一种甲状腺多基因联合检测试剂盒的制作方法

[0001]
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种甲状腺多基因联合检测试剂盒。


背景技术：

[0002]
甲状腺结节是人群中普遍存在的一种甲状腺疾病，是甲状腺细胞在局部异常生长所引发的病变。大多数情况下，甲状腺结节是良性的，可以采取保守治疗的方式，但也有5%-10%的甲状腺结节是恶性的，即甲状腺癌，需要早期手术治疗，才能获得良好的预后效果。目前，通过细针穿刺（fna）的方法获取甲状腺细胞，进行细胞学检查是当今评估甲状腺结节是否为恶性肿瘤的金标准。然而，仍有20%-30%的甲状腺结节无法通过这种方式获得明确诊断。
[0003]
随着分子生物学技术的进展，分子诊断在甲状腺结节良恶性的鉴别诊断中，逐渐受到人们的关注。美国国立综合癌症网络（nccn）2019年版的临床实践指南中明确指出：（1）对细针穿刺无法确定的疑似滤泡型及hurthle细胞癌（诊断依据为血管或包膜的浸润），分子检测有助于判定其良恶性；（2）细胞学无法明确诊断的结节，利用分子诊断的技术，检测braf、ras、ret/ptc、pax8/pparγ等癌基因的变异对辅助诊断甲状腺癌具有重要作用。
[0004]
目前的研究表明基因融合是甲状腺癌发病的决定性因素之一，癌症基因组计划（the cancer genome atlas）绘制的甲状腺癌的遗传图谱提示，基因融合占据了甲状腺癌基因突变的20%左右。因此鉴定出甲状腺癌组织中的基因融合及相关基因突变情况对于甲状腺癌的精准诊断和治疗有重要意义。
[0005]
目前基因融合的检测，主要依赖于实时荧光定量pcr（real time pcr，rt-pcr）、荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，fish）和免疫组化（immunohistochemistry，ihc）等。fish和ihc均采用探针杂交原理对已知的基因融合进行检测，一般一次仅检测一种类型的基因融合，操作流程复杂，成本较高；rt-pcr具有相对较高的检测通量，但需要的样品量较多，实验操作步骤多，检测费用较高。对于标志性突变位点通常采用特异性引物进行pcr检测。但没有发现对于甲状腺结节能够实现一个试剂盒的一管反应同时检出基因融合突变和点突变。
[0006]
中国专利cn111349694a公开了一种甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法及试剂盒，虽然能检测ret/ptc1融合、ret/ptc3融合及pax8-pparg重排这三种甲状腺癌相关基因融合突变情况，但不能检测braf、kras、nras、hras、tertp等点突变。
[0007]
又如中国专利cn110241215b公开了一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的引物及试剂盒，可以同时检测6个基因的15个位点的变异以及3个融合基因变异，其中包括braf基因、kras基因、hras基因、nras基因、tert基因、eif1ax基因和ret/ptc1融合、ret/ptc3融合、pax8/pparγ融合，但该技术方案存在以下缺点：对于融合基因伴侣基因检测范围较小，只能检测ptc1/ret和ptc3/ret两种融合类型；构建的dna测序文库复杂度低，易产生假阳性；操作复杂，需要独立进行rna和dna两份文库构建。
[0008]
再如cn110878358a公开了一组甲状腺癌标志物及其应用，该专利针对甲状腺分子
分型、靶向用药、化疗用药、手术提示、预后及遗传相关的44种基因的全外显子区域，进行高深度测序同时分析基因的snv/indel、基因融合等多种变异类型，深度解析甲状腺结节以及甲状腺癌的分子层面信息，针对44种基因设计的捕获探针，覆盖了558个靶向目标区域，探针包括3633条序列，大小共计254.096kbp，制备的试剂盒覆盖面广，性价比高，实效性强，可以对甲状腺患者进一步的分子分型、用药提示、遗传风险评估等提供参考依据，适于临床推广应用。缺点是：液相杂交成本较高，且操作流程复杂。
[0009]
而传统的荧光pcr法检测则存在每次只能检测一个位点，需要的样品量较多；检测成本较高；实验操作数量较多，检测程序耗时长等缺陷。
[0010]
综上，上述方法均只能对已知的基因融合检测或对点突变进行检测，并且受限于检测通量的限制，无法对甲状腺肿瘤致癌的融合基因和点突变实现一次性的全检测。而据众多研究报道，甲状腺癌的致病性基因融合已经超过40种，并且有大量的新的基因融合及基因突变被陆续报道。因此，开发一种能快速同时检测融合基因和点突变的试剂盒，对于甲状腺癌的临床研究和诊断具有重要的意义。


技术实现要素：

[0011]
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是为了能同时检测甲状腺肿瘤相关多基因的、已知及未知基因融合和突变情况，提供了一种甲状腺多基因联合检测试剂盒，通过对送检样品的dna和rna共同提取，对rna进行逆转录成cdna后，与dna一起进行高通量测序文库构建，并进行高通量测序，能一次性检测包括ccdc6-ret/ncoa4-ret融合及pax8/pparγ融合，braf(v600e)、hras(61)、nras(61)、kras(12,13)、kras(61)、tertp等多种点突变，可以为甲状腺癌患病个体提供精准诊断和治疗，并可为甲状腺结节患者进行癌症风险评估。
[0012]
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案。
[0013]
一方面，本发明提供了一组用于检测融合基因和点突变的特异性复合引物，所述的特异性复合引物的序列如下表1所示。
[0014]
表1 特异性复合引物序列
名称引物序列检测位点通用引物1（seqidno:10）aatgatacggcgaccaccgagat和特异性引物1-8分别配对特异性引物1（seqidno:11）gtgactggagttcagacgtgcgctcttccgatccttccgagggaattcccactttggatccccdc6-ret/ncoa4-ret特异性引物2（seqidno:12）gtgactggagttcagacgtgcgctcttccgatcgggccagaatggcatctctgtgtcaaccpax8/pparγ特异性引物3（seqidno:13）gtgactggagttcagacgtgcgctcttccgatcctgttcaaactgatgggacccactccatcgbraf(v600e)特异性引物4（seqidno:14）gtgactggagttcagacgtgcgctcttccgatcaccggaagcaggtggtcattgatgghras(61)特异性引物5（seqidno:15）gtgactggagttcagacgtgcgctcttccgatccctcatgtattggtctctcatggcactgtnras(61)特异性引物6（seqidno:16）gtgactggagttcagacgtgcgctcttccgatcagctgtatcgtcaaggcactcttgcckras(12,13)特异性引物7（seqidno:17）gtgactggagttcagacgtgcgctcttccgatcaaagccctccccagtcctcatgtkras(61)特异性引物8（seqidno:18）gtgactggagttcagacgtgcgctcttccgatcaggacgcagcgctgcctgaaactcgctertp
基于上述引物序列，本发明的第一目的在于：提供一种甲状腺多基因联合检测试剂盒。
[0015]
所述的甲状腺多基因联合检测试剂盒包括本发明上述的：（1）检测融合基因和点突变的特异性复合引物。
[0016]
所述的甲状腺多基因联合检测试剂盒还包括：（2）一种dna文库构建的专用接头。
[0017]
所述的dna文库构建的专用接头为接头引物1分别和8条不同的i5端引物构成的8个二聚体。
[0018]
所述的接头引物1和8条不同的i5端引物的序列如下表2所示。
[0019]
表2 专用接头序列
专用接头引物序列接头引物1（seqidno:1）gatcggaagagccacatactgai5端1号引物（seqidno:2）aatgatacggcgaccaccgagatctacacctctctatacactctttccctacacgacgctcttccgatcti5端2号引物（seqidno:3）aatgatacggcgaccaccgagatctacactatcctctacactctttccctacacgacgctcttccgatcti5端3号引物（seqidno:4）aatgatacggcgaccaccgagatctacacgtaaggagacactctttccctacacgacgctcttccgatcti5端4号引物（seqidno:5）aatgatacggcgaccaccgagatctacacactgcataacactctttccctacacgacgctcttccgatcti5端5号引物（seqidno:6）aatgatacggcgaccaccgagatctacacaaggagtaacactctttccctacacgacgctcttccgatcti5端6号引物（seqidno:7）aatgatacggcgaccaccgagatctacacctaagcctacactctttccctacacgacgctcttccgatcti5端7号引物（seqidno:8）aatgatacggcgaccaccgagatctacaccgtctaatacactctttccctacacgacgctcttccgatcti5端8号引物（seqidno:9）aatgatacggcgaccaccgagatctacactctctccgacactctttccctacacgacgctcttccgatct
所述的专用接头具有附图1所示的结构。其中，所述的5_index的序列为：ctctctat、tatcctct、gtaaggag、actgcata、aaggagta、ctaagcct、cgtctaat或tctctccg。
[0020]
所述的专用接头包括附图2所示的8个接头结构。
[0021]
所述的甲状腺多基因联合检测试剂盒还包括：（3）一组文库扩增复合引物，所述的文库扩增复合引物的序列如下表3所示。
[0022]
表3 文库扩增复合引物序列
名称引物序列通用引物2（seqidno:19）aatgatacggcgaccaccgi7端1号引物（seqidno:20）caagcagaagacggcatacgagattcacaagcgtgactggagttcagacgtgti7端2号引物（seqidno:21）caagcagaagacggcatacgagatactacacggtgactggagttcagacgtgti7端3号引物（seqidno:22）caagcagaagacggcatacgagatatcgtacggtgactggagttcagacgtgti7端4号引物（seqidno:23）caagcagaagacggcatacgagatagacacaggtgactggagttcagacgtgti7端5号引物（seqidno:24）caagcagaagacggcatacgagatttgtcctggtgactggagttcagacgtgti7端6号引物（seqidno:25）caagcagaagacggcatacgagattgtgagaggtgactggagttcagacgtgti7端7号引物（seqidno:26）caagcagaagacggcatacgagataaggttgggtgactggagttcagacgtgti7端8号引物（seqidno:27）caagcagaagacggcatacgagatattagccagtgactggagttcagacgtgt
本发明提供的试剂盒中，上述（1）-（3）项试剂独立包装。
[0023]
作为优选的实施方案，本发明的第一个目的提供的试剂盒还包括以下任意一个或多个试剂组：反转录反应试剂组；dna片段化、末端修复及加碱基a试剂组；dna连接试剂组；pcr扩增试剂组；高保真热启动pcr扩增试剂组。
[0024]
需要特别说明的是，本发明提供的检测融合基因和点突变的特异性复合引物是本发明的第二个目的。所述的检测融合基因和点突变的特异性复合引物被用于与非本发明提供的其他接头配合来进行ccdc6-ret/ncoa4-ret、pax8/pparγ、braf(v600e)、hras(61)、nras(61)、kras(12,13)、kras(61)和tertp检测的产品或相关方法也应当属于本发明这一目的所包含的范围。
[0025]
具体地，所述的反转录反应试剂组包括随机引物、第一链合成缓冲液、第一链合成酶混合液、第二链合成缓冲液、第二链合成酶混合液和超纯水。
[0026]
具体地，所述的dna片段化、末端修复及加碱基a试剂组包括10
×
dna片段化缓冲液、5
×
片段化酶混合液和超纯水。
[0027]
具体地，所述的dna连接试剂组包括5
×
连接酶缓冲液、tianseq dna连接酶、专用
接头和超纯水。
[0028]
具体地，所述的pcr扩增试剂组包括5
×
多重pcr反应酶混合液、pcr引物和超纯水。
[0029]
具体地，所述的高保真热启动pcr扩增试剂组包括高保真热启动酶反应液和超纯水。
[0030]
本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，也就是非疾病检测性的甲状腺多基因联合检测方法。
[0031]
所述的使用方法包括以下步骤：s1.使用dna文库构建的专用接头连接检测样本dna；s2.使用检测融合基因和点突变的特异性复合引物对步骤s1的连接产物进行复合pcr扩增；s3.使用文库扩增复合引物对步骤s2获得的扩增产物进行pcr扩增，获得测序文库；s4.对步骤s3获得的测序文库进行测序。
[0032]
作为一些优选的实施方案，所述的使用方法包括以下步骤：（1）提取样本中的dna和rna；（2）将步骤（1）所得的rna进行逆转录制备cdna；（3）将步骤（2）所得的cdna与步骤（1）所得的dna混合后，进行核酸片段化、末端修复及加a，得cdna与dna混合液；（4）将步骤（3）所得的cdna与dna混合液进行接头连接并纯化，得纯化后的接头连接产物；（5）将步骤（4）所得的纯化后的接头连接产物进行第一步特异性pcr并纯化，得第一步pcr纯化产物；（6）将步骤（5）所得的第一步pcr纯化产物进行第二步通用pcr并纯化，得测序文库；（7）上机测序；（8）生物信息学分析软件对进行数据结果分析。
[0033]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果。
[0034]
1、就本发明的整体构思而言，本发明实现了融合基因和点突变的同时检测。
[0035]
2、就本发明针对文库构建的设计构思而言。
[0036]
传统扩增子文库构建检测基因位点突变时，使用双引物扩增（参见附图3的示意图），生成的文库双端位置固定，导致某个位置的测序序列无法有效去除扩增导致的序列重复，从而无法识别降低扩增过程中引入的随机突变，导致灵敏度降低。
[0037]
而本发明对cdna和dna进行随机打断后，在dna两端连接通用引物，一端采用特异性引物扩增，一端采用通用引物，保留其中一段的随机性，从而可以有效识别重复测序序列。参见附图4的示意图。
[0038]
3、就本发明检测融合基因和点突变的特异性复合引物的设计而言。
[0039]
融合基因是指将两个或多个基因的编码区首尾相连．置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下，构成的嵌合基因。例如ccdc6-ret/ncoa4-ret，其中ret为核心基因，ccdc6、ncoa4为伴侣基因，融合基因通常有多个伴侣基因，并且融合断点往往不一样。
[0040]
因此传统扩增子文库构建需要同时知晓伴侣基因和核心基因两个基因，并且断点
位置也已知的情况下，进行引物设计检测。容易遗漏断点未知，或者伴侣基因未知的融合类型。
[0041]
本发明通过将单引物设置在核心基因上，不必事先知道断点或伴侣基因，在引物扩增过程中，都能够将序列包含在文库中，通过测序识别伴侣基因及断点位置。二者对比参见附图5的示意图。
[0042]
4、就整个检测流程而言。
[0043]
传统液相杂交捕获文库流程偏长，涉及约24个步骤，耗时20-24h，操作过程复杂，本试剂盒发明精简操作流程至11个步骤和耗时缩短至6-8h，参见附图6的示意图。
[0044]
5、与其他检测技术的比较（1）与利用sanger测序法检测braf(v600e)、hras(61)、nras(61)、kras(12,13)、kras(61)、tertp等突变位点比较sanger测序法敏感性较低，灵敏度较低，只能达到10%。本发明试剂盒利用高通量测序法，每次测序每个突变并行测序10000次以上。灵敏度可达到0.1%。
[0045]
sanger测序法操作复杂，每管反应只能检测一个位点。本发明试剂盒通过加入多个位点的检测引物，并进行高通量测序可同时检测上述所有位点。
[0046]
（2）与利用arms_pcr法检测上述突变比较利用arms_pcr法突变操作复杂，每管反应只能检测一个至三个位点；而本发明试剂盒通过加入多个位点的检测引物，并进行高通量测序可同时检测上述所有位点。另外，arms_pcr法无法利用mrna检测融合基因，本发明试剂盒可以检测。
[0047]
（3）与利用rt-pcr法检测融合基因比较rt-pcr的检测方法检测效率较低，一次只能检测一种类型融合，本发明试剂盒通过同时加入多组引物，可实现多种融合同时检测。rt-pcr只能检测已知种类，限定特定断点的融合基因类型，本发明则克服了这一缺陷。
[0048]
6、本发明整体技术方案利用高通量测序法，每次测序每个突变并行测序10000次以上，结合整体构思、文库构建的设计构思，以及“（1）dna文库构建的专用接头；（2）检测融合基因和点突变的特异性复合引物；（3）文库扩增复合引物”的设计构思，一方面实现了同时检测上述所有位点（融合基因和多个突变位点）；另一方面从多方面多角度提升检测灵敏度，灵敏度可达到0.1%。而常规检测方法（例如利用sanger测序）敏感性较低，灵敏度较低，只能达到10%。
[0049]
综上，相对于现有技术，本发明提供了一种灵敏度更高的，能够实现融合基因和突变位点同时检测的甲状腺多基因联合检测试剂盒。
附图说明
[0050]
图1为专用接头结构。
[0051]
图2为专用接头的8个接头结构。
[0052]
图3为构建传统扩增子文库检测基因位点突变。
[0053]
图4为构建本发明单引物文库检测基因位点突变。
[0054]
图5为构建传统扩增子文库与本发明单引物文库检测融合基因的比较。
[0055]
图6为构建液相杂交捕获文库与本发明单引物文库的比较。
[0056]
图7为本发明试剂盒使用方法的实验流程图。
[0057]
图8为本发明单引物扩增文库构建流程图。
[0058]
图9为采用本发明试剂盒检测ccdc6-ret融合阳性的结果。
[0059]
图10为采用本发明试剂盒检测kras-g12d突变阳性的结果。
[0060]
图11为通过随机末端去重提升灵敏度原理图。
[0061]
图12为传统双端引物扩增子文库检测kras-g12d点突变的背景突变频率。
[0062]
图13为本发明“通用引物+特异性引物”检测kras-g12d点突变的背景突变频率。
[0063]
图14为两种不同的引物对ccdc6-ret阳性样品的检测结果。上半部分为特异性引物1，下半部分为ret其他测试引物。
[0064]
图15为两种不同的引物对kras g12d阳性样品的检测结果。
[0065]
图16为临床样品编号19474（ncoa4-ret）的检测结果。左半部分为ncoa4，右半部分为ret。
[0066]
图17为临床样品编号19753（pax8/pparγ）的检测结果。左半部分为pax8，右半部分为pparγ。
[0067]
图18为braf(v600e)：braf p.v600e reference standard的检测结果。
[0068]
图19为nras(61)：nras p.q61h reference standard的检测结果。
[0069]
图20为tertp：19225（野生型）的检测结果。箭头所指处为tertp启动子区域。
[0070]
图21为hras(61)：19387（野生型）的检测结果。
[0071]
图22为kras(61)：kras p.q61h reference standard的检测结果。
具体实施方式
[0072]
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0073]
试剂：随机引物、第一链合成酶混合液、第一链合成缓冲液、第二链合成缓冲液、第二链合成酶混合液，均购自天根生化科技（北京）有限公司，货号：tianseq rna片段化及cdna合成模块（ng308）。
[0074]
10
×
dna片段化缓冲液、5
×
片段化酶混合液购自天根生化科技（北京）有限公司，货号：tianseq快速dna片段化/末端修复/da添加模块（ng301）。
[0075]5×
连接酶缓冲液、tianseq dna连接酶购自天根生化科技（北京）有限公司，货号：tianseq快速连接模块（ng303）。
[0076]
1.6x磁珠购自天根生化科技（北京）有限公司，货号：tianseq dna片段分选磁珠（ng306）。
[0077]5×
多重pcr反应酶混合液购自takara，货号：multiplex pcr assay kit ver.2，rr062a。
[0078]
高保真热启动酶反应液购自天根生化科技（北京）有限公司，货号：tianseq高保真pcr反应预混液（ng219）。
[0079]
实施例1 dna文库构建的专用接头、检测融合基因和点突变的特异性复合引物、文库扩增复合引物的设计（1）检测融合基因和点突变的特异性复合引物一组用于检测融合基因和点突变的特异性复合引物，特异性复合引物的序列如表1所示。
[0080]
（2）dna文库构建的专用接头一种dna文库构建的专用接头，为接头引物1分别和8条不同的i5端引物构成的8个二聚体。
[0081]
接头引物1和8条不同的i5端引物的序列如表2所示。
[0082]
专用接头具有如图1所示的结构。其中，所述的5_index的序列为：ctctctat、tatcctct、gtaaggag、actgcata、aaggagta、ctaagcct、cgtctaat或tctctccg。
[0083]
因此，专用接头包括如图2所示的8个接头结构。
[0084]
（3）一组文库扩增复合引物，文库扩增复合引物的序列如表3所示。
[0085]
实施例2 甲状腺多基因联合检测试剂盒及其使用方法一种甲状腺多基因联合检测试剂盒，包括实施例1中的：（1）检测融合基因和点突变的特异性复合引物；（2）dna文库构建的专用接头；（3）文库扩增复合引物。
[0086]
上述试剂盒还包括：反转录反应试剂组；dna片段化、末端修复及加碱基a试剂组；dna连接试剂组；pcr扩增试剂组；高保真热启动pcr扩增试剂组。
[0087]
其中，反转录反应试剂组包括随机引物、第一链合成缓冲液、第一链合成酶混合液、第二链合成缓冲液、第二链合成酶混合液和超纯水；dna片段化、末端修复及加碱基a试剂组包括10
×
dna片段化缓冲液、5
×
片段化酶混合液和超纯水；dna连接试剂组包括5
×
连接酶缓冲液、tianseq dna连接酶、专用接头和超纯水；pcr扩增试剂组包括5
×
多重pcr反应酶混合液、pcr引物和超纯水；高保真热启动pcr扩增试剂组包括高保真热启动酶反应液和超纯水。
[0088]
本发明提供的试剂盒中，上述（1）-（3）项试剂独立包装。
[0089]
上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：s1.使用dna文库构建的专用接头连接检测样本dna；s2.使用检测融合基因和点突变的特异性复合引物对步骤s1的连接产物进行复合pcr扩增；s3.使用文库扩增复合引物对步骤s2获得的扩增产物进行pcr扩增，获得测序文库；s4.对步骤s3获得的测序文库进行测序。
[0090]
具体步骤如下（如图7、图8所示）。
[0091]
一、cdna逆转录1、第一链cdna合成（1）试剂准备：将样本中提取的rna置于冰上缓慢解冻后移液器混匀，随机引物从-20℃取出，解冻后轻弹混匀，将第一链合成酶混合液从-20℃取出，轻弹混匀。
[0092]
（2）在pcr管中建立如下表4反应体系，并用移液器轻轻吹打充分混匀。
[0093]
表4 反应体系组分名称体积（μl）
rnax（1000ng）随机引物1超纯水10-x总量11（3）将上述反应体系于65℃孵育5分钟，然后置于冰上2分钟。
[0094]
（4）步骤（3）结束后，在原管中继续加入下表5所列的逆转录组分。
[0095]
表5 逆转录组分组分名称体积（μl）步骤3结束反应液11第一链合成缓冲液7第一链合成酶混合液2总量20（5）用移液器轻轻吹打充分混匀，进行第一链cdna合成反应，热盖温度105℃。
[0096]
反应程序：25℃保持10分钟；42℃保持15分钟；70℃保持15分钟；4℃保温。
[0097]
注意：反应结束后立即进行cdna第二链的合成反应。
[0098]
2、第二链cdna合成（1）将第二链合成缓冲液和第二链合成酶混合液从-20℃取出，轻弹混匀，在pcr管中建立如下表6反应体系，并用移液器轻轻吹打充分混匀。
[0099]
表6 反应体系组分名称体积（μl）合成的第一链cdna20第二链合成缓冲液8.5第二链合成酶混合液3.5超纯水48总量80（2）在pcr仪中进行第二链cdna合成反应，pcr热盖温度设定为≤40℃。
[0100]
反应步骤：16℃保持60分钟；4℃保温。
[0101]
注意：反应结束后，cdna第二链的合成产物可在4℃暂存1小时，但是建议反应结束后立即进行下步纯化步骤。
[0102]
（3）纯化1.8x纯化磁珠纯化cdna第二链的合成产物，37μl洗脱，进行cdna定量，得到cdna样品。
[0103]
二、cdna与样品提取的dna混合取50ngcdna样品和同一份样本中提取的50ngdna样品等量混合，得到cdna和dna混合液100ng。
[0104]
三、文库构建：核酸片段化、末端修复及加a1、配制如下表7反应体系，冰上操作，各组分加入后，请轻柔吸打混匀，注意不要涡旋。
[0105]
表7 反应体系（当dna上样量>10ng）组分名称体积（μl）10
×
dna片段化缓冲液5
cdna和dna混合液x超纯水35-x5
×
片段化酶混合液10总量502、设置pcr仪反应程序。开启热盖，热盖温度设置为70℃。
[0106]
反应程序：4℃保持1分钟；32℃保持7分钟；65℃保持30分钟；4℃保温。
[0107]
片段化时间选择参考下表8。
[0108]
表8 片段化时间的选择-32℃片段化时间（分钟）dna主峰大小250bp350bp450bp550bp10ngdna上样量24161410100ngdna上样量1610861000ngdna上样量148643、反应结束后，立即进入接头连接步骤。
[0109]
四、文库构建：接头连接1、在上一步骤反应结束管中直接加入下表9组分。
[0110]
表9 接头连接组分组分体积（μl）步骤三片段化反应产物505
×
连接酶缓冲液20tianseqdna连接酶10专用接头（15μm）2.5水17.5总量100其中，专用接头包括如图2所示的8个接头结构。
[0111]
注：一个样品一次只用以上8种中任选的一种接头结构。设置8种接头结构的原因是为区分不同的样品，保证能够同时测序多个样品。
[0112]
2、将上一步骤的反应液用移液器吸打混匀，放入pcr仪，进行如下反应（无热盖）。
[0113]
反应程序：20℃保持15分钟；4℃保温。
[0114]
3、1.6x磁珠纯化接头连接产物，16μl超纯水洗脱，取15μl上清液到新的pcr管中，进行第一步pcr扩增反应。
[0115]
五、第一步多重pcr扩增1、使用多重pcr反应体系，进行pcr，反应体系如下表10。
[0116]
表10 pcr反应体系组分每反应量（μl）5
×
多重pcr反应酶混合液410μm的特异性引物（8条）混合物1.2（每条引物终浓度0.1μm）5μm的通用引物1（现取现用）0.6（终浓度0.15μm）步骤四获得的纯化后的接头连接产物x超纯水14.2-x
总量20其中，特异性引物（8条）混合物包括特异性引物1-8（seq id no:11-18）。
[0117]
特异性引物（8条）混合物的混合方案如下表11所示。
[0118]
表11 特异性引物（8条）混合物的混合方案
引物名称8条引物各引物100μm混入量（μl）20μl反应体系引物终浓度（μm）特异性引物110.1特异性引物210.1特异性引物310.1特异性引物410.1特异性引物510.1特异性引物610.1特异性引物710.1特异性引物810.110μm引物mix总量8 2、反应混合液配好后，移液器吹打10次混匀，放入pcr仪，运行下面的反应程序（热盖105℃）。
[0119]
反应程序：99℃保持2分钟，1个循环；99℃保持15s，69℃保持4分钟，18个循环；72℃保持10分钟，1个循环；4℃保温。
[0120]
3、pcr结束后，电泳。1.6x磁珠纯化，得到第一步pcr扩增产物，qubit定量。
[0121]
六、第二步pcr扩增1、取第一步pcr扩增产物进行第二步pcr扩增，扩增体系如下表12。
[0122]
表12 扩增体系组分反应量（μl）高保真热启动酶反应液25i7-primer（10μm）1.5通用引物2（10μm）1.5第一步pcr纯化产物x水22-x总量50其中，i7端引物为i7端1号引物-i7端8号引物（seq id no:20-27）中任选一种。一个样品的检测只用一种i7端引物，设置八种i7端引物的原因是为区分不同的样品，保证能够同时测序多个样品。
[0123]
2、第二步pcr扩增反应混合液配好后，移液器吹打10次混匀，放入pcr仪，运行下面的反应程序（热盖105℃）。
[0124]
反应程序：初始变性95℃保持3分钟，1个循环；变性98℃保持20sec，退火58℃保持15sec，延伸72℃保持15sec，8个循环；终延伸72℃保持1分钟，1个循环；4℃保温。
[0125]
3、pcr反应结束后，qubit定量，电泳。
[0126]
4、1.3x磁珠纯化，10μl超纯水洗脱。qubit定量。
[0127]
5、文库稀释到2-3ng/μl，进行agilent 4150 tapestation 系统检测。
[0128]
6、测序上机。
[0129]
7、生物信息学分析软件对进行数据结果分析。
[0130]
试验例1采用本发明实施例2记载的方法针对临床样品进行检测。
[0131]
检测结果如图9和图10所示，检出该样本为ccdc6-ret融合阳性以及kras-g12d突变阳性。
[0132]
试验例2完全相同的样本和检测环境下，传统双引物的灵敏度数据与本发明“通用+特异”引物的灵敏度数据对比。
[0133]
传统双引物的灵敏度数据与本发明的差异主要是，在文库构建过程中的pcr过程会产生一定的碱基错误，此错误会随着pcr循环数的增加呈指数增长，最终导致测序数据背景突变增高，为有效识别真实的原始存在于样品本身的突变，必须将阳性判断限值提高，以保证足够的检测特异性。
[0134]
本发明的的优势在于，通过一端的随机位置，可以有效识别多条reads是否来源于同一个原始dna模板，对于来源于同一个原始dna模板，将进行去重处理，只保留其中一条，因此可有效降低背景突变，从而可以将阳性判断限制降低，从而提高灵敏度。
[0135]
原理如图11所示。传统双端引物扩增子文库，背景突变频率为0.3、0.4，真实突变频率为0.5，不能有效区分背景突变和真实突变，导致灵敏度较低。本发明通用引物+特异性引物文库，根据随机端位置进行去重，背景突变频率为0.28，真实突变频率为0.71，有效区分背景突变和真实突变，提升灵敏度。
[0136]
通过实际测试，统计各位点背景突变情况和最终确定的阳性判断值如下表13。
[0137]
表13 各位点背景突变情况和最终确定的阳性判断值
位点传统平均背景突变频率传统阳性判断值本发明平均背景突变频率本发明阳性判断值kras-g12d2.32%4%0.61%0.9%nras-q612.73%4%0.38%0.6%hras-q611.69%3%0.49%0.7%braf-v6002.21%4%0.57%0.7%
其中，对于kras-g12d点突变标准品，采用传统双端引物扩增子文库检测，如图12所示，背景突变频率分别为1.9%、1.2%，。kras-g12d真实突变频率为2.6%，在此种背景下，需要kras-g12d突变频率大于4%才能被判定为阳性。采用本发明“通用引物+特异性引物”检测并根据随机端进行去重效果，如图13所示，背景突变频率分别为0.6%、0.3%，。kras-g12d真实突变频率为2.2%，在此种背景下，需要kras g12d突变频率大于0.9%即可被判定为阳性。
[0138]
试验例3在其它检测条件完全一致的情况下，将本发明中的特异性复合引物中的一条或两条进行替换后，无法获得完美检测结果的对比试验。
[0139]
1、ccdc6-ret不同的特异性引物对比测试特异性引物1：gtgactggagttcagacgtgcgctcttccgatccttccgagggaattcccactttggatcc其他测试引物：gtgactggagttcagacgtgcgctcttccgatctctaccttccggcaacggaactggtga
相同条件下，两种不同的引物对ccdc6-ret阳性样品检测。结果如表14和图14所示。
[0140]
表14 两种不同的引物对ccdc6-ret阳性样品的检测结果 ccdc6测序深度ret测序深度阳性判断特异性引物137226122阳性其他测试引物93555弱阳性以上结果说明，其他测试引物相比于特异性引物1，对ccdc6-ret检测敏感性降低。
[0141]
2、kras g12d不同的特异性引物对比测试特异性引物6：gtgactggagttcagacgtgcgctcttccgatcagctgtatcgtcaaggcactcttgcc其他测试引物：gtgactggagttcagacgtgcgctcttccgatcagcatcgtcaaggcactcttgcc相同条件下，两种不同的引物对kras g12d阳性样品检测。结果如表15和图15所示。
[0142]
表15 两种不同的引物对kras g12d阳性样品的检测结果 kras测序深度阳性判断特异性引物636429阳性其他测试引物1062阴性以上结果说明，其他测试引物相比于特异性引物6，对kras g12d检测的敏感性降低。
[0143]
试验例4采用本发明实施例2记载的方法对其他位点捕获效果进行测试。突变类型、样本编号及来源如表16所示。结果如图16-22所示，均能检测到。
[0144]
表16 其他位点捕获效果测试突变类型样品名称/编号样品来源ncoa4-ret19474临床样品pax8/pparγ19753临床样品braf(v600e)brafp.v600ereferencestandard南京科佰生物nras(61)nrasp.q61hreferencestandard南京科佰生物kras(12,13)krasp.g12dreferencestandard南京科佰生物tertp19225（野生型）临床样品hras(61)19387（野生型）临床样品kras(61)krasp.q61hreferencestandard南京科佰生物最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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