利用CRISPR/Cas9系统对橡胶草或蒲公英基因定点突变的方法与流程

利用crispr/cas9系统对橡胶草或蒲公英基因定点突变的方法
技术领域
[0001]
本发明涉及植物基因编辑技术领域，具体涉及用于橡胶草或蒲公英crispr/cas9基因编辑的表达盒、载体以及利用crispr/cas9系统对橡胶草或蒲公英基因定点突变的方法。


背景技术：

[0002]
crispr/cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated protein 9)基因组编辑系统由cas9核酸酶以及sgrna(single guide rna)组成，其实现基因编辑的原理是：sgrna 5
′
端的20个碱基通过碱基互补配对的方式结合靶序列，cas9蛋白负责切割靶序列，形成dna双链断裂结构，从而激活细胞内的两种修复机制，即非同源末端连接(nhej)或同源重组(hr)，通过这两种修复机制引发断口处碱基的丢失、插入和替换，获得突变体。crispr/cas9技术由于具有简单、高效、灵活等优点，被广泛应用于多种物种的基因组编辑。crispr/cas9技术在植物中的应用及其优势主要包括以下几个方面：一方面是crispr/cas9技术通过非同源末端连接机制修复断裂的双链切口、增加或减少若干碱基从而导致移码突变，这类突变与自然突变、物理突变和化学突变的本质相同，但crispr/cas9介导的基因组定点突变更具有针对性和效率性；另一方面crispr/cas9技术在外源dna修复模板存在的情况下，通过hr机制在特定的位点造成点突变或基因的插入、替换和聚合等，这种情况避免了普通转基因过程中外源基因插入基因组造成的位置效应等影响，而且crispr/cas9技术通过后代的遗传分离可以获得不含转基因元件的突变株系，因此crispr/cas9技术比传统的诱变育种和转基因育种具有更高的安全性。除此之外，crispr/cas9技术可通过多个sgrna同时在基因组的多个位点对多个基因进行编辑，可用来分析基因家族各成员的功能或遗传途径中各个基因的遗传顺序和功能等。
[0003]
天然橡胶是重要的战略物资和工业原料。橡胶草(taraxacum kok-saghyz)为菊科蒲公英属多年生草本植物，原产于哈萨克斯坦以及中国新疆等地，其根部可合成优质的天然橡胶，是极具发展前景的产胶作物，也是研究天然橡胶生物合成理想的模式植物。橡胶草为自交不亲和植物，传统杂交选育种的周期长、效率低。突变体是育种和基因功能研究的重要材料，利用自然发生的或者物理、化学诱变技术获得能够稳定遗传的纯合突变体尤为困难，这严重阻碍了橡胶草的研究与育种。crispr/cas9技术在植物中的研究发现，大量的突变可在t1代甚至t0代获得突变基因纯合体，极大地缩短了育种周期。在拟南芥、水稻、小麦、玉米、大豆等物种中通过crispr/cas9技术已成功获得可稳定遗传的纯合突变体，但目前尚未在橡胶草中实现高效的crispr/cas9基因编辑。因此，crispr/cas9技术在橡胶草种质改良上的应用具有重要价值。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是提供一种用于橡胶草或蒲公英crispr/cas9基因编辑的表达盒、
载体、宿主细胞以及利用crispr/cas9系统对橡胶草或蒲公英基因定点突变的方法。
[0005]
本发明以橡胶草为研究对象，开发适用于橡胶草的crispr/cas9基因编辑系统。在研发过程中，本发明发现，与其他组成型启动子相比，在橡胶草中采用cmylcv启动子驱动crispr/cas9系统的sgrna的转录，能够显著提高crispr/cas9的基因定点突变效率。而在此基础上，在sgrna的上游和下游分别设置csy4发夹序列，不仅能够显著提高多靶标同时突变的载体构建的效率，而且还可进一步提高crispr/cas9的基因定点突变的效率。在上述发现的基础上，本发明在橡胶草中实现了高效的atpap1基因的敲除。
[0006]
基于橡胶草和蒲公英的亲缘关系较近，本发明的crispr/cas9基因编辑系统也可适用于蒲公英(普通蒲公英)。
[0007]
具体地，本发明提供以下技术方案：
[0008]
第一方面，本发明提供用于橡胶草或蒲公英crispr/cas9基因编辑的表达盒，该表达盒包含cmylcv启动子和被cmylcv启动子驱动转录且能够与基因编辑靶标特异结合的sgrna。
[0009]
以上所述的表达盒中，sgrna位于cmylcv启动子的下游，受cmylcv启动子驱动转录。
[0010]
所述sgrna的序列可根据靶基因的变化而不同，其能够与基因编辑靶标特异结合，实现打靶。
[0011]
所述靶基因可以是橡胶草或蒲公英中存在的任何基因或有生物学功能的任何dna序列，包括橡胶草与蒲公英基因组中任何有生物学功能的基因或dna序列，或者是通过转基因整合到橡胶草或蒲公英基因组中的任何目标基因，例如：atpap1基因。
[0012]
为实现多靶标同时突变，sgrna可为两个或两个以上。
[0013]
本发明中，所述cmylcv启动子优选包含如seq id no.1所示的序列。
[0014]
优选地，所述表达盒还包括位于所述sgrna的上游和下游的csy4发夹序列，所述csy4发夹序列包含如seq id no.2所示的序列。
[0015]
本发明中，通过采用cmylcv启动子驱动sgrna的转录，实现适当且稳定的sgrna的转录，能够更高效地引导cas9核酸内切酶对靶基因的dna进行切割、编辑。进一步通过在sgrna的上游和下游分别设置csy4发夹序列，将sgrna与启动子以及各sgrna进行间隔，不仅提高了表达盒和载体的构建效率，而且进一步提高了crispr/cas9基因编辑效率。
[0016]
作为本发明的一种实施方式，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2。
[0017]
优选地，所述sgrna靶向atpap1基因，所述sgrna1包含如seq id no.3所示的序列，所述sgrna2包含如seq id no.4所示的序列。
[0018]
本发明利用上述表达盒实现了橡胶草atpap1基因的高效敲除，在进行橡胶草atpap1基因敲除时，所述sgrna1包含如seq id no.3所示的序列，所述sgrna2包含如seq id no.4所示的序列。
[0019]
seq id no.3：5
′-
cttcgccttcataggcttct-3
′
；
[0020]
seq id no.4：5
′-
tacgcccattcctacaacac-3
′
。
[0021]
在进行atpap1基因敲除时，所述表达盒的序列优选如seq id no.5所示。
[0022]
第二方面，本发明提供一种橡胶草或蒲公英crispr/cas9基因编辑载体，该载体包含以上所述的表达盒。
[0023]
为实现crispr/cas9基因编辑，所述载体还包含cas9基因和筛选标记基因。在进行基因编辑时，所述载体上包含sgrna表达盒、cas9基因表达盒和筛选标记基因表达盒的t-dna区域整合到橡胶草基因组上。
[0024]
其中，所述cas9基因编码cas9蛋白。所述筛选标记基因可为植物转基因过程中常用的筛选标记基因，包括但不限于bar基因等。
[0025]
优选地，cas9基因由camv 35s启动子驱动转录。
[0026]
在进行atpap1基因敲除时，所述载体包括如下的结构cas9-cmylcv-csy4-atpap1/sgrna1-csy4-atpap1/sgrna2-csy4，其中atpap1/sgrna1和atpap1/sgrna2为靶向atpap1基因的2个sgrna。所述载体的序列优选如seq id no.6所示。
[0027]
第三方面，本发明提供包含所述表达盒或所述载体的宿主细胞。
[0028]
优选地，所述宿主细胞微生物细胞或非繁殖性植物细胞。
[0029]
第四方面，本发明提供所述表达盒或所述载体或所述宿主细胞在橡胶草或蒲公英基因编辑中的应用。
[0030]
本发明还提供所述表达盒或所述载体或所述宿主细胞在橡胶草或蒲公英的遗传育种或种质资源改良中的应用。
[0031]
本发明还提供所述表达盒或所述载体或所述宿主细胞在对橡胶草或蒲公英atpap1基因进行编辑中的应用。
[0032]
第五方面，本发明提供一种利用crispr/cas9系统对橡胶草或蒲公英基因定点突变的方法，其为：将所述表达盒或所述载体转入橡胶草或蒲公英中，经筛选获得靶基因突变的植株。
[0033]
具体地，通过农杆菌介导的遗传转化方法将crispr/cas9基因编辑载体转入携带靶基因的橡胶草或蒲公英受体材料中，通过再生植株诱导、筛选以及测序验证，获得靶基因定点突变的突变植株，实现对橡胶草或蒲公英中特定基因的定点突变。
[0034]
本发明中，所述橡胶草为二倍体橡胶草。
[0035]
作为本发明的优选实施方案，所述方法包括以下步骤：
[0036]
(1)根据靶基因序列筛选特异性的包含20个碱基的打靶sgrna序列，并根据每个打靶sgrna序列设计组装引物，组装引物包括csy(5
′-
tcgtctccxxxxxxxxxxxxctgcctatacggcagtgaac-3
′
，x为打靶sgrna的前12个核苷酸的反向互补序列)、rep(5
′-
tcgtctcaxxxxxxxxxxxxgttttagagctagaaatagc-3
′
，x为打靶sgrna的后12个核苷酸)，载体通用引物包括cmylcv(5
′-
tgctcttcgcgctggcagacatactgtcccac-3
′
)和csy-t(5
′-
tgctcttctgacctgcctatacggcagtgaac-3
′
)；
[0037]
(2)以crispr/cas9表达载体为模板，用步骤(1)的引物进行pcr扩增，获得包含csy4发夹序列的sgrna序列；
[0038]
(3)通过同源重组将包含不同sgrna的pcr扩增片段与携带筛选标记基因(例如：bar基因)的crispr/cas9表达载体进行组装获得重组载体，所述重组载体以camv35s启动子驱动cas9，cmylcv启动子驱动sgrna，不同的打靶sgrna用csy4进行间隔，测序验证后转入农杆菌菌株；
[0039]
(4)取生长状态良好的橡胶草组培苗的根，切成0.5-1.0cm的根段进行农杆菌侵染转化；
[0040]
(5)侵染根段移至滤纸上共培养，然后转接至分化培养基诱导分化不定芽，不定芽再转接至生根培养基生根，获得阳性再生植株；
[0041]
(6)提取阳性植株dna，根据靶基因及其sgrna作用位点的核苷酸序列设计引物，通过pcr扩增跨越sgrna位点的片段并测序验证，鉴定植株突变位点。
[0042]
以上方法中，所述分化培养基的组成如下：ms+15-30g/l蔗糖+0.5-2.0mg/l 6-ba+0.01-0.05mg/l naa+300-500mg/l特美汀+3.9-4.0g/l植物凝胶+适当浓度的筛选剂；
[0043]
所述生根培养基的组成如下：1/2ms+10-15g/l蔗糖+300-500mg/l特美汀+3.9-4.0g/l植物凝胶+适当浓度的筛选剂(例如2-10mg/l basta)。
[0044]
所述的侵染转化是将橡胶草组培苗根段浸入如下侵染液中侵染20-30分钟；侵染液组成为ms+15-30g/l蔗糖+0.5-2.0mg/l 6-ba+0.01-0.05mg/l naa+100-300μm乙酰丁香酮+od600值为0.5-0.8携带重组载体和筛选标记基因的农杆菌菌液。
[0045]
步骤(5)中共培养条件为21-25℃黑暗培养1-3天。
[0046]
步骤(5)中诱导分化和生根培养条件为21-25℃，光周期为光照16-18小时，黑暗6-8小时。
[0047]
本发明的有益效果在于：本发明提供利用crispr/cas9系统对橡胶草基因定点突变的方法，采用农杆菌转化的方法将含有表达筛选标记基因的表达盒、cmylcv启动子驱动的sgrna表达盒(不同的打靶sgrna用csy4进行间隔)、camv 35s启动子驱动的cas9蛋白表达盒的t-dna区域整合到橡胶草基因组上，这些元件在橡胶草细胞内转录、翻译并发挥功能，通过筛选获得目的基因定点突变的再生植株。
[0048]
通过转基因方式将crispr/cas9系统导入橡胶草中进行表达的过程中，寻找合适的启动子启动各个元件的表达具有重要作用。本发明发现，在橡胶草中，驱动sgrna表达的启动子对编辑效率具有重要作用并首次在橡胶草中使用cmylcv启动子驱动sgrna，采用csy4发夹序列对不同的打靶sgrna进行间隔，极大地提高了多靶标同时敲除载体构建的效率和植株的突变率。本发明的crispr/cas9基因编辑方法具有实验周期短、操作简便、效率高等特点，为橡胶草、蒲公英的基因编辑、基因功能发现奠定了技术基础，为橡胶草、蒲公英的改良育种提供新方法，对于橡胶草性状改良具有重大实际意义。
附图说明
[0049]
图1为本发明实施例2中经筛选后得到的阳性植株表型，从左至右的图片依次为侵染转化后过表达atpap1橡胶草株系无菌苗根段的分化、再生编辑植株生根、对照过表达atpap1橡胶草植株表型。
[0050]
图2为本发明实施例3中atpap1基因突变结果序列比对：其中，阳性对照ck为atpap1基因部分序列，突变体m1#-m3#为转化后植株基因部分序列，从图中可以看出，突变体m1#与m2#的atpap1基因序列与阳性对照ck相比，分别在靶标2的位置发生了4个和6个碱基缺失，从而导致基因功阅读框位移和失活；而突变体m3#则是在靶标1与靶标2之间发生了大片段删除，从而导致基因失活。
具体实施方式
[0051]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1靶向过表达
atpap1基因转基因橡胶草中atpap1基因的crispr/cas9基因编辑载体的构建
[0052]
1、针对橡胶草转基因植株中atpap1基因设计基于crispr/cas9的2个打靶sgrna序列，其中靶标1(atpap1/sgrna1)的核苷酸序列为5
′-
cttcgccttcataggcttct-3
′
(seq id no.3)，靶标2(atpap1/sgrna2)的核苷酸序列为5
′-
tacgcccattcctacaacac-3
′
(seq id no.4)。
[0053]
2、根据靶基因atpap1的打靶sgrna1和sgrna2序列设计组装引物：
[0054]
cmylcv(seq id no.7)：
[0055]5′-
tgctcttcgcgctggcagacatactgtcccac-3
′
；
[0056]
csy-grna1(seq id no.8)：
[0057]5′-
tcgtctccatgaaggcgaagctgcctatacggcagtgaac-3
′
；
[0058]
rep-grna1(seq id no.9)：
[0059]5′-
tcgtctcatcataggcttctgttttagagctagaaatagc-3
′
；
[0060]
csy-grna2(seq id no.10)：
[0061]5′-
tcgtctccggaatgggcgtactgcctatacggcagtgaac-3
′
；
[0062]
rep-grna2(seq id no.11)：
[0063]5′-
tcgtctcattcctacaacacgttttagagctagaaatagc-3
′
；
[0064]
csy-t(seq id no.12)：
[0065]5′-
tgctcttctgacctgcctatacggcagtgaac-3
′
。
[0066]
3、以pdirect_23c质粒经banⅰ内切酶酶切后的产物为模板，分别以cmylcv和csy-grna1，rep-grna1与csy-grna2，rep-grna2和csy-t引物组合进行3次pcr反应(需要连接更多的sgrna以此类推)，通过pcr扩增反应获得csy4-sgrna序列。使用phanta max super-fidelity dna polymerase(vazyme,cat.no.p505-d1,南京)进行pcr扩增，反应体系为：酶切后的质粒模板50ng，上下游引物(10μmol/l)各0.6μl，2
×
phanta max buffer 15μl，dntp mix 0.5μl，phanta max polymerase 0.4μl，加ddh2o至30μl。pcr扩增程序为：98℃变性1min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s，共30个循环；最后72℃延伸2min；4℃保存。
[0067]
4、分别将3次pcr扩增产物稀释10倍后用于以下重组连接反应：pdirect_23c质粒50ng，pcr反应1、2、3稀释后产物各0.5μl，sap
ⅰꢀ
0.5μl，esp3ⅰ0.5μl，2
×
t7 dna ligase buffer 10μl，t7 dna ligase 1μl，加ddh2o至20μl。连接反应程序为：37℃ 5min，25℃ 10min，共10个循环；4℃保存。取5μl连接产物转化大肠杆菌，经菌落pcr检测后进行测序验证，测序验证正确的重组质粒命名为cas9-cmylcv-csy4-atpap1/sgrna1-csy4-atpap1/sgrna2-csy4。进一步利用电击法将重组质粒转入农杆菌agl1菌株中用于橡胶草的侵染转化。
[0068]
测序结果表明，重组质粒cas9-cmylcv-csy4-atpap1/sgrna1-csy4-atpap1/sgrna2-csy4的全序列如seq id no.6所示，该载体以camv 35s启动子驱动cas9，cmylcv启动子(seq id no.1)驱动sgrna，cmylcv与atpap1/sgrna1之间以及atpap1/sgrna1与atpap1/sgrna2之间用csy4序列(seq id no.2)进行间隔，cmylcv-csy4-atpap1/sgrna1-csy4-atpap1/sgrna2-csy4表达盒的序列如seq id no.5所示。
[0069]
实施例2基因定点突变橡胶草植株的制备方法
[0070]
1、橡胶草无菌苗的获得：采用携带外源atpap1基因的橡胶草t2代转基因植株作为
受体材料，浓度为10-15％(v/v)的次氯酸钠溶液(原液按100％用)，按1滴(20μl)/200ml加入tritonx-100混匀制成消毒液，用消毒液对t2代转基因种子消毒10-15分钟，无菌水冲洗3-5次后播种于含有50-100mg/l卡那霉素的1/2ms培养基中催芽，5天后转接一次含有50-100mg/l卡那霉素的1/2ms培养基培养20天左右获得根系生长情况良好的无菌苗，其叶片和根均为紫色。
[0071]
2、取生长状态良好的无菌苗的根，经无菌水洗2-3次后，用滤纸吸干用于侵染转化。
[0072]
3、农杆菌侵染转化：含有重组质粒cas9-cmylcv-csy4-atpap1/sgrna1-csy4-atpap1/sgrna2-csy4的农杆菌agl1用侵染液悬浮调整od
600
值为0.5-0.8，根切成0.5-1.0cm的根段进行侵染25分钟。
[0073]
4、侵染根段移至滤纸上21-25℃黑暗共培养1-3天，然后转接至分化培养基诱导分化不定芽，分化培养条件均为21-25℃，光周期为光照16-18小时，黑暗6-8小时。
[0074]
5、筛选与再生植株：携带外源atpap1基因的橡胶草根段为紫色，如果atpap1基因被敲除，不定芽和叶片变为绿色、根为白色。因此，侵染转化后挑选绿色的不定芽转接至生根培养基进行生根，期间每2-3周转接一次，最终获得叶片变为绿色、根为白色的阳性再生植株。结果如图1所示，atpap1基因定点突变后诱导形成的不定芽变为绿色或者浅色，进一步生根获得的再生编辑植株叶片为绿色、根为白色，而未转化的对照植株叶片和根均呈紫色。
[0075]
转化过程中所用到的试剂和培养基配方如下：
[0076]
侵染液：ms+:20g/l蔗糖+1.5mg/l 6-ba+0.05mg/l naa+200μm乙酰丁香酮；
[0077]
分化培养基：ms+20g/l蔗糖+1.5mg/l 6-ba+0.05mg/l naa+500mg/l特美汀+3.95g/l植物凝胶+5mg/l basta；
[0078]
生根培养基：1/2ms+10g/l蔗糖+300mg/l特美汀+4.0g/l植物凝胶+10mg/l basta。
[0079]
实施例3基因定点突变橡胶草的检测
[0080]
1、atpap1基因定点突变株系的表型观察
[0081]
观察实施例2的atpap1基因定点突变后的诱导形成的不定芽，结果发现，在紫色的根段上分化出绿色和紫色两种颜色的不定芽，紫色的不定芽说明这部分根段中atpap1基因未被定点突变仍然正常表达，绿色或者浅色的不定芽则为atpap1基因已失活，结果见图1。从图1圆圈标注处可以看出绿色的不定芽无atpap1表达，表明转化细胞中atpap1基因已被成功编辑失活。
[0082]
2、突变株系基因测序验证
[0083]
(1)dna提取：用购自天根生化科技(北京)有限公司的dna提取试剂盒抽提实施例2获得的叶片变为绿色、根变为白色的突变植株的基因组dna。
[0084]
(2)atpap1基因pcr扩增
[0085]
使用kod-fx(toyobo，cat.no.kfx-101，上海)对突变植株的atpap1基因进行pcr扩增，反应体系为：基因组dna 80-100ng，上、下游引物(atpap1-f:5
′-
atggagggttcgtccaaag-3
′
，seq id no.13；atpap1-r:5
′-
ctaatcaaatttcacagtctctcc-3
′
，seq id no.14)(10μmol/l)各1.5μl，2
×
pcr buffer 25μl，dntp mix 10μl，kod polymerase 1.0μl，加ddh2o至50μl。pcr扩增程序为：98℃变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸30s，共32个循环；
最后72℃延伸2min；4℃保存。
[0086]
(3)样品测序及其序列分析
[0087]
将以上pcr产物回收纯化之后连接到t载体，送广州艾基生物技术有限公司进行测序验证，测序结果如图2所示：阳性对照ck为atpap1基因部分序列，突变体m1#-m3#为转化后植株基因部分序列，从图中可以看出，突变体m1#与m2#的atpap1基因序列与阳性对照ck相比，在靶标2的位置发生了4-6个碱基缺失，从而导致基因功阅读框位移和失活；而突变体m3#则是在靶标1与靶标2之间发生了大片段删除，从而导致基因失活。结果表明，利用本发明提供方法成功实现了对特定基因的定位定点突变，突变效率为35.3％。
[0088]
本发明提供一种利用crispr/cas9系统对橡胶草或蒲公英基因定点突变的方法，该载体系统重组质粒的构建过程中仅用一个表达载体作为模板，多个pcr反应可同步进行，pcr产物无需纯化即可进行连接，而且一个连接反应可实现多个片段的连接，可在1-2天内完成2个或者多个打靶sgrna的连接，极大地简化了载体构建的过程，效率提高了至少1倍。以cas9-cmylcv-csy4-atpap1/sgrna1-csy4-atpap1/sgrna2-csy4载体构建为例，3个pcr反应在一个pcr仪中同步进行，扩增之后即可进行连接反应，转入农杆菌菌株agl1后对橡胶草进行侵染转化，获得再生植株的突变效率为35.3％；而利用atu6启动子驱动的载体系统构建含相同的打靶sgrna的重组载体cas9-atu6-atpap1/sgrna1-atu6-atpap1/sgrna2时，需要用到含atu6启动子的中间载体作为模板进行pcr扩增将atu6启动子序列与打靶sgrna连接，2个靶标需要进行6次pcr反应，产物纯化后再用于表达载体的连接反应，转入农杆菌菌株agl1后对橡胶草进行侵染转化，获得再生植株的突变效率仅为6.25％。
[0089]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除