一种快速筛选双孢蘑菇W192菌株的耐高温菌株的引物及方法与流程

一种快速筛选双孢蘑菇w192菌株的耐高温菌株的引物及方法
技术领域
[0001]
本发明属于食用菌育种技术领域，涉及一种快速筛选双孢蘑菇w192菌株的耐高温菌株的引物及方法。


背景技术：

[0002]
双孢蘑菇(agaricusbisporus)，中文别名为蘑菇、洋蘑菇、白蘑菇。其含有丰富的蛋白质、多糖、维生素、核苷酸和不饱和脂肪酸，不仅营养丰富，肉质肥美，味道鲜美，而且热能低，具有很高的医疗保健作用，日益受到各国人民的喜爱。在国外，双孢蘑菇至今仍占食用菌消费的主导地位，以世界食用菌生产第二大国-美国(约占世界总产量16％)为例，双孢蘑菇占其总产量90％以上。在中国，双孢蘑菇消费市场发展迅速，鲜菇市场销售日益渐旺。
[0003]
国外双孢蘑菇主要栽培品种有sylvan公司的a15，s512、s608、130和荷兰horst蘑菇试验站的u1、u3等。这些品种均适合本国的设施化栽培。在国内，双孢蘑菇的种质资源十分缺乏，给双孢蘑菇菌种改良和选育工作带来了相当大的困难。目前，国内双孢蘑菇主要栽培品种有as2796，2000，192，浙农1号等，但是其中只有w192菌株是我国自主选育适合工厂化生产用的工厂化菌株，其他国内双孢蘑菇的工厂化品种都是进口国外的。因此，国内双孢蘑菇工厂化菌株的缺乏限制了国内双孢蘑菇工厂化的发展。
[0004]
温度是影响双孢蘑菇生长的主要因素。双孢蘑菇对温度的要求分为两个阶段，其菌丝体发育温度范围为4-32℃。双孢蘑菇菌丝生长阶段的最适合温度应保持在22-25℃。双孢蘑菇子实体生长发育的温度范围是4-25℃，对栽培环境进行温度调控是工厂化生产双孢蘑菇的主要调控因子之一。因此有必要设计一种快速筛选双孢蘑菇w192菌株的耐高温菌株的引物及方法。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种种植大球盖菇最优稻秸秆用量的判定方法。
[0006]
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种快速筛选双孢蘑菇w192菌株的耐高温菌株的引物，所述引物的序列为：
[0007]
4140-1f:ttccgttcagtgctacc；
[0008]
4140-1r:tgcaaagagagctggtaca。
[0009]
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种快速筛选双孢蘑菇w192菌株的耐高温菌株的方法，包括下列步骤：
[0010]
步骤1：提取w192菌株dna
[0011]
将待检测的w192杂交菌株或者孢子菌株在pda平板上进行培养，然后挑取菌丝，用dna裂解液对挑取的菌丝进行裂解，得到菌丝裂解液；
[0012]
步骤2：pcr扩增
[0013]
以菌丝裂解液作为pcr扩增的模板，使用权利要求1所述的引物4140-1f和4140-1r进行pcr扩增；
[0014]
步骤3：如果可以扩增出产物大小为781bp的条带，则其为耐高温菌株，反之则为不耐高温菌株。
[0015]
优选的技术方案为：pcr扩增程序为：94℃预变性5min，95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃，10min，4℃保存。
[0016]
优选的技术方案为：pcr扩增体系为：总体积为20μl，包括10μl的pcr mix，7ul的双蒸水，1ul的引物4140-1f，1ul的引物4140-1r和1ul的菌丝裂解液。
[0017]
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
[0018]
本发明可以快速筛选双孢蘑菇w192菌株的耐高温菌株，在为进行出菇实验可以提前预判w192孢子菌株的耐高温特性，大大地节约了选育耐高温菌株的时间和促进的选育的进程。
附图说明
[0019]
图1为4140分子标记筛选电泳图。注：m：d2000 marker；ck:w192出发菌株扩增结果；1-6：w192的6株耐高温菌株扩增结果。
[0020]
图2为w192孢子菌株的pcr扩增电泳图。注：m：marker；ck:出发菌株；1-23：用温度筛选过的孢子菌株。
具体实施方式
[0021]
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
[0022]
请参阅图1-2。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
[0023]
实施例1：一种快速筛选双孢蘑菇w192菌株的耐高温菌株的引物及方法
[0024]
根据基因4140设计引物4140-1f和4140-1r，分别为seq.no.1和seq.no.2，用作筛选双孢蘑菇w192菌株的耐高温菌株的引物。基因4140的序列为seq.no.3。根据引物，检测方法具体步骤如下：
[0025]
(1)提取w192菌株dna
[0026]
收集的w192杂交菌株或者孢子菌株在pda平板上进行培养，待平板上的菌落直径约为2cm，挑取菌丝，用dna裂解液对挑取的菌丝进行裂解，所裂解的液体作为pcr模板。dna裂解液购自上海生工生物工程股份有限公司。
[0027]
(2)pcr扩增
[0028]
以菌丝裂解液作为pcr模板，使用引物4140-1f和4140-1r进行普通pcr扩增。
[0029]
两个引物序列为：
[0030]
4140-1f:ttccgttcagtgctacc；
[0031]
4140-1r:tgcaaagagagctggtaca。
[0032]
(3)pcr扩增条件
[0033]
上述pcr扩增程序为：94℃预变性5min，95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃，10min，4℃保存。
[0034]
pcr扩增体系为：总体积为20μl,包括10ul pcr mix，7ul双蒸水，1ul引物4141-1f，1ul引物4140-1r和dna模板1ul。pcr mix购自大连宝生公司。
[0035]
(4)耐高温菌株筛选
[0036]
利用引物4140-1f和4140-1r进行普通pcr扩增的产物大小为781bp，如果以w192菌株的杂交菌株或者孢子菌株的dna为模板，用引物4140-1f和4140-1r进行pcr扩增，如果可以扩增出产物大小为781bp的条带，如图1，视其为耐高温菌株，反之亦然。
[0037]
本发明对筛选得到的w192的5株高温菌株和出发菌株进行基因组重测序和比较分析，挑选碱基序列有差异的基因进行验证，筛选得到了编号为4140的基因，在突变位点上设计引物，以w192菌株的dna为模板，耐高温菌株可以获得长度为781bp的特异性产物，正常菌株无此特异性产物，以区别耐高温菌株和出发菌株。通过pcr扩增的方法可以快速、准确和简单地鉴定w192耐高温菌株，不仅大大缩短了选育w192菌株的进程，还提高了选育耐高温菌株的准确率。
[0038]
实施例2：一种快速筛选双孢蘑菇w192菌株的耐高温菌株的引物及方法
[0039]
1.w192菌株的孢子菌株的收集
[0040]
将开伞的w192菌株的子实体放入孢子收集器收集孢子，将孢子涂布在pda平板上，涂布的孢子浓度月为103/ml，每个直径为9cm的平板涂布100ul孢子悬液，放入25℃培养箱进行培养。
[0041]
2.w192菌株孢子菌株温度的处理
[0042]
将萌发的孢子菌株用40℃处理24小时后，转移到25℃继续培养，可以继续生长的孢子菌株作为耐高温菌株的备选。
[0043]
3.w192孢子菌株dna提取
[0044]
挑取50mg的孢子菌株的菌丝放入1.5ml的离心管中，加入50ul的dna裂解液，80℃温育5min，dna提取液制备完成。
[0045]
4.pcr扩增
[0046]
以孢子菌株的dna提取液做模板，以4140-1f和4140-1r为引物，进行pcr扩增。
[0047]
5.pcr扩增条件
[0048]
上述pcr扩增程序为：94℃预变性5min，95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min，35个，72℃，10min，4℃保存。
[0049]
pcr扩增体系为：总体积为20μl,包括10ul pcr mix，7ul双蒸水，1ul引物4140-1f，1ul引物4140-1r和dna模板1ul。
[0050]
6.耐高温菌株筛选
[0051]
利用引物4140-1f和4140-1r进行普通pcr扩增的产物大小为781bp，如果以w192菌株的孢子菌株的dna为模板，用引物4140-1f和4140-1r进行pcr扩增，如果可以扩增出产物大小为781bp的条带(如图2)，视其为耐高温菌株，反之亦然。
[0052]
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形
式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
[0053]
[0054]

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