一种珠星三块鱼特异性DNA分子标记及其应用的制作方法

一种珠星三块鱼特异性dna分子标记及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及一种鱼类种质提纯方法，具体涉及一种珠星三块鱼特异性dna分子标记及其品种鉴定和种质快速提纯的方法。


背景技术：

[0002]
三块鱼(tribolodon)是鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科三块鱼属几种土著经济种的统称，主要分布于太平洋西北部的日本海及一些内陆淡水河流，是唯一降海洄游的鲤科鱼类。在我国仅分布于绥芬河和图们江流域。三块鱼是传统的名贵珍稀鱼类，肉质细嫩、肉味鲜美，肉中蛋氨酸和赖氨酸等人体必需氨基酸含量比一般鱼类高，含有丰富的不饱和脂肪酸和维生素a、维生素d等。研究证明，三块鱼体内含有一种多糖黏蛋白质，有促进细胞发育、提高机体免疫力、降低胆固醇、防止动脉硬化和冠心病的功能，对代谢性疾病、身体虚弱等也有较好疗效。历史上，三块鱼与兴凯湖的大白鱼和乌苏里江的鲑鱼并称为“边塞三珍”。
[0003]
近年来，由于水域环境遭到破坏，加之污染和酷捕滥捞等多种自然和人为因素，三块鱼资源濒临枯竭。为了增加三块鱼的野生种群数量，我国东宁县鲑鱼孵化放流站(绥芬河)从1989年开始每年通过捕捞洄游产卵群体，通过人工繁殖、放流，补充三块鱼野生资源。三块鱼每年4-6月份由日本海分批溯河到我国绥芬河产卵，当地渔民根据洄游群体的婚姻色和洄游时间将其分为“金滩头”、“银滩头”和“黑滩头”3种。但是解剖学、同工酶、线粒体dna和核dna分子标记等越来越多的证据证实溯河到我国绥芬河产卵的三块鱼只有2种，分别为俗称金滩头的珠星三块鱼(t.hakonensis)和俗称黑滩头的三块鱼(t.brandtii)。
[0004]
珠星三块鱼和三块鱼两种鱼类形态相似，只有性成熟(4龄可达到性成熟)洄游产卵时其婚姻色，即体侧“红线”的分布和数量存在明显差异，因此可依据婚姻色进行分类判定。珠星三块鱼体侧表现为3条红线，而三块鱼在侧线下鳞靠近腹部有1条红线，还有很多个体的“红线”表型特征介于“二者”之间或不具备“红线”特征，不易判别。利用表型鉴定和分子标记检测发现，珠星三块鱼种质混杂严重，一些个体表型和基因组都出现了三块鱼特有的表型特征和基因痕迹。早期，日本学者miura masao和okataahihiro对珠星三块鱼和三块鱼两个物种早期发育进行了系统的形态学研究，利用载黑素细胞在体节不同位置区分这两个物种鱼苗(masao and ahihiro.1995.a study on morphological disrimation between triobolodonbrandtii and t.hakonensis at the early development stages.45:103-109.)。但此方法在实践操作中不易掌握，需要对相同发育时间上的不同种幼鱼进行细致的观察比较，筛选周期也较长。专利cn107365872b提供了一种利用微卫星引物ssr-1和ssr-2鉴定绥芬河三块鱼不同洄游群体的方法，可区分珠星三块鱼、三块鱼或二者的杂交。专利cn109439762a则提供了一种更为简化的分子标记引物对a8和a11，用于鉴定珠星雅罗鱼(珠星三块鱼)和三块鱼。
[0005]
dna序列辅助分类作为一个理想的辅助形态学分类手段，迄今已有30多年历史。2003年，herbert首次提出dna条形码(dna barcoding)定义，即通过使用短的、标准化的基因片段来进行物种鉴定，以提高真核生物识别的效率，同时使得dna序列辅助分类方法得到
一定程度的统一，加快发展进程。目前，dna条形码技术已经成为一个被广泛接受的物种鉴定工具，它重点强调了标准化和数据验证，亦被称为dna分类学。目前，线粒体细胞色素c氧化酶亚基i(coi)基因是动物dna条形码研究中使用最为广泛的标准基因，因为它具有：(1)适中的序列变异程度；(2)变异区域两端的序列高度保守；(3)序列长度适宜等特点。这一结论在许多鱼类、昆虫和鸟类等动物中均得到很好验证，但对于珠星三块鱼的研究尚未空白。
[0006]
由于三块鱼属的鱼类在形态方面非常相近，难以辨别，极易发生杂交、种质混杂的现象，而传统的筛选及种质提纯的手段耗费周期长，且不易操作，因此，亟需对种质不纯的珠星三块鱼进行提纯，科学指导珠星三块鱼的增殖放流，确保珠星三块鱼种质的纯正及其天然野生资源的可持续利用。


技术实现要素：

[0007]
针对上述不足，本发明提供了一种珠星三块鱼特异性dna分子标记、dna条形码及珠星三块鱼种质快速提纯的方法，操作简单、准确性高、周期短、且种质纯度高，有利于解决种质混杂的问题，为种质保护、合理利用及种质生物多样性提供了技术支撑。
[0008]
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
[0009]
一方面，本发明提供了一种与珠星三块鱼种质特异性紧密连锁的dna分子标记，所述的dna分子标记序列如seq id no:1所示。
[0010]
另一方面，本发明提供了一种扩增所述珠星三块鱼dna分子标记的引物对，所述的引物对包含引物gene-f和引物gene-r，所述的gene-f序列如seq id no:2所示，所述的gene-r序列如seq id no:3所示。
[0011]
又一方面，本发明提供了一种珠星三块鱼dna分子标记或扩增dna分子标记的引物对在珠星三块鱼品种鉴定、种质纯化或品种改良中的应用。
[0012]
又一方面，本发明提供了一种珠星三块鱼dna分子标记或扩增dna分子标记的引物对在制备用于珠星三块鱼品种鉴定、种质纯化或品种改良的工具中的应用。
[0013]
具体地，所述的工具为独立试剂或试剂盒。
[0014]
又一方面，本发明提供了一种用于珠星三块鱼的品种鉴定、种质纯化或品种改良的工具，所述的工具包含珠星三块鱼dna分子标记或扩增dna分子标记的引物对。
[0015]
具体地，所述的工具为独立试剂、试剂盒、dna指纹图谱卡或dna扩增和比对装置。
[0016]
进一步具体地，所述的工具还包含珠星三块鱼dna条形码序列及其扩增引物对，所述的珠星三块鱼dna条形码序列如seq id no:4所示；所述的珠星三块鱼dna条形码序列的扩增引物对包含coi-f和coi-r，所述的coi-f序列如seq id no:5所示，所述的coi-r序列如seq id no:6所示。
[0017]
又一方面，本发明提供了一种珠星三块鱼种质快速提纯的方法，所述的种质快速提纯方法包括以下步骤：
[0018]
(1)挑选珠星三块鱼体色特征个体，所述体色特征为珠星三块鱼体侧有三条红线；
[0019]
(2)将步骤(1)选出的个体提取基因组总dna；
[0020]
(3)对步骤(2)提取的dna进行鉴定，选主效单倍型为hap3的个体；
[0021]
(4)对步骤(3)选出个体的dna进行鉴定，选具有珠星三块鱼dna分子标记的个体；
[0022]
(5)将步骤(4)选出的个体进行自交，选取后代f1中符合珠星三块鱼单倍型、dna分
子标记和体色特征的个体。
[0023]
具体地，步骤(1)中，所述的三条红色分别位于珠星三块鱼侧线鳞、侧线鳞上和侧线鳞下。
[0024]
具体地，步骤(3)中，所述的dna鉴定方法为pcr。
[0025]
进一步具体地，步骤(3)中，所述的pcr反应体系为25μl，包括自制pcr buffer mix18μl，浓度10μmol/l的上下游引物各1μl，5u/l的taq dna聚合酶0.2μl，dna样本2μl，去离子灭菌水2.8μl；自制pcr buffer mix包括50mmol/l kcl、10mmol/l tris-hcl、0.10％tritonx-100、1.5mmol/l mgcl2、0.10％np-40、0.01％明胶和200μmol/l 4种dntp；其中，上下游引物为珠星三块鱼dna条形码序列的扩增引物coi-f和coi-r。
[0026]
进一步具体地，步骤(3)中，所述的pcr反应程序为95℃预变性3min；95℃变性15s，57.7℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min。
[0027]
进一步具体地，步骤(3)中，所述的pcr产物为珠星三块鱼dna条形码，所述的条形码有效序列长度为632bp。
[0028]
具体地，步骤(4)中，所述的dna鉴定方法为pcr。
[0029]
进一步具体地，步骤(4)中，所述的pcr反应体系为25μl，包括自制pcr buffer mix18μl，浓度10μmol/l的上下游引物各1μl，5u/l的taq dna聚合酶0.2μl，dna样本2μl，去离子灭菌水2.8μl；自制pcr buffer mix包括50mmol/l kcl、10mmol/l tris-hcl、0.10％tritonx-100、1.5mmol/l mgcl2、0.10％np-40、0.01％明胶和200μmol/l 4种dntp；其中，上下游引物为扩增珠星三块鱼特异性dna分子标记的引物gene-f和gene-r。
[0030]
进一步具体地，步骤(4)中，所述的pcr反应程序为95℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min。
[0031]
进一步具体地，步骤(4)中，所述的pcr产物为珠星三块鱼特异性dna分子标记，所述的dna分子标记有效序列长度为188bp。
[0032]
具体地，步骤(5)中，珠星三块鱼单倍型为hap3；珠星三块鱼dna分子标记有效序列长度为188bp；珠星三块鱼体色特征为体侧有三条红线，所述的三条红色分别位于侧线鳞、侧线鳞上和侧线鳞下。
[0033]
又一方面，本发明提供了一种珠星三块鱼品种鉴定的方法，所述的品种鉴定方法包括以下步骤：
[0034]
(1)表型鉴定，所述表型为珠星三块鱼体侧有三条红线；
[0035]
(2)对步骤(1)表型鉴定合格的珠星三块鱼个体提取基因组总dna；
[0036]
(3)对步骤(2)提取的dna进行主效单倍型鉴定，所述单倍型为hap3；
[0037]
(4)对步骤(3)鉴定单倍型为hap3的个体进一步进行珠星三块鱼dna分子标记鉴定。
[0038]
具体地，步骤(1)中，所述的三条红色分别位于珠星三块鱼侧线鳞、侧线鳞上和侧线鳞下。
[0039]
具体地，步骤(3)中，所述的主效单倍型鉴定方法为pcr。
[0040]
进一步具体地，步骤(3)中，所述的pcr反应体系为25μl，包括自制pcr buffer mix18μl，浓度10μmol/l的上下游引物各1μl，5u/l的taq dna聚合酶0.2μl，dna样本2μl，去离子灭菌水2.8μl；自制pcr buffer mix包括50mmol/l kcl、10mmol/l tris-hcl、0.10％
tritonx-100、1.5mmol/l mgcl2、0.10％np-40、0.01％明胶和200μmol/l 4种dntp；其中，上下游引物为珠星三块鱼dna条形码序列的扩增引物coi-f和coi-r。
[0041]
进一步具体地，步骤(3)中，所述的pcr反应程序为95℃预变性3min；95℃变性15s，57.7℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min。
[0042]
进一步具体地，步骤(3)中，所述的pcr产物为珠星三块鱼dna条形码，所述的条形码有效序列长度为632bp。
[0043]
具体地，步骤(4)中，所述的dna分子标记鉴定方法为pcr。
[0044]
进一步具体地，步骤(4)中，所述的pcr反应体系为25μl，包括自制pcr buffer mix18μl，浓度10μmol/l的上下游引物各1μl，5u/l的taq dna聚合酶0.2μl，dna样本2μl，去离子灭菌水2.8μl；自制pcr buffer mix包括50mmol/l kcl、10mmol/l tris-hcl、0.10％tritonx-100、1.5mmol/l mgcl2、0.10％np-40、0.01％明胶和200μmol/l 4种dntp；其中，上下游引物为扩增珠星三块鱼特异性dna分子标记的引物gene-f和gene-r。
[0045]
进一步具体地，步骤(4)中，所述的pcr反应程序为95℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min。
[0046]
进一步具体地，步骤(4)中，所述的pcr产物为珠星三块鱼特异性dna分子标记，所述的dna分子标记有效序列长度为188bp。
[0047]
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
[0048]
(1)本发明采用表型和基因型(线粒体dna条形码鉴定及核dna特异分子标记鉴定)筛选提高珠星三块鱼种质纯度，种质提纯操作简单，鉴定结果更为准确，可避免人工繁殖造成的种质混杂，保护种质资源。
[0049]
(2)为避免线粒体dna母性遗传的干扰，本发明进一步对表型为三线、主效单倍型为hap3的个体进行基因组特异性dna分子标记鉴定，排除了核基因组基因污染的情况，提高了珠星三块鱼种质的纯度。
[0050]
(3)本发明对自交后代f1再次进行dna条形码判定、dna分子标记鉴定和表型鉴定，从而进一步提高了种质提纯的稳定性。
[0051]
(4)本发明获得的子一代即自交后代f1在苗种阶段即可实现基因组提纯，待4年达性成熟可实现表型鉴定，从而实现种质提纯，缩短了提纯周期。
附图说明
[0052]
图1为珠星三块鱼原种(三线个体)及珠星三块鱼表型变异种(单线个体)对比图。
[0053]
图2为选取草鱼为外类群构建的系统进化树。
[0054]
图3为实施例5步骤5选出的珠星三块鱼个体中20尾性成熟个体(珠星三块鱼亲本)的特异性dna分子标记pcr产物凝胶电泳图。其中m为dna marker，序号1-20为所选出的20尾性成熟个体(珠星三块鱼亲本)。
[0055]
图4是实施例5步骤6后代f1进行特异性dna分子标记鉴定凝胶电泳图。其中m为dna marker，附图左侧序号1-10、11-20、21-30为步骤5选取的性成熟个体(亲本)，附图右侧序号1-10、11-20、21-30为步骤6选取的30尾自交子代个体(子代)。
具体实施方式
[0056]
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0057]
实施例1珠星三块鱼特异性dna分子标记及其引物对
[0058]
珠星三块鱼特异性dna分子标记序列如下所示(seqidno:1)：
[0059]
ctggggttgacaaagaatggtcagaaaaagtgaaaatatccagtgagcaggagttctgtgggttcgaggggatagaaaggcaacagtaactcaaataaccactcactgaggtctacagaagagcatctctgaatgcacaacatgtcgaaccttgaagcaaatgagctacagcagaaacgaacacacca。
[0060]
特异性dna分子标记序列的扩增引物序列如下所示：
[0061]
gene-f(seq id no:2)：5
’-
ctggggttgacaaagaatggt-3
’
；
[0062]
gene-r(seq id no:3)：5
’-
tggtgtgttcgtttctgctg-3
’
。
[0063]
实施例2珠星三块鱼dna条形码及其引物
[0064]
珠星三块鱼dna条形码序列如下所示(seq id no:4)：
[0065]
ggggaccgctttaagccttctcattcgggctgaattaagtcaacccgggtcacttctaggtgacgaccaaatttataacgttattgttactgcccacgccttcgtaataattttctttatagtgatgccaattcttatcggaggatttggaaattgactggtgccactaatgattggggcacctgacatggcattcccccgaataaataatataagcttctgactactaccgccatcattcctactactactagcctcttctggcgttgaagccggagctgggacaggatgaacagtatacccaccacttgcaggcaacctcgcccacgcaggagcatcagtagacttaacaatcttctctttacatctggcaggtgtatcatctatcctaggggcagtaaattttattactacaattattaatatgaaacccccagccatctcccagtaccaaacacccttatttgtatggtccgtactcgtaacagccgtcctcctccttctgtcgctaccagtcctagctgccggaattacaatgctccttacagaccgtaacctaaacactacattctttgacccagcaggcggaggcgacccaattctgtatcaacacctattctgattctttggtc。
[0066]
珠星三块鱼dna条形码序列的扩增引物序列如下所示：
[0067]
coi-f(seq id no:5)：5
’-
tcaaccaaccacaaagacattggcac-3
’
；
[0068]
coi-r(seq id no:6)：5
’-
tagacttctgggtggccaaagaatca-3
’
。
[0069]
实施例3珠星三块鱼种质鉴定的方法
[0070]
1.珠星三块鱼表型鉴定：挑选珠星三块鱼特有体色特征的个体，即珠星三块鱼体侧有三条红线，分别位于侧线鳞、侧线鳞上和侧线鳞下的个体。
[0071]
2.将步骤1选出的个体进行基因组总dna的提取：
[0072]
提取步骤为：剪取少量95％乙醇保存的鳍条，用滤纸吸干乙醇，放入2ml离心管中，加入600μldna提取裂解液，置于55℃过夜消化，其中dna提取裂解液成分包括：1mol/l tris(ph8.0)、5mol/l nacl、0.5mol/l edta(ph8.0)、10％sds和200μg/ml蛋白酶k；次日加入等体积的酚/氯仿混合液(体积比1:1)抽提1次，12000r/min室温离心10min，吸取上清(约550μl)加入1ml无水乙醇沉淀，12000r/min室温离心10min，70％乙醇洗涤1次，室温干燥10min，加入0.1
×
te溶解。采用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性，nanodrop 8000(thermo fisher scientific,ma,usa)测定dna浓度后稀释至10ng/μl，4℃保存备用。
[0073]
3.对步骤2提取的基因组总dna进行pcr反应，对珠星三块鱼dna条形码序列进行判
定，选主效单倍型为hap3的个体。
[0074]
其中，pcr反应体系为25μl，包括自制pcr buffer mix18μl，浓度10μmol/l的上下游引物各1μl，5u/l的taq dna聚合酶0.2μl，dna样本2μl，去离子灭菌水2.8μl；自制pcr buffer mix包括50mmol/l kcl、10mmol/l tris-hcl、0.10％tritonx-100、1.5mmol/l mgcl2、0.10％np-40、0.01％明胶和200μmol/l 4种dntp；其中，上下游引物为实施例2中珠星三块鱼dna条形码序列的扩增引物coi-f和coi-r。
[0075]
pcr反应程序为95℃预变性3min；95℃变性15s，57.7℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min。
[0076]
珠星三块鱼dna条形码coi有效序列长度为632bp。pcr扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测合格后，进行测序。经与实施例2中珠星三块鱼dna条形码序列对比一致后，选取主效单倍型为hap3的个体。
[0077]
4.将步骤3选出的个体的基因组总dna进行pcr反应，进行珠星三块鱼特异性dna分子标记鉴定，选具有珠星三块鱼种质特异性dna分子标记的个体。
[0078]
其中，pcr反应体系为25μl，包括自制pcr buffer mix18μl，浓度10μmol/l的上下游引物各1μl，5u/l的taq dna聚合酶0.2μl，dna样本2μl，去离子灭菌水2.8μl；自制pcr buffer mix包括50mmol/l kcl、10mmol/l tris-hcl、0.10％tritonx-100、1.5mmol/l mgcl2、0.10％np-40、0.01％明胶和200μmol/l 4种dntp；其中，上下游引物为实施例1中扩增珠星三块鱼特异性dna分子标记的引物gene-f和gene-r。
[0079]
pcr反应程序为95℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min。
[0080]
珠星三块鱼特异性dna分子标记有效序列长度为188bp。pcr扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，选取具有珠星三块鱼特异性dna分子条带的个体，也可通过测序，选取与实施例1中的珠星三块鱼特异性dna分子标记序列一致的个体。
[0081]
实施例4珠星三块鱼种质提纯的方法
[0082]
步骤1-4同实施例3。
[0083]
5.将步骤4选出的个体进行自交，后代f1进行dna条形码判定和特异性dna分子标记鉴定，选出符合珠星三块鱼特征的个体，即具有以下特征：dna条形码鉴定有效序列长度为632bp，单倍型为hap3(或通过序列比对一致)；特异性dna分子标记鉴定有效序列长度为188bp(或通过序列比对一致)；具有特有体色特征，即体侧有三条红线，所述的三条红色分别位于侧线鳞、侧线鳞上和侧线鳞下，完成珠星三块鱼的提纯。
[0084]
实施例5珠星三块鱼快速种质提纯
[0085]
1.选取中国水产科学研究院黑龙江水产研究所呼兰实验站室外池塘养殖的4龄野生珠星三块鱼。
[0086]
2.珠星三块鱼表型鉴定：
[0087]
通过体色鉴别发现野生珠星三块鱼具有两种体色，一种具有珠星三块鱼特有体色特征，三条红线，分别位于侧线鳞、侧线鳞上及侧线鳞下，另一种则具有三块鱼特有体色特征，单条红线，位于侧线鳞下。从162尾上述两种体色纯正个体中选择出体色特征为三条红线的93尾个体。
[0088]
3.对162尾野生珠星三块鱼进行电子标记，并分别进行基因组总dna提取。提取步
mix包括50mmol/l kcl、10mmol/l tris-hcl、0.10％tritonx-100、1.5mmol/l mgcl2、0.10％np-40、0.01％明胶和200μmol/l 4种dntp；其中，上下游引物为实施例1中扩增珠星三块鱼特异性dna分子标记的引物gene-f和gene-r。
[0098]
pcr反应程序为95℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min。
[0099]
珠星三块鱼特异性dna分子标记有效序列长度为188bp。pcr扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，选取出的88尾珠星三块鱼凝胶电泳条带一致，均可扩增出与野生珠星三块鱼一致的条带，并未出现三块鱼特有dna谱带，选取其中20尾珠星三块鱼凝胶电泳结果图进行展示，如图3所示。
[0100]
6.将步骤5选取的88尾珠星三块鱼个体进行自交，后代f1提取基因组总dna，进行dna条形码序列判定和特异性dna分子标记鉴定，选出单倍型为hap3、有珠星三块鱼特异性dna分子标记以及体侧有三条红线的个体确定为提纯得到的种质资源。
[0101]
如图4所示，后代f1进行特异性dna分子标记鉴定，各选取30尾亲本及30尾子代f1，其子代f1凝胶电泳结果与亲本珠星三块鱼一致，证明其种质资源的基因型与亲本一致。
[0102]
实施例6验证
[0103]
将获得的种质资源进行自交得到f2代1500尾，f2代全部个体体侧有三条红线、单倍型为hap3并具有珠星三块鱼特异性dna分子标记。验证结果说明，本发明提纯方法有效、稳定、可靠。
[0104]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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