一种甘草MYB1基因、其编码的蛋白和应用的制作方法

一种甘草myb1基因、其编码的蛋白和应用
技术领域
[0001]
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种甘草myb1基因、其编码的蛋白和应用。


背景技术：

[0002]
甘草作为一种药用植物，其根和根茎入药和作为天然甜味剂由来已久。甘草中的类黄酮包括甘草查尔酮系列、异黄酮类、异黄烷、黄烷醇等，占比1-5％根部干重，具有抗炎症、抗氧化和抗肿瘤活性。在多年生的胀果甘草中，甘草查尔酮a的含量超过0.2％，但在其他品种的甘草中，其含量甚低甚至检测不到，因而可以认为甘草查尔酮a是胀果甘草中较为特异的次生代谢产物。胀果甘草中的甘草查尔酮主要有甘草查尔酮a/c/e(lca,lcc,lce)。甘草查尔酮a/c/e属于甘草类黄酮，是同分异构体，具有抗微生物、抗肿瘤活性，具有明显的清除自由基和抗氧化作用，是一种快速、高效的美白祛斑化妆品添加剂，具有重大的经济价值。然而，甘草查尔酮a在胀果甘草中的积累调控机制未有研究过。
[0003]
myb是一类植物转录因子家族。这类转录因子在植物中调节类苯丙烷合成途径中起着重要作用。这类转录因子蛋白n端具有保守的myb区域(dna结合结构域)，c端具有高度可变性。根据myb区域中的重复序列，可将myb分为四类：1r(r1/2,r3-myb)，2r(r2r3-myb)，3r(r1r2r3-myb)和4r(四个类r1/r2重复序列)。myb转录因子一般情况下表达量比较低，通过调节myb转录因子的表达量，提高受其调控的结构基因的表达，影响植物的代谢途径，最后达到提高代谢产物的含量，是一种可行的途径。通过转录调控提高药用植物中的活性成分具有重大意义。


技术实现要素：

[0004]
基于此，本发明的目的在于提供一种甘草myb1基因、其编码的蛋白和应用，通过基因克隆进行功能研究发现所述甘草myb1基因能提高植物类黄酮的含量，尤其是胀果甘草中特异的甘草查尔酮a(lca)的含量，以及培育高产甘草查尔酮a的植物品种。
[0005]
实现上述目的的技术方案如下。
[0006]
一种甘草myb1基因，所述甘草myb1基因的cdna阅读框的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2所示；或为与seq id no.1、seq id no.2完全互补配对的序列；或为在seq id no.1、seq id no.2所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列；或为编码氨基酸序列如seq id no.3所示的序列。
[0007]
一种甘草myb1蛋白，所述甘草myb1蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示；或为在seq id no.3所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸，或末端修饰，且具有相同功能的氨基酸序列。
[0008]
本发明还提供了上述甘草myb1基因或上述甘草myb1蛋白在提高植物甘草查尔酮a含量中的应用。
[0009]
本发明还提供了上述甘草myb1基因或上述甘草myb1蛋白在植物育种中提高植物
甘草查尔酮a含量中的应用。
[0010]
本发明还提供了含有上述甘草myb1基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或转基因植物株系。
[0011]
在其中一些实施例中，所述重组表达载体为psuper-myb1。
[0012]
在其中一些实施例中，上述重组表达载体上带有gfp标记，即psuper-gfp-myb1。
[0013]
在其中一些实施例中，所述重组菌为含有上述重组表达载体的发根农杆菌。
[0014]
在其中一些实施例中，所述发根农杆菌为msu440。
[0015]
在其中一些实施例中，所述植物为甘草，更优选为胀果甘草。
[0016]
本发明还提供了上述重组表达载体或重组菌在提高植物类黄酮含量中的应用。
[0017]
在其中一些实施例中，所述类黄酮为总黄酮和/或甘草查尔酮a。
[0018]
本发明的另一目的是提供了一种提高植物甘草查尔酮a含量的方法。实现上述目的的技术方案如下。
[0019]
一种提高植物甘草查尔酮a含量的方法，所述方法为在植物培养体系中加入能促进上述甘草myb1基因表达的试剂。
[0020]
在其中一些实施例中，所述能促进上述甘草myb1基因表达的试剂为植物激素茉莉酸甲酯(meja)。
[0021]
在其中一些实施例中，所述植物激素茉莉酸甲酯(meja)在植物培养体系中的浓度为80-120μm。
[0022]
在其中一些实施例中，所述植物激素茉莉酸甲酯(meja)在植物培养体系中的浓度为100
±
5μm。
[0023]
本发明还提供了一种提高植物、愈伤组织、悬浮细胞或毛状根甘草查尔酮a含量的方法。
[0024]
一种提高植物、愈伤组织、悬浮细胞或毛状根甘草查尔酮a(总类黄酮)含量的方法，所述方法为将上述甘草myb1基因转入植物、愈伤组织、悬浮细胞或毛状根中，并使其表达。
[0025]
在其中一些实施例中，所述方法包括以下步骤：
[0026]
(1)从乌拉尔甘草或胀果甘草中提取rna，反转录获得cdna，然后以cdna为模板，利用如seq id no.4所示的前引物和seq id no.5所示的后引物进行pcr扩增，获得上述甘草myb1基因的cdna阅读框；
[0027]
(2)将步骤(1)获得的cdna阅读框连接到psuper-gfp表达载体中，获得重组表达载体psuper-gfp-myb1，然后转化发根农杆菌；
[0028]
(3)将步骤(2)获得的阳性发根农杆菌侵染外植体，继续培养获得过表达上述甘草myb1基因的植物、愈伤组织、悬浮细胞或毛状根，所述植物、愈伤组织、悬浮细胞或毛状根的类黄酮含量增加。
[0029]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0030]
本发明提供了一种能提高甘草查尔酮a的甘草myb1基因，该基因在甘草根部表达，能够被植物激素茉莉酸甲酯(meja)诱导。由于该myb1基因能够显著提高甘草查尔酮a的含量，从而提高甘草的药用价值和经济价值。而且，所述甘草myb1基因可广泛应用于提高植物中甘草查尔酮a的含量，以及培育高产甘草查尔酮a的植物品种、愈伤组织、悬浮细胞和毛状
根，在医药和美容等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
[0031]
图1为gimyb1基因和gumyb1基因cds pcr扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。
[0032]
图2为在含有100μm meja的ms培养基上培养0h和24h的胀果甘草组培苗(左)，以及培养0h、12h和24h的胀果甘草组培苗中甘草查尔酮a的含量检测结果(右)；其中，ja代表meja，lca代表甘草查尔酮a。
[0033]
图3为在含有100μm meja的ms培养基上培养2d、4d和6d的胀果甘草种子苗(左)，以及培养2d、4d和6d的胀果甘草种子苗中总黄酮的含量检测结果(右)。
[0034]
图4为甘草种子苗转移到含有100μm meja的ms培养基上培养0h、2h、6h、12h和24h时gimyb1基因的表达量检测结果。
[0035]
图5为2根myb1基因表达显著上调的转基因毛状根(左)，以及2根转基因毛状根中myb1基因的表达量检测结果(右)。
[0036]
图6为2根myb1基因表达显著上调的转基因毛状根中甘草查尔酮a和总黄酮的含量检测结果；其中lca代表甘草查尔酮a。
具体实施方式
[0037]
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0038]
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
[0039]
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
[0040]
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
[0041]
本发明所述甘草myb1基因的cdna阅读框的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示；或为与seq id no.1、seq id no.2完全互补配对的序列；或为在seq id no.1或seq id no.2所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列；或为编码氨基酸序列如seq id no.3所示的序列。
[0042]
seq id no.1：
[0043]
atgggaagggctccttgttgtgagaaagtgggtttgaaaaaagggaggtggacagcagaggaagatgaaattttgaccaactacgtccaggccaaaggagaaggctcttggaggttattgccaaaaaatgcagggttgcttagatgtgggaagagttgcagattaagatggattaactatttgagagctgatctcaaaagggggaatatttctgccgaagagg
aaaataccattgtcaagttgcatgcttctttcggcaacaggtggtctttgatagcaagtcatttgccagggagaacagacaacgagataaaaaactactggaactctcacttgagcaggaaggtttacagcttccgagggacgagaaacaacaacaatagtactagtagcagtagtagtgctaataataaagagattccccaggtggaagagatggtggacacacccacacctcctccaaagcgaaaaggcggtagaaccagccggtgggccatgaagaagaacaaaagctacgcccaaaaggttaattctcatcagagcccaaataaacaaggtcagaataaggaagtaccggttacacttccatccacaccaacgctagagagcgagaattggtctcgcacgatgatgatggatttcatggttcaagaccctgctgagaaggaagaagatcaacaactagttgctgatgggtcatgtactagtagttattcctatcaagctcgagaagaaaaaggaaatgggttgcagttaccgtgccttgttgacggtgagaaagaaagtactactaccacccatggagacatgttaggaccgtatgattcagagggtattaatggcggtgaggtgttgagttttaatgacatcatcatggaaactagcatgatggaagaagcaggtggtggtggggttttgtctacatttggtaatgaagacagagaaattattagcagcaatgatgttgcggtggtgattaatgaaagaggggacacggtgggtactgctactaacgcaattggaacaggggaccctgcagagagtagtagtgtgaaccagagctcgaatggggagttacattcttgctcttccatggcttcgggattatatgatagtaattgggattgggagagtgtgatgcagttgaaccataaaggagtcgagtctgtgtcgtgggatcaaaatgaaaacttgcttacttggctgtgggatgatactgattgggagaaggatttacagagatttggagagattgatcccgagaagcaaaatgctatggtttcttggtttctatcttga
[0044]
seq id no.2
[0045]
atgggaagggctccttgttgtgagaaagtgggtttgaaaaaagggaggtggacagcagaggaagatgaaattttgaccaactacgttcaggccaaaggagaaggctcttggaggttattgccaaaaaatgcagggttgcttagatgtgggaagagttgcagattaagatggattaactatttgagagctgatctcaaaagggggaatatttctgccgaagaggaaaataccattgtcaagttgcatgcttctttcggcaacaggtggtctttgatagcaagtcatttgccagggagaacagacaacgagataaaaaactactggaactctcacttgagcaggaaggtttacagcttccgagggacaagaaacaacaacaatagtactagtagcagtagtagtgctaataataaagagattccccaggtggaagagatggtggacacacccacacctcctccaaagcgaaaaggcggtagaaccagccggtgggccatgaagaagaacaaaagctacgcccaaaaggttaattctcatcagagcccaaataaacaaggtcagaataaggaagtaccggttacacttccatccacaccaacgctagagagcgagaattggtctcgcacgatgatgatggatttcatggttcaagaccctgctgagaaggaagaagatcaacaactagttgctgatgggtcatgtactagtagttattcctatcaagctcgagaagaaaaaggaaatgggttgcagttaccgtgccttgttgacggtgagaaagaaagtactactaccacccatggagacatgttaggaccgtatgattcagagggtattaatggcggtgaggtgttgagttttaatgacatcatcatggaaactagcatgatggaagaagcaggtggtggtggggttttgtctacatttggtaatgaagacagagaaattattagcagcaatgatgttgcggtggtgattaatgaaagaggggacacggtgggtactgctactaacgcaattggaacaggggaccctgcagagagtagtagtgtgaaccagagctcgaatggggagttacattcttgctcttccatggcttcgggattatatgatagtaattgggattgggagagtgtgatgcagttgaaccataaaggagtcgagtctgtgtcgtgggatcaaaatgaaaacttgcttacttggctgtgggatgatactgattgggagaaggatttacagagatttggagagattgatcccgagaagcaaaatgctatggtttcttggtttctatcttga
[0046]
应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述cdna阅读框的碱基序列进行修改，也属于本发明的保护范围。
[0047]
本发明所述甘草myb1蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示；或为在seq id no.3所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸，或末端修饰，且具有相同功能的氨基酸序列。
[0048]
seq id no.3：
[0049]
mgrapccekvglkkgrwtaeedeiltnyvqakgegswrllpknagllrcgkscrlrwinylradlkrg
nisaeeentivklhasfgnrwsliashlpgrtdneiknywnshlsrkvysfrgtrnnnnstsssssannkeipqveemvdtptpppkrkggrtsrwamkknksyaqkvnshqspnkqgqnkevpvtlpstptlesenwsrtmmmdfmvqdpaekeedqqlvadgsctssysyqareekgnglqlpclvdgekestttthgdmlgpydseginggevlsfndiimetsmmeeaggggvlstfgnedreiissndvavvinergdtvgtatnaigtgdpaesssvnqssngelhscssmasglydsnwdwesvmqlnhkgvesvswdqnenlltwlwddtdwekdlqrfgeidpekqnamvswfls*(*表示终止)
[0050]
应当理解，在不影响所述甘草myb1蛋白结构和活性的前提下，对上述甘草myb1蛋白的氨基酸序列进行各种取代、缺失或增加一个或多个氨基酸，或末端修饰，也属于本发明的保护范围。
[0051]
实施例1
[0052]
本实施例一种甘草myb1基因，所述myb1基因来源于乌拉尔甘草(gumyb1基因)，其cdna阅读框的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0053]
上述gumyb1基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
[0054]
上述gumyb1基因的cdna阅读框可通过以下方法获得：
[0055]
以实验室的乌拉尔甘草品种gdn16为材料，提取其rna，反转录为cdna，根据已有的乌拉尔甘草基因组序列设计引物克隆乌拉尔甘草中gumyb1基因cds，所述引物包括如seq id no.4所示的上游引物和seq id no.5所示的下游引物。利用dna高保真酶(high-fidelity dna polymerase)进行pcr扩增，pcr反应体系为：cdna模板：2μl；前引物(f):10um；后引物(r)：10um；primestar mix:25μl；ddh2o：19μl；总反应体系50μl。反应条件：94℃：5min，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s，72℃：5min，16℃：∞；其中，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s这三步33个循环。将50μl pcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。取目标条带进行测序，所得gumyb1基因的cds序列如seq id no.1所示，其所编码的蛋白序列如sed id no.3所示。
[0056]
本实施例还以胀果甘草为材料，根据乌拉尔甘草基因组序列设计引物从胀果甘草中克隆得到myb1基因(gimyb1基因)，克隆方法同上，将50μl pcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。经过测序发现，所述gimyb1基因的cdna阅读框的核苷酸序列如seq id no.2所示，其表达蛋白gimyb1蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示，与gumyb1编码同一个蛋白。至此，我们将gumyb1和gimyb1统一命名为myb1。
[0057]
seq id no.4
[0058]
gcaagcttatgggaagggctccttgtt
[0059]
seq id no.5
[0060]
gcggtaccagatagaaaccaagaaaccatagc。
[0061]
实施例2
[0062]
本发明提供的甘草myb1基因能够被植物激素meja诱导，在植物激素meja处理下，其表达量上调，甘草根部总黄酮和甘草查尔酮a含量相应增加。
[0063]
一、胀果甘草中甘草查尔酮a和甘草总黄酮能够被meja诱导积累
[0064]
为研究meja是否能够诱导甘草查尔酮a和甘草总黄酮的积累,我们用100μm meja处理17天苗龄的甘草组培苗和10天苗龄的甘草种子苗，然后检测甘草查尔酮a和甘草总黄酮的含量。
[0065]
实验方法：
[0066]
1.生物材料的种植
[0067]
取200粒胀果甘草种子，置于50ml离心管中，加入10ml浓硫酸，浸泡15-20分钟。吸出浓硫酸，纯水快速冲洗5次，每次15ml，直至没有浓硫酸残留。加入20ml 2％naclo，消毒15-20分钟。然后再倒出naclo，用15ml无菌纯水清洗5次，每次静置10min。清洗完之后加入20ml无菌纯水，28℃、200rpm条件下震荡培养24h，甘草种子开始萌发，获得刚萌发的甘草种子苗。
[0068]
2.meja处理胀果甘草组培苗
[0069]
胀果甘草组培苗在ms培养基上生长14天后，转移到新的ms培养基上垂直培养，恢复3天，再转移到含有100μm meja的ms培养基上培养0h、12h和24h，然后提取胀果甘草组培苗中的甘草查尔酮a并测定甘草查尔酮a的含量。
[0070]
甘草查尔酮a提取方法如下：
[0071]
(1)收集在含有100μm meja的ms培养基上培养0h、12h和24h的胀果甘草组培苗，使用液氮研磨并冻干。
[0072]
(2)冻干后称取10mg样品，置于2ml离心管。
[0073]
(3)纯甲醇提取：将装有样品的2ml离心管中加入1ml纯甲醇，超声1小时，同时准备新的离心管、做好标记，超声结束后用移液枪吸取上清液至新的离心管；样品中再次加入1ml纯甲醇，超声1小时，两次合并滤液，蒸干浓缩。
[0074]
(4)溶解：吸取300μl纯甲醇重悬提取的化合物，所得的提取液用0.22μm滤膜过滤，收集滤液(含甘草查尔酮a)。
[0075]
甘草查尔酮a检测方法如下：
[0076]
(1)色谱系统：采用agilent zorbax sb-c18柱(3.0
×
100mm，1.8μm)，柱温40℃，流速0.25ml/min，进样量10μl；流动相a：乙腈，流动相b：0.1％甲酸水；梯度洗脱：0-6min，70％～60％b；6-15min，60％～45％b；15～8min，45％～10％b；18～21min，10％b；21～21.1min，10％～70％b；21.1～24min，70％b，甘草查尔酮a的检测波长为370nm。
[0077]
(2)质谱条件：选择负离子模式，离子喷雾电压为2500v。鞘气体、辅助气体和尾气的流速分别为40、10和0arb。离子转移管和汽化器的温度分别为350℃和300℃。甘草查尔酮a的定量是通过采用esi阴离子模式的多反应检测模式进行。产生甘草查尔酮a次级母离子的碰撞能分别为24.4v、19.56v和21v。
[0078]
(3)甘草查尔酮a含量计算：通过用不同浓度的甘草查尔酮a标品在hplc上检测峰面积，建立浓度与峰面积之间的标准曲线。
[0079]
3.meja处理胀果甘草种子苗
[0080]
将在ms培养基上萌发10天的甘草种子苗转移到含有100μm meja的ms培养基上培养0h、2h、6h、12h、24h、2d、4d和6d，每个时间点三个重复。将甘草苗根部切下，液氮速冻，保存于-80℃。总共三次独立重复实验。处理0h、2h、6h、12h和24h的样品用于检测gimyb1基因的表达；处理2d、4d和6d的样品用于检测总黄酮的含量。
[0081]
总黄酮的提取方法如下：
[0082]
(1)收集在含有100μm meja的ms培养基上培养2d、4d和6d的甘草种子苗，使用液氮研磨并冻干。
[0083]
(2)冻干后称取10mg样品，置于2ml离心管。
[0084]
(3)80％甲醇提取：将装有样品的2ml离心管中加入1ml 80％甲醇，超声提取1小时(240w，常温)。获得的提取液12000g离心2min，将上清液收集到新的2ml离心管中。超声提取重复两次。上清液收集后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液(含总黄酮)。
[0085]
总黄酮的检测方法如下：总黄酮的检测方法使用分光光度法，根据中国药典2015中的方法检测样品的od值。具体如下：将1ml提取物加入10ml容量瓶中，然后加入0.5ml 5％na2no3溶液，充分混合后，溶液在室温下反应6分钟。然后，将0.5ml 10％al(no3)3溶液添加到容量瓶中，充分混合并在室温下保持6分钟。最后，将4ml 5％naoh加入到容量瓶中，充分混合并反应15分钟。所得溶液在500nm处测定其吸光值。芦丁作为标品用于标准曲线的制定。
[0086]
实验结果：
[0087]
1.胀果甘草中甘草查尔酮a能够被meja诱导积累
[0088]
在含有100μm meja的ms培养基上培养0h、12h和24h的胀果甘草组培苗中甘草查尔酮a的检测结果为：峰面积分别为20104、23566、143267。根据甘草查尔酮a浓度与峰面积之间的标准曲线得到浓度的计算公式为：y＝2e-05x+0.1634。利用上述公式计算得到在含有100μm meja的ms培养基上培养0h、12h和24h的胀果甘草组培苗中甘草查尔酮a的浓度分别为：25.35ng/mg干重、28.66ng/mg干重、121.15ng/mg干重。
[0089]
如图2所示，与培养0h(control)相比，meja在处理17天苗龄的甘草组培苗24h时，甘草组培苗中甘草查尔酮a含量明显升高，说明meja在处理17天苗龄的甘草组培苗24h时能够诱导甘草查尔酮a含量的积累。
[0090]
2.胀果甘草中总黄酮能够被meja诱导积累
[0091]
在含有100μm meja的ms培养基上培养2d、4d和6d的胀果甘草种子苗中总黄酮的检测结果为：2d的od500:对照组为0.0115，处理组为0.039；4d的od500：对照组为0.0342，处理组为0.0649；6d的od500：对照组为0.0304，处理组为0.0729。根据标准曲线得到总黄酮浓度的计算公式为：y＝10.982x-0.0226。利用上述公式计算得到在含有100μm meja的ms培养基上培养2d、4d和6d的甘草种子苗中总黄酮的浓度分别为：2d的对照组为6.36mg/g干重，处理组为11.90mg/g干重；4d的对照组为11.99mg/g干重，处理组为17.21mg/g干重；6d的对照组为10.78mg/g干重，处理组为16.46mg/g干重。
[0092]
如图3所示，与培养0h(control)相比，meja在处理10苗龄的甘草种子苗2d、4d和6d时，都能诱导甘草总黄酮的积累。
[0093]
二、胀果甘草gimyb1基因响应meja诱导
[0094]
实验方法：
[0095]
为了检测gimyb1基因是否响应meja，我们将在固体培养基上萌发10天的胀果甘草种子苗转移到含有100μm meja的固体培养基上培养0h、2h、6h、12h和24h，各个时间点取样，每个样品三次重复。利用qrt-pcr实验技术用来检测gimyb1基因的表达情况(以gidreb和gicops作为内参)，检测引物为：seq id no.6gimyb1-f:ctgtgtcgtgggatcaaaatg,seq id no.7gimyb1-r:ttgcttctcgggatcaatctc；seq id no.8gidreb-f:ggttgctgaaattcgggagc,seq id no.9gidreb-r:cattggggaagttgaggcg；seq id no.10gicops3-f:ggaagcgccaatacgagg,seq id no.11gicops3-r:acaacaagcacagcagaagaaa。反应体系为：cdna模板：1μl；前引物(f):10um；后引物(r)：10um；tb green mix:5μl；ddh2o：3μl；总反应
体系10μl。反应条件：(预变性)95℃：30s；(扩增)95℃：10s，60℃：30s；(融解曲线)95℃：1s，65℃：2.5s；(冷却)40℃：30s。其中，(扩增)95℃：10s，60℃：30s这一步40个循环。
[0096]
实验结果：
[0097]
检测结果如图4所示，与未处理的对照(0h)相比，meja处理2h时，gimyb1基因的表达量上调将近7倍；在处理6h和12h时，gimyb1基因的表达有所回落，但仍显著高于0h时的表达量；在处理24h时，gimyb1基因的表达量又有所上升，是0h表达量的将近5倍。总体上，gimyb1基因受meja的诱导表达，而meja同时又能够诱导甘草苗中甘草查尔酮a和甘草总黄酮的积累。上述结果表明，gimyb1基因能响应meja的诱导调控甘草查尔酮a和甘草总黄酮含量的积累。
[0098]
实施例3
[0099]
本实施例提供一种myb1基因过表达的甘草转基因毛状根，并检测其中甘草查尔酮a和甘草总黄酮的含量。
[0100]
实验方法：
[0101]
利用实施例1所述方法获得myb1基因的cds，然后将所述cds连接到psuper-gfp表达载体中，获得重组表达载体psuper-gfp-myb1。使用cacl2介导的化学转化法将重组表达载体psuper-gfp-myb1导入发根农杆菌msu440中。筛选抗链霉素和卡那霉素的农杆菌，进行菌液pcr，pcr使用的引物为：seq id no.12psuper1300-f：ggataaatagccttgcttcctat；seq id no.13psuper1300-r：aactttattgccaaatgtttgaac；反应体系为：模板：1μl；psuper1300-f:10um；psuper1300-r：10um；t5 mix:5μl；ddh2o：3μl；总反应体系10μl。反应条件：94℃：5min，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s，72℃：5min，16℃：∞；其中，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s这三步35个循环。挑选阳性菌落摇菌，扩大培养，至菌液od值达到约0.5。
[0102]
用外植体浸染法浸染甘草外植体：在ms固体培养基上萌发8天的胀果甘草种子苗，在无菌超净工作台内将其下胚轴和子叶切下来，用于发根农杆菌浸染。浸染后的甘草外植体置于含有250μg/ml头孢的1/2ms的培养基上，待毛根从外植体长出3-5cm后，切下毛根转移到含有250μg/ml头孢和25μg/ml潮霉素(hyg)的1/2ms培养基上，筛选阳性毛根。挑选能够在筛选培养基上快速生长的阳性毛根转移到含有250μg/ml头孢的1/2ms液体培养基中悬浮培养。取液体培养的一部分毛根，提取dna和rna，以未转基因毛根为阴性对照(control)，通过pcr和qrt-pcr(方法同实施例2)筛选阳性毛根，将具有显著高表达myb1的转基因毛根作为后续研究材料，提取并检测其中甘草查尔酮a和甘草总黄酮的含量，具体提取和检测方法同实施例2。
[0103]
实验结果：
[0104]
如图5所示，myb1转基因毛状根在含有250μg/ml的1/2ms液体培养基中生长一个月，筛选得到2根myb1基因表达显著上调的转基因毛状根，分别记为oe-1和oe-2。提取和检测这2根转基因毛状根中甘草查尔酮a和甘草总黄酮的含量，结果如图6所示，与control(未转基因毛根)相比，oe-1和oe-2中甘草查尔酮a和甘草总黄酮的含量均显著升高，说明myb1基因过表达能够显著提高甘草中的甘草查尔酮a和甘草总黄酮含量。
[0105]
以上实验结果表明，在毛状根中过表达myb1基因，能够显著提高甘草中甘草查尔酮a和总黄酮的含量。因此，myb1基因将可以应用于培育高品质的甘草品种，提高甘草的药
用价值和经济价值。
[0106]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0107]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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