一株曲霉菌株GW13及其应用的制作方法

2021-02-02 02:02:18|

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一株曲霉菌株gw13及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及曲霉生产杂色曲霉毒素的技术领域。

背景技术：

[0002]
杂色曲霉毒素(st)主要由杂色曲霉、焦曲霉、变色曲霉、爪曲霉、毛壳霉及黄曲霉等产生。这些霉菌广泛存在于小麦、大麦、玉米、花生、大豆等粮食，产毒量最高的是杂色曲霉。
[0003]
杂色曲霉毒素是致癌性真菌毒素之一。其毒性虽弱于黄曲霉毒素，但由于主要的产毒菌杂色曲霉、构巢曲霉等在食品饲料中分布广，产毒比例高，故对人、畜、家禽的危害不容忽视。
[0004]
真菌毒素是粮食生产过程中的必检项目，常用的真菌毒素检测方法包括效液相色谱法、气相色谱法和酶联免疫以及一些色谱-质谱联用技术，但是这些检测目前大多依靠进口标准物质最为对照品，无法实现国产。
[0005]
如何制备高纯度的杂色曲霉毒素标准品一直是本领域没有解决的技术难题。

技术实现要素：

[0006]
本发明的第一目的是提供一株曲霉(aspergillus sp)菌株gw13，属于曲霉(aspergillus sp)，该菌株已于2020年7月16日作为专利菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏中心登记入册编号cgmcc no.19931。
[0007]
本发明的第二目的是提供利用该菌株发酵并纯化制得杂色曲霉毒素的应用。
[0008]
进一步地，所述杂色曲霉毒素结构式如式i所示：
[0009][0010]
本发明有效解决了制备高纯度的杂色曲霉毒素标准品这一行业技术难题。
附图说明
[0011]
图1为式i化合物的1h核磁共振图谱。
[0012]
图2为式i化合物的
13
c核磁共振图谱。
具体实施方式
[0013]
实施例1
[0014]
1.菌株gw13的采集
[0015]
2019年9月从陕西省咸阳市收集的玉米中分离到一株菌，命名为菌株gw13。
[0016]
2.菌株gw13的鉴定
[0017]
菌株gw13的bt部分序列见序列表的序列1(seq id no.1)，与genbank accession no.jn854007.1的序列相似性最高，相似性为99.5％。
[0018]
根据以上鉴定结果，菌株gw13属于曲霉(aspergillus sp)。
[0019]
3.菌株gw13的保藏
[0020]
菌株gw13，属于曲霉(aspergillus sp)，已于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏中心登记入册编号cgmcc no.19931。
[0021]
4.菌株gw13制备杂色曲霉毒素
[0022]
1)取在-80℃甘油管中保藏的菌株gw13，用接种环接种于平皿马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基上，28℃静置培养5-10天。所述pda培养基为：40g potato dextrose agar干粉(美国gibco公司)，蒸馏水定容至1000ml，115℃灭菌30min。
[0023]
2)用无菌水冲洗步骤1中的平皿pda培养基收集真菌孢子液，将所收集的孢子液接种到含有发酵培养基的1000ml三角瓶中，28℃静置培养20天得到发酵物；所述发酵物是由孢子、菌丝及所述固体培养基培养基组成。
[0024]
所述步骤2中，所述pda培养基上的孢子液的接种量为所述发酵培养基(由大米、玉米、小麦和糙米等和水组成的培养基)重量优选5％；所述由大米、玉米、小麦和水组成的培养基中，所述大米、玉米、小麦和水的重量份数比为100g：100ml；
[0025]
所述发酵的条件可为20-35℃，如28℃固体静置培养，7-35天(具体可为20天)。
[0026]
发酵培养基：玉米、大米、小麦、糙米等，并不限于这四种培养基。玉米培养基：将200g大米在200ml水中浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌20min。大米培养基：将200g玉米渣在200ml水中浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌20min。小麦培养基：将200g小麦在200ml水中浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌20min。糙米培养基：将200g糙米在200ml水中浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌20min。
[0027]
3)在步骤2得到的三角瓶(含固体发酵物)中加入2.0l有机试剂(乙酸乙酯:甲醇＝4:1)，室温浸提24h，收集上清液，并重复提取3次，合并上清液。上清液利用旋转蒸发仪减压蒸馏至干燥，得到粗提物。
[0028]
4)将步骤3中得到的粗提物利用二氯甲烷和甲醇混合溶剂(1:1)溶解并与硅胶混合(粗浸膏与硅胶的质量比为1：2)，待溶剂挥发后，进行吸附层析分离(吸附层析分离为薄层层析硅胶柱分离，所述凝胶柱的型号为sephadex lh-20)，先用二氯甲烷洗脱两次，再用二氯甲烷与甲醇的混合液洗脱五次，二氯甲烷与甲醇的体积比依次为：99：1、99：1、98：2、98：2和97：3依次得到7个馏分。
[0029]
5)将步骤4依次得到的7个馏分中第7个馏分用体积比为2：1的二氯甲烷和甲醇的
混合液作为洗脱液吸附层析(凝胶柱层析)分离，每50ml收集1份，依次得到5个馏分，将所述5个馏分中第5个馏分纯化(用反相色谱柱进行纯化，流动相为体积百分浓度为65％的甲醇水溶液；该反相色谱柱可为型号为rp-18的agilent反相色谱柱，色谱柱的柱长为250mm，内径为9.4mm，检测波长254纳米)后，得到如下式i所述化合物：
[0030][0031]
数值表式如i化下：合物的1h核磁共振图谱(如图1)和
13
c核磁共振图谱(如图2)
[0032][0033]
式i化合物的hplc纯度色谱图(如图3)。峰面积分析其中式i含量为99.17％。

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