一株产苹果酸的米曲霉菌株的筛选及其应用的制作方法

[0001]
本发明涉及一株产苹果酸的米曲霉菌株的筛选及其应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

[0002]
苹果酸(malate)，分子式为c4h6o5，又名2-羟基丁二酸，其粉末呈白色结晶状，苹果酸是一种非常重要的四碳平台化合物，与琥珀酸、富马酸一起被美国能源部列为四碳1,4-二羧酸组中最有潜力的生物基大宗化学品。由于苹果酸分子结构式中有一个手性碳原子，所以在自然界中存在三种形式：d型、l型、dl型，其中l-苹果酸是tca循环中的中间产物，在细胞质中的nadh通过苹果酸-天冬氨酸途径穿梭进入线粒体的过程中起到十分关键的作用。苹果酸具有令人愉悦的香味，在食品工业中主要用作酸味剂，据报道，世界上每年的苹果酸需求量超过了20万吨。使用化学法合成dl-苹果酸的技术从六十年代被发明以来一直沿用至今。生物法生产l-苹果酸拥有低污染、低能耗、低成本与可持续发展等优点，已经发展成为合成l-苹果酸的主流方法，其中包括酶催化法和微生物发酵法。酶催化法已经应用于l-苹果酸的工业生产，而微生物发酵法生产苹果酸的水平需得到进一步提高。


技术实现要素：

[0003]
为进一步提高苹果酸的产量，本申请通过artp、ntg、
60
coγ射线迭代复合诱变，筛选获得一株高苹果酸的米曲霉，并将其应用于苹果酸的发酵中，以使得苹果酸的产量得到更大的提高。
[0004]
本发明提供了一株米曲霉(aspergillusoryzae)，为菌株fmme-s-38，已于2020年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2020294，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
[0005]
本发明提供了一种微生物菌剂，所述菌剂中含有所述菌株fmme-s-38。
[0006]
在本发明的一种实施方式中，将菌株fmme-s-38接种于pda平板中，28～35℃下培养65～75h，待菌株fmme-s-38的孢子浓度达到107cfu/ml以上时加入缓冲液(生理盐水或ph值为7的0.2m磷酸盐缓冲液)冲洗米曲霉孢子得到孢子悬液，在无菌环境下加入保护剂，得到微生物菌剂。
[0007]
在本发明的一种实施方式中，所述保护剂为15g/100ml的葡萄糖溶液。
[0008]
本发明提供了一种生产苹果酸的方法，以所述菌株fmme-s-38为发酵菌株，或添加所述微生物菌剂。
[0009]
在本发明的一种实施方式中，所述菌株fmme-s-38在单位体积ml或单位质量g的发酵体系中孢子个数处于105～107数量级。
[0010]
在本发明的一种实施方式中，发酵体系中的氮源可以为胰蛋白胨，所述胰蛋白胨的初始浓度为6～6.5g/l。
[0011]
在本发明的一种实施方式中，在发酵第18～24小时补加氮源。
[0012]
在本发明的一种实施方式中，补加的氮源为胰蛋白胨，所述胰蛋白胨在体系中的
浓度为2～3g/l。
[0013]
在本发明的一种实施方式中，将含有孢子个数为109～10
10
数量级的150ml的种子培养基以10ml/100ml的转接量，接种至发酵培养基，在32～37℃，150～200rpm下发酵。
[0014]
在本发明的一种实施方式中，种子培养基中含有葡萄糖50～55g/l，酵母粉10～12g/l，kh2po
4 0.5～0.8g/l，kh2po
4 0.5～0.8g/l，nacl 0.1～0.5g/l。
[0015]
本发明提供了一种提高苹果酸产量的方法，利用所述菌株fmme-s-38，或所述微生物菌剂，转化生成苹果酸。
[0016]
在本发明的一种实施方式中，发酵初始时胰蛋白胨浓度为6～6.5g/l。
[0017]
在本发明的一种实施方式中，在发酵第18～24时一次性补加胰蛋白胨。
[0018]
在本发明的一种实施方式中，补加的胰蛋白胨在发酵体系中的浓度为2～3g/l。
[0019]
在本发明的一种实施方式中，将含有孢子数为109～10
10
数量级的150ml的种子培养基以10ml/100ml的转接量，接种至发酵培养基，在32～37℃，150～200rpm下发酵。
[0020]
在本发明的一种实施方式中，在30～35℃培养，发酵过程中ph维持6.1～6.8，搅拌550～650rpm，通气分为两阶段调控，发酵前期0～36h为3vvm，36h至发酵结束为1vvm。
[0021]
在本发明的一种实施方式中，种子培养基中含有葡萄糖50～55g/l，酵母粉10～12g/l，kh2po
4 0.5～0.8g/l，kh2po
4 0.5～0.8g/l，nacl 0.1～0.5g/l。
[0022]
本发明还保护所述米曲霉，或所述微生物菌剂，或所述生产苹果酸的方法，或提高苹果酸产量的方法在生产苹果酸中的应用。
[0023]
本发明的有益效果：
[0024]
本发明以aspergillus oryzaenrrl3488为出发菌株，通过artp、ntg、
60
coγ射线迭代复合诱变，筛选获得一株高苹果酸的米曲霉，命名为fmme-s-38。在摇瓶优化条件下，苹果酸产量可达到140g/l及以上，在30l发酵罐苹果酸产量可达到191.5g/l，且具备良好的遗传稳定性，适用于工业化生产。
[0025]
生物材料保藏
[0026]
本发明所提供的菌株fmme-s-38，分类命名为aspergillus oryzaefmme-s-38，已于2020年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2020294，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
[0027]
图1为菌株筛选过程中各突变菌株的苹果酸产量图。
[0028]
图2为菌株fmme-s-38在30l发酵罐培养的发酵曲线图。
具体实施方式
[0029]
筛选平板培养基以g/l计：葡萄糖150～160，胰蛋白胨15～18，kh2po
4 0.1～0.5，k2hpo40.1～0.5，mgso4·
7h2o 0.1～0.5，cacl
2 0.05～0.1，mncl
2 0.001～0.002，kno
3 0.5～0.8，nacl0.01～0.02，feso4·
7h2o 0.01～0.02，溴甲酚绿0.01-0.02。
[0030]
初筛培养基以g/l计：葡萄糖150～160，胰蛋白胨15～18，kh2po
4 0.1～0.5，k2hpo
4 0.1～0.5，mgso4·
7h2o 0.1～0.5，cacl
2 0.05～0.1，mncl
2 0.001～0.002，kno
3 0.5-0.8，nacl 0.01～0.02，feso4·
7h2o 0.01～0.02。
[0031]
复筛培养基以g/l计：葡萄糖50～55，胰蛋白胨6～8，kh2po
4 0.1～0.5，k2hpo
4 0.1～0.5，mgso4·
7h2o 0.1～0.5，cacl
2 0.05～0.1，mncl
2 0.001～0.002，kno
3 0.5-0.8，nacl 0.01～0.02，feso4·
7h2o 0.01～0.02。
[0032]
种子培养基以g/l计：葡萄糖50～55，酵母粉10～12，kh2po
4 0.5～0.8，kh2po
4 0.5～0.8，nacl 0.1～0.5。
[0033]
发酵培养基以g/l计：葡萄糖150～160，胰蛋白胨6～8，kh2po
4 0.1～0.5，k2hpo
4 0.1～1，mgso4·
7h2o 0.1～1，cacl
2 0.05～0.1，mncl
2 0.001～0.01，kno
3 0.1～1，nacl 0.01～0.02，feso4·
7h2o 0.01～0.02。
[0034]
实施例1：菌株的获得
[0035]
(1)ntg诱变
[0036]
①
单孢子悬液制备：将出发菌株(nrrl3488)转接于pda斜面30℃培养4天，长好孢子后，用0.05％吐温洗下孢子，用灭菌过的脱脂棉过滤，然后计数，取一定量置于预先灭菌的装有9ml的0.1mol/l ph 6.0的磷酸缓冲液的三角瓶中(含直径为0.1～0.3mm玻璃珠100个)，使单孢子悬液终浓度为106个/ml。30～32℃，200r/min振荡60min，然后取孢子悬液0.8ml添加到5ml的离心管中，每个菌2支，共4支，备用。
[0037]
②
诱变反应：分别吸取0.2ml ntg母液分别加入5ml、含有0.8ml菌悬液的离心管中混匀，使ntg终浓度为1mg/ml，30℃，200rpm振荡培养(注意避光)30min和60min。
[0038]
③
终止反应：将含有处理液的离心管在10000rpm离心5min，弃去上清液，再加入3ml的生理盐水，10000rpm、离心5min，倒掉上清液，重复以上操作3次。
[0039]
④
涂布筛选：取0.5ml菌悬液进行梯度稀释到102，吸取60μl涂布平板。30～32℃倒置培养1-4天左右，观察结果，然后挑取单菌落。
[0040]
(2)常压室温等离子体(artp)诱变
[0041]
a、诱变器具：酒精灯，打火机，5ml注射器(底部塞上1mm左右的棉花)，10μl无菌枪头，10μl无菌枪一把，artp育种仪载片6个，装有0.1g甘油和9ml水的50ml锥形瓶，100个直径为0.1～0.3mm的玻璃珠。
[0042]
b、灭菌操作：枪头、移液器使用高压蒸汽灭菌121℃，30min，artp育种仪载片使用火焰灼烧灭菌。
[0043]
c、制备菌悬液
[0044]
取ntg筛选出的菌株制成孢子悬液，通过塞有棉花的5ml注射器过滤获得2ml过滤后的孢子悬液，在50ml的锥形瓶中稀释至106个/ml，震荡培养3～4h，制得菌悬液备用。
[0045]
d、artp诱变处理
[0046]
取制备好的菌悬液10μl均匀涂抹至已灭菌冷却的小铁片上，并置入artp育种机，诱变功率100w，高纯氦气通气量10slm，处理距离2mm，分别处理120、150、180s。
[0047]
e、后培养
[0048]
将处理后的小铁片取出，放入装有1ml无菌水的5ml离心管中，用涡旋振荡仪振荡菌体至少100s，使其彻底悬浮于离心管中，得到菌悬液。
[0049]
(3)
60
coγ射线辐照
[0050]
a、制备菌悬液
[0051]
取上述经artp筛选得到的菌株参照以上方法制备得到菌悬液，备用。
[0052]
b、
60
coγ射线辐照处理
[0053]
将制备好的菌悬液分置于五支试管中，每管10ml，直接进行γ射线处理，辐照剂量分别为0、0.6、0.8和0.9kgy。
[0054]
将
60
coγ射线辐照处理过的菌株分别同时通过下述方法进行筛选：
[0055]
①
放线菌酮平板筛选：
[0056]
将经辐照处理后的菌悬液分别稀释至10-2
和10-3
浓度，取50～100μl涂布于筛选固体培养基(放线菌酮浓度为0.02g/200ml)。以不经诱变处理的菌悬液为对照组。将涂布好的平板置于30～34℃恒温培养箱中培养1～3天。从含有抑制剂的平板上挑取萌发快、变色圈大、菌落直径大、菌落菌丝粗短、菌落中央孢子密集的单菌落，进行步骤(4)的初筛。
[0057]
②
氯化锂平板筛选：
[0058]
将经辐照处理后的菌悬液分别稀释至10-2
和10-3
浓度，取50～100μl涂布于筛选三种固体培养基(氯化锂1.5g/200ml)。以不经诱变处理的菌悬液为对照组。将涂布好的平板置于30～34℃恒温培养箱中培养1～3天。从含有抑制剂的平板上挑取萌发快、变色圈大、菌落直径大、菌落菌丝粗短、菌落中央孢子密集的单菌落，进行步骤(4)的初筛。
[0059]
③
鱼藤酮平板筛选：
[0060]
将经辐照处理后的菌悬液分别稀释至10-2
和10-3
浓度，取50～100μl涂布于筛选三种固体培养基(鱼藤酮0.05g/200ml)。以不经诱变处理的菌悬液为对照组。将涂布好的平板置于30～34℃恒温培养箱中培养1～3天。从含有抑制剂的平板上挑取萌发快、变色圈大、菌落直径大、菌落菌丝粗短、菌落中央孢子密集的单菌落，进行步骤(4)的初筛。
[0061]
(4)菌株的初筛：
[0062]
根据平板菌落的形态，挑出最为符合高产菌形态特征的菌落(菌落直径相对更大、气生菌丝少、孢子生长密集、颜色相对更深)，转接马铃薯斜面培养基上，于30-34℃培养1～3天。待孢子长好后，分别接入2～3环斜面孢子至初筛培养基中。通过观察发酵过程中菌球大小、发酵液颜色变化，可适当淘汰部分劣势菌株；最后通过测定120h苹果酸产量(产量超过95～100g/l)、残糖含量及ph(ph处于6.15～6.30)，从而挑选出优良菌株。
[0063]
(5)菌株的复筛：
[0064]
将初筛筛选到的菌株使用6～7ml 0.05％吐温80把对应的斜面中的孢子洗下，血球计数板计数，按接种量为1.2-1.6
×
106个/ml接种到复筛培养基中进行第一次复筛实验(每组3瓶平行样)，观察发酵过程中菌球大小是否均匀、发酵液颜色变化是否正常，同时通过测定120h苹果酸产量(产量超过75g/l)、残糖含量及ph(ph为6.20～6.27)，从中选出苹果酸高产的优势菌株。
[0065]
步骤1：配制培养基
[0066]
种子培养基以g/l计：葡萄糖50～55，酵母粉10～12，kh2po
4 0.5～0.8，kh2po
4 0.5～0.8，nacl 0.1～0.5。
[0067]
发酵培养基以g/l计：葡萄糖150～160，胰蛋白胨6～8，kh2po
4 0.1～0.5，k2hpo
4 0.1～1，mgso4·
7h2o 0.1～1，cacl
2 0.05～0.1，mncl
2 0.001～0.01，kno
3 0.1～1，nacl 0.01～0.02，feso4·
7h2o 0.01～0.02。
[0068]
pda固体培养基以g/l计：土豆200～300，琼脂粉20～25。
[0069]
步骤2：种子制备
[0070]
150ml种子培养基装于500ml三角瓶中置于121℃灭菌15～30min。菌株保藏于终浓度为50％的甘油管中，分别取四种孢子悬浮液(原始菌株、ntg所得菌株，artp所得菌株，
60
coγ所得菌株)1～3ml接种到种子培养基中进行种子培养，32～37℃，200rpm培养20～30h，培养至种子培养基中的孢子数为109～10
10
数量级。
[0071]
步骤3：摇瓶发酵培养
[0072]
种子培养基以10ml/100ml的转接量，接入装有45ml发酵培养基的250ml三角瓶中进行发酵培养。在32～37℃，200rpm条件下发酵120h，取发酵液离心，收集上清液用hplc测定发酵液中的苹果酸含量。结果如图1所示，复筛菌株摇瓶产量可达到79.8g/l，将此菌株命名为fmme-s-38。
[0073]
实施例2：菌株fmme-s-38的生理生化特性
[0074]
(1)菌株形态鉴定
[0075]
对筛选的菌株按《微生物分类学》进行生理生化特性鉴定(见下表1)：
[0076]
表1菌落形态特征对比
[0077][0078]
(2)菌株分子生物学鉴定
[0079]
its2 rdna基因的pcr扩增与序列测定：以提取的基因组dna为模板扩增its2 rdna，以通用pcr引物扩增its2区域序列750bp，并送至公司测序，将测序结果在ncbi上进行blast，与现有的基因序列比对。结果表明菌株fmme-s-38与aspergillus oryzaenrrl3488的its2 rrna序列同源性最高，相似度达到98％，因而菌株fmme-s-38鉴定为米曲霉(aspergillusoryzae)。
[0080]
its2-f：5'-gcatcgatgaagaacgcagc-3'；
[0081]
its2-r：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'。
[0082]
实施例3：菌株fmme-s-38摇瓶生产苹果酸
[0083]
将菌株fmme-s-38接种到150ml种子培养基中在32～37℃，200rpm培养20～30h培养，至种子培养基中的孢子数为109～10
10
数量级，将种子培养基以10ml/100ml的接种量接种至发酵培养基(装有45ml发酵培养基的250ml三角瓶)，在32～37℃，200rpm条件下发酵120h，取发酵液离心，收集上清液用hplc测定发酵液中的苹果酸含量。
[0084]
(1)初始氮浓度优化
[0085]
原始发酵培养基中的胰蛋白胨的浓度为7g/l，将其替换为5.5、6、6.5、7.5g/l，进行摇瓶发酵，结果如表2所示：在初始发酵培养基中的浓度为6～6.5g/l，时，苹果酸产量可达到130g/l及以上。
[0086]
表2初始氮浓度的优化
[0087][0088]
(2)补氮浓度优化
[0089]
基于最优的初始胰蛋白胨浓度为6.5g/l的情况下，在发酵18h时，添加胰蛋白胨作为氮源，对添加氮的浓度做优化，结果如表3所示：在发酵过程中补加2～3g/l(在发酵体系中的浓度)的胰蛋白胨，可使苹果酸产量提升至135g/l及以上。
[0090]
表3补氮浓度优化
[0091][0092]
(3)补氮时间的优化
[0093]
分别在发酵开始的第12、18、24、36h对发酵体系添加终浓度为3g/l的胰蛋白胨(一次性补加)，发酵120h，结果如表4所示：在发酵开始后第18～24小时补加胰蛋白胨，可使苹果酸的产量提升至140g/l。
[0094]
表4补料时间的优化
[0095][0096]
(4)传代稳定性：
[0097]
在将菌株传代6代，在相同的发酵条件下(具体实施方式参见步骤(3)，发酵第24小时进行补氮)，测定其生产苹果酸的产量，结果如表5所示：将fmme-s-38传代6次，其苹果酸产量及其他相关的性质稳定，因而具备较好的遗传稳定性。
[0098]
表5菌株fmme-s-38传代稳定性
[0099][0100]
实施例4：fmme-s-38在30l发酵罐发酵
[0101]
150ml种子培养基装于500ml三角瓶中置于121℃灭菌15～30min，将菌株fmme-s-38菌株接种到种子培养基中进行种子培养，32～37℃，200rpm培养20～30h，培养至种子培养基中的孢子数为109～10
10
；
[0102]
30l发酵罐中发酵培养基初始装液量为15l，种子转接量为1.5l(10ml/100ml)，温度为30～35℃，过程中ph维持6.1～6.8，搅拌550～650rpm，通气分为两阶段调控，发酵前期0～36h为3vvm，36h至发酵结束为1vvm；发酵培养基中的初始氮浓度为6.5g/l，在发酵开始后的第24小时补加终浓度为3g/l的胰蛋白胨。
[0103]
发酵过程中取一定量的发酵液，用1～2m的盐酸稀释后离心，收集上清液用hplc测定发酵液中的l-苹果酸含量。结果表6所示，发酵时间120h，l-苹果酸产量可达到154.2g/l，当发酵168小时，苹果酸产量可达到191.5g/l。
[0104]
表6 30l发酵罐发酵结果
[0105][0106]
实施例5：菌株fmme-s-38的微生物菌剂的制备
[0107]
将菌株fmme-s-38接种于pda平板中，30℃下培养72h，待菌株fmme-s-38的孢子浓度达到107cfu/ml以上时加入缓冲液(生理盐水或ph值为7的0.2m磷酸盐缓冲液)冲洗米曲霉孢子得到孢子悬液，在无菌环境下加入保护剂(15g/100ml的葡萄糖溶液)，得到菌剂。
[0108]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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