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2021-02-02 01:02:42|
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起点商标网 一种n-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)吡啶-2-胺类化合物及其制备方法
技术领域
[0001]
本发明属于药物领域，具体涉及一种n-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)吡啶-2-胺类化合物及其制备方法。
背景技术：
[0002]
转染重排（ret）是一种神经生长因子受体酪氨酸激酶。ret参与细胞增殖、神经传导、细胞迁移和细胞分化，在与神经营养因子（gdnf）受体α-1、2、3、4中的一种结合后被活化，其激活涉及细胞增殖和存活的多个下游途径，诱导细胞增生。现有研究表明，ret融合蛋白与部分癌症成相关性，包括非小细胞癌、甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌等。ret基因的异位、突变或过表达增强了其活化，从而有助于肿瘤细胞生长、形成或组织浸润。此外，现有研究也表明ret是癌症的不良预后因子，一些报道指出，ret的异位及其增强的活化水平也与癌症的预后呈负相关性。因此抑制ret可能是治疗具有组成性ret激酶活性癌症的有效策略。
[0003]
礼来制药的retevmo（loxo-292，通用名：selpercatinib）在美国获得fda批准上市，批准的适应症包括转移性ret融合阳性非小细胞肺癌、晚期或转移性ret突变甲状腺髓样癌和晚期或转移性ret融合阳性甲状腺癌。
[0004]
因此，研究发现结构新颖、活性较强且副作用更小的ret抑制剂具有重要意义。
技术实现要素：
[0005]
本发明为了寻找新型的ret激酶抑制剂，经过广泛深入的研究，设计、合成了一系列结构新颖、安全性高、对ret激酶的抑制活性较高的n-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)吡啶-2-胺类化合物，并且研究了这一类化合物的抗肿瘤活性。
[0006]
本发明的一个目的是提供一种n-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)吡啶-2-胺类化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物。
[0007]
本发明的另一个目的是提供一种上述化合物的制备方法。
[0008]
本发明的另一个目的是提供一种包含上述化合物的药物组合物。
[0009]
本发明的另一个目的是提供上述化合物和上述药物组合物作为ret激酶抑制剂用于治疗肿瘤的用途。
[0010]
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：第一方面，本发明提供了一种具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物：
其中，r1为单取代、多取代或不取代的苯环或芳杂环。
[0011]
进一步的，所述r1优选自：。
[0012]
本发明提供的具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物，可以选自具有如下化合物结构的化合物：
。
[0013]
第二方面，本发明提供了一种具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物的制备方法，包括如下步骤：（1）中间体ⅳ的合成：具有式ⅱ结构的化合物ⅱ和具有式ⅲ结构的化合物ⅲ于第一种碱存在的第一溶剂中，在第一反应温度下发生反应生成具有式ⅳ结构的中间体ⅳ；（2）中间体
ⅵ
的合成：中间体ⅳ和具有式
ⅴ
结构的化合物
ⅴ
在催化剂的作用下于第二种碱存在的第二溶剂中，在第二反应温度下发生反应生成具有式
ⅵ
结构的中间体
ⅵ
；（3）中间体
ⅶ
的合成：中间体
ⅵ
和酸于第三溶剂中，在第三反应温度下发生反应生成具有式
ⅶ
结构的中间体
ⅶ
；（4）具有式ⅰ结构的化合物的合成：中间体
ⅶ
和具有式
ⅷ
结构的化合物
ⅷ
在缩合剂的作用下于第三种碱存在的第四溶剂中，在第四反应温度下发生反应生成具有式ⅰ结构的化合物。
[0014]
作为本发明所提供的制备方法的一个优选方案，在反应步骤（1）中：所述第一反应温度为40℃~120℃；和/或，所述第一种碱选自三乙胺、二异丙基乙胺、n-甲基吗啉、4-二甲基氨基吡啶、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂中的至少一种；和/或，所述第一溶剂选自甲苯、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺和n,n-二甲基乙酰胺中的至少一种。
[0015]
作为本发明所提供的制备方法的另一个优选方案，在反应步骤（2）中：所述第二反应温度为40℃~120℃；和/或，所述第二种碱选自三乙胺、二异丙基乙胺、碳酸钾、碳酸铯、叔丁醇钠、叔丁醇
钾、磷酸钾和醋酸钠中的至少一种；和/或，所述第二溶剂选自二氧六环、甲苯、乙腈、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺和n,n-二甲基乙酰胺中的至少一种；和/或，所述催化剂选自双(三苯基膦)二氯化钯(ii)、四(三苯基膦)钯、双(二亚芐基丙酮)钯、醋酸钯和1,1'-[双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯中的至少一种。
[0016]
作为本发明所提供的制备方法的另一个优选方案，在反应步骤（3）中：所述第三反应温度为20℃~100℃；和/或，所述第三溶剂选自甲苯、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醇和甲醇中的至少一种；和/或，所述酸为三氟乙酸或氯化氢溶液。
[0017]
优选的，所述氯化氢溶液为氯化氢溶于有机溶剂中形成的溶液。
[0018]
进一步优选的，所述氯化氢溶液为氯化氢乙醇溶液、氯化氢甲醇溶液、氯化氢乙酸乙酯溶液和氯化氢四氢呋喃溶液中的任意一种。
[0019]
作为本发明所提供的制备方法的另一个优选方案，在反应步骤（4）中：所述第四反应温度为20~100℃；和/或，所述缩合剂为n,n'-羰基二咪唑、碳酰氯、双(三氯甲基)碳酸酯中的至少一种；和/或，所述第三种碱选自三乙胺、二异丙基乙胺、n-甲基吗啉和4-二甲基氨基吡啶中的至少一种；和/或，所述第四溶剂选自四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯、n,n-二甲基甲酰胺和乙腈中的至少一种。
[0020]
本发明提供的制备方法以化合物ⅱ和化合物ⅲ为起始原料，通过合成中间体ⅳ、中间体
ⅵ
和中间体
ⅶ
，最终制备出具有式ⅰ结构的化合物。整个制备过程操作简单，易于控制，对生产设备要求不高，适用于工业化大规模生产。
[0021]
本发明提供的制备方法中的各种条件，例如反应物、溶剂、酸、碱、催化剂、所用化合物的用量、反应温度、反应所需时间等均不仅限于上面的解释。本发明提供的具有式ⅰ结构的化合物还可以任选地将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便地制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。
[0022]
第三方面，本发明提供了一种药物组合物，包含具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物。
[0023]
在本发明中，具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物是作为药物组合物中的活性成分。
[0024]
本发明提供的药物组合物除了包含治疗有效量的至少一种具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物之外，还包含：一种或多种药用辅料；和/或，一种或多种除了具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物之外的其它具有抑制ret激酶活性的药用活性物质。
[0025]
制备本发明提供的药物组合物的方法对本领域技术人员而言是显而易见的，包括常见的混合、溶解、冻干等技术。
[0026]
本发明提供的药物组合物可以依照药学领域的常规制备方法制成各种常见的剂型，例如片剂、含片、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶液剂、口服混悬剂、口服乳剂、注射剂等。
方便提供给患者临床使用，通过各种常见的给药方式向患者施用，例如口服或肠胃外施用(通过静脉内、肌内、局部或皮下途径)。
[0027]
第四方面，本发明提供了具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物和包含具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物的药物组合物作为ret激酶抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
[0028]
就本发明提供的化合物和药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用而言，是采用对需要治疗肿瘤的患者施用治疗有效量的本发明提供的化合物或药物组合物的方式来实现治疗效果。本发明提供的化合物或药物组合物可以作为治疗肿瘤的治疗手段单独使用，也可以与手术、放疗、化疗等其它治疗肿瘤的常规治疗手段配合使用。
[0029]
本发明提供的化合物或药物组合物用于治疗肿瘤的治疗有效量取决于许多因素。可能会根据需要治疗的肿瘤的具体种类而改变，这可以由本领域技术人员不经过度尝试即可确定。实际治疗中还需要考虑患者年龄和体重、病症严重程度、具体施药方式等因素，最终取决于在场医师或临床医生的决定。
[0030]
进一步的，所述肿瘤选自：皮肤癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、脑癌、直肠癌、食管癌、舌癌、肾癌、宫颈癌、子宫体癌、睾丸癌、泌尿癌、黑素癌、星型细胞癌、脑膜瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性粒细胞白血病、成人t细胞白血病淋巴瘤、肝细胞癌、多发性骨髓瘤、基底细胞瘤、精原细胞瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、纤维肉瘤。
[0031]
本发明的表达中涉及的一些术语定义如下：术语“药学上可接受的盐”是指那些保留母体化合物的生物有效性及特性的盐。该盐包括：酸加成盐，其是通过母体化合物的游离碱与无机酸或与有机酸的反应而获得的；所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、磷酸、硫酸及高氯酸等；所述有机酸包括乙酸、草酸、(d)或(l)苹果酸、马来酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟乙磺酸、乳酸、扁桃酸、黏液酸、双羟萘酸、泛酸、琥珀酸或丙二酸等；或者，当母体化合物中存在的酸质子被置换为金属离子或与有机碱配位时形成的盐；所述金属离子包括碱金属离子、碱土离子、铝离子等；所述有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、n-甲基葡糖胺等。
[0032]
术语“水合物”是指水分子以配位键或共价键与化合物中的阳离子或阴离子结合，或指水离子不直接与阳离子或阴离子结合而是以一定比例存在于固体晶格的确定位置而形成的物质。
[0033]
术语“溶剂合物”是指化合物与药学上可接受的溶剂分子缔合形成的物质，药学上可接受的溶剂一般包括乙醇、乙酸等。
[0034]
术语“立体异构体”是指具有相同分子式、但是分子中原子在空间排列方式上不同的化合物。由于本发明提供的化合物可具有一个或多个不对称中心，因此该化合物可以单独(r)-立体异构体形式制备或以单独(s)-立体异构体形式制备或以其混合物形式制备。除
非另有说明，否则本发明中的特定化合物的描 述或名称意欲包括个别对映异构体与其外消旋混合物或其它混合物。用于测定立体化学构型及分离立体异构体的方法是本领域的常规技术(参见《advanced organic chemistry》的第4章中的论述，第4版，j.march，john wiley及sons，new york，1992)。因此，本发明亦涵盖具有调节ret激酶活性的能力的任何立体异构形式、其相应对映异构体(d-异构体及l-异构体或(+)异构体及(-)异构体)及其非对映异构体及其混合物且不限于任一种立体异构形式。
[0035]
术语“芳杂环”是指芳族的杂环，通常为具有1至3个选自n、o或s的杂原子的5-至8-元的杂环。芳杂环可以任选地进一步稠合或连接于芳族和非芳族的碳环和杂环。所述芳杂环的非限制性的实例包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噻噁唑基、吡咯基、苯基-吡咯基、呋喃基、苯基-呋喃基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、噻吩基、苯并噻吩基、异二氢吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、1,2,3-三唑基、1-苯基-1,2,3-三唑基、2,3-二氢吲哚基、2,3-二氢苯并呋喃基、2,3-二氢苯并噻吩基、苯并吡喃基、2,3-二氢苯并噁嗪基、2,3-二氢喹喔啉基等。
[0036]
术语“药物组合物”是指一种或多种本发明所提供的化合物与其它化学成分(例如药用辅料)的混合物。药物组合物的目的旨在促进化合物给予生物。
[0037]
术语“药用辅料”是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，对生物不产生明显刺激且不会消除所给予的化合物的生物活性及特性，并且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋型、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药物组合物的质量、安全性和有效性的重要成分。药用辅料包括但不限于载体、稀释剂、赋形剂、增溶剂、助溶剂、黏合剂、崩解剂、渗透促进剂、ph调节剂、缓冲剂、释放阻滞剂、矫味剂、防腐剂、抗氧剂等。
[0038]
本发明的有益效果包括：（1）本发明提供了一类n-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)吡啶-2-胺类化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物，可以作为有效的ret激酶抑制剂，其抑制活性较强且副作用较小。
[0039]
（2）本发明还提供了一种包含n-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)吡啶-2-胺类化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物的药物组合物，具有很好的抗肿瘤药理活性。
具体实施方式
[0040]
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体的实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式只是用于详细说明本专利，并不以任何方式限制本发明的保护范围。
[0041]
在本发明的具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物的制备方法中，具体反应过程如下：
第一步要合成中间体ⅳ：将化合物ⅱ、化合物ⅲ和第一种碱溶于第一溶剂中，在40℃~120℃发生反应生成中间体ⅳ。其中第一种碱可以选择三乙胺、二异丙基乙胺、n-甲基吗啉、4-二甲基氨基吡啶、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂中的至少一种；第一溶剂可以选择甲苯、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺和n,n-二甲基乙酰胺中的至少一种。
[0042]
例如，将1mol化合物ⅱ、1mol化合物ⅲ和2mol二异丙基乙胺溶于2l二甲基亚砜中，在60℃下搅拌反应生成中间体ⅳ。可以采用薄层色谱（thin layer chromatography，简写为tlc）监测反应，反应完毕后经提取、干燥、浓缩、分离等常规处理工艺即可得到中间体ⅳ。
[0043]
第二步是合成中间体
ⅵ
：将中间体ⅳ、化合物
ⅴ
和第二种碱溶于第二溶剂中，再向第二溶剂中加入催化剂，在40℃~120℃下搅拌反应生成中间体
ⅵ
。其中，第二种碱可以选择三乙胺、二异丙基乙胺、碳酸钾、碳酸铯、叔丁醇钠、叔丁醇钾、磷酸钾和醋酸钠中的至少一种；第二溶剂可以选择二氧六环、甲苯、乙腈、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺和n,n-二甲基乙酰胺中的至少一种；催化剂可以选择双(三苯基膦)二氯化钯(ii)（分子式简写为pdcl2(pph3)2）、四(三苯基膦)钯（分子式简写为pd(pph3)4）、双(二亚芐基丙酮)钯（分子式简写为pd(dba)2）、醋酸钯（分子式简写为pd(oac)2）和1,1'-[双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（分子式简写为pd(dppf)cl2）中的至少一种。
[0044]
例如，将1mol中间体ⅳ、1mol化合物
ⅴ
和1.5mol碳酸铯溶于1.5l甲苯中，再加入0.05mol醋酸钯，在80℃下搅拌反应生成中间体
ⅵ
。可以采用tlc监测反应，反应完毕后经提取、干燥、浓缩、分离等常规处理工艺即可得到中间体
ⅵ
。
[0045]
在第二步的反应中，为了提高催化剂的活性，在反应体系中还可添加适量的配体。所述配体选自三苯基膦、三丁基膦、2-双环己基膦-2',4',6'-三异丙基联苯、2-双环己基膦-2',6'-二甲氧基联苯、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽中的至少一种。
[0046]
第三步是合成中间体
ⅶ
：将中间体
ⅵ
溶于第三溶剂中，加入三氟乙酸或氯化氢溶液，在20℃~100℃下发生反应生成中间体。其中，第三溶剂可以选择甲苯、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醇和甲醇中的至少一种；氯化氢溶液可以选择氯化氢乙醇溶液、氯化氢甲醇溶液、氯化氢乙酸乙酯溶液和氯化氢四氢呋喃溶液中的任意一种。
[0047]
例如，将1mol中间体
ⅵ
溶于2.0l二氯甲烷中，加入0.5l三氟乙酸在40℃下搅拌反应生成中间体
ⅶ
。可以采用tlc监测反应，反应结束后经浓缩、提取、干燥、浓缩、分离等常规处理工艺即可得到中间体
ⅶ
。
[0048]
第四步是合成具有式ⅰ结构的化合物：将中间体
ⅶ
、化合物
ⅷ
和第三种碱溶于第四溶剂中，并向第四溶剂中加入缩合剂，在20~100℃下发生反应生成具有式ⅰ结构的化合物。其中，第三种碱可以选择三乙胺、二异丙基乙胺、n-甲基吗啉和4-二甲基氨基吡啶中的至少
一种；第四溶剂可以选择四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯、n,n-二甲基甲酰胺和乙腈中的至少一种；缩合剂可以选择n,n'-羰基二咪唑、碳酰氯、双(三氯甲基)碳酸酯中的至少一种。
[0049]
例如，将0.01mol中间体
ⅶ
、0.01mol化合物
ⅷ
、0.03mol三乙胺和0.01mol n,n'-羰基二咪唑（cdi）溶于3l甲苯中，在75℃搅拌反应生成具有式ⅰ结构的化合物。可以采用tlc监测反应，反应完毕以后，再经过浓缩、分离等常规处理工艺即可获得最终产物。
[0050]
本发明先后进行多次试验，现列举一部分试验作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明：除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；以下实施例中所用的原材料、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得；所述试剂用量，如无特殊说明，均为常规实验操作中试剂用量；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0051]
实施例1：n-(3-氟苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺第一步：将化合物1a（29.4g，200.0mmol）、化合物1b（19.4g，200.0mmol）、碳酸铯（77.8g，240.0mmol）溶于n,n-二甲基甲酰胺（dmf）（300ml）中，升温至80℃，搅拌反应12小时，tlc监测反应，反应完毕后降至室温，加入水300ml淬灭反应，加入乙酸乙酯（400mlx2）两次提取，合并有机层，干燥、浓缩、柱层析分离得到28.5g的化合物1c，收率为68.5%。化合物1c为类白色固体。
[0052]
第二步：将化合物1c（28.0g，134.6mmol）、化合物1d（30.1g，161.5mmol）、pd(dppf)cl2（5.8g，8mmol）、k2co3（27.9g，201.9mmol）置于dmf（200ml）中，升温至100℃，搅拌反应6小时，tlc监测反应，反应完毕后降至室温，加入水200ml淬灭反应，加入乙酸乙酯（300mlx2）两次提取，合并有机层，干燥、浓缩、柱层析分离得到32.5g的化合物1e，收率为67.4%。化合物1e为类白色固体。
[0053]
第三步将化合物1e（32.0g，89.3mmol）溶于二氯甲烷（300ml）中，室温下加入三氟乙酸（50ml），室温搅拌反应4小时，tlc监测反应，反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，然后用饱和碳酸氢钠溶液调ph值至9-10，加入乙酸乙酯（300mlx2）两次提取，合并有机层，干燥、浓缩、柱层析分离得到20.1g的化合物1f，收率为87.2%。化合物1f为白色固体。
[0054]
第四步将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物1g（111mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、n,n'-羰基二咪唑（cdi）（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物1）223mg，收率为56.5%，esi(+)m/z=396.2。
[0055]
实施例2n-(3-甲氧基苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0056]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物2a（123mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物2)298mg，收率为73.2%，esi(+)m/z=408.2。
[0057]
实施例3n-(3-氰基苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0058]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物3a（118mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物3)254mg，收率为63.2%，esi(+)m/z=403.2。
[0059]
实施例4n-(3-氯苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0060]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物4a（127mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，
反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物4)268mg，收率为65.2%，esi(+)m/z=412.2。
[0061]
实施例5n-(3-氨基羰基苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0062]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物5a（136mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物5)282mg，收率为67.1%，esi(+)m/z=421.2。
[0063]
实施例6n-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0064]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物6a（124mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物6)305mg，收率为74.8%，esi(+)m/z=409.2。
[0065]
实施例7n-(2-甲氧基吡啶-4-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0066]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物7a（124mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，
反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物7)228mg，收率为55.9%，esi(+)m/z=409.2。
[0067]
实施例8n-(4-氰基苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0068]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物8a（118mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物8)247mg，收率为61.4%，esi(+)m/z=403.2。
[0069]
实施例9n-(3-氯-4-氟苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0070]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物9a（145mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物9)244mg，收率为56.9%，esi(+)m/z=430.2。
[0071]
实施例10n-(4-氨基羰基苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0072]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物10a（136mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物10)295mg，收率为70.2%，esi(+)m/z=421.2。
[0073]
实施例11n-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧己烷-6-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0074]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物10a（151mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物11)277mg，收率为63.7%，esi(+)m/z=436.2。
[0075]
实施例12n-(苯并[b][1,3]二氧戊烷-5-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0076]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物12a（137mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物12)287mg，收率为68.2%，esi(+)m/z=422.2。
[0077]
实施例13n-(1h-吲哚-6-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0078]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物13a（133mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物13)242mg，收率为58.0%，esi(+)m/z=418.2。
[0079]
实施例14
n-(1h-苯并[d]咪唑-6-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0080]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物14a（133mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物14)273mg，收率为65.5%，esi(+)m/z=418.2。
[0081]
实施例15n-(苯并[b]噻吩-6-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0082]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物15a（149mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物15)295mg，收率为68.1%，esi(+)m/z=434.2。
[0083]
实施例16n-(4-(1h-吡唑-1-基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0084]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物16a（159mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物16)312mg，收率为70.4%，esi(+)m/z=444.2。
[0085]
实施例17
n-(4-(1h-吡咯-1-基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0086]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物17a（158mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物17)278mg，收率为62.9%，esi(+)m/z=443.2。
[0087]
实施例18n-(4-(3-氧代吡咯-1-基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0088]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物18a（176mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物18)320mg，收率为69.6%，esi(+)m/z=461.2。
[0089]
实施例19n-(4-(3-氧代吗林基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0090]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物19a（192mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，
反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物19)302mg，收率为63.4%，esi(+)m/z=477.2。
[0091]
实施例20n-(4-(2-氧代哌啶-1-基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0092]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物20a（190mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物20)288mg，收率为60.8%，esi(+)m/z=475.2。
[0093]
实施例21n-(4-(4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0094]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物21a（205mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物21)296mg，收率为60.5%，esi(+)m/z=490.2。
[0095]
实施例22n-(4-(3-氧代哌嗪-1-基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺
按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0096]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物22a（191mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物22)311mg，收率为65.5%，esi(+)m/z=476.2。
[0097]
生物学评价ret激酶体外活性测试实验方法：在96孔板中先后加入10μl反应溶液、10μlret激酶、10μl底物、10μl待测化合物溶液、10μl腺苷三磷酸(atp)溶液，混匀后孵育30分钟；然后在每个孔板中加入10μl激酶反应终止液，接着在每个孔板中加入10μl磷酸-组蛋白h3抗体，在25℃孵育60分钟后加入100μl辣根过氧化物酶(hrp)-抗体螯合剂溶液，在25℃孵育60分钟，继而加入100μltmb底物于25℃孵育10分钟，最后在每个孔板中加入100μlelisa终止液，用酶联免疫检测仪记录450nm的读数，以不加药物的溶剂作为空白对照，通过计算得到ic
50
，具体数据如下表所示：其中，a＜50nm，50nm≤b≤500nm，500nm＜c。
[0098]
从上表可以看出，化合物1-化合物22均可以抑制ret激酶。其中，化合物2、化合物5、化合物6、化合物10、化合物13、化合物14、化合物15、化合物19和化合物20对ret激酶的抑制能力最强。
[0099]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术领域
[0001]
本发明属于药物领域，具体涉及一种n-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)吡啶-2-胺类化合物及其制备方法。
背景技术：
[0002]
转染重排（ret）是一种神经生长因子受体酪氨酸激酶。ret参与细胞增殖、神经传导、细胞迁移和细胞分化，在与神经营养因子（gdnf）受体α-1、2、3、4中的一种结合后被活化，其激活涉及细胞增殖和存活的多个下游途径，诱导细胞增生。现有研究表明，ret融合蛋白与部分癌症成相关性，包括非小细胞癌、甲状腺癌、乳腺癌、胰腺癌等。ret基因的异位、突变或过表达增强了其活化，从而有助于肿瘤细胞生长、形成或组织浸润。此外，现有研究也表明ret是癌症的不良预后因子，一些报道指出，ret的异位及其增强的活化水平也与癌症的预后呈负相关性。因此抑制ret可能是治疗具有组成性ret激酶活性癌症的有效策略。
[0003]
礼来制药的retevmo（loxo-292，通用名：selpercatinib）在美国获得fda批准上市，批准的适应症包括转移性ret融合阳性非小细胞肺癌、晚期或转移性ret突变甲状腺髓样癌和晚期或转移性ret融合阳性甲状腺癌。
[0004]
因此，研究发现结构新颖、活性较强且副作用更小的ret抑制剂具有重要意义。
技术实现要素：
[0005]
本发明为了寻找新型的ret激酶抑制剂，经过广泛深入的研究，设计、合成了一系列结构新颖、安全性高、对ret激酶的抑制活性较高的n-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)吡啶-2-胺类化合物，并且研究了这一类化合物的抗肿瘤活性。
[0006]
本发明的一个目的是提供一种n-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)吡啶-2-胺类化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物。
[0007]
本发明的另一个目的是提供一种上述化合物的制备方法。
[0008]
本发明的另一个目的是提供一种包含上述化合物的药物组合物。
[0009]
本发明的另一个目的是提供上述化合物和上述药物组合物作为ret激酶抑制剂用于治疗肿瘤的用途。
[0010]
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：第一方面，本发明提供了一种具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物：
其中，r1为单取代、多取代或不取代的苯环或芳杂环。
[0011]
进一步的，所述r1优选自：。
[0012]
本发明提供的具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物，可以选自具有如下化合物结构的化合物：
。
[0013]
第二方面，本发明提供了一种具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物的制备方法，包括如下步骤：（1）中间体ⅳ的合成：具有式ⅱ结构的化合物ⅱ和具有式ⅲ结构的化合物ⅲ于第一种碱存在的第一溶剂中，在第一反应温度下发生反应生成具有式ⅳ结构的中间体ⅳ；（2）中间体
ⅵ
的合成：中间体ⅳ和具有式
ⅴ
结构的化合物
ⅴ
在催化剂的作用下于第二种碱存在的第二溶剂中，在第二反应温度下发生反应生成具有式
ⅵ
结构的中间体
ⅵ
；（3）中间体
ⅶ
的合成：中间体
ⅵ
和酸于第三溶剂中，在第三反应温度下发生反应生成具有式
ⅶ
结构的中间体
ⅶ
；（4）具有式ⅰ结构的化合物的合成：中间体
ⅶ
和具有式
ⅷ
结构的化合物
ⅷ
在缩合剂的作用下于第三种碱存在的第四溶剂中，在第四反应温度下发生反应生成具有式ⅰ结构的化合物。
[0014]
作为本发明所提供的制备方法的一个优选方案，在反应步骤（1）中：所述第一反应温度为40℃~120℃；和/或，所述第一种碱选自三乙胺、二异丙基乙胺、n-甲基吗啉、4-二甲基氨基吡啶、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂中的至少一种；和/或，所述第一溶剂选自甲苯、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺和n,n-二甲基乙酰胺中的至少一种。
[0015]
作为本发明所提供的制备方法的另一个优选方案，在反应步骤（2）中：所述第二反应温度为40℃~120℃；和/或，所述第二种碱选自三乙胺、二异丙基乙胺、碳酸钾、碳酸铯、叔丁醇钠、叔丁醇
钾、磷酸钾和醋酸钠中的至少一种；和/或，所述第二溶剂选自二氧六环、甲苯、乙腈、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺和n,n-二甲基乙酰胺中的至少一种；和/或，所述催化剂选自双(三苯基膦)二氯化钯(ii)、四(三苯基膦)钯、双(二亚芐基丙酮)钯、醋酸钯和1,1'-[双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯中的至少一种。
[0016]
作为本发明所提供的制备方法的另一个优选方案，在反应步骤（3）中：所述第三反应温度为20℃~100℃；和/或，所述第三溶剂选自甲苯、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醇和甲醇中的至少一种；和/或，所述酸为三氟乙酸或氯化氢溶液。
[0017]
优选的，所述氯化氢溶液为氯化氢溶于有机溶剂中形成的溶液。
[0018]
进一步优选的，所述氯化氢溶液为氯化氢乙醇溶液、氯化氢甲醇溶液、氯化氢乙酸乙酯溶液和氯化氢四氢呋喃溶液中的任意一种。
[0019]
作为本发明所提供的制备方法的另一个优选方案，在反应步骤（4）中：所述第四反应温度为20~100℃；和/或，所述缩合剂为n,n'-羰基二咪唑、碳酰氯、双(三氯甲基)碳酸酯中的至少一种；和/或，所述第三种碱选自三乙胺、二异丙基乙胺、n-甲基吗啉和4-二甲基氨基吡啶中的至少一种；和/或，所述第四溶剂选自四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯、n,n-二甲基甲酰胺和乙腈中的至少一种。
[0020]
本发明提供的制备方法以化合物ⅱ和化合物ⅲ为起始原料，通过合成中间体ⅳ、中间体
ⅵ
和中间体
ⅶ
，最终制备出具有式ⅰ结构的化合物。整个制备过程操作简单，易于控制，对生产设备要求不高，适用于工业化大规模生产。
[0021]
本发明提供的制备方法中的各种条件，例如反应物、溶剂、酸、碱、催化剂、所用化合物的用量、反应温度、反应所需时间等均不仅限于上面的解释。本发明提供的具有式ⅰ结构的化合物还可以任选地将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便地制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。
[0022]
第三方面，本发明提供了一种药物组合物，包含具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物。
[0023]
在本发明中，具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物是作为药物组合物中的活性成分。
[0024]
本发明提供的药物组合物除了包含治疗有效量的至少一种具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物之外，还包含：一种或多种药用辅料；和/或，一种或多种除了具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物之外的其它具有抑制ret激酶活性的药用活性物质。
[0025]
制备本发明提供的药物组合物的方法对本领域技术人员而言是显而易见的，包括常见的混合、溶解、冻干等技术。
[0026]
本发明提供的药物组合物可以依照药学领域的常规制备方法制成各种常见的剂型，例如片剂、含片、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶液剂、口服混悬剂、口服乳剂、注射剂等。
方便提供给患者临床使用，通过各种常见的给药方式向患者施用，例如口服或肠胃外施用(通过静脉内、肌内、局部或皮下途径)。
[0027]
第四方面，本发明提供了具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物和包含具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物的药物组合物作为ret激酶抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
[0028]
就本发明提供的化合物和药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用而言，是采用对需要治疗肿瘤的患者施用治疗有效量的本发明提供的化合物或药物组合物的方式来实现治疗效果。本发明提供的化合物或药物组合物可以作为治疗肿瘤的治疗手段单独使用，也可以与手术、放疗、化疗等其它治疗肿瘤的常规治疗手段配合使用。
[0029]
本发明提供的化合物或药物组合物用于治疗肿瘤的治疗有效量取决于许多因素。可能会根据需要治疗的肿瘤的具体种类而改变，这可以由本领域技术人员不经过度尝试即可确定。实际治疗中还需要考虑患者年龄和体重、病症严重程度、具体施药方式等因素，最终取决于在场医师或临床医生的决定。
[0030]
进一步的，所述肿瘤选自：皮肤癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、脑癌、直肠癌、食管癌、舌癌、肾癌、宫颈癌、子宫体癌、睾丸癌、泌尿癌、黑素癌、星型细胞癌、脑膜瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性粒细胞白血病、成人t细胞白血病淋巴瘤、肝细胞癌、多发性骨髓瘤、基底细胞瘤、精原细胞瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、纤维肉瘤。
[0031]
本发明的表达中涉及的一些术语定义如下：术语“药学上可接受的盐”是指那些保留母体化合物的生物有效性及特性的盐。该盐包括：酸加成盐，其是通过母体化合物的游离碱与无机酸或与有机酸的反应而获得的；所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、磷酸、硫酸及高氯酸等；所述有机酸包括乙酸、草酸、(d)或(l)苹果酸、马来酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟乙磺酸、乳酸、扁桃酸、黏液酸、双羟萘酸、泛酸、琥珀酸或丙二酸等；或者，当母体化合物中存在的酸质子被置换为金属离子或与有机碱配位时形成的盐；所述金属离子包括碱金属离子、碱土离子、铝离子等；所述有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、n-甲基葡糖胺等。
[0032]
术语“水合物”是指水分子以配位键或共价键与化合物中的阳离子或阴离子结合，或指水离子不直接与阳离子或阴离子结合而是以一定比例存在于固体晶格的确定位置而形成的物质。
[0033]
术语“溶剂合物”是指化合物与药学上可接受的溶剂分子缔合形成的物质，药学上可接受的溶剂一般包括乙醇、乙酸等。
[0034]
术语“立体异构体”是指具有相同分子式、但是分子中原子在空间排列方式上不同的化合物。由于本发明提供的化合物可具有一个或多个不对称中心，因此该化合物可以单独(r)-立体异构体形式制备或以单独(s)-立体异构体形式制备或以其混合物形式制备。除
非另有说明，否则本发明中的特定化合物的描 述或名称意欲包括个别对映异构体与其外消旋混合物或其它混合物。用于测定立体化学构型及分离立体异构体的方法是本领域的常规技术(参见《advanced organic chemistry》的第4章中的论述，第4版，j.march，john wiley及sons，new york，1992)。因此，本发明亦涵盖具有调节ret激酶活性的能力的任何立体异构形式、其相应对映异构体(d-异构体及l-异构体或(+)异构体及(-)异构体)及其非对映异构体及其混合物且不限于任一种立体异构形式。
[0035]
术语“芳杂环”是指芳族的杂环，通常为具有1至3个选自n、o或s的杂原子的5-至8-元的杂环。芳杂环可以任选地进一步稠合或连接于芳族和非芳族的碳环和杂环。所述芳杂环的非限制性的实例包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噻噁唑基、吡咯基、苯基-吡咯基、呋喃基、苯基-呋喃基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、噻吩基、苯并噻吩基、异二氢吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、1,2,3-三唑基、1-苯基-1,2,3-三唑基、2,3-二氢吲哚基、2,3-二氢苯并呋喃基、2,3-二氢苯并噻吩基、苯并吡喃基、2,3-二氢苯并噁嗪基、2,3-二氢喹喔啉基等。
[0036]
术语“药物组合物”是指一种或多种本发明所提供的化合物与其它化学成分(例如药用辅料)的混合物。药物组合物的目的旨在促进化合物给予生物。
[0037]
术语“药用辅料”是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，对生物不产生明显刺激且不会消除所给予的化合物的生物活性及特性，并且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋型、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药物组合物的质量、安全性和有效性的重要成分。药用辅料包括但不限于载体、稀释剂、赋形剂、增溶剂、助溶剂、黏合剂、崩解剂、渗透促进剂、ph调节剂、缓冲剂、释放阻滞剂、矫味剂、防腐剂、抗氧剂等。
[0038]
本发明的有益效果包括：（1）本发明提供了一类n-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)吡啶-2-胺类化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物，可以作为有效的ret激酶抑制剂，其抑制活性较强且副作用较小。
[0039]
（2）本发明还提供了一种包含n-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)吡啶-2-胺类化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物的药物组合物，具有很好的抗肿瘤药理活性。
具体实施方式
[0040]
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体的实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式只是用于详细说明本专利，并不以任何方式限制本发明的保护范围。
[0041]
在本发明的具有式ⅰ结构的化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、立体异构体或同位素化合物的制备方法中，具体反应过程如下：
第一步要合成中间体ⅳ：将化合物ⅱ、化合物ⅲ和第一种碱溶于第一溶剂中，在40℃~120℃发生反应生成中间体ⅳ。其中第一种碱可以选择三乙胺、二异丙基乙胺、n-甲基吗啉、4-二甲基氨基吡啶、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂中的至少一种；第一溶剂可以选择甲苯、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺和n,n-二甲基乙酰胺中的至少一种。
[0042]
例如，将1mol化合物ⅱ、1mol化合物ⅲ和2mol二异丙基乙胺溶于2l二甲基亚砜中，在60℃下搅拌反应生成中间体ⅳ。可以采用薄层色谱（thin layer chromatography，简写为tlc）监测反应，反应完毕后经提取、干燥、浓缩、分离等常规处理工艺即可得到中间体ⅳ。
[0043]
第二步是合成中间体
ⅵ
：将中间体ⅳ、化合物
ⅴ
和第二种碱溶于第二溶剂中，再向第二溶剂中加入催化剂，在40℃~120℃下搅拌反应生成中间体
ⅵ
。其中，第二种碱可以选择三乙胺、二异丙基乙胺、碳酸钾、碳酸铯、叔丁醇钠、叔丁醇钾、磷酸钾和醋酸钠中的至少一种；第二溶剂可以选择二氧六环、甲苯、乙腈、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺和n,n-二甲基乙酰胺中的至少一种；催化剂可以选择双(三苯基膦)二氯化钯(ii)（分子式简写为pdcl2(pph3)2）、四(三苯基膦)钯（分子式简写为pd(pph3)4）、双(二亚芐基丙酮)钯（分子式简写为pd(dba)2）、醋酸钯（分子式简写为pd(oac)2）和1,1'-[双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（分子式简写为pd(dppf)cl2）中的至少一种。
[0044]
例如，将1mol中间体ⅳ、1mol化合物
ⅴ
和1.5mol碳酸铯溶于1.5l甲苯中，再加入0.05mol醋酸钯，在80℃下搅拌反应生成中间体
ⅵ
。可以采用tlc监测反应，反应完毕后经提取、干燥、浓缩、分离等常规处理工艺即可得到中间体
ⅵ
。
[0045]
在第二步的反应中，为了提高催化剂的活性，在反应体系中还可添加适量的配体。所述配体选自三苯基膦、三丁基膦、2-双环己基膦-2',4',6'-三异丙基联苯、2-双环己基膦-2',6'-二甲氧基联苯、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽中的至少一种。
[0046]
第三步是合成中间体
ⅶ
：将中间体
ⅵ
溶于第三溶剂中，加入三氟乙酸或氯化氢溶液，在20℃~100℃下发生反应生成中间体。其中，第三溶剂可以选择甲苯、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醇和甲醇中的至少一种；氯化氢溶液可以选择氯化氢乙醇溶液、氯化氢甲醇溶液、氯化氢乙酸乙酯溶液和氯化氢四氢呋喃溶液中的任意一种。
[0047]
例如，将1mol中间体
ⅵ
溶于2.0l二氯甲烷中，加入0.5l三氟乙酸在40℃下搅拌反应生成中间体
ⅶ
。可以采用tlc监测反应，反应结束后经浓缩、提取、干燥、浓缩、分离等常规处理工艺即可得到中间体
ⅶ
。
[0048]
第四步是合成具有式ⅰ结构的化合物：将中间体
ⅶ
、化合物
ⅷ
和第三种碱溶于第四溶剂中，并向第四溶剂中加入缩合剂，在20~100℃下发生反应生成具有式ⅰ结构的化合物。其中，第三种碱可以选择三乙胺、二异丙基乙胺、n-甲基吗啉和4-二甲基氨基吡啶中的至少
一种；第四溶剂可以选择四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯、n,n-二甲基甲酰胺和乙腈中的至少一种；缩合剂可以选择n,n'-羰基二咪唑、碳酰氯、双(三氯甲基)碳酸酯中的至少一种。
[0049]
例如，将0.01mol中间体
ⅶ
、0.01mol化合物
ⅷ
、0.03mol三乙胺和0.01mol n,n'-羰基二咪唑（cdi）溶于3l甲苯中，在75℃搅拌反应生成具有式ⅰ结构的化合物。可以采用tlc监测反应，反应完毕以后，再经过浓缩、分离等常规处理工艺即可获得最终产物。
[0050]
本发明先后进行多次试验，现列举一部分试验作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明：除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；以下实施例中所用的原材料、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得；所述试剂用量，如无特殊说明，均为常规实验操作中试剂用量；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0051]
实施例1：n-(3-氟苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺第一步：将化合物1a（29.4g，200.0mmol）、化合物1b（19.4g，200.0mmol）、碳酸铯（77.8g，240.0mmol）溶于n,n-二甲基甲酰胺（dmf）（300ml）中，升温至80℃，搅拌反应12小时，tlc监测反应，反应完毕后降至室温，加入水300ml淬灭反应，加入乙酸乙酯（400mlx2）两次提取，合并有机层，干燥、浓缩、柱层析分离得到28.5g的化合物1c，收率为68.5%。化合物1c为类白色固体。
[0052]
第二步：将化合物1c（28.0g，134.6mmol）、化合物1d（30.1g，161.5mmol）、pd(dppf)cl2（5.8g，8mmol）、k2co3（27.9g，201.9mmol）置于dmf（200ml）中，升温至100℃，搅拌反应6小时，tlc监测反应，反应完毕后降至室温，加入水200ml淬灭反应，加入乙酸乙酯（300mlx2）两次提取，合并有机层，干燥、浓缩、柱层析分离得到32.5g的化合物1e，收率为67.4%。化合物1e为类白色固体。
[0053]
第三步将化合物1e（32.0g，89.3mmol）溶于二氯甲烷（300ml）中，室温下加入三氟乙酸（50ml），室温搅拌反应4小时，tlc监测反应，反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，然后用饱和碳酸氢钠溶液调ph值至9-10，加入乙酸乙酯（300mlx2）两次提取，合并有机层，干燥、浓缩、柱层析分离得到20.1g的化合物1f，收率为87.2%。化合物1f为白色固体。
[0054]
第四步将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物1g（111mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、n,n'-羰基二咪唑（cdi）（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物1）223mg，收率为56.5%，esi(+)m/z=396.2。
[0055]
实施例2n-(3-甲氧基苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0056]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物2a（123mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物2)298mg，收率为73.2%，esi(+)m/z=408.2。
[0057]
实施例3n-(3-氰基苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0058]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物3a（118mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物3)254mg，收率为63.2%，esi(+)m/z=403.2。
[0059]
实施例4n-(3-氯苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0060]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物4a（127mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，
反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物4)268mg，收率为65.2%，esi(+)m/z=412.2。
[0061]
实施例5n-(3-氨基羰基苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0062]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物5a（136mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物5)282mg，收率为67.1%，esi(+)m/z=421.2。
[0063]
实施例6n-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0064]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物6a（124mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物6)305mg，收率为74.8%，esi(+)m/z=409.2。
[0065]
实施例7n-(2-甲氧基吡啶-4-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0066]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物7a（124mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，
反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物7)228mg，收率为55.9%，esi(+)m/z=409.2。
[0067]
实施例8n-(4-氰基苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0068]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物8a（118mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物8)247mg，收率为61.4%，esi(+)m/z=403.2。
[0069]
实施例9n-(3-氯-4-氟苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0070]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物9a（145mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物9)244mg，收率为56.9%，esi(+)m/z=430.2。
[0071]
实施例10n-(4-氨基羰基苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0072]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物10a（136mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物10)295mg，收率为70.2%，esi(+)m/z=421.2。
[0073]
实施例11n-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧己烷-6-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0074]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物10a（151mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物11)277mg，收率为63.7%，esi(+)m/z=436.2。
[0075]
实施例12n-(苯并[b][1,3]二氧戊烷-5-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0076]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物12a（137mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物12)287mg，收率为68.2%，esi(+)m/z=422.2。
[0077]
实施例13n-(1h-吲哚-6-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0078]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物13a（133mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物13)242mg，收率为58.0%，esi(+)m/z=418.2。
[0079]
实施例14
n-(1h-苯并[d]咪唑-6-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0080]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物14a（133mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物14)273mg，收率为65.5%，esi(+)m/z=418.2。
[0081]
实施例15n-(苯并[b]噻吩-6-基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0082]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物15a（149mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物15)295mg，收率为68.1%，esi(+)m/z=434.2。
[0083]
实施例16n-(4-(1h-吡唑-1-基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0084]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物16a（159mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物16)312mg，收率为70.4%，esi(+)m/z=444.2。
[0085]
实施例17
n-(4-(1h-吡咯-1-基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0086]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物17a（158mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物17)278mg，收率为62.9%，esi(+)m/z=443.2。
[0087]
实施例18n-(4-(3-氧代吡咯-1-基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0088]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物18a（176mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物18)320mg，收率为69.6%，esi(+)m/z=461.2。
[0089]
实施例19n-(4-(3-氧代吗林基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0090]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物19a（192mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，
反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物19)302mg，收率为63.4%，esi(+)m/z=477.2。
[0091]
实施例20n-(4-(2-氧代哌啶-1-基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0092]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物20a（190mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物20)288mg，收率为60.8%，esi(+)m/z=475.2。
[0093]
实施例21n-(4-(4-甲基-2-氧代哌嗪-1-基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0094]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物21a（205mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物21)296mg，收率为60.5%，esi(+)m/z=490.2。
[0095]
实施例22n-(4-(3-氧代哌嗪-1-基)苯基)-4-(6-((5-甲基-1h-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺
按照实施例1中的第一步、第二步、第三步的方法合成化合物1f。
[0096]
将化合物1f（258mg，1.0mmol）、化合物22a（191mg，1.0mmol）、三乙胺（303mg，3.0mmol）、cdi（162mg，1.0mmol）溶于二氯甲烷（30ml）中，室温搅拌反应过夜，tlc监测反应，反应完毕后，直接浓缩，柱层析分离得到类白色固体（化合物22)311mg，收率为65.5%，esi(+)m/z=476.2。
[0097]
生物学评价ret激酶体外活性测试实验方法：在96孔板中先后加入10μl反应溶液、10μlret激酶、10μl底物、10μl待测化合物溶液、10μl腺苷三磷酸(atp)溶液，混匀后孵育30分钟；然后在每个孔板中加入10μl激酶反应终止液，接着在每个孔板中加入10μl磷酸-组蛋白h3抗体，在25℃孵育60分钟后加入100μl辣根过氧化物酶(hrp)-抗体螯合剂溶液，在25℃孵育60分钟，继而加入100μltmb底物于25℃孵育10分钟，最后在每个孔板中加入100μlelisa终止液，用酶联免疫检测仪记录450nm的读数，以不加药物的溶剂作为空白对照，通过计算得到ic
50
，具体数据如下表所示：其中，a＜50nm，50nm≤b≤500nm，500nm＜c。
[0098]
从上表可以看出，化合物1-化合物22均可以抑制ret激酶。其中，化合物2、化合物5、化合物6、化合物10、化合物13、化合物14、化合物15、化合物19和化合物20对ret激酶的抑制能力最强。
[0099]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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