一种桑黄抗胃癌细胞增殖的有效成分及其制备方法与流程

[0001]
本发明涉及桑黄多糖制备技术领域，特别涉及一种桑黄抗胃癌细胞增殖的有效成分及其制备方法。


背景技术：

[0002]
多糖是由10个以上单糖通过糖苷键连接聚合而成的高分子碳水化合物，分别作为结构成分、储藏养分、特殊的活性成分，在自然界广泛分布。天然活性多糖由于其独特的药理作用和较小的毒副作用，展现出广阔的研究和应用前景。
[0003]
桑黄是一种具有多种药理作用的真菌子实体，因寄生于桑树而得名。中医认为桑黄能利五脏、软坚、排毒、止血等，现代医药学研究发现桑黄具有抗癌、抗炎症、抗氧化、降血糖、免疫调节、抗血管生成、护肝等多种药理作用，但其药用机理尚不清楚，这阻碍了其药用价值的进一步提高，分离纯化桑黄抗癌活性成分，对于推进桑黄药用新产品开发及其价值提升等，均具有积极意义。


技术实现要素：

[0004]
本发明要解决的技术问题是提供一种桑黄抗胃癌细胞增殖的有效成分及其制备方法，制备的桑黄多糖纯度高。
[0005]
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
[0006]
一种桑黄抗胃癌细胞增殖的有效成分，所述有效成分为桑黄多糖。
[0007]
一种桑黄抗胃癌细胞增殖有效成分的制备方法，包括以下步骤：
[0008]
1)桑黄多糖提取
[0009]
桑黄细粉过100～120目，加去离子水，桑黄细粉和去离子水重量比为1∶30～40，超声波处理10～15min；
[0010]
浸提，提取时间2～4小时，提取温度80～90℃；
[0011]
向浸提液中加入3～5倍重量的无水乙醇，醇析8～10小时；
[0012]
浓缩醇析后以3500～5000rpm离心15～25min，弃上清液后得沉淀物，用无水乙醇洗涤沉淀；
[0013]
真空冷冻干燥得到桑黄粗多糖；
[0014]
2)桑黄多糖纯化
[0015]
将桑黄粗多糖制成水溶液，滴加适量的浓氨水使其ph值达到8～10，静置10～15min后在4500～5000rpm下离心10～15min除去蛋白沉淀；
[0016]
将多糖溶液稀释1～3倍，再加入等体积的seveg试剂，剧烈震荡25～35min后，4500～5000rpm下离心10～15min，取上清液加入等体积seveg试剂重复除蛋白操作一次；
[0017]
向上述上清液中加入95％乙醇至80％～85％终浓度，混匀后，4℃静置3～4h；
[0018]
静置后的溶液6000～8000rpm离心15～30min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液6000～8000rpm离心15～30min去除不溶物质；
[0019]
上清液用15kd透析膜对水透析，即得粗提prp透析液；
[0020]
粗提prp透析液，6000～8000rpm离心15～30min收集上清液，上清液用0.45μm滤膜过滤得到滤液；
[0021]
滤液经由d152及d301t串联而组成的离子交换柱进一步室温20～25℃下纯化，洗脱液为蒸馏水，纯化后，再经sephadex g-100凝胶柱层析纯化，以蒸馏水作为洗脱液进行洗脱，洗脱后真空冷冻干燥，得到桑黄多糖。
[0022]
优选的，其中步骤1)中
[0023]
桑黄细粉过110目，桑黄细粉和去离子水重量比为1∶35，超声波功率600w，处理时间10min；
[0024]
浸提，提取时间3小时，提取温度85℃；
[0025]
醇析，向浸提液中加入4倍量的无水乙醇，醇析9小时；
[0026]
浓缩醇析后3500～5000rpm离心20min弃上清液，得沉淀物，用无水乙醇洗涤沉淀；
[0027]
真空冷冻干燥得到桑黄粗多糖。
[0028]
优选的，所述桑黄细粉通过以下步骤制得：
[0029]
将桑黄子实体用中药粉碎机粉碎，过筛，得到初桑黄粉；
[0030]
采用超微粉碎震动磨机将上述初桑黄粉粉碎，过筛，得到桑黄细粉。
[0031]
采用上述技术方案，由于对桑黄多糖进行了多次提纯，因此可以得到纯度高的桑黄多糖，为桑黄在抗癌方面的应用提供了使用依据。
具体实施方式
[0032]
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0033]
实施例1
[0034]
一种桑黄抗胃癌细胞增殖有效成分的制备方法，包括以下步骤：
[0035]
1)桑黄多糖提取
[0036]
桑黄细粉过100目，加去离子水，桑黄细粉和去离子水重量比为1∶30，超声波处理10min；
[0037]
浸提，提取时间2小时，提取温度80℃；
[0038]
向浸提液中加入3倍重量的无水乙醇，醇析8～10小时；
[0039]
浓缩醇析后以3500rpm离心15min，弃上清液后得沉淀物，用无水乙醇洗涤沉淀；
[0040]
真空冷冻干燥得到桑黄粗多糖；
[0041]
2)桑黄多糖纯化
[0042]
将桑黄粗多糖制成水溶液，滴加适量的浓氨水使其ph值达到8，静置10min后在4500rpm下离心10min除去蛋白沉淀；
[0043]
将多糖溶液稀释1倍，再加入等体积的seveg试剂，剧烈震荡25min后，4500rpm下离心10min，取上清液加入等体积seveg试剂重复除蛋白操作一次；
[0044]
向上述上清液中加入95％乙醇至80％终浓度，混匀后，4℃静置3h；
[0045]
静置后的溶液6000rpm离心15min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液6000rpm离
心15min去除不溶物质；
[0046]
上清液用15kd透析膜对水透析，即得粗提prp透析液；
[0047]
粗提prp透析液，6000rpm离心15min收集上清液，上清液用0.45μm滤膜过滤得到滤液；
[0048]
滤液经由d152及d301t串联而组成的离子交换柱进一步室温20℃下纯化，洗脱液为蒸馏水，纯化后，再经sephadex g-100凝胶柱层析纯化，以蒸馏水作为洗脱液进行洗脱，洗脱后真空冷冻干燥，得到桑黄多糖；
[0049]
所述桑黄细粉通过以下步骤制得：
[0050]
将桑黄子实体用中药粉碎机粉碎，过筛，得到初桑黄粉；
[0051]
采用超微粉碎震动磨机将上述初桑黄粉粉碎，过筛，得到桑黄细粉。
[0052]
实施例2
[0053]
一种桑黄抗胃癌细胞增殖有效成分的制备方法，包括以下步骤：
[0054]
1)桑黄多糖提取
[0055]
桑黄细粉过120目，加去离子水，桑黄细粉和去离子水重量比为1∶40，超声波处理15min；
[0056]
浸提，提取时间4小时，提取温度90℃；
[0057]
向浸提液中加入5倍重量的无水乙醇，醇析10小时；
[0058]
浓缩醇析后以5000rpm离心25min，弃上清液后得沉淀物，用无水乙醇洗涤沉淀；
[0059]
真空冷冻干燥得到桑黄粗多糖；
[0060]
2)桑黄多糖纯化
[0061]
将桑黄粗多糖制成水溶液，滴加适量的浓氨水使其ph值达到10，静置15min后在5000rpm下离心15min除去蛋白沉淀；
[0062]
将多糖溶液稀释3倍，再加入等体积的seveg试剂，剧烈震荡35min后，5000rpm下离心15min，取上清液加入等体积seveg试剂重复除蛋白操作一次；
[0063]
向上述上清液中加入95％乙醇至85％终浓度，混匀后，4℃静置4h；
[0064]
静置后的溶液8000rpm离心30min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液8000rpm离心30min去除不溶物质；
[0065]
上清液用15kd透析膜对水透析，即得粗提prp透析液；
[0066]
粗提prp透析液，8000rpm离心30min收集上清液，上清液用0.45μm滤膜过滤得到滤液；
[0067]
滤液经由d152及d301t串联而组成的离子交换柱进一步室温25℃下纯化，洗脱液为蒸馏水，纯化后，再经sephadex g-100凝胶柱层析纯化，以蒸馏水作为洗脱液进行洗脱，洗脱后真空冷冻干燥，得到桑黄多糖；
[0068]
所述桑黄细粉通过以下步骤制得：
[0069]
将桑黄子实体用中药粉碎机粉碎，过筛，得到初桑黄粉；
[0070]
采用超微粉碎震动磨机将上述初桑黄粉粉碎，过筛，得到桑黄细粉。
[0071]
实施例3
[0072]
人胃癌细胞株sgc-7901培养于含体积分数为10％fbs的rpmi1640培养基中，于37℃、5％co2条件下传代培养，当细胞融合度约为80％，即进行细胞传代，实验时取对数生长
期细胞，采用mtt法检测细胞的存活率，调整细胞为5
×
104个/ml，100μl/孔接种于96孔板中，设立空白组、正常对照组、不同浓度桑黄细粉溶液组及不同浓度桑黄菌丝体提取液组，每孔加入上述药物100μl，分别培养24h和48h后，每孔加入5g/l的mtt为20μl，继续培养4h后，吸去上清，每孔加入150μl dmso，室温置于摇床10min，于酶标仪490nm处测定od值，计算细胞存活率和半数抑制浓度(ic
50
)，存活率(％)＝(od
样品-od
空白
)/(od
正常-od
空白
)*100，倒置显微镜观察细胞形态，细胞处理同上，在药物作用24h和48h后，采用倒置显微镜观察，物镜20倍，拍照记录各组细胞形态；
[0073]
如表1所示为不同浓度桑黄细粉溶液和不同浓度桑黄菌丝体提取液24h和48h时对人胃癌细胞存活率影响表(n＝3,x
±
sd)，随着桑黄细粉溶液和桑黄菌丝体提取液浓度增加和作用时间延长，mtt结果显示细胞存活率降低，光镜下观察细胞数量减少，皱缩，变圆，贴壁不紧密，部分脱落，形态损伤程度逐渐加深，作用时间24h时，桑黄细粉溶液浓度达到0.4mg/ml，桑黄菌丝体提取液浓度达到1.2mg/ml，对人胃癌细胞株sgc-7901细胞呈现明显细胞增殖抑制作用(p＜0.05)，作用时间48h时，桑黄细粉溶液浓度达到0.2mg/ml，桑黄菌丝体提取液浓度达到1.2mg/ml，对人胃癌细胞株sgc-7901细胞呈现明显细胞增殖抑制作用(p＜0.05)；
[0074]
桑黄细粉溶液作用于人胃癌sgc-7901细胞24和48h的ic
50
分别为2.684和2.748mg/ml，95％置信区间分别为1.936～3.721mg/ml和2.165～3.487mg/ml；桑黄菌丝体提取液24h和48h的ic
50
分别为11.30和4.202mg/ml，95％置信区间分别为5.719～22.34mg/ml和2.536～6.960mg/ml。
[0075]
表1
[0076][0077]
注：*p<0.05,**p<0.01与空白对照组(0.0mg/ml)比
[0078]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除