一种丹参中菲醌和酚酸有效部位的提取方法与流程

[0001]
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种丹参中菲醌和酚酸有效部位的提取方法。


背景技术：

[0002]
丹参中的药效物质基础主要分为两类，分别是以丹参酮iia、隐丹参酮、丹参酮i等为代表的脂溶性菲醌有效部位和以丹酚酸b、迷迭香酸、丹参素等为代表的水溶性酚酸有效部位。丹参中的两类有效部位在药理、药效方面有许多类似的地方，主要表现为相同的药理作用产生相同的药效和不同的药理作用产生相同的药效。如酚酸和菲醌有效部位均可抗炎、抗氧化、调血脂、抗纤维化、促进癌细胞凋亡、抗血管内皮细胞凋亡、抗心肌细胞凋亡、抗神经细胞凋亡、促骨生成、降低骨吸收、降低糖异生和调节免疫；药效则涉及抗动脉粥样硬化、抗心肌肥大、抗心肌缺血、抗脑缺血性损伤、抗肝纤维化、抗糖尿病、抗骨质疏松和提高免疫等。同时两类有效部位通过作用于不同的靶点、网络通路可以产生相同的药理药效作用。如酚酸有效部位通过抗炎和抗神经细胞凋亡来治疗帕金森和阿兹海默；而菲醌有效部位则通过作用于神经系统提高突触的可塑性达到此目的。两类有效部位也存在不同的药理药效作用。如酚酸有效部位可以扩血管而降血压，抗炎而抗哮喘；菲醌有效部位还可以通过抑制免疫来抗风湿性关节炎。中医中丹参有除烦安神的功效，酚酸和菲醌有效部位都表现为治疗脑出血性神经损伤、脑中风等，但是酚酸有效部位还可以治疗蛛网膜下出血，菲醌有效部位还有镇痛的功效。正是由于药理与药效“一对多”、药理与功效“多对一”的关系让两类有效部位合用不仅可以增强制剂的共同药效作用，同时还可以因同一药理作用的不同侧重而达到增效的目的。以丹参为主要成分的制剂如今已被广泛应用于冠心病、心绞痛的治疗。
[0003]
现有的丹参制剂大多只含有丹参中的一种或一类成分，即使是少部分用丹酚酸b和丹参酮iia共同作为指标成分的制剂，也是有效成分含量较低，这直接导致了制剂的疗效片面或者不显著，并且造成了原料的浪费。本公开的发明兼顾了饮片中的两类有效部位，同时提取菲醌和酚酸两类有效部位，从成分的角度尽可能地接近原药材，使之被最大程度地利用。菲醌有效部位长于抗氧化维持血管内皮屏障而酚酸有效部位则偏于抗凝血和抗心肌细胞凋亡来治疗心血管疾病，同时富集两类有效部位就可以使之发挥协同作用，更全面更高效地治疗心血管疾病，为丹参新型制剂的开发奠定基础。
[0004]
本发明的创新点就在于用不同的溶剂从丹参一味药材中同时富集两类有效部位，提高药材的利用率；通过系统地研究提取工艺中的各项参数，提高两类有效部位中指标成分的转移率，这对今后相关制剂的开发及工业生产都具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
解决的技术问题：本发明以丹参酮iia、隐丹参酮、丹酚酸b和迷迭香酸的转移率为指标，应用单因素实验结合正交试验的方法对丹参菲醌和酚酸有效部位的提取工艺展开了
研究，提供了一种丹参中菲醌和酚酸有效部位的提取方法。
[0006]
技术方案：一种从丹参中提取菲醌和酚酸有效部位的方法，包括如下步骤：(1)以干燥的丹参饮片为原料，加入提取溶剂进行加热回流提取，提取溶剂为60％～95％乙醇溶液，丹参饮片与提取溶剂的重量比为1:6～1:15，提取时间为0.5～3h，提取结束后过滤，得药渣和滤液1；(2)取步骤(1)中的药渣加入提取溶剂进行提取，提取溶剂为水或者20％～40％乙醇溶液，丹参饮片与提取溶剂的重量比为1:10～1:18，提取时间为1～2h，提取结束后过滤，药渣再加提取溶剂，结束后过滤，合并滤液得滤液2；(3)滤液1即为丹参菲醌有效部位提取液，滤液2位丹参酚酸有效部位提取液。
[0007]
优选的，步骤(1)中，丹参饮片与乙醇的重量比为1:10，乙醇的浓度为90wt.％。
[0008]
优选的，步骤(1)中，提取时间为1.5h。
[0009]
优选的，步骤(1)中，提取次数为1～3次。
[0010]
优选的，步骤(2)中，丹参饮片与提取溶剂的重量比为1:18，乙醇的浓度为40wt.％。
[0011]
优选的，步骤(2)中，提取时间为1.5h
[0012]
优选的，步骤(2)中，提取次数为1～3次
[0013]
有益效果：本发明的提取方法可以有效地促进丹参中的菲醌和酚酸有效部位的释放，提高提取率，降低生产成本；操作简单且原料易得，有利于工业生产。本发明提出的提取方法，针对两类有效部位的指标成分，分别考察了提取溶剂、提取溶剂用量、提取时间、提取次数等，优化出了丹参菲醌有效部位和酚酸有效部位的的最佳提取工艺条件，隐丹参酮和丹参酮 iia的转移率均在80％左右，丹酚酸b的转移率要比市售制剂高60％～70％。
附图说明
[0014]
图1为乙醇浓度对四种指标成分转移率的影响示意图；
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图2为提取溶剂用量对丹参酮iia、隐丹参酮的影响示意图；
[0016]
图3为提取时间对丹参酮iia、隐丹参酮的影响示意图；
[0017]
图4为提取次数对丹参酮iia、隐丹参酮的影响示意图。
具体实施方式
[0018]
实施例1
[0019]
1.仪器与试药
[0020]
waters 2695型高效液相色谱仪；agilent c18柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；丹参酮iia 对照品(批号y20j8c40264)；隐丹参酮对照品(批号)；丹酚酸b对照品(批号p10j9f52565)；迷迭香酸对照品(批号)均供含量测定用，购于上海源叶生物科技有限公司；丹参饮片(购于安徽协和城药业有限公司)；中性氧化铝(北京索莱宝科技有限公司)；甲醇、乙睛(色谱纯，美国tedia公司)；其他试剂为分析纯。
[0021]
2.方法
[0022]
2.1丹参菲醌有效部位提取方法
[0023]
称取丹参饮片，置于250ml原底烧瓶中，加入乙醇溶液加热回流，滤过后离心的上清液用0.22μm的微孔滤膜滤过，得到菲醌有效部位样品溶液。
[0024]
2.2丹参酚酸有效部位提取方法
[0025]
在滤渣中加入乙醇溶液加热回流(以第一次不同)，滤过得滤液2；再在滤渣中加入与第二次同浓度不等量的乙醇溶液加热回流，滤过得滤液3。合并滤液2和3，然后用0.22μm的微孔滤膜滤过，得到酚酸有效部位样品溶液。
[0026]
2.3对照品溶液的制备
[0027]
精密称定丹参酮iia、隐丹参酮、丹酚酸b、迷迭香酸对照品，置50ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得到四种指标成分的对照品溶液。
[0028]
2.4高效液相色谱条件
[0029]
色谱柱agilent c18(4.6
×
250mm，5μm)，以乙腈(a)—0.05％磷酸(b)为流动相梯度洗脱：0～15min，10％～25％a；15～25min，25％a；25～30min，25％～35％a；30～40min， 35％～74％a；40～55min，74％a。流速为1ml
·
min-1
，柱温25℃，检测波长为270nm，进样量为10μl。
[0030]
2.5菲醌有效部位单因素实验
[0031]
分别以提取溶剂种类、料液比、提取时间和提取次数4个因素为自变量，以丹参酮iia 和隐丹参酮的转移率为因变量，分别固定其中三个因素条件，变化某一因素条件，进行单因素实验，考察某一因素对菲醌有效部位提取的影响。优选菲醌有效部位提取条件。
[0032]
2.6酚酸有效部位提取工艺优化
[0033]
2.6.1分别以提取方式、提取溶剂种类、料液比、提取时间和提取次数4个因素为自变量
[0034]
以丹酚酸b和迷迭香酸的转移率为因变量，分别固定其中三个因素条件，变化某一因素条件，进行单因素实验，考察某一因素对菲醌有效部位提取的影响。
[0035]
2.6.2正交试验
[0036]
综合单因素实验结果，确定三个因素的三个水平，以丹酚酸b和迷迭香酸的转移率为指标对酚酸有效部位的提取条件进行优化，如下表1所示。
[0037]
表1酚酸有效部位提取因素水平表
[0038][0039]
3.结果与分析
[0040]
3.1方法学考察
[0041]
3.1.1线性关系考察
[0042]
分别精密吸取混合对照品溶液0.2、0.5、1、2、3、5、7ml，用甲醇定容至10ml，进hplc分析，其中迷迭香酸的浓度为0.0926mg/ml，丹酚酸b的浓度为0.1076mg/ml，隐丹参酮的浓度为0.0568mg/ml，丹参酮iia的浓度为0.0484mg/ml。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，迷迭香酸、丹酚酸b、隐丹参酮和丹参酮iia的标准曲线分别是y＝8248.2x-10832， r2＝0.9997，线形范围为1.852～92.60μg
·
ml-1
；y＝6104.4x-96590，r2＝0.999线形范围为
21.52～ 107.6μg
·
ml-1
；y＝46.353x-14512，r2＝0.9997线形范围为1.136～48.4μg
·
ml-1
；y＝52.518x-17998， r2＝0.9997，线形范围为0.968～56.8μg
·
ml-1
。
[0043]
3.1.2精密度试验
[0044]
取混合对照品溶液其中迷迭香酸的浓度为0.0926mg/ml，丹酚酸b的浓度为0.1076mg/ml，隐丹参酮的浓度为0.0568mg/ml，丹参酮iia的浓度为0.0484mg/ml，连续进样6次，计算6 次峰面积结果的rsd值。结果迷迭香酸的rsd为1.08％，丹酚酸b的rsd为1.17％，隐丹参酮的rsd为0.44％，丹参酮iia的rsd为0.47％，表明仪器精密度良好。
[0045]
3.1.3稳定性试验
[0046]
取同一供试品溶液，分别与0，2，4，8，12，24h进样，记录峰面积，计算各成分含量和rsd。结果迷迭香酸的rsd为1.90％，丹酚酸b的rsd为1.76％，隐丹参酮的rsd为1.76％，丹参酮iia的rsd为1.69％，表明供试品在24h内稳定。
[0047]
3.1.4重复性试验
[0048]
取同一批丹参药材，按照供试品溶液制备方法制备6份样品，进样记录峰面积，计算含量和rsd。结果迷迭香酸的rsd为1.46％，丹酚酸b的rsd为1.08％，隐丹参酮的rsd为 1.18％，丹参酮iia的rsd为1.16％，表明方法重复性良好。
[0049]
3.1.5加样回收率试验
[0050]
取已知含量的同一批丹参药材粉末，分别加入相当于药材含量中80％、100％、120％的迷迭香酸、丹酚酸b、隐丹参酮和丹参酮iia对照品，按照供试品制备方法进行制备。分别进样，记录峰面积计算含量和rsd。结果迷迭香酸的平均回收率为99.35％，rsd为1.38％；丹酚酸b的平均回收率为99.99％，rsd为0.68％；隐丹参酮的平均税收率为99.54％，rsd 为1.99％；丹参酮iia的平均回收率为99.98％，rsd为1.42％，回收结果良好，方法学考察符合要求。
[0051]
3.2菲醌有效部位提取单因素实验结果
[0052]
3.2.1提取溶剂种类考察
[0053]
乙醇浓度对四种指标成分转移率的影响都很大，且考虑到第一次提取中要尽量少地提取出酚酸有效部位，故分别加入95％、90％、80％、70％、60％乙醇按照2.1.1的方法进行提取，料液比1:6，提取时间是1小时，提取次数为1次。按照2.2.2测定四种指标成分的含量，计算转移率。结果见图1，显示90％乙醇提取的时候，丹酚酸b和迷迭香酸的转移率相对较低，而丹参酮iia和隐丹参酮的转移率较高，所以提取溶剂选择90％乙醇。
[0054]
3.2.2料液比考察
[0055]
在料液比上，本实施例选择了1:6、1:8、1:10、1:12、1:15这五个量，用90％乙醇按照 2.1.1方法提取，时间是1小时，提取次数为1次。按照2.2.2测定四种指标成分的含量，计算转移率。结果见图2，显示10倍量乙醇提取的时候丹参酮iia和隐丹参酮的转移率较高。故选择料液比为1:10。
[0056]
3.2.3提取时间考察
[0057]
提取时间选择0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h，用90％乙醇按照2.1.1方法进行提取，料液比1:10提取次数为1次。按照2.2.2测定四种指标成分的含量，计算转移率。结果见图3，显示提取时间为1.5h时丹参酮iia和隐丹参酮的转移率最高。故选择提取时间为1.5h。
[0058]
3.2.4提取次数考察
[0059]
选择1、2、3次，用90％乙醇按照2.1.1方法提取，料液比1:10，提取时间为1.5小时。按照2.2.2测定四种指标成分的含量，计算转移率。结果见图4，表明大部分丹参酮iia和隐丹参酮都在第一次加热回流中被提取出来，考虑到丹酚酸b和迷迭香酸的损失，故选择提取时间为1次。
[0060]
3.3丹参菲醌有效部位最佳提取工艺验证
[0061]
根据单因素实验结果，优选出丹参菲醌有效部位的提取工艺为加10倍量90％乙醇加热回流提取1次，提取时间为1.5h。称定丹参饮片30g，按照上述最佳工艺分三批进行验证，丹参酮iia和隐丹参酮的平均转移率分别为79.63％和81.97％，固含为7.17％，rsd分别是0.82％、 0.53％和2.02％。结果显示菲醌类成分转移率较高，表明该工艺稳定可行。
[0062]
表2菲醌有效部位提取工艺验证结果
[0063][0064]
3.4酚酸有效部位单因素实验结果
[0065]
3.4.1提取方式考察
[0066]
比较加热回流和温浸两种提取方式，用纯水按照2.1.2方法提取1次，料液比1:8提取时间为1小时。按照2.2.2测定丹酚酸b和迷迭香酸的含量，计算转移率。
[0067]
表3提取方式及其转移率
[0068][0069]
根据表2，加热回流提取效率更高，故选择提取方式为加热回流。
[0070]
3.4.2提取溶剂考察
[0071]
选择溶剂为纯水、20％、40％、60％和80％乙醇，按照2.1.2方法提取1次，料液比1:8，提取时间为1小时。按照2.2.2测定丹酚酸b和迷迭香酸的含量，计算转移率。
[0072]
表4提取溶剂及其转移率
[0073][0074]
根据表3，20％乙醇提取时丹酚酸b和迷迭香酸的转移率均处于最大值，故本实例选择纯水、20％乙醇和40％乙醇作为提取溶剂这一因素的三个水平。
[0075]
3.4.3料液比考察
[0076]
本实例选择1:6、1:8、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20，用纯水按照2.1.2方法提取 1次，时间为1小时。按照2.2.2测定丹酚酸b和迷迭香酸的含量，计算转移率。
[0077]
表5料液比及其转移率
[0078][0079]
根据表4，料液比为1:18时迷迭香酸转移率最高，料液比为1:20时丹酚酸b的转移率最高。从料液比为1:8后开始两种指标成分的转移率均处于较高水平，故选择料液比的三个水平为1:10、1:14和1:18.
[0080]
3.4.4提取时间考察
[0081]
提取时间选择0.5、1、1.5、2和3小时，用纯水按照2.1.2方法提取1次，料液比1:8。按照2.2.2测定丹酚酸b和迷迭香酸的含量，计算转移率。
[0082]
表6提取时间及其转移率
[0083][0084]
根据表5，2小时以后丹酚酸b和迷迭香酸转移率均减小，丹酚酸b尤甚，这坑时丹酚酸b在长时间加热下分解的缘故。0.5小时两者转移率均较小，故水平选择1、1.5和2小时。
[0085]
3.4.5提取次数考察
[0086]
选择1、2、3次，用95％乙醇按照2.1.1方法提取，料液比1:8提取时间为1小时。按照 2.1.2测定丹酚酸b和迷迭香酸的含量，计算转移率。
[0087]
表7提取时间及其转移率
[0088][0089]
根据表6，提取次数达到2次时，丹酚酸b和迷迭香酸及本能被提取完全，考虑到节能环保，挂选择提取次数为2次。
[0090]
3.5正交试验优化丹参酚酸有效部位的提取工艺
[0091]
表8酚酸有效部位提取正交试验结果
[0092][0093]
表9酚酸有效部位提取方差分析
[0094][0095]
对正交试验所得结果作直观和方差分析。由直观分析可知，影响提取效果的因素顺序为: 提取溶剂种类(a)>提取时间(c)>料液比(b)；由方差分析可知，三个因素均具有显著性。由此得出的最佳工艺组合为a3b3c2，即药渣用40％乙醇加热回流提取2次，第一次加 10倍量溶剂提取1h，第二次加8倍量溶剂提取0.5h。
[0096]
3.6丹参酚酸有效部位提取工艺验证
[0097]
按照上述最佳工艺分三批进行验证。迷迭香酸和丹酚酸b的平均转移率分别为83.59％和 69.86％，固含为41.59％，rsd分别是1.96％、0.09％和0.63％。结果显示酚酸类成分转移率较高，表明该工艺稳定可行。
[0098]
表10菲醌有效部位提取工艺验证结果
[0099]
。

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