一种磁性虚拟模板分子印迹聚合物及其制备方法、应用与流程

[0001]
本发明涉及分离分析技术领域，特别是涉及一种磁性虚拟模板分子印迹聚合物及其制备方法、应用。


背景技术：

[0002]
窄叶鲜卑花是是蔷薇科鲜卑花属植物，是藏族民间的常用药物，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫系统和抗肝损伤等多种功效。
[0003]
萜类成分是窄叶鲜卑花降脂的主要活性成分，其含有的多种活性成分赋予了其一定的经济价值、药用价值。目前，多采用溶剂提取法或超声波提取法，部分人还会采用超声辅助水蒸气蒸馏法或水蒸气蒸馏法。
[0004]
由于窄叶鲜卑花中成分复杂，传统的提取分离方法步骤繁琐、溶剂消耗量大、制备周期长、提取效率低，亟需一种提取效率更高的方法或试剂。


技术实现要素：

[0005]
本发明的一个目的在于提出一种分离萜类物质的磁性虚拟模板分子印迹聚合物。
[0006]
一种磁性虚拟模板分子印迹聚合物，包括以下组分：
[0007]
磁性fe3o4@sio2@c＝c纳米微粒10-50份，
[0008]
4-乙烯基吡啶10-30份，
[0009]
乙二醇二甲基丙烯酸酯200-300份，
[0010]
偶氮二异丁腈10-20份。
[0011]
根据本发明提出的磁性虚拟模板分子印迹聚合物，不仅具备较规则球形和较好的尺寸范围，还具备超顺磁性、良好的热稳定性及晶型稳定性。
[0012]
本发明的另一个目的在于提出一种上述磁性虚拟模板分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
[0013]
(1)将10-30份的虚拟模板分子的京尼平苷和4-乙烯基苯甲酸超声溶解于乙腈中，得到混合物溶液，静置；
[0014]
(2)制备磁性fe3o4@sio2@c＝c纳米微粒，向所述混合物溶液中加入所述磁性fe3o4@sio2@c＝c纳米微粒，超声处理后摇匀，得到混合物；
[0015]
(3)向所述混合物中加入乙二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈，超声混合均匀，充入氮气，进行聚合反应后静置，得到聚合混合物；
[0016]
(4)对所述聚合混合物进行磁力分离沉降，除去上层液体，用洗脱液反复对沉降的固体物质进行洗脱，直至无虚拟模板分子京尼平苷检出为止，得到所述磁性虚拟模板分子印迹聚合物。
[0017]
根据本发明提出的制备方法，该方法简单，减少溶剂消耗，缩短提取时间，简化了窄叶鲜卑花中萜类化合物的分离提取过程。
[0018]
另外，根据本发明提供的制备方法，还可以具有如下附加的技术特征：
[0019]
进一步地，在所述步骤(4)中，所述洗脱液为甲醇和乙酸的混合溶液，二者的体积比为5-10:1。
[0020]
进一步地，所述磁性fe3o4@sio2@c＝c纳米微粒的制备步骤包括：
[0021]
将fe3o4@sio2磁性纳米微粒超声分散于甲苯中，搅拌的同时逐滴加入3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷；
[0022]
待反应结束后，用磁铁吸附反应沉淀物，除去上层液体，用无水乙醇和双蒸水洗涤多次，真空干燥，得到磁性fe3o4@sio2@c＝c纳米微粒。
[0023]
进一步地，所述fe3o4@sio2磁性纳米微粒的质量、甲苯体积、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷体积比为(0.3-0.5)g:(100-300)ml:(2-8)ml。
[0024]
进一步地，所述3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的滴加速度为2.0-3.0ml/min，搅拌速度为200-300rpm，搅拌温度为20-30℃，搅拌时间为10-15h。
[0025]
本发明还提出一种上述的磁性虚拟模板分子印迹聚合物的应用，包括以下步骤：
[0026]
吸附，提取窄叶鲜卑花干燥地上部分的干燥粗提物，将所述干燥粗提物溶于甲醇溶剂中，加入所述磁性虚拟模板分子印迹聚合物，混合均匀，在室温条件下于恒温振荡器内振摇吸附，得到吸附混合物；
[0027]
沉降，将所述吸附混合物在外部磁场作用下沉降3min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，采用hplc检测上清液中鲜卑花单萜苷的浓度，并收集沉降的磁性虚拟模板分子印迹聚合物，得到沉降物；
[0028]
洗涤，向所述沉降物中加入洗涤溶液，反复洗涤多次后，在外部磁场作用下，沉降3min，收集洗涤后的沉降物，再次执行2次洗涤，得到洗涤物；
[0029]
洗脱，向洗涤物中加入ph值为5-8的洗脱溶液，搅拌30min后，在外部磁场作用下，沉降5min，收集洗脱液，即为提取分离后的鲜卑花萜类物质溶液。
[0030]
根据本发明提出的应用，对鲜卑花萜类化合物吸附量高，有较好的选择性识别能力和重复利用性，可以快速、准确的从窄叶鲜卑花粗提物中分离并富集萜类物质。
[0031]
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0032]
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0033]
图1是本发明实施例1的磁性虚拟模板分子印迹聚合物的电子显微镜检测结果；
[0034]
图2是本发明实施例1的磁性虚拟模板分子印迹聚合物的红外光谱检测结果；
[0035]
图3是本发明实施例1的磁性虚拟模板分子印迹聚合物的热重分析结果；
[0036]
图4是测定鲜卑花单萜苷吸光度的标准曲线图；
[0037]
图5是本发明实施例1的磁性虚拟模板分子印迹聚合物的对鲜卑花单萜苷的吸附量-时间曲线图；
[0038]
图6是本发明实施例1的磁性虚拟模板分子印迹聚合物的吸附量-浓度曲线图；
[0039]
图7是本发明实施例1的磁性虚拟模板分子印迹聚合物选择性识别能力柱状图；
[0040]
图8是本发明实施例1的磁性虚拟模板分子印迹聚合物的重复利用率柱状图；
[0041]
图9是本发明实施例1的性虚拟模板分子印迹聚合物的实际样品应用高效液相色谱图，其中(a)sibiskoside的标准峰，(b)窄叶鲜卑花粗提物原液，(c)dmips吸附后的粗提物，(d)dmips的洗脱物。
具体实施方式
[0042]
为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
[0043]
实施例1
[0044]
一种磁性虚拟模板分子印迹聚合物，包括以下组分：
[0045]
磁性fe3o4@sio2@c＝c纳米微粒30份，
[0046]
4-乙烯基吡啶20份，
[0047]
乙二醇二甲基丙烯酸酯200份，
[0048]
偶氮二异丁腈10份。
[0049]
上述磁性虚拟模板分子印迹聚合物通过如下方法进行制备。
[0050]
1.磁性fe3o4纳米粒子的制备：
[0051]
将13.5g三氯化铁超声溶解于500ml乙二醇中，加入36g无水乙酸钠，在300rpm的条件下机械搅拌30min后，转移至1l不锈钢反应釜中进行反应，在200℃、100rpm的条件下持续反应6h；
[0052]
反应结束后，静置冷却至室温，得到有明显的细小黑色颗粒物悬浮的棕褐色液体，用磁铁吸附黑色产物，除去上层液体，用无水乙醇和双蒸水洗涤多次，在60℃下真空干燥12h，得到磁性fe3o4纳米粒子。
[0053]
具体的，上述的洗涤处理过程如下：
[0054]
①
交替使用100ml无水乙醇和100ml的双蒸水洗涤固体产物；
[0055]
②
用磁铁进行磁力分离沉降，除去上清液体后得到固体产物；
[0056]
③
重复步骤
①
和步骤
②
3次。
[0057]
2.磁性fe3o4纳米微粒的硅烷化：
[0058]
向上述得到的0.4g磁性fe3o4纳米粒子中加入50ml的0.5mol/l柠檬酸钠水溶液，超声分散后用磁铁进行磁力分离沉降，去除上清液，加入40ml双蒸水和160ml异丙醇，超声混合均匀后进行机械搅拌，搅拌同时以滴加速度为2.0ml/min逐滴加入滴加6ml氨水和3ml正硅酸乙酯，在室温下以300rpm的搅拌速度持续搅拌12h；
[0059]
反应结束后，用磁铁吸附棕褐色产物，除去上层液体，用无水乙醇和双蒸水洗涤多次，在60℃下真空干燥12h，得到硅烷化磁性fe3o4纳米微粒。
[0060]
上述的洗涤处理过程如下：
①
交替使用100ml无水乙醇和100ml的双蒸水洗涤固体产物；
[0061]
②
用磁铁进行磁力分离沉降，除去上清液体后得到固体产物；
[0062]
③
重复步骤
①
和步骤
②
3次。
[0063]
3.乙烯基修饰的磁性fe3o4@sio2纳米粒子的制备：
[0064]
将上述得到的0.2gfe3o4@sio2磁性纳米微粒，加入200ml甲苯，超声分散后，以滴加速度为2ml/min逐滴加入4ml的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，滴加完成后，在室温下以300rpm的搅拌速度持续搅拌12h，反应结束后，用磁铁吸附灰褐色产物，除去上层液体，用无水乙醇和双蒸水洗涤多次，在60℃下真空干燥12h，得到磁性fe3o4@sio2@c＝c纳米微粒。
[0065]
上述的洗涤处理过程如下：
[0066]
①
交替使用100ml无水乙醇和100ml的双蒸水洗涤固体产物；
[0067]
②
用磁铁进行磁力分离沉降，除去上清液体后得到固体产物；
[0068]
③
重复步骤
①
和步骤
②
3次。
[0069]
4.分离窄叶鲜卑花萜类物质的磁性虚拟模板分子印迹聚合物的制备：
[0070]
(1)将19.4mg虚拟模板分子京尼平苷和26.3mg功能单体4-乙烯基吡啶超声溶解于20ml乙腈中，然后静置4h；
[0071]
(2)加入上述得到的50mg磁性fe3o4@sio2@c＝c纳米微粒，超声振荡摇匀后静置1h；
[0072]
(3)加入297.3mg交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和20mg引发剂偶氮二异丁腈，超声混合均匀，充入氮气10min，并密封反应瓶，在60℃恒温摇床上振荡24h，使之充分反应；
[0073]
(4)聚合反应结束后，通过磁铁分离收集印迹聚合物。用体积比为9：1的甲醇-乙酸溶液反复洗涤，直至紫外检测不到虚拟模板分子京尼平苷。最后，用甲醇洗涤至中性，并在在60℃下真空干燥12h，得到分离窄叶鲜卑花萜类物质的磁性虚拟模板分子印迹聚合物。
[0074]
磁性虚拟模板分子印迹聚合物从窄叶鲜卑花中分离萜类物质的应用按以下步骤进行：
[0075]
i.吸附，将窄叶鲜卑花干燥地上部分干燥粗提物溶于甲醇溶剂中，加入所制备的磁性虚拟模板分子印迹聚合物，混合均匀后在室温条件下于恒温振荡器振摇吸附；
[0076]
ii.沉降，在外部磁场作用下，沉降3min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，经hplc检测上清液中鲜卑花单萜苷的浓度，并收集沉降的磁性虚拟模板分子印迹聚合物；
[0077]
iii.洗涤，向步骤2)收集到的磁性虚拟模板分子印迹聚合物中加入洗涤溶液，反复洗涤多次后，在外部磁场作用下，沉降3min，收集洗涤后沉降的磁性虚拟模板分子印迹聚合物；
[0078]
iv.重复步骤iii操作3次；
[0079]
v.洗脱，向步骤4)得到的磁性虚拟模板分子印迹聚合物中加入ph值为5-8的洗脱溶液，搅拌30min后，在外部磁场作用下，沉降5min，收集洗脱液,即为提取纯化后的鲜卑花单萜苷溶液。
[0080]
为了进一步说明本实施例，对上述所得的磁性虚拟模板分子印迹聚合物分别进行电子显微镜检测、红外光谱检测、热重分析、吸附量检测、吸附选择性检测和重复利用效率检测，结果见图1至8。
[0081]
从图1可以看出，该磁性虚拟模板分子印迹聚合物呈球形，粒径较大，但是表面明显粗糙，纳米粒子之间出现粘连，这和印迹聚合反应发生在载体的表面有关，表明分子印迹层是多孔结构，说明磁性虚拟模板分子印迹聚合物制备成功。
[0082]
从图2可以看出，该磁性虚拟模板分子印迹聚合物在590cm-1
左右出现fe-o的伸缩振动的主要特征吸收峰，证明fe3o4纳米粒子合成；在1097cm-1
和470cm-1
处有两个分别归属
于si-o的伸缩和弯曲振动的强峰，，表明sio2成功包裹上fe3o4；在1627cm-1
处的存在归属于硅烷偶联剂mps上的碳碳双键的伸缩振动峰；在1730cm-1
处出现交联剂egdma中c＝o结构的伸缩振动特征峰，说明分子印迹层成功包裹。
[0083]
从图3可以看出，该磁性虚拟模板分子印迹聚合物在100℃左右产生的重量损失主要是由于聚合物上残留的有机溶剂和水的蒸发；从200℃持续升温到600℃时，磁性虚拟模板分子印迹聚合物的质量在280℃到430℃之间发生快速下降，主要是由于印迹分子层受热分解。当温度超过430℃后，磁性虚拟模板分子印迹聚合物的质量几乎保持恒定，表明当温度低于280℃时，印迹聚合物具有良好的热稳定性。
[0084]
具体的，在进行吸附量检测时，采用如下过程：
[0085]
首先选用紫外分光光度法来绘制鲜卑花单萜苷的标准曲线(图4)。准确配制浓度为100mg/l的鲜卑花单萜苷甲醇溶液，分别移取0、0.3、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0ml定容到10ml容量瓶，用紫外分光光度计在221nm处测定吸光度，以甲醇作为空白对照，得标准曲线和回归方程。回归方程为y＝0.0422x+0.0129，其中横坐标为鲜卑花单萜苷含量(mg/l)，纵坐标为吸光值(abs)，标准误差r2＝0.9997；
[0086]
分别准确称取5mg的虚拟模板分子印迹聚合物和非虚拟模板分子印迹聚合物，加入5ml浓度为100mg/l的鲜卑花单萜苷的甲醇溶液，混合均匀后，在35℃恒温振荡器中振荡10、20、40、60、80、100、120、150min，用磁铁吸附，移取1ml上清液，用甲醇定容至10ml，以甲醇为空白对照，测定上清液中鲜卑花单萜苷吸光度值，计算质量浓度；
[0087]
再配制浓度为30、60、90、120、150、180、240、300mg/l的目标化合物鲜卑花单萜苷的甲醇溶液，准确移取5ml的不同浓度的溶液，分别加入5mg的虚拟模板分子印迹聚合物和非虚拟模板分子印迹聚合物，在35℃恒温振荡器中振荡2h后，用磁铁吸附，移取1ml上清液，用甲醇定容至10ml，以甲醇为空白测定最大吸光度，计算上清液中鲜卑花单萜苷质量浓度。根据计算结果，制作等温吸附曲线。
[0088]
采用下式计算不同吸附时间下印迹聚合物的吸附量，并制作相应的吸附动力学曲线，见图5和图6：
[0089]
q
e
＝(c
o
－c
e
)v/m，
[0090]
式中，q
e
(mg/g)为印迹材料的吸附量，c
o
(mg/l)和c
e
(mg/l)为sibiskoside的起始和平衡后质量浓度，v(l)为溶液体积，m(mg)为印迹材料的质量。
[0091]
从图5和图6可以看出，测试例的分离窄叶鲜卑花萜类物质的磁性虚拟模板分子印迹聚合物对鲜卑花单萜苷的吸附量随着时间的增加而逐渐增大，但是吸附速率逐渐减小。吸附动力学曲线变化表明，在0～20min内，印迹材料的吸附速度较快，吸附量增加迅速；20～40min内，吸附量增加变慢，吸附速度逐渐变缓，直至趋于稳定；40min后基本达到吸附平衡。对比dnips的吸附曲线，dmips对目标化合物的吸附速度更快，吸附量更高。随着溶液中鲜卑花单萜苷质量浓度的增加，吸附材料对鲜卑花单萜苷的吸附量也逐渐增加，当目标化合物浓度超过200mg/l时，dmips和dnips的吸附量趋于饱和，dmips和dnips的吸附量有明显的区别，dmips的吸附量最高达到14.67mg/g，是dnips吸附量的2倍左右，吸附效率较高。
[0092]
具体的，对磁性虚拟模板分子印迹聚合物进行吸附选择性的检测的过程如下：
[0093]
选取穿心莲内酯、虎杖苷、熊果苷、咖啡酸和槲皮素作为竞争性化合物，通过选择性吸附实验考察dmips对目标化合物是否具有较高的亲和力和选择性。称取5mg的dmips和
dnips，分别加入到5ml的200mg/lsibiskoside、穿心莲内酯、虎杖苷、熊果苷、咖啡酸和槲皮素的甲醇溶液中，在恒温振荡器上振荡至吸附平衡后，用磁铁吸附印迹材料，移取上清液1ml，用甲醇定容至10ml。
[0094]
通过紫外-可见分光光度计分别在单体化合物的最大吸收波长处测定吸光度值，计算印迹聚合物对竞争性化合物的吸附量，结果如图7所示，dmips对sibiskoside的吸附量远高于对其他结构类似物的吸附量，说明dmips对sibiskoside具有较好的专一识别能力。
[0095]
具体的，对磁性虚拟模板分子印迹聚合物进行重复利用效率检测的过程如下：
[0096]
称取5mg的dmips，加入5ml浓度为200mg/l的鲜卑花单萜苷甲醇溶液，在35℃恒温振荡器中振荡2h后，移取上清液1ml并用甲醇定容至10ml，以甲醇作空白测定最大吸光度，计算吸附量。将dmips用甲醇-乙酸(9：1，v/v)洗涤数次至检测不到鲜卑花单萜苷sibiskoside，收集后再用甲醇润洗，挥干溶剂并在60℃下真空干燥，按以上步骤重复试验6次。
[0097]
请参阅图8，经过6次反复洗脱吸附后，dmips对目标化合物的印迹效果仍保持在80％左右。
[0098]
另外，再对该磁性虚拟模板分子印迹聚合物进行实际样品应用检测，过程如下：
[0099]
称取10mg的dmips，与5ml的窄叶鲜卑花粗提物溶液甲醇溶液混合，在恒温振荡器上振荡6h后，通过磁铁吸附分离印迹材料和溶液，用体积比为9：1的甲醇-乙酸溶液洗脱dmips数次后，挥干溶剂并用甲醇溶解，将粗提物甲醇提取液、dmips吸附后溶液和dmips洗脱物溶液通过0.22μm微孔滤膜，用hplc进行检测。sibiskoside标准品峰用于确定保留时间。
[0100]
从图9可以看出，dmips对sibiskoside的吸附要高于对粗提物中其他组分的吸附，具有较好的选择性吸附和富集能力，可以用于窄叶鲜卑花中萜类化合物的分离与纯化。
[0101]
实施例2
[0102]
本实施例与实施例1的不同之处在于：
[0103]
步骤(1)中所述的乙二醇的体积为300ml，无水乙酸钠的质量为20g。
[0104]
实施例3
[0105]
本实施例与实施例1的不同之处在于：
[0106]
所述步骤(2)中双蒸水的体积为60ml，异丙醇溶液的体积为140ml。其他步骤和参数与实施例1相同。
[0107]
实施例4
[0108]
本实施例与实施例1的不同之处在于：
[0109]
所述步骤(2)中正硅酸乙酯的体积为5ml，氨水的体积为8ml。
[0110]
实施例5
[0111]
本实施例与实施例1的不同之处在于：
[0112]
所述步骤(2)中的氨水和正硅酸乙酯的滴加速度为3.0ml/min。
[0113]
实施例6
[0114]
本实施例与实施例1的不同之处在于：
[0115]
所述步骤(3)中甲苯体积为300ml、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷体积为8ml。
[0116]
实施例7
[0117]
本实施例与实施例1的不同之处在于：
[0118]
所述步骤(4)中京尼平苷的质量为25.0mg、4-乙烯基吡啶的质量为30.0mg、乙腈的体积为25ml。
[0119]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0120]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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