cacl2，0.1％-0.3％cocl2，1％-3％mgso4。
[0015]
进一步地，步骤2中，培养条件为转速400rpm，通气量2.0vvm。
[0016]
进一步地，步骤2中，通过向发酵液一加入碱液调节所述发酵液的ph。
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进一步地，步骤3中，诱导剂为异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷。
[0018]
进一步地，基于每升发酵液二，异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷的添加量为0.5-1mm。
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本发明提供了一种在大肠杆菌中发酵生产酯酶的方法，通过在发酵液中补入培养液以及控制发酵液的ph等技术手段，有效提高了单位od产肌氨酸氧化酶的水平，使得肌氨酸氧化酶的比活力和稳定性得到了明显的提升，无效蛋白比例大大减少。
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以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
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图1为本发明一实施例在大肠杆菌中发酵生产酯酶的方法流程图。
具体实施方式
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以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
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实施例1
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本实施例提供的发酵生产酯酶的方法，包括如下步骤：
[0025]
步骤1：将种子罐中含有酯酶基因片段的大肠杆菌种子液以1％-2％的比例接种于灭过菌的发酵罐中进行通气搅拌培养，培养条件为转速100rpm，通气量0.5vvm，温度37℃，罐压0.03mpa；
[0026]
培养液(2.5l)包括：酵母抽提粉1.5％，nacl 0.5％，葡萄糖0.5％，kh2po
4 0.15％，k2hpo
4 0.3％，mgso
4 0.05％，(nh4)2so
4 0.5％，硫胺素0.01％，ph 6.8-7.0。
[0027]
步骤2：当溶氧低于20％后，逐步提高转速至400rpm，通气量至2.0vvm，控制ph 7.0-7.1，并补入培养液，培养液包括：葡萄糖30-50％，znso
4 0.4％-0.8％，cacl
2 0.3％-0.5％，cocl
2 0.1％-0.3％，mgso
4 1％-3％，ph 5.0-5.2；
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调节ph通过在发酵液中加入碱液，碱液的制备方法为：向装有1l无菌水的2l补碱瓶中加入1l氨水，混匀待用。
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步骤3：发酵od600至30以上时，加入诱导剂，诱导剂为0.5mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，基于每升所述发酵液，异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷的添加量为0.5-1mm，将发酵罐温度控制为25-27℃，并继续培养10-16h，离心收菌后取1g菌泥用10mm ph 7.5的tris-hcl buffer 10ml进行重悬，然后用超声细胞破碎仪破碎10min，功率40％，超2s停2s，sds-page检测发酵诱导前后和破碎的酶液样品，发现诱导后和破碎后的样品在36kda处有明显的蛋白条带，而未诱导的样品在此处无条带，证明诱导后有酯酶目的蛋白生成；同时破碎后的样品以不同链长的对硝基苯基酯为反应底物，通过紫外分光光度计测反应后底物浓度随时间的变化所发生的改变，溶液在405nm处的吸光值变化来计算酶活。因此，我们通过uv-2550紫外可见光分光光度计(岛津)监测单个酶促反应体系在405nm波长处紫外吸收变化量，来评估estwy酶的活性变化，在此单位活性被定义为每分钟水解底物1μmol生成对硝基苯酚(胺)所需要的酶量。酶反应体系为：体系：1ml；960ul pbs，20ul对硝基苯辛酸酯底物，20ul酶液)缓冲条件：ph＝7.4。
[0030]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

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