基于piggyBac转座子系统制备稳定表达BE4蛋白的猪肾上皮细胞系的方法与流程

基于piggybac转座子系统制备稳定表达be4蛋白的猪肾上皮细胞系的方法
技术领域
[0001]
本发明属于基因工程和细胞工程领域，具体地说，涉及一种基于piggybac转座子系统制备稳定表达be4蛋白的猪肾上皮细胞系的方法。


背景技术：

[0002]
crispr/cas9系统作为近年来最火热的基因编辑技术广被泛应用于人类基础医学研究、动植物生命科学等领域。然而针对单个碱基突变的基因的修正，crispr/cas9系统因其在细胞内的低同源重组效率，被应用得并不广泛。由于dna双链断裂时，细胞更倾向于利用非同源末端修原理对目的dna进行修复,因而利用同源重组进行的单个碱基的替换过程十分低效。david r.liu及其科研团队于2016年报道了一种新型的基因编辑工具，即单碱基编辑(base editing,be)技术。单碱基编辑系统的出现成功实现了高效且安全的单个碱基的替换编辑，而且无需双链dna断裂或者修复模板。david r.liu团队设计了催化失活型cas9蛋白和胞苷脱氨酶的融合蛋白，使得cas酶保留了可被单链rna引导编辑的能力，但不会导致双链dna断裂，并介导胞苷直接转化为尿苷，从而实现胞嘧啶(cytosine,c)到胸腺嘧啶(thymidine,t)的转换。单碱基编辑技术从被报道至今，已经发展到第四代(be4)，相比于传统的crispr/cas9技术，提升了对基因组点突变进行编辑的效率以及范围，同时降低了脱靶率，是一种新型的、安全的、可被广泛利用的新一代基因编辑技术。
[0003]
由于be4融合蛋白编码基因比较大，进行相关基因编辑时会因为质粒偏大而导致转染效率较低，影响基因编辑的效率，使得构建基因编辑细胞系/基因编辑模式动物的阳性率非常低。同时，将靶向所需编辑碱基的sgrna导入稳定表达be4蛋白的细胞系中，可以获得编辑该碱基(或多个碱基)的细胞，为研究该碱基(或多个碱基)功能提供了新的手段。最后，构建稳定表达be4蛋白的细胞系，可为高通量构建单碱基饱和突变文库提供良好的实验基础，对解析复杂的细胞或个体生命进程具有重要意义。


技术实现要素：

[0004]
为解决上述问题，本发明提供了一种能稳定表达be4融合蛋白的猪肾上皮细胞系(pk-15-be4)的制备方法，该方法能通过piggybac转座子系统构建稳定表达be4蛋白的猪肾上皮细胞系。
[0005]
本发明采用了以下技术方案：
[0006]
一种稳定表达be4蛋白的猪肾上皮细胞系的制备方法，包括以下步骤：
[0007]
将piggybac转座子载体和转座酶表达载体共转染猪肾上皮细胞pk-15，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞群，然后挑选单克隆细胞系，并通过扩增be4的特征片段以及转染活性sgrna验证编辑活性，从而得到稳定表达be4蛋白的猪肾上皮细胞系。
[0008]
进一步地，所述的piggybac转座子载体的序列如seq id no.1所示，包括be4融合蛋白序列、抗生素筛选标记基因(嘌呤霉素抗性基因)、5
’
tr以及3
’
tr同源序列等元件。
[0009]
进一步地，所述的转座酶表达载体的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0010]
进一步地，用于扩增be4的特征片段的引物序列如seq id no.4和5所示。
[0011]
进一步地，转染的活性sgrna序列如seq id no.6、seq id no.7或seq id no.8所示(任选一条)。
[0012]
在本发明的具体实施例，基于piggybac转座子系统制备稳定表达be4蛋白的猪肾上皮细胞系的方法具体如下：
[0013]
(1)构建piggybac转座子和转座酶表达载体
[0014]
按照序列seq id no.1和2分别构建piggybac转座子载体(pb-be4max)和转座酶表达载体。质粒经阳性转化至大肠杆菌，经扩大培养，再经去内毒素提取得到实验所需质粒；
[0015]
(2)pb-be4max载体和转座酶表达载体质粒共转染pk-15细胞
[0016]
构建好pb-be4max载体和转座酶表达载体质粒后，培养pk-15细胞至融合度为70％-80％，共转染pb-be4max载体和转座酶表达载体质粒，转染6h后换成新鲜的培养基，继续在37℃，5％co2恒温细胞培养箱中培养；
[0017]
(3)嘌呤霉素筛选阳性细胞群
[0018]
转染好的细胞培养48h后，更换培养基为2μg/ml的嘌呤霉素的新鲜培养基，继续在37℃，5％co2恒温细胞培养箱中培养2-3天，收集剩余存活细胞即为阳性细胞群，备用；
[0019]
(4)单克隆细胞系的阳性鉴定及be4蛋白活性鉴定
[0020]
用培养基将(3)所述阳性细胞群的细胞稀释成7-8个细胞/ml，再铺板至10cm皿中，培养8-10天；待单细胞长成单个细胞团后，使用克隆环将阳性细胞团挑出，继续扩大培养。收集各个单克隆细胞系的细胞，提取其基因组dna，通过pcr扩增be4载体关键序列筛选阳性的单克隆细胞系，所用引物序列如seq id no.4和5所示，目的条带大小约为500bp；进一步转染活性sgrna验证be4蛋白编辑活性后，sgrna序列如seq id no.6、seq id no.7或seq id no.8所示(任选一条)，即得到稳定表达be4蛋白的猪肾上皮细胞系。
[0021]
本发明公开的稳定表达be4蛋白的猪肾上皮细胞系pk-15-be4，可以用于和sgrna结合构建特异碱基或多个碱基编辑的基因组编辑细胞系，用于研究被编辑碱基的细胞生物学功能。构建的稳定表达be4蛋白的细胞系，可为高通量构建单碱基饱和突变文库提供良好的实验基础，对解析复杂的细胞或个体生命进程具有重要意义。本发明具有以下有益效果：
[0022]
(1)提供了尚未有商品化可用于猪基因组编辑的细胞系pk-15-be4；
[0023]
(2)本细胞系可用于编辑猪基因组特异碱基或多个碱基，从而有助于研究被编辑碱基的生物学功能；
[0024]
(3)本细胞系可获得单个或多个碱基编辑的稳定细胞系；
[0025]
(4)本细胞系可为高通量构建单碱基饱和突变文库提供良好的实验基础，对解析复杂的细胞或个体生命进程具有重要意义。
附图说明
[0026]
图1是本发明实施例的piggybac转座子载体关键元件组成结构以及转座子质粒图谱，图1a是关键元件组成结构图，图1b是转座子质粒图谱。
[0027]
图2是be4系统活性验证所用sgrna表达载体关键元件组成结构。
[0028]
图3是本发明实施例的转座酶表达载体质粒图谱。
[0029]
图4是本发明实施例转染并且筛选后单细胞形成的单克隆细胞系图。
[0030]
图5本发明实施例be4蛋白序列敲入后，单克隆细胞系扩增be4载体元件后进行pcr鉴定结果图。
[0031]
图6是本发明实施例的细胞系活性验证实验中，3条有活性的sgrna转染后，流式细胞术分选后的结果图。
[0032]
图7是本发明实施例的细胞系活性验证实验中，活性sgrna转染后，sanger测序鉴定三个靶向区域的测序峰图。
具体实施方式
[0033]
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明，需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修饰和替换。
[0034]
实施例1piggybac转座子和转座酶表达载体构建
[0035]
参阅图1与图3，piggybac转座子载体(pb-be4max)包括be4融合蛋白序列、抗生素筛选标记基因(嘌呤霉素抗性基因)、5
’
tr以及3
’
tr同源序列等元件，序列如seq id no.1所示，质粒图谱如图1b所示。转座酶载体质粒包括转座酶蛋白序列等元件，序列如seq id no.2所示，质粒图谱如图3所示。质粒经阳性转化至大肠杆菌，经扩大培养，再经去内毒素提取得到实验所需质粒。
[0036]
实施例2pb-be4max载体和转座酶表达载体质粒共转染pk-15细胞
[0037]
将上述pb-be4max载体和转座酶表达载体质粒共转染至pk-15细胞，采用脂质体转染方法(lipo2000)，具体操作流程如下：
[0038]
转染前，将传代良好的pk-15细胞接种至6孔板培养皿，待细胞生长至融合度为70％-80％时转染。依据质量比pb-be4max载体：转座酶表达载体＝2:1的比例，将pb-be4max载体和转座酶表达载体共同转染至pk-15细胞中，按照lipo2000(invitrogen)操作说明书进行操作。转染好的细胞培养48h后，更换培养基为2μg/ml的嘌呤霉素的新鲜培养基，继续在37℃、5％co2恒温细胞培养箱中培养2-3天，收集剩余存活细胞即为阳性细胞群，备用。
[0039]
实施例3单克隆细胞系的挑取
[0040]
参阅图4，用新鲜基础培养基将实施例2所述阳性细胞群的细胞稀释成7-8个细胞/ml，再铺板至10cm皿中，培养8-10天；待单细胞长成单个细胞团后，使用克隆环将阳性细胞团挑出，继续扩大培养，图4所示为单细胞形成的单克隆细胞系图。
[0041]
实施例4单克隆细胞系的阳性鉴定
[0042]
参阅图5，收集部分各个单克隆细胞系的细胞，提取其基因组dna，pcr扩增be4载体关键序列，扩增的序列如seq id no.3所示，所用引物序列如seq id no.4和5所示，核酸电泳胶如图5所示。结果表明，扩增产物的条带大小约为500bp，与预期扩增结果相符合。
[0043]
实施例5单克隆细胞系的be4蛋白活性鉴定
[0044]
参阅图2，构建sgrna表达载体验证be4蛋白活性，关键元件结构如图2所示，载体命名为pgl3-u6-sgrna。利用在线grna设计网站(http://www.chopchop.cbu.uib.no/)针对某一点突变设计sgrna，三条sgrna(slc35b2-sgrna、cd79b-sgrna、novel6806-sgrna)均已在crispr/cas9系统中验证具有切割活性。三条sgrna序列分别如seq id no.6、seq id no.7、
seq id no.8所示，靶向的目的区域的序列分别如seq id no.9(slc35b2-sgrna)、seq id no.10(cd79b-sgrna)、seq id no.11(novel6806-sgrna)所示。将合成的三对寡核苷酸序列稀释至10μm，然后各取5μl混合均匀，在pcr仪上进行退火处理，程序为：95℃，10min；65℃，30min。将退火后的pcr产物与bbsi酶切过后的质粒(lenti-u6-sgrna-gfp)骨架连接，挑取单克隆菌落，扩大培养后测序，将构建成功的载体分别命名为slc35b2-sgrna、cd79b-sgrna、novel6806-sgrna。
[0045]
参阅图6，选取pk-be4 line1细胞系进行be4系统活性验证实验，分别将三个sgrna表达载体转染至line1单克隆细胞系中，用脂质体转染方法(lipo2000)转染，具体操作流程如实施例2。转染后3天，细胞进行流式分选，结果如图6所示。结果表明部分细胞(产生绿色荧光部分)转染成功。
[0046]
参阅图7，流式分选后的细胞经扩大培养，提取细胞基因组dna，pcr分别扩增sgrna靶向的目的区域，扩增三条活性sgrna靶向的目的区域的序列所用引物序列分别如seq id no.12和13(slc35b2-sgrna)、seq id no.14和15(cd79b-sgrna)、seq id no.16和17(novel6806-sgrna)所示。产物送至武汉擎科创新生物科技有限公司进行测序验证，结果显示在靶位点出现了c/t双峰，证明发生了碱基替换，说明成功获得稳定表达be4蛋白的pk15细胞系。
[0047]
以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所做的进一步的详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例作出若干替代或变形，而这些替代或变形方式都应当视为属于本发明的保护范围。

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