一种光唇鱼雄性分子标记的制作方法

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本发明属于鱼类性别分子标记筛选技术领域，具体涉及一种光唇鱼雄性分子标记。


背景技术：

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光唇鱼(acrossocheilus fasciatus)俗称淡水石斑鱼，属鲤形目、鲤科，在浙江、安徽、江西、福建及台湾等地均有分布。光唇鱼生活于山涧溪流和江河中上游等急流环境中，其体色鲜艳，具有较高的观赏价值，且肉质细嫩、营养丰富，是一种既适合天然放养又适合设施养殖的经济鱼类。
[0003]
近年来光唇鱼的养殖产业发展较为迅速，对其人工养殖的研究也越来越多。但光唇鱼总体生长速度较慢，养殖2年才能达到体长15～20cm、体重100g左右的上市规格。如何提高光唇鱼的生长速度是一个非常值得研究的内容。
[0004]
通过遗传育种方式来筛选生长速度快的家系是水产领域常用的方法。而家系选育是近年来应用比较广泛的一种遗传育种方法，具有系谱清晰，可延缓近交衰退、缩短育种年限、选育效果好并可为分子育种奠定基础等优点。因为家系选育实际是对基因型的选择，通过对优势基因型的富集，选育出的目标性状相关基因具有较高的纯合度。从而使一些隐性性状的表现几率增加，加速淘汰一些不良基因，增加优良性状的累积频率，最终获得优良的经济性状。


技术实现要素：

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本发明的目的是提供一种光唇鱼雄性分子标记，能够从基因组水平上区分雌雄光唇鱼，从而更方便光唇鱼家系建立，弥补现有技术的不足。
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本发明所提供的光唇鱼雄性特异性分子标记，包含有：
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1)核苷酸序列为seq id no:1的核酸片段：
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gcttatctaactctatcacttattacttcattcttagttgtcctatgagtc tcgacagctatttggggagaagtttgaccgttgagtctccttatacgaccgt aataaatagatcatcgacaatgatgctcagcactacttaattgatatcagcaa accattttagcaaccctattagttctggagcactcggtcactattctcgttag atga(seq id no:1)；
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2)在1)中的核酸片段上取代、缺失、添加一个或核苷酸，由1)所衍生的片段；
[0010]
本发明还提供一种用于鉴定光唇鱼雄性的方法，是通过检测上述片段或部分片段存在与否来鉴定的；
[0011]
所述的方法，是使用pcr扩增/测序引物来检测光唇鱼个体；
[0012]
用于检测上述光唇鱼雄性特异性分子标记的引物对，其上下游引物的序列信息分别如下：
[0013]
其一种上游引物的序列为：5
′-
atctaactctatcacttattac-3
′
(seq id no:3)；
[0014]
下游引物，其序列为：5-ctaacgagaatagtgaccgag-3(seq id no:4)；
[0015]
本发明还提供一种用于鉴别光唇鱼雄性的pcr检测试剂盒，包含有上述的用于扩增上述特异性分子标记的引物对。
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本发明从光唇鱼中筛选获得了雄性特异性的分子标记，根据该分子标记设计的检测引物只能在光唇鱼雄性个体中扩增出目的条带，从而可以用该分子标记鉴别光唇鱼的性别；用于光唇鱼的家系构建过程。
附图说明
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图1：southern杂交电泳图，其中图a是琼胶电泳图片，图b是转膜杂交图，图片中m是marker，泳道1、2为雌性光唇鱼，3、4为雄性光唇鱼；
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图2：雄性光唇鱼pcr产物电泳图。
具体实施方式
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aflp标记是基于pcr技术扩增基因组dna限制性片段，基因组dna先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接dna片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点。aflp扩增可使某一样品出现特定的dna 谱带，而在另一样品中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及dna扩增后得到的dna多态性可作为一种分子标记。
[0020]
scar(序列特异扩增区，sequence characterized amplified region)标记是由 paran和michelmore提出的一种基于pcr技术的单基因位点多态性遗传标记，可直接通过扩增片段的有无来鉴别样品间的差异。
[0021]
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。
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实施例1光唇鱼雄性特异dna片段的筛选
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通过aflp-scar方法，从确定性别的雄性光唇鱼中获得了性别相关的dna 分子标记。该雄性光唇鱼的特异dna片段长213bp，其序列为seq id no:1：
[0024]
gcttatctaactctatcacttattacttcattcttagttgtcctatgagtc tcgacagctatttggggagaagtttgaccgttgagtctccttatacgaccgt aataaatagatcatcgacaatgatgctcagcactacttaattgatatcagcaa accattttagcaaccctattagttctggagcactcggtcactattctcgttag atga。
[0025]
为了验证该dna片段只是存在与雄性光唇鱼中，设计探针进行southern杂交，使用pcr dig probe synthesis kit(roche公司，货号11636090910)和地高辛杂交检测试剂盒ii(roche公司，货号11585614910)进行探针标记和southern 杂交。其中探针的长度为201bp，序列为seq id no:2：
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atctaactctatcacttattacttcattcttagttgtcctatgagtctcga cagctatttggggagaagtttgaccgttgagtctccttatacgaccgtaata aatagatcatcgacaatgatgctcagcactacttaattgatatcagcaaacc attttagcaaccctattagttctggagcactcggtcactattctcg。
[0027]
杂交结果如图2所示，结果表明特异性片段只存在与雄性光唇鱼中；可以通过检测该片段的存在与否来进行雄性光唇鱼的鉴定。
[0028]
实施例2：检测雄性光唇鱼的方法
[0029]
设计用于检测核苷酸序列为seq id no:1的特异性片段所需要的引物组，其中的引物的序列信息如下：
[0030]
其一种上游引物的序列为：5
′-
atctaactctatcacttattac-3
′
(seq id no:3)；
[0031]
下游引物，其序列为：5-ctaacgagaatagtgaccgag-3(seq id no:4)；该引物对扩增的目的片段大小为205bp。
[0032]
使用上述引物对进行检测，具体步骤如下：
[0033]
1、提取雌雄光唇鱼的dna：
[0034]
使用酚氯仿方法来提取光唇鱼鳍条dna，提取的样品用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，用紫外分光光度计测量其od值，调整dna浓度至50ng/μl，于
ꢀ-
20℃冻存待用。
[0035]
2、进行pcr扩增：
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pcr反应体系包括10.5μl ddh2o，1.5μl 10
×
buffer，0.6μl dntp (2.5mmol/l)，0.6μl上游引物，0.6μl下游引物，0.2μl rtaq酶(5u/μl)，1μl 模板dna(50ng/μl)。
[0037]
pcr扩增程序：95℃10min；95℃45s、60℃45s、72℃1min，35个循环； 72℃10min；4℃保存。
[0038]
pcr产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳可以看出雄性个体可扩增出205bp特异条带(图2)，而雌性个体中并没有条带。
[0039]
将pcr产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收目的片段。将片段回收连接pmd18-t载体，转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆进行测序。测序结果证实扩增出的条带为目的条带，从而证明本发明的标记能够用来检测遗传雄性的光唇鱼。

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