一种改进的戈那瑞林的固相合成方法与流程

[0001]
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种改进的戈那瑞林的固相合成方法。


背景技术：

[0002]
戈那瑞林，其氨基酸序列为：5—氧化脯氨酰一l一组氨酰一l一色氨酰一l一丝氨酰一l一酪氨酰一甘氨酰一l一亮氨酰一l一精氨酰一l脯氨酰一甘氨酰胺(pyr-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly-nh2)，分子式为c
55
h
75
n
17
o
13
，分子量为1182.33。
[0003]
戈那瑞林为人工合成的促性腺激素释放素，属肽类化合物，为十肽，该品能刺激垂体合成和释放卵泡刺激激素合黄体生成激素(fsh和lh)，临床上主要用于鉴别诊断男性或女性由于下丘脑或垂体功能低下所引起的生育障碍，性腺萎缩性的性腺功能不足、乳溢性闭经、原发和继发性闭经、绝经和早熟绝经、垂体肿瘤，垂体的器官损伤和事实上的下丘脑功能障碍等。适应症包括：
[0004]
1)用于诊断下丘脑-垂体-生殖腺功能障碍；
[0005]
2)治疗闭经与促性腺激素分泌不足和多滤泡性卵巢引起的不孕症；
[0006]
3)戈那瑞林或其同类物布舍瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林、那法瑞林和曲普瑞林还可用于避孕、隐睾症、恶性肿瘤(尤其前列腺癌)、延迟的和提前的青春期；
[0007]
4)还可用于子宫内膜异位；
[0008]
5)用于促排卵以治疗下丘脑性闭经所致不孕、原发性卵巢功能不足，特别是对氯米芬无效的患者；
[0009]
6)还用于小儿隐睾症及雄激素过多、垂体肿瘤等。作为兽药，其可以促使动物腺垂体释放促卵泡素和促黄体素，用于治疗奶牛的卵巢机能停止，诱导奶牛同期发情。
[0010]
现有技术中戈那瑞林合成方法报道较少，中国发明专利申请201710439767.8报道了一种固相合成法合成戈那瑞林的方法，该专利采用rinkamideam树脂为固相载体，缩合剂调件为hbtu/hobt/dipea，fmoc氨基酸为单体，哌啶为脱保护试剂，然后从c端到n端逐一进行偶联，直至合成保护戈那瑞林树脂肽链，最后，裂解得到戈那瑞林。此方法采用了易制毒试剂哌啶，最后一个氨基酸5-氧脯氨酸没有保护，会产生大量的副产物。
[0011]
捷克专利cz2014976a3采用了类似的氨基酸单体和rink树脂为载体的合成方法。
[0012]
美国专利us4024248提及了戈那瑞林类似物可以采用片段缩合的方法，将片段分为pyr-his-trp和ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly-nh2或pyr-his-trp-ser和tyr-gly-leu-arg-pro-gly-nh2，然后采用叠氮法进行缩合，缩合片段未经保护，副反应较多，成本较大。


技术实现要素：

[0013]
基于此，有必要针对背景技术中存在的问题，提供一种改进的戈那瑞林的固相合成方法。
[0014]
本发明的技术方案是构造一种改进的戈那瑞林的固相合成方法，包括以下步骤：
[0015]
1)以酰胺树脂为固相载体，以fmoc保护氨基酸为单体，末端为boc保护的pyr，以哌
嗪为脱帽试剂，在缩合剂的作用下，依次逐个接上氨基酸，合成戈那瑞林；
[0016]
2)用切肽试剂切肽后浓缩，得到戈那瑞林粗品。
[0017]
在其中一个实施例中，步骤1)中，保护氨基酸单体为：boc-pyr-oh，fmoc-his(boc)-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-ser(but)-oh，fmoc-tyr(but)-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-pro-oh。
[0018]
在其中一个实施例中，步骤1)中，所述的脱帽试剂哌嗪溶液的溶剂为偶极非质子溶剂，哌嗪的质量浓度为2-5％。
[0019]
在其中一个实施例中，步骤1)中，所述的缩合剂为：hbtu、hatu、tatu、tbtu、pybop、bop、dic、dcc其中的一种。
[0020]
在其中一个实施例中，步骤2)中，所述的切肽试剂为：三氟乙酸溶液。
[0021]
在其中一个实施例中，步骤2)中，所述的戈那瑞林粗品的纯度可以达到95％。
[0022]
本发明的优点和有益效果如下：
[0023]
用哌嗪溶液作为脱帽试剂合成戈那瑞林，方便购买、运输和储存，保质期长，且价格便宜，合成戈那瑞林粗品的纯度高，对于后面的纯化工艺将会非常简单，适合大规模工业化生产，未用到任何有毒和易制毒试剂，没有剧烈的化学反应，方便自动化生产。
附图说明
[0024]
图1为本发明的小试戈那瑞林粗品的rp-hplc图谱。
[0025]
图2为本发明的小试戈那瑞林的ms图谱。
[0026]
图3为本发明的是中试戈那瑞林粗品的rp-hplc图谱。
具体实施方式
[0027]
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的首选实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
[0028]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0029]
实施例1
[0030]
在本权利要求书和说明书中出现的缩写，其的意义见下表：
[0031][0032][0033]
5g树脂投料表如下：
[0034]
名称分子量密度体积μl投料质量mgrink-amideresin取代率(0.8mmol/g)
ꢀꢀꢀ
5000fmoc-gly-oh297\\2376fmoc-pro-oh337\\2696fmoc-arg(pbf)-oh648.8\\5190.4fmoc-leu-oh353.4\\2827.2fmoc-gly-oh297\\2376fmoc-tyr(tbu)-oh459.5\\3676fmoc-ser(tbu)-oh383.4\\3067.2fmoc-trp(boc)-oh526.6\\4212.8
fmoc-his(boc)-oh477.51\\3820.08boc-pyr-oh229.2\\1833.6hbtu379.24\\2882.224diea129.240.7821586.581240.704
[0035]
一种改进的戈那瑞林的固相合成方法，包括以下步骤：
[0036]
1)以酰胺树脂为固相载体，以fmoc保护氨基酸为单体，末端为boc保护的pyr，以哌嗪为脱帽试剂，在缩合剂的作用下，依次逐个接上氨基酸，合成戈那瑞林；
[0037]
优选地，步骤1)中，保护氨基酸单体为：boc-pyr-oh，fmoc-his(boc)-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-ser(but)-oh，fmoc-tyr(but)-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-pro-oh。
[0038]
优选地，步骤1)中，所述的脱帽试剂哌嗪溶液的溶剂为偶极非质子溶剂，哌嗪溶液的质量浓度为2-5％；
[0039]
更优选地，溶剂为dmf，哌嗪的质量浓度为3％。
[0040]
优选地，步骤1)中，所述的缩合剂为：hbtu、hatu、tatu、tbtu、pybop、bop、dic、dcc其中的一种。
[0041]
具体地，合成过程如下：
[0042]
1.gly-树脂的合成：
[0043]
(1)将树脂称于50ml多肽反应器中，量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0044]
(2)称取fmoc-gly-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0045]
2.pro-gly-树脂的合成：
[0046]
(1)称取fmoc-pro-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。
[0047]
(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0048]
3.arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0049]
(1)称取fmoc-arg(pbf)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应3小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。
[0050]
(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0051]
4.leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0052]
(1)称取fmoc-leu-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。
[0053]
(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0054]
5.gly-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0055]
(1)称取fmoc-gly-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。
[0056]
(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0057]
6.tyr(tbu)-gly-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0058]
(1)称取fmoc-tyr(tbu)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。
[0059]
(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0060]
7.ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0061]
(1)称取fmoc-ser(tbu)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。
[0062]
(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0063]
8.trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0064]
(1)称取fmoc-trp(boc)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。
[0065]
(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0066]
9.his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0067]
(1)称取fmoc-his(boc)-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。
[0068]
(2)量取40ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0069]
10.boc-pyr-his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0070]
称取boc-pyr-oh/hbtu于50ml容器中，量取dmf20ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。
[0071]
2)用切肽试剂切肽后浓缩，得到戈那瑞林粗品。
[0072]
优选地，步骤2)中，所述的切肽试剂为：三氟乙酸溶液。
[0073]
优选地，步骤2)中，所述的戈那瑞林粗品的纯度可以达到95％。
[0074]
具体地，合成过程如下：
[0075]
将树脂肽用甲醇洗涤4遍，真空干燥24小时，配置切肽试剂三氟乙酸裂解液(tfa:h2o:tis＝95:2.5:2.5)，取15ml裂解液倒入反应器中反应30min，收集反应液，重复反应四遍，加200ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，真空干燥，称量得4.1g，产率86.7％，纯度93.6％，hplc分析图谱见附图1(分析方法：流动相：配制溶液a：0.1m磷酸溶液，三乙胺调ph至3，溶液a：乙腈＝85：15，等度洗脱；分析波长：220nm；)，ms图谱见附图2。
[0076]
实施例2
[0077]
100g树脂投料表如下：
[0078][0079][0080]
一种改进的戈那瑞林的固相合成方法，包括以下步骤：
[0081]
1)以酰胺树脂为固相载体，以fmoc保护氨基酸为单体，末端为boc保护的pyr，以哌嗪为脱帽试剂，在缩合剂的作用下，依次逐个接上氨基酸，合成戈那瑞林；
[0082]
1.gly-树脂的合成：
[0083]
(1)将树脂称于1000ml多肽反应器中，量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0084]
(2)称取fmoc-gly-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0085]
2.pro-gly-树脂的合成：
[0086]
称取fmoc-pro-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0087]
3.arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0088]
称取fmoc-arg(pbf)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应3小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0089]
4.leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0090]
称取fmoc-leu-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0091]
5.gly-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0092]
称取fmoc-gly-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0093]
6.tyr(tbu)-gly-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0094]
称取fmoc-tyr(tbu)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0095]
7.ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0096]
称取fmoc-ser(tbu)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0097]
8.trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0098]
称取fmoc-trp(boc)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0099]
9.his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0100]
称取fmoc-his(boc)-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。量取800ml脱帽试剂(质量浓度为3％哌嗪/dmf溶液)，倒入树脂中，反应20min。dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阳性。
[0101]
10.boc-pyr-his(boc)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-gly-leu-arg(pbf)-pro-gly-树脂的合成：
[0102]
称取boc-pyr-oh/hbtu于1000ml容器中，量取dmf400ml加入，将其溶解，加入diea，混匀，倒入反应器中反应2小时，抽去反应液，dmf洗涤四遍，茚三酮检测为阴性。
[0103]
2)用切肽试剂切肽后浓缩，得到戈那瑞林粗品。
[0104]
具体地，粗品(pyr-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly-nh2)的合成过程为：
[0105]
将树脂肽用甲醇洗涤4遍，真空干燥24小时，配置三氟乙酸裂解液(tfa:h2o:tis＝95:2.5:2.5)，取300ml裂解液倒入反应器中反应30min，收集反应液，重复反应四遍，收集所有裂解液，浓缩，浓缩至少量时，加500ml冷乙醚沉淀，收集沉淀，用乙酸乙酯将沉淀洗涤3
遍，过滤收集沉淀，真空干燥，称量得84.25g，产率89.1％，纯度96.5％，hplc分析图谱见附图3(分析方法：流动相：配制溶液a：0.1m磷酸溶液，三乙胺调ph至3，溶液a：乙腈＝85：15，等度洗脱；分析波长：220nm)。
[0106]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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