一种用于防治桃红颈天牛的球孢白僵菌及其应用的制作方法

[0001]
本发明涉及一种对桃红颈天牛有杀虫活性的球孢白僵菌菌株，其对桃红颈天牛成虫和幼虫均有较好的杀虫活性。


背景技术：

[0002]
桃红颈天牛(aromia bungii faldermann)又称铁炮虫，是桃、杏、李等果树的主要蛀干害虫。其幼虫为害树木的韧皮部和木质部，为害部位隐蔽，防治困难。危害轻则截干，严重时可造成全树死亡甚至毁园。由于桃红颈天牛幼虫危害部位隐蔽，且生活周期较长，世代重叠严重，因此防控和治理起来比较困难。随着桃树种植面积的快速增长和传播途径的多样化，桃红颈天牛危害面积不断扩大。如果不及时对桃红颈天牛进行发生危害调查防治，会造成因盲目用药导致人工成本增加、药剂残留、杀伤天敌等问题。
[0003]
目前，生产上防治桃红颈天牛的方法主要是化学防治，此外也有刮皮钩杀幼虫、树干涂白、化学药剂堵杀虫道幼虫等措施。但这几种方法分别存在用工量大、刮除树皮造成树体损伤从而易引起病菌入侵、成本较高和容易产生药害的问题，因此为解决桃红颈天牛危害严重及传统防治中耗费人工、污染环境等问题。生物防治由于具有专一性强、对人畜无害、不易产生抗药性以及无环境污染等优点，日益受到人们的青睐。因此，筛选对桃红颈天牛有高致病性的生防微生物是防治桃红颈天牛的一种有效途径。


技术实现要素：

[0004]
本发明之一提供了一种球孢白僵菌(beauveria bassiana)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.20250。
[0005]
本发明之二提供了一种对本发明之一所述的球孢白僵菌进行遗传改良后得到的工程菌。
[0006]
在一个具体实施方式中，所述工程菌通过向如本发明之一所述的球孢白僵菌转入功能基因得到。
[0007]
在一个具体实施方式中，所述功能基因为用于防治为害植物害虫的基因、用于防治为害植物病原微生物的基因和增强所述球孢白僵菌防治桃红颈天牛效果的基因中的至少一种。
[0008]
本发明之三提供了一种组合物，所述组合物包含如本发明之一所述的球孢白僵菌或如本发明之二中任意一项所述的工程菌。
[0009]
在一个具体实施方式中，所述组合物的剂型为悬浮剂、油悬剂、粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂中的至少一种。
[0010]
本发明之四提供如本发明之一所述的球孢白僵菌、如本发明之二中任意一项所述的工程菌和如本发明之三所述的组合物中的至少一种在用于防治桃红颈天牛中的应用。
[0011]
在一个具体实施方式中，所述桃红颈天牛为幼虫和/或成虫。
[0012]
本发明的有益效果：
[0013]
本发明从田间采集到的感病桃红颈天牛体表分离纯化到42株白僵菌，经室内生物活性测定发现，其中spt35菌株对桃红颈天牛成虫和幼虫均有较高的杀虫活性，经分子生物学鉴定为球孢白僵菌。本发明中的球孢白僵菌spt35单独使用对桃红颈天牛成虫和幼虫均具有较高的杀虫活性。
附图说明
[0014]
图1为中sday固体培养基上于28℃培养的spt35菌株。
[0015]
图2为spt35侵染的桃红颈天牛3龄幼虫。
[0016]
图3为spt35侵染的桃红颈天牛成虫。
[0017]
菌株保藏
[0018]
本发明筛选的微生物spt35菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.20250，保藏日期为2020年08月27日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为球孢白僵菌(beauveria bassiana)。
具体实施方式
[0019]
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
[0020]
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
[0021]
实施例1：对桃红颈天牛幼虫有杀虫活性菌种的筛选
[0022]
在河北顺平桃园进行桃红颈天牛田间为害调查时，获得自然感病僵虫；带回室内通过sday固体培养基(配方：蛋白胨10g，酵母10g，葡萄糖40g，琼脂15g，蒸馏水1l，自然ph)28℃培养分离纯化得到共计42株初始菌株，对各初始菌株依次进行编号为spt1至spt42。
[0023]
通过对初始菌株的菌落形态、孢子形态(在sday培养基上，菌落初期白色绒状，后变为白色絮状，背面无色，培养10d左右开始产生分生孢子，产孢细胞单生，产孢时乳白色，分生孢子呈亚圆形，直径1.8-3.2
×
l.4-2.7μm)观察，初步确定所筛选到的42株初始菌株属于球孢白僵菌。
[0024]
实施例2：初始菌株孢子的制备
[0025]
将实施例1中的42株初始菌株分别在sday固体培养基上28℃恒温培养至产孢，刮取孢子，采用血球计数法，用0.02％(v/v)吐温-80水悬液将孢子配制成1
×
109孢子/ml母液。
[0026]
实施例3：初始菌株对桃红颈天牛幼虫的杀虫活性
[0027]
按照实施例2的方法制备的各菌株的孢子采用梯度稀释法分别配制成1
×
107孢子/ml的浓度。以0.02％(v/v)吐温-80水悬液处理作为空白对照(ck)。
[0028]
将健康和大小均一致的2龄桃红颈天牛幼虫试虫分别置于不同菌株的孢子悬浮液中5s，用滤纸吸干多余水分。单头置于指形管中，指形管中放新鲜桃叶，叶柄用脱脂棉加无菌水保湿，27℃饲养，光周期12l：12d，每天更换补充新鲜桃叶。每处理20头幼虫，3次重复。在第7d、10d和14d检查死活虫数，计算校正死亡率，其中死亡率和校正死亡率的计算公式如下：
[0029]
死亡率％＝各处理死亡虫数/供试总虫数
×
100％
[0030]
校正死亡率％＝(处理死亡率-空白对照死亡率)/(1-空白对照死亡率)
×
100％
[0031]
结果见表1。
[0032]
表1 42株初始菌株对桃红颈天牛幼虫的杀虫活性
[0033]
[0034][0035]
从表1可知，在被测的42株菌株中，spt35菌株对桃红颈天牛幼虫杀虫活性最高，7天校正死亡率达到100％，其他菌株对天牛幼虫杀虫活性均较低，7天校正死亡率均在50％以下，不具有应用前景。
[0036]
实施例4：初始菌株对桃红颈天牛成虫的杀虫活性
[0037]
按照实施例2方法制备的各菌株的孢子采用梯度稀释法分别配制成1.00
×
108孢子/ml的浓度。以0.02％(v/v)吐温-80水悬液处理作为空白对照(ck)。
[0038]
将塑料盒(10cm
×
15cm)用次氯酸钠100倍液浸泡1h，用无菌水清洗干净，晾干后放入新鲜桃叶作为成虫的饲料。挑取健康活泼的桃红颈天牛成虫，将不同菌株的孢子悬液500微升喷洒试虫体表，并用滤纸吸去多于水分，置于26
±
1℃、光周期12l：12d条件下饲养，每天更换补充新鲜桃叶。每处理10头试虫，设5次重复，施药后在第7d、10d和14d定期调查死亡虫数，计算校正死亡率。其中死亡率和校正死亡率的计算公式同实施例3。结果见表2。
[0039]
表2 42株初始菌株对桃红颈天牛成虫的杀虫活性
[0040]
[0041][0042]
从表2可以看出，spt35对桃红颈天牛成虫杀虫活性最强，14d对天牛成虫校正死亡率达100％，而其他菌株对桃红颈天牛的成虫14d校正死亡率均低于50％，杀虫活性普遍较弱。
[0043]
结合实施例3表1的数据可知，spt3、spt26、spt34、spt36、spt39、spt41菌株对桃红颈天牛幼虫14d校正死亡率达到70％以上，但一方面它们对幼虫的7天校正死亡率均在50％以下，不具有在幼虫应用方面的前景；另一方面对成虫14d的杀虫活性最高仅为50％，因而在成虫应用方面也不具有前景。
[0044]
基于实施例3和实施例4的数据可知这些球孢白僵菌初始菌株对桃红颈天牛成虫和幼虫的杀虫活性并不一致。
[0045]
实施例5：纯化复壮spt35菌株
[0046]
将对桃红颈天牛成虫和幼虫的杀虫活性均最佳的spt35的初始菌株重新接种桃红颈天牛的幼虫(在实践中，成虫也可以)，通过对再次感病的桃红颈天牛幼虫上的病原菌进行纯化复壮培养获得纯化的spt35菌株。
[0047]
实施例6：spt35菌株孢子的制备
[0048]
在sday固体培养基上28℃恒温培养纯化复壮的spt35菌株至产孢，刮取孢子，采用血球计数法，用0.02％(v/v)吐温-80水悬液将孢子配制成1
×
109孢子/ml母液。
[0049]
实施例7：spt35菌株对桃红颈天牛幼虫的杀虫活性
[0050]
按照实施例6的方法制备的spt35菌株的孢子采用梯度稀释法分别配制成1
×
104孢子/ml、1
×
105孢子/ml、1
×
106孢子/ml、1
×
107孢子/ml、1
×
108孢子/ml、1
×
109孢子/ml6个浓度。以0.02％(v/v)吐温-80水悬液处理作为空白对照。
[0051]
将健康和大小均一致的1龄、2龄和3龄桃红颈天牛幼虫试虫分别置于上述6个不同浓度的spt35孢子悬浮液中5s，用滤纸吸干多余水分。单头置于指形管中，指形管中放新鲜桃叶，叶柄用脱脂棉加无菌水保湿，27℃饲养、光周期12l：12d、每天更换补充新鲜桃叶。每处理20头幼虫，3次重复，5d检查死虫和活虫数，死亡率和校正死亡率的计算公式同实施例3。采用spss10.0计算lc
50
，结果见表3。
[0052]
根据表3可知，spt35菌株对1龄幼虫的lc
50
为4.60
×
105孢子/ml，对2龄幼虫的lc
50
为3.49
×
106孢子/ml，对3龄幼虫的lc
50
为2.52
×
107孢子/ml。
[0053]
表3 spt35菌株对不同龄期桃红颈天牛幼虫的杀虫活性
[0054][0055]
实施例8：spt35菌株对桃红颈天牛成虫的杀虫活性
[0056]
按照实施例6的方法制备的spt35菌株的孢子采用梯度稀释法分别配制成1
×
109、1.25
×
108和3.13
×
107孢子/ml 3个浓度。以0.02％(v/v)吐温-80水悬液处理作为空白对照。
[0057]
将塑料盒(10cm
×
15cm)用次氯酸钠100倍液浸泡1h，用无菌水清洗干净，晾干后放入新鲜桃叶作为成虫的饲料。挑取健康活泼的桃红颈天牛成虫，将上述不同浓度的spt35孢悬液500微升喷洒试虫体表，并用滤纸吸去多于水分，以0.02％(v/v)吐温-80水悬液处理作为对照，置于26
±
1℃、光周期12l：12d条件下饲养，每天更换补充新鲜桃叶。每处理10头试虫，设5次重复，施药后在第7d、10d和14d定期调查死亡虫数，计算校正死亡率。其中死亡率和校正死亡率的计算公式同实施例3。
[0058]
结果见表4。
[0059]
从表4可以看出，spt35菌株对桃红颈天牛成虫具有较高杀虫活性，侵染时间短，1
×
109孢子/ml浓度下，侵染第10d，成虫的累计死亡率即达到90％以上；1
×
108孢子/ml浓度下，侵染第14d，成虫的累计死亡率即达到100％。
[0060]
表4 spt35菌株对桃红颈天牛成虫的杀虫活性
[0061][0062]
实施例9：spt35菌株在分子水平上的分类鉴定
[0063]
在铺有灭菌玻璃纸的sday培养基上刮取spt35菌丝体放入研钵中，加液氮后研磨成粉末，转移到10ml的离心管中，加入1ml的dna抽提液(0.1g/ml，抽提液配方：ph7.5tris-hcl0.2mol/l，nacl 0.5mol/l，sds 1％)，漩涡振荡混匀，加入200μltris饱和酚，65℃水浴30min，其中每隔5-10min混匀一次；变凉之后，加入1ml体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇，轻摇混匀，12000r/min，4℃离心5min；重复一次上面步骤；将上清液转移到一新离心管，向该离心管中加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放30min，12000r/min离心10min收集沉淀，75％酒精冲洗，超净台吹风干燥，加入适量的te溶解沉淀即得到dna。加入3μl的rna酶，37℃水浴1h；加500ml ddh2o，加入400μl氯仿/异戊醇(24:1)，12000r/min离心10min，取上清，重复两次。重复上面的步骤，沉淀dna，溶于30μl te中，-20℃保存以备用做真菌its区pcr扩增
的dna模板。
[0064]
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成真菌its区通用引物its1(seq id no.1)/its4(seq id no.2)。pcr扩增的20μl反应体系包括：1μl dna模板，5μl10
×
pcr buffer，0.2μl taqdna聚合酶(5u/l)，0.5μl10mmol/ml dntp，0.5μl10mmol/ml its-1，0.5μl10mmol/l its-4，纯水补至20μl。pcr反应条件：95℃ 5min，95℃ 45s，55℃45s，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸5min。pcr产物2μl，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。将pcr回收产物送至金唯智生物科技有限公司测序部进行测序，得到如seq id no.3所示的its的核苷酸序列，将其与genebank数据库中的核苷酸序列进行同源性blast比对。结果表明，与该菌株its最为接近的为球孢白僵菌菌株，两者its序列的相似性为100％。
[0065]
结合spt35菌株的形态学特点，最终将该菌株鉴定为球孢白僵菌。因此，其系统分类为球孢白僵菌(beauveria bassiana)。该菌株已于2020年8月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为20250，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0066]
实施例10：jcf、lu71和spt35白僵菌菌株对桃红颈天牛杀虫活性的比较
[0067]
白僵菌jcf菌株(zl201610075756.1)已知对地下害虫华北大黑鳃金龟成虫和幼虫具有较高活性；白僵菌lu71菌株(zl201410244148.x)已知对韭蛆幼虫具有较好杀虫活性。
[0068]
将jcf、lu71和spt35三株白僵菌菌株按照实施例6的方法制备孢子，然后均定量为1
×
107孢子/ml浓度测定对桃红颈天牛成虫和2龄幼虫的杀虫活性，测定方法参考实施例3和实施例4。结果见表5和表6。
[0069]
从测定结果可以看出，jcf、lu71两株白僵菌对桃红颈天牛成虫和幼虫杀虫活性均比较低，由此可见白僵菌对靶标害虫的杀虫活性具有专一性较强的特点。虽然地下害虫金龟子与桃红颈天牛均属于鞘翅目害虫，但杀虫活性却不一致，可见即便对同目不同科属的昆虫，不同的白僵菌菌株的杀虫活性也不一致。
[0070]
表5不同白僵菌菌株对桃红颈天牛成虫的杀虫活性
[0071][0072]
表6不同白僵菌菌株对桃红颈天牛幼虫的杀虫活性
[0073]

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