糖基转移酶基因的用途的制作方法

[0001]
本发明属于微生物基因的功能与应用领域，具体涉及糖基转移酶基因orf1595、cps4i在提高植物乳杆菌ym 4-3胞外多糖生物合成中的应用。


背景技术：

[0002]
乳酸菌（lactic acid bacteria）是一类公认安全（generally regarded as safe, gras）发酵葡萄糖或者用乳糖产生乳酸的微生物的统称。不仅存在于无机环境当中，而且在人类、动物肠道等环境中亦很常见，传统上与发酵食品相关，并且与人类文化和福祉密切相连，在历史上，乳酸菌因其对所发酵食品感官、质量和安全方面所具有的积极贡献而广为人知。
[0003]
乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，eps）是乳酸菌所产生的一种重要次级代谢产物，近年来引起了人们广泛关注和认识。微生物 eps 是一种高分子量、长链、线性或支链生物聚合物，经常由重复的糖单元或由 α-和 β-糖苷键连接的糖衍生物组成，它是微生物在生长过程中分泌到细胞外的一种代谢产物，可以分为粘附于细胞表面的荚膜多糖和游离于培养基中的粘液多糖两种类型，它对微生物不仅具有保护和粘附作用往往还具有其他一些对人类或植物或动物有益的特性。例如乳酸菌所产胞外多糖在帮助微生物抵御脱水、营养缺乏、噬菌体、渗透压、拮抗物和有毒物等不利条件时发挥重要作用。微生物源胞外多糖相较于植物源多糖以及动物源多糖而言，其易培养、不受病虫害影响、环境季节限制因素较少、可大规模培养发酵以及生理活性多种多样等特性赋予了微生物胞外多糖更优秀的应用潜质。多样的可培养微生物的存在为人类生产生活提供了巨大的便利，其代谢产物可应用于农业、制药、化妆品、食品等行业，并且丰富了人们的生活。
[0004]
随经济发展而来的是人类健康的需求不断升高，乳酸菌eps安全的来源及其多样的生理活性使其在市场上更具有竞争力。但是通常情况下eps合成量普遍不高，且菌株稳定性较差，提取和纯化成本高等因素制约着乳酸菌eps在工业生产中大规模的应用，因此将愈加成熟的基因工程技术对相应菌株基因层面的改造结合最优的培养条件能有效提高eps合成量并降低成本，并使得eps的工业化生产成为可能。


技术实现要素：

[0005]
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种糖基转移酶基因的用途，即糖基转移酶基因orf1595或cps4i在提高植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）胞外多糖合成中的用途，所述基因orf1595的核苷酸序列如seq id no: 1所示，基因cps4i的核苷酸序列如seq id no: 2所示；本发明将orf1595、cps4i基因与温度敏感型质粒pfed760重组构建了敲除载体pfed760-δorf1595、pfed760-δcps4i，并将其导入植物乳杆菌感受态进而通过同源重组构建了orf1595、cps4i基因单敲除菌株δorf1595、δcps4i；通过比较野生型菌株与敲除菌株的生理生化差异以及eps产量的不同证明orf1595或cps4i基因在eps合成中起关键作用，本发明在eps生物合成的研究及应用领域具有很大潜力。
[0006]
为了实现本发明的上述目的，本发明的技术方案如下：1、糖基转移酶基因orf1595、cps4i敲除载体的制备，所述敲除载体通过以下方法得到：以食源性植物乳杆菌基因组为模板，利用引物对（orf1595-up-f+ orf1595-up-r；orf1595-down-f+ orf1595-down-r；cps4i-up-f + cps4i-up-r；cps4i-down-f + cps4i-down-r）分别扩增上下游同源臂，pcr产物用作模板，利用引物对（orf1595-up-f + orf1595-down-r；cps4i-up-f + cps4i-down-r）扩增得到敲除片段，该片段纯化后，与温度敏感型质粒pfed760分别用限制性内切酶ecorⅰ、hind
ꢀⅲ
同步酶切，酶切产物经切胶回收后，进行连接实验，连接产物导入到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，提取质粒得到orf1595、cps4i基因敲除载体pfed760-δorf1595、pfed760-δcps4i，其中引物序列如下：orf1595-up-f
ꢀꢀꢀꢀ5’-ꢀ
ccggaattcgatggatctaaagcggtgtt-3
’
，orf1595-up-r
ꢀꢀꢀꢀ5’-ꢀ
cgctgaatgaattgcctttgtgccgcatgtatttgtaagg-3
’
；orf1595-down-f
ꢀꢀ5’-ꢀ
ccttacaaatacatgcggcacaaaggcaattcattcagcg-3
’
，orf1595-down-r
ꢀꢀ5’-ꢀ
cccaagcttgtggcaagccgtcaacga-3
’
；cps4i-up-f
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ5’-ꢀ
ccggaattcgacaagtgaaacggtctt-3
’
，cps4i-up-r
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ5’-ꢀ
tctgctcccgtccgtttacgctccctcggcaaataggtt-3
’
；cps4i-down-f
ꢀꢀꢀꢀ5’-ꢀ
aacctatttgccgagggagcgtaaacggacgggagcaga-3
’
，cps4i-down-r
ꢀꢀꢀꢀ5’-ꢀ
cccaagcttaggtccataccattagaagc-3
’
；本发明中orf1595、cps4i基因及其上下游同源臂序列如seq id no:3及seq id no:4所示，来源于食源性植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）；植物乳杆菌因其安全无害等特点，广泛应用于食品、药品等领域，故其基因也是对人体安全无害的，这将为该发明将来在胞外多糖生产领域的应用提供理论的安全保障。
[0007]
2、糖基转移酶基因orf1595、cps4i敲除菌株构建和筛选，包括上述糖基转移酶基因orf1595、cps4i敲除载体构建及后期敲除载体转化和敲除菌株筛选，步骤如下：（1）敲除载体pfed760-δorf1595、pfed760-δcps4i的转化：在90~100μl植物乳杆菌感受态中分别加入10μl敲除载体pfed760-δorf1595、pfed760-δcps4i轻轻混匀，冰浴5min后转入预冷电击杯中，按照1.25 kv/cm，200 ω的参数进行电击，电击完成后迅速向电转杯中加入900μl新鲜mrs培养液，用枪头轻轻吹打混匀后，将混合液转移至无菌1.5ml离心管中，28℃静止培养2.5~3h使细胞复苏。培养后菌液8000~10000 rpm离心3 min，弃900μl上清液，用剩余上清液重悬菌体，涂布于含有50μg/ml红霉素mrs固体平板上，28℃静置培养。
[0008]
（2）orf1595、cps4i基因敲除菌株筛选：步骤（1）中长出的单菌落转接于含有50μg/ml红霉素的mrs液体培养基中，28℃静置培养直至菌液od600为0.2~0.3时，将菌液转移至37℃继续静置培养过夜，该培养菌液稀释103~105倍后涂布于含有50
µ
g/ml红霉素的mrs固体平板上，37℃静置培养24h，挑取单克隆，接种至1ml含有50
µ
g/ml红霉素的mrs液体培养基中37℃静置培养过夜，该培养菌液按1%接种至不含抗生素的mrs液体培养基中，28℃静置培养过夜，然后菌液稀释103~105倍后涂布于无抗生素的mrs固体平板，37℃静置培养至长出单克隆，挑取较小单菌落一一对应划线于含有50
µ
g/ml红霉素和不含抗生素的mrs固体平板，37℃静置培养24h，挑取在含抗生素的mrs琼脂平板上无法生长，而在不含抗生素的平板上可以生长的菌落进行菌液pcr验证，从而获得植物乳杆菌ym 4-3
--
δorf1595及植物乳杆菌ym 4-3-δcps4i单敲除菌株；该筛选方法提高了敲除菌株的筛出效率。
[0009]
本发明中所述菌液pcr验证中使用位于上游同源臂上游基因组的前引物（orf1595-uu-f：5
’-ꢀ
ctttgaggtggtggtagac-3
’
，cps4i
ꢀ-
uu-f：5
’-
gacgtgcaagttgtcagagtt-3
’
），位于下游同源臂下游基因组的后引物（orf1595-dd-r：5
’-ꢀ
aatatagcgcgataccaga
ꢀ-3’
，cps4i
ꢀ-
dd-r：5
’-ꢀ
aggcaccgtaagcgacac-3
’
）；野生型菌株pcr片段比orf1595敲除菌株大250bp、比cps4i敲除菌株大591bp。
[0010]
3、利用构建成功的敲除菌株证明了食源性植物乳杆菌的orf1595、cps4i基因与植物乳杆菌eps合成中起关键作用。
[0011]
本发明的特点之一在于研究基因来自于食源性食物乳杆菌，具有安全性，可用于后期食品发酵领域。
[0012]
本发明的特点之二在于基因敲除菌株筛选的方法提高了敲除菌株的筛选效率。
[0013]
本发明特点之三在于，证明了本发明研究基因orf1595、cps4i基因在胞外多糖合成中的关键作用，为eps合成功能性食品的研发提供一定理论基础，且进一步发现了此基因在细胞形态及菌株生长中的作用。
[0014]
与现有技术相比本发明具有以下优势：1）研究基因来源于食品级微生物，具有安全性；2）本发明研究基因orf1595、cps4i基因在eps合成中发挥关键作用。
附图说明
[0015]
图1为本发明敲除菌株菌液pcr验证，其中图a：ym 4-3-δorf 1595菌株筛选，m为5000bp dna分子 marker，泳道1-5为ym 4-3-δorf1595菌株，泳道6为空白对照（无菌ddh2o）pcr产物对照，其余泳道为ym 4-3菌株对照；图b：ym 4-3-δcps4i菌株筛选，m为5000bp dna分子 marker，泳道1-2为ym 4-3-δ cps4i菌株，其余泳道为ym 4-3菌株对照；图2为本发明野生型及敲除型菌株胞外多糖产量对比，其中4-3表示野生型ym 4-3菌株；qc1595表示orf1595基因敲除菌株ym 4-3-δ orf1595；qc4i表示cps4i基因敲除菌株ym 4-3-δcps4i。
具体实施方式
[0016]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法；温度敏感型质粒pped760由伊利诺伊大学michael j federle 博士惠赠；下述实施例中的结果如无特别说明，均为三次重复的平均值。
[0017]
实施例1：糖基转移酶基因（orf1595、cps4i）敲除同源臂克隆1、pcr扩增上下游同源臂使用takara细菌基因组dna提取试剂盒（宝生物工程有限公司）提取食源性植物乳杆菌ym 4-3基因组，具体操作按照试剂盒说明书进行：针对基因orf1595，以提取基因组为模板，分别以orf1595-up-f（5
’-ꢀ
ccggaattcgatggatctaaagcggtgtt-3
’
下划线为酶切位点ecorⅰ)、orf1595-up-r（5
’-ꢀ
cgctgaatgaattgcctttgtgccgcatgtatttgtaagg-3
’
）和orf1595-down-f （5
’-ꢀ
ccttacaaatacatgcggcacaaaggcaattcattcagcg-3
’
）、orf1595-down-r（5
’-ꢀ
cccaagcttgtggcaagccgtcaacga-3
’
，下划线为酶切位点hind
ꢀⅲꢀ
)进行扩增得到上下游同
3-δcps4i胞外多糖含量为23.8
±
0.364mg/l，均比野生型菌株低，由此证明糖基转移酶基因orf1595、cps4i在植物乳杆菌ym 4-3菌株中胞外多糖合成过程中起到关键作用。因此，后续可通过过量表达糖基转移酶的方式提高其胞外多糖产量，以达到扩大生产的目的，为植物乳杆菌ym 4-3菌株在工业上的应用提供理论基础。

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