一种用于贝氏柯克斯体核酸检测的CRISPR-Cas13a系统的制作方法

一种用于贝氏柯克斯体核酸检测的crispr-cas13a系统
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于贝氏柯克斯体核酸检测的crispr-cas13a系统。


背景技术：

[0002]
贝氏柯克斯体(coxiella burnetii)为重要的人兽共患病q热的病原体。贝氏柯克斯体在蜱经期和经卵垂直传播，携带贝氏柯克斯体的蜱叮咬野生动物或家畜，引起动物感染；感染动物将贝氏柯克斯体大量排出污染环境，导致人q热发生或暴发流行。q热自然疫源地在我国广泛分布,目前至少有20多个省市自治区报道过q热的发生，其中四川、云南、内蒙、新疆和西藏等地还发生过q热的流行。
[0003]
血清学检测贝氏柯克斯体特异性抗体是目前诊断立克次体感染的金标准。但是，血清学诊断在q热发病的初期往往检测不到抗体。立克次体病原分离操作复杂，效率低下。另外，贝氏柯克斯体核酸检测技术可作为q热早前感染的辅助诊断技术。目前，贝氏柯克斯体核酸检测技术(如实时荧光定量pcr和rpa技术)能检测到贝氏柯克斯体核酸最低拷贝数为10拷贝/test。
[0004]
2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)，特异性达到单碱基的核酸检测技术——基于crispr-cas13a的核酸检测平台sherlock，利用leptotrichia wadei cas13a蛋白(lwcas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)，实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种用于贝氏柯克斯体核酸检测的crispr-cas13a系统。
[0006]
本发明提供了一种crrna，其靶序列如序列表的序列3所示。
[0007]
本发明还提供了一种crrna，如序列表的序列1所示。
[0008]
以上任一所述crrna用于通过crispr-cas13a系统检测贝氏柯克斯体。
[0009]
本发明还保护一种核酸分子组合物，由引物coxiella-f、引物coxiella-r和特异crrna组成；引物coxiella-f为序列表的序列6所示的单链dna分子；引物coxiella-r为序列表的序列7所示的单链dna分子；特异crrna为以上任一所述的crrna。
[0010]
本发明还保护以上任一所述crrna或所述核酸分子组合物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测贝氏柯克斯体核酸。
[0011]
本发明还保护一种用于检测贝氏柯克斯体核酸的试剂盒，包括以上任一所述crrna或所述核酸分子组合物。
[0012]
所述试剂盒用于通过crispr-cas13a系统检测贝氏柯克斯体核酸。
[0013]
所述试剂盒还包括cas13a蛋白。
[0014]
所述cas13a蛋白为lwcas13a蛋白。
[0015]
所述cas13a蛋白如序列表的序列8所示。
[0016]
更进一步的，所述试剂盒还包括用于rpa扩增的其他试剂和用于实现crispr-cas13a系统检测的其他试剂。所述用于rpa扩增的其他试剂包括缓冲液和/或ddh2o。所述用于实现crispr-cas13a系统检测的其他试剂包括如下试剂中的全部或部分：ntp(如ntp mix)、t7 rna聚合酶、rna酶抑制剂、报告rna(substrate v2，报告rna是具有信号报告功能的rna分子)、rnase free water。
[0017]
所述试剂盒还可包括记载有如下判定标准的载体：在同一检测时间内，试验组荧光强度值比阴性对照荧光强度值高2倍以上即判定为阳性结果。
[0018]
所述试剂盒还可包括记载有如下判定标准的载体：检测过程中的任何时刻荧光强度大于或等于600a.u.即判定为阳性结果。
[0019]
本发明还保护以上任一所述crrna或所述核酸分子组合物或所述试剂盒在检测贝氏柯克斯体核酸中的应用。
[0020]
本发明还保护一种检测贝氏柯克斯体核酸的方法，包括如下步骤：
[0021]
(1)提取供试样本的总dna，作为模板溶液；
[0022]
(2)取模板溶液，采用引物coxiella-f和引物coxiella-r组成的引物对进行rpa扩增；
[0023]
(3)取步骤(2)的产物溶液，进行基于crispr-cas13a系统的可视化检测；所述crispr-cas13a系统中的crrna为以上任一所述的crrna。
[0024]
所述步骤(2)的反应体系具体可如表1所示。所述步骤(2)具体可为：制备表1所示的47.5μl体系，加入装有rpa冻干粉的基础反应单元(随nfo rpa扩增试剂盒提供)中，使冻干粉充分重溶均匀。向每个反应管管盖上加入2.5μl 280mm乙酸镁溶液，合上管盖瞬离收集并混合均匀。然后将反应管放置在39℃条件下反应20-40分钟。
[0025]
所述步骤(3)的反应体系具体可如表2所示。所述步骤(3)具体可为：将装有表2所示体系的pcr管放入荧光定量pcr仪中，设置通道激发光波长490nm，发射光波长520nm，37℃，每2min读取一次数值，读取40次共计80分钟，检测体系中荧光强度变化。
[0026]
本发明还保护一种检测贝氏柯克斯体核酸的方法，包括如下步骤：
[0027]
提取供试样本的总dna，进行基于crispr-cas13a系统的可视化检测；所述crispr-cas13a系统中的crrna为以上任一所述的crrna。
[0028]
进行基于crispr-cas13a系统的可视化检测的反应体系中具有t7 rna聚合酶。
[0029]
示例性的，所述贝氏柯克斯体为贝氏柯克斯体新桥株。
[0030]
本发明公开检测贝氏柯克斯体核酸检测的crispr-cas13a检测系统，可将检测灵敏度提高至1拷贝/test，可在最短4分钟内检测出贝氏柯克斯体核酸，实现了对痕量贝氏柯克斯体核酸样品更高灵敏、高特异、快速准确的检测。本发明对于贝氏柯克斯体感染的防控具有重大的应用推广价值。
附图说明
[0031]
图1为crrna1和crrna2检测贝氏柯克斯体核酸的时间-荧光曲线。
[0032]
图2为含有crrna1的crispr-cas13a检测不同浓度贝氏柯克斯体核酸的时间-荧光曲线。
[0033]
图3为含有crrna1的crispr-cas13a在4min内检测不同浓度的贝氏柯克斯体核酸的荧光强度。
[0034]
图4为针对贝氏柯克斯体的crispr-cas13a的特异性评价(时间-荧光曲线)。
[0035]
图5为针对贝氏柯克斯体的crispr-cas13a的特异性评价(60min荧光强度)。
[0036]
图6为针对贝氏柯克斯体的crispr-cas13a检测q热感染小鼠脾脏核酸样本(时间-荧光曲线)。
[0037]
图7为针对贝氏柯克斯体的crispr-cas13a检测q热感染小鼠心脏核酸样本(时间-荧光曲线)。
[0038]
图8为针对贝氏柯克斯体的crispr-cas13a检测q热感染小鼠肺脏核酸样本(时间-荧光曲线)。
具体实施方式
[0039]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0040]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0041]
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0042]
实施例1、试剂盒的各个组件的制备
[0043]
一、lwcas13a蛋白的制备
[0044]
lwcas13a蛋白的表达、纯化及活性鉴定参见发明名称为“一种用于检测埃博拉病毒的crrna靶点及crispr-cas13a系统”，公布号为cn110628955的专利申请文件中的方法。具体步骤如下：
[0045]
1、lwcas13a蛋白的诱导表达、纯化及鉴定
[0046]
lwcas13a表达质粒为pc013-twinstrep-sumo-hulwcas13a，获自addgene平台(https://www.addgene.org/search/catalog/plasmids/？q＝pc013-twinstrep-sumo-hulwcas13a)。lwcas13a表达质粒表达序列表的序列8所示的lwcas13a蛋白。
[0047]
将lwcas13a表达质粒导入大肠杆菌rosetta(de3)感受态细胞，然后采用tb液体培养基37℃、200rpm培养14小时以上。然后以1:100的体积比转接入含amp抗性的tp液体培养基中，37℃、300rpm培养至od
600nm
＝0.6左右，然后加入iptg并使其在体系中的浓度为500μm，然后18℃、200rpm培养16h。离心收集菌体经超声破碎后收集蛋白上清，并利用cas13a蛋白所带的his6标签通过ni柱(histrap hp column，ge healthcarelife science)进行初步纯化，利用sumo将所带标签部分进行酶切，再利用cas13a蛋白的等电点特性通过阳离子交换柱(unigel-50sp，nano-micro tech)进行第二次纯化，实验过程中利用sds-page蛋白电泳鉴定每一步得到的蛋白，进行蛋白大小分析，同时利用his6标签抗体进行蛋白的初步鉴定，以确定诱导的蛋白为目的蛋白。
[0048]
2、lwcas13a蛋白浓度及活性鉴定
[0049]
使用蛋白活性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测lwcas13a蛋白浓
度，利用报告rna试剂盒(invitrgen)，检测490nm激发、520nm波长下的发射光的荧光值，判断体系中的lwcas13a蛋白是否被激活。即在靶点rna、与靶点对应的crrna的存在下，lwcas13a蛋白是否能被激活并剪切体系中的报告rna，使其发出荧光，同时设置非特异性靶点进行特异性检测，以及人细胞总rna作为背景rna，检测体系是否会受到背景rna的干扰。检测结果发现，本发明纯化得到纯度较高的lwcas13a蛋白，并且无rnase的污染，该蛋白与crrna结合形成的复合体，可被特异的靶序列激活，并剪切体系中的报告rna，从而发出荧光信号，该蛋白可用于后续的检测实验。同时，在蛋白终浓度为45nm时即可检测到明显的荧光信号变化。
[0050]
二、特异crrna的制备
[0051]
分别人工合成crrna-1和crrna-2。crrna-1和crrna-2均为单链rna分子，crrna-1如序列表的序列1所示，crrna-2如序列表的序列2所示。序列1和序列2中，下划线标注的区域为与cas13a蛋白结合的锚定序列，粗体标注的区域为与贝氏柯克斯体基因组中的靶序列特异结合的向导序列。
[0052]
序列1、gggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacgacuaggcuuuccacuccgugcguaaac。
[0053]
序列2、gggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacacuggggcauugcugacuaggcuuucca。
[0054]
crrna1的靶序列如序列表的序列3所示，位于位于贝氏柯克斯体基因组(rsa493毒株，genbank:cp040059.1，12-may-2019)中第170230位-170257位dna序列转录得到的mrna。crrna2的靶序列如序列表的序列4所示，位于位于贝氏柯克斯体基因组(rsa493毒株，genbank:cp040059.1，12-may-2019)中第170216位-170243位dna序列转录得到的mrna。
[0055]
序列3、cugauccgaaaggugaggcacgcauuug。
[0056]
序列4、ugaccccguaacgacugauccgaaaggu。
[0057]
三、标准品质粒的制备
[0058]
将序列表的序列5所示的双链dna分子插入至puc57载体的bamhi和saci酶切位点之间，得到标准品质粒，将其命名为plasmid-coxiella。序列表的序列5所示的双链dna分子属于贝氏柯克斯体16srna基因序列。序列表的序列5中，第57-84位为crrna2的靶序列，第71至98位为crrna1的靶序列。用te buffer溶解并悬浮plasmid-coxiella，得到1
×
109copies/μl的标准品质粒母液。
[0059]
四、rpa扩增引物的设计和制备
[0060]
rpa扩增引物如下：
[0061]
coxiella-f(序列6)：aattctaatacgactcactatagggtatcgggggaaccctcctgctttttagcaa；
[0062]
coxiella-r(序列7)：cataccatggctctaaatgtaaatacataa。
[0063]
coxiella-f中，下划线标注t7序列。
[0064]
分别制备coxiella-f和coxiella-r。
[0065]
实施例2、最佳crrna的筛选
[0066]
将实施例1制备的标准品质粒母液进行稀释，使质粒浓度为106copies/μl，即为plasmid-coxiella标准品质粒溶液。
[0067]
1、rpa扩增
[0068]
以plasmid-coxiella标准品质粒溶液作为模板溶液，进行rpa扩增，得到rpa扩增产物。
[0069]
rpa扩增体系如表1所示。
[0070]
制备表1所示的47.5μl体系，加入装有rpa冻干粉的基础反应单元中，使冻干粉充分重溶均匀。向每个反应管管盖上加入2.5μl 280mm乙酸镁溶液，合上管盖瞬离收集并混合均匀。然后将反应管放置在39℃条件下反应20-40分钟。
[0071]
2、基于crispr-cas13a系统检测贝氏柯克斯体核酸
[0072]
试验组反应体系见表2。
[0073]
特异crrna分别采用实施例1制备的crrna-1或crrna-2。
[0074]
将表2中的rpa扩增产物替换为ddh2o，且保持其他试剂组分不变，即为阴性对照。
[0075]
将装有表2所示体系的pcr管放入荧光定量pcr仪中，设置通道激发光波长490nm，发射光波长520nm，37℃，每2min读取一次数值，读取40次共计80分钟，检测体系中荧光强度变化。
[0076]
结果见图1。采用106copies/μl的plamid-coxiella作模板时，crrna-1检测荧光强度随时间推移而升高，且荧光值较crrna-2和水对照的荧光值要高。而crrna-2可能由于第42-45位的连续“gggg”碱基与第14-17位的连续“cccc”碱基形成rna发夹结构影响对靶序列的识别和cas13a蛋白的结合，检测荧光强度不随时间推移而升高，无明显的检测活性。因此，采用crrna-1作为贝氏柯克斯体检测的crrna。
[0077]
实施例3、试剂盒的组成和方法的建立
[0078]
一、试剂盒的组成
[0079]
试剂盒的组成如下：实施例1制备的cas13a蛋白、实施例1制备的crrna-1、实施例1制备的标准品质粒母液、实施例1制备的rpa扩增引物(coxiella-f和coxiella-r)。
[0080]
二、方法的建立
[0081]
1、rpa扩增
[0082]
以供试dna溶液作为模板溶液，进行rpa扩增，得到rpa扩增产物。
[0083]
供试dna溶液为标准品质粒溶液或样本dna溶液。
[0084]
rpa扩增体系如表1所示。
[0085]
表1 rpa扩增体系
[0086][0087]
制备表1所示的47.5μl体系，加入装有rpa冻干粉的基础反应单元(随nfo rpa扩增试剂盒提供)中，使冻干粉充分重溶均匀。向每个反应管管盖上加入2.5μl 280mm乙酸镁溶液，合上管盖瞬离收集并混合均匀。然后将反应管放置在39℃条件下反应
20-40分钟。
[0088]
2、基于crispr-cas13a系统检测贝氏柯克斯体核酸
[0089]
试验组反应体系见表2。特异crrna采用实施例1制备的crrna-1。
[0090]
将表2中的rpa扩增产物替换为ddh2o，且保持其他试剂组分不变，即为阴性对照。
[0091]
表2 crispr-cas13a检测体系(25μl)
[0092][0093]
报告rna为rnasealert
tm
qc system v2中的substrate v2。rnasealert
tm
qc system v2：invitrogen
tm
公司，货号4479769。
[0094]
将装有表2所示体系的pcr管放入荧光定量pcr仪中，设置通道激发光波长490nm，发射光波长520nm，37℃，每2min读取一次数值，读取40次共计80分钟，检测体系中荧光强度变化。
[0095]
结果判定：
①
在同一检测时间内，试验组荧光强度值比阴性对照荧光强度值高2倍以上即判定为阳性结果；
②
检测过程中的任何时刻荧光强度大于或等于600a.u.即判定为阳性结果；满足
①
和/或
②
都判定为阳性。
[0096]
实施例4、灵敏度检测
[0097]
将实施例1制备的标准品质粒母液进行梯度稀释，得到标准品质粒溶液。标准品质粒溶液中，质粒浓度分别为106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl、100copies/μl。
[0098]
将标准品质粒溶液作为供试dna溶液，采用实施例3的试剂盒并按照实施例3的方法进行检测。
[0099]
第0至80分钟crispr-cas13a检测结果见图2。结果显示，10
0-106copies/μl的标准品质粒的扩增产物的荧光信号在反应开始后开始升高，而阴性对照中仅存在本底荧光且荧光强度不随时间推移而升高。
[0100]
从检测开始的第4分钟，crispr-cas13a检测的荧光信号强度见图3。100copies/μl到106copies/μl模板对应荧光信号依次为199.00
±
2.646a.u.、205
±
11.27a.u.、201.33
±
8.021a.u.、210.67
±
3.215a.u.、213.67
±
3.786a.u.、228.67
±
8.5054a.u.、216.33
±
8.327a.u.，阴性对照荧光信号为91.333
±
23.692a.u.。与阴性对照相比，荧光强度均具有统计学差异(one way anova检验，p<0.001)，且达到阴性对照荧光值的2倍以上。结果表明本发明的crispr-cas13a检测系统可在最短4分钟内(2个循环)检出贝氏柯克斯体核酸，灵敏度达到单拷贝(1copy/test)。
[0101]
实施例5、特异性检测
[0102]
供试物：贝氏柯克斯体新桥株、普氏立克次体、恙虫病东方体karp株、莫氏立克次
体、立氏立克次体、西伯利亚立克次体、黑龙江立克次体、恙虫病东方体gilliam株、猪链球菌、康氏立克次体、单核细胞增生李斯特菌、宋内志贺菌、霍乱弧菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、查菲埃立克体、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、加拿大立克次体、鼠疫耶尔森氏菌、伤寒沙门菌、蒙塔纳立克次体、噬吞噬细胞无形体、汉赛巴通体、五日热巴通体。供试物记载于文献1或文献2。文献1：实时荧光定量pcr同时快速检测4类致病性立克次体,寄生虫与医学昆虫学报,2019年,26(2)110-117。文献2：实时荧光定量pcr检测汉赛巴通体[j].中华流行病学杂志,2007,28(3):277-281。
[0103]
取供试物，提取基因组dna，即为供试dna溶液。供试dna溶液中，dna浓度为10ng/μl。
[0104]
采用实施例3的试剂盒并按照实施例3的方法进行检测。
[0105]
第0至15分钟crispr-cas13a检测结果见图4。检测结果显示，含有贝氏柯克斯体核酸的试验组荧光信号在反应开始后开始升高，而阴性对照(ddh2o)以及含有其他供试物核酸的试验组中的荧光强度不随时间推移而升高，含有贝氏柯克斯体核酸的试验组荧光强度要显著高于阴性对照以及含有其他供试物核酸的试验组。
[0106]
从检测开始的第60分钟，crispr-cas13a检测的荧光信号强度见图5。含有贝氏柯克斯体核酸的试验组荧光强度为阴性对照以及含有其他供试物的试验组平均荧光强度的200倍。说明本发明的基于crispr-cas13a系统检测贝氏柯克斯体核酸的方法具有很高的特异性，检测过程中不存在交叉反应。
[0107]
实施例6、本发明方法应用于q热感染动物样本的检测
[0108]
在absl-3实验室中进行试验。
[0109]
108拷贝数的贝氏柯克斯体新桥株通过气溶胶吸入途径感染balb/c小鼠(5只)，同时设置未感染小鼠作为对照小鼠(3只)。感染7天后将小鼠处死，取小鼠心脏、肺脏、脾脏样本，用2ml pbs缓冲液进行研磨，然后提取基因组dna。
[0110]
将提取的基因组dna作为供试dna溶液。供试dna溶液中，dna浓度为10ng/μl。
[0111]
采用实施例3的试剂盒并按照实施例3的方法进行检测。
[0112]
结果见图6、图7和图8。crispr-cas13a检测结果显示，贝氏柯克斯体感染组小鼠脏器组织(心脏、肺脏、脾脏)样本的荧光信号在反应开始后开始升高，而阴性对照组(ddh2o)以及对照小鼠脏器组织(心脏、肺脏、脾脏)样本的荧光强度不随时间推移而升高，贝氏柯克斯体感染组小鼠脏器组织样本的荧光强度要显著高于阴性对照以及对照小鼠脏器组织。检测开始后第80分钟，贝氏柯克斯体感染组小鼠脏器组织样本荧光强度为阴性对照以及对照小鼠脏器组织的20倍以上。说明本发明的基于crispr-cas13a系统检测贝氏柯克斯体核酸的方法可用于贝氏柯克斯体感染动物标本的核酸检测。
[0113]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

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