一种构建体及其在动物衰老细胞示踪和衰老细胞清除中的应用的制作方法

[0001]
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种构建体及其在动物衰老示踪和清除衰老细胞中的应用，本发明还涉及由该构建体改造的细胞或动物模型。


背景技术：

[0002]
衰老细胞是指细胞退出细胞周期，进入不分裂的状态，同时在一定程度上保持细胞的功能。衰老细胞的基本变化包括细胞核肿胀、核质比增加、染色质结构变化，细胞复制能力降低或丧失，细胞功能衰退、新陈代谢减慢等。更典型的特征有衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色阳性；出现衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,sasp)，即分泌il-1a、il-1b、il-6、tgf-β1、tnf-α、ccl5、cxcl10等多种细胞因子。细胞衰老研究涉及的检测指标包括衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)、端粒长度和端粒酶活性、衰老相关异染色质(sahf)、衰老相关分泌表型以及衰老通路基因p53、p21和p16ink4a等。sa-β-gal是最常用的细胞衰老标志物，但并不适合作为示踪标志物。利用谱系示踪技术，通过衰老标志物标记衰老细胞，对衰老细胞及其后代细胞的增殖、分化以及迁移等活动进行追踪观察，对于开展衰老细胞在发育、衰老及肿瘤发生中的生物学行为研究具有重要意义。
[0003]
衰老在整个生命周期中都可发生，包括胚胎发生期间。衰老细胞的数量也会随着年龄增大而增加，衰老还在发育以及伤口愈合中发挥重要作用。中科院周斌课题组2019年在《circulation》中证实ccn1诱导的衰老成纤维细胞会分泌多种sasp细胞因子。利用senolytics药物清除年老小鼠体内的衰老细胞，能够改善小鼠的生理状态，延长小鼠的寿命。靶向衰老的骨髓细胞可提高白血病小鼠的存活率。近年来多篇文章也证明衰老细胞与骨骼老化、腰椎肩旁病变、骨关节炎再生有着密不可分的联系。在人体中部分遭受慢性损伤性疾病的器官如肝脏、肾脏中均有衰老细胞的存在，且其存在对于肿瘤发生发展均有一定的影响。衰老与肿瘤的关系目前得不到清晰的阐述，一方面认为衰老细胞会募集巨噬细胞，激活免疫系统加强其对肿瘤细胞的清除。另一方面，大量衰老细胞的存在，会分泌大量的衰老细胞相关分泌表型(sasp)因子，大量的炎症因子会促进肿瘤的发生。
[0004]
如何从衰老细胞的角度更好地解释肿瘤发生，了解衰老细胞在肿瘤发生的不同阶段所扮演的正负角色是本领域亟待解决的问题。此外，如何靶向杀死衰老细胞而不损伤邻近健康细胞，如何在阻断sasp负性因子的同时保留正性因子的作用，如何将动物实验的研究结果推广至临床诊断与治疗等诸多问题都有待进一步的研究。
[0005]
为了更好地研究衰老在发育、疾病及肿瘤中发挥的作用与机制，科研人员正在尝试多种衰老动物模型的建立和研究。然而，鉴于衰老发生发展的复杂性，体内信号通路的相互关联、相互制约又是极为繁杂的，衰老细胞的诱因、类型和表达marker具有很大的差异性，使得这种研究工作举步维艰。即使人们已知了解一些基因与衰老具有相关性，仍然不易于成功地通过改造衰老相关基因而获得有用的疾病模型或有用的抗衰老方法。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供基因改造的细胞或动物模型及其在衰老示踪和清除衰老细胞中的应用。
[0007]
在本发明的第一方面，提供一种分离的构建体，所述构建体靶向于p21基因，且包含有报告基因和白喉毒素受体基因；所述构建体能够改造细胞或动物的基因组，在细胞或动物体中进行衰老细胞定位、示踪、分选、诱导衰老细胞凋亡和/或清除衰老细胞。
[0008]
在一个优选例中，所述构建体靶向于p21基因的3号外显子；较佳地靶向于3号外显子的第47位碱基之后。
[0009]
在另一优选例中，所述的报告基因包括选自下组的报告基因：荧光素酶基因(luciferease)，tdtomato，绿色荧光蛋白基因(gfp)，增强型绿色荧光蛋白编码基因，红色荧光蛋白基因(rfp)，β-半乳糖苷酶编码基因等；较佳地，所述报告基因包括：荧光素酶基因和tdtomato；更佳地，所述荧光素酶为akaluc；更佳地，所述构建体从5
’
至3
’
依次包含以下可操作性相连的元件：akaluc，tdtomato，白喉毒素受体基因。
[0010]
在另一优选例中，akaluc的5
’
端、akaluc与tdtomato之间、tdtomato与白喉毒素受体基因之间，还包括2a序列(核糖体跳跃序列)、p2a和/或t2a。
[0011]
在另一优选例中，白喉毒素受体基因的3
’
端，还包括终止子；较佳地所述终止子为多聚a。
[0012]
在另一优选例中，所述构建体还包括flp识别位点(frt)；较佳地，所述flp识别位点为2个且两者之间还包括正筛选标记基因(更佳地为neo基因)：pgk-neo和/或ddsdc-neo。
[0013]
在另一优选例中，所述构建体还包括单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选基因。
[0014]
在另一优选例中，所述构建体的两端，较佳地所述akaluc的上游和终止子的下游(较佳地2a的5
’
端和正筛选标记基因的3
’
端)，还分别包括5
’
同源臂序列和3
’
同源臂序列。
[0015]
在本发明的另一方面，提供所述的构建体的应用，用于靶向于p21基因，改造细胞或动物的基因组，在细胞或动物体中进行衰老细胞定位、示踪、分选、诱导衰老细胞凋亡和/或清除衰老细胞。
[0016]
在另一优选例中，所述构建体靶向于p21基因的3号外显子中。
[0017]
在本发明的另一方面，提供一种细胞，其基因组中整合有外源的所述的构建体；较佳地，所述构建体整合于细胞的p21基因，更佳地整合于p21基因的3号外显子；较佳地，所述的细胞包括：胚胎干细胞、体细胞、生殖细胞或肿瘤细胞。
[0018]
在另一优选例中，所述生殖细胞包括受精卵，卵母细胞，精子。
[0019]
在另一优选例中，所述的体细胞包括：成纤维细胞，上皮细胞，血液细胞，组织或器官来源的细胞。
[0020]
在本发明的另一方面，提供一种改造细胞的基因组的方法，所述方法包括：将前面任一所述的构建体转染细胞，获得基因组中整合有外源构建体的细胞；较佳地，所述的受试细胞包括：胚胎干细胞、体细胞、生殖细胞或肿瘤细胞；较佳地，所述生殖细胞包括受精卵，卵母细胞，精子；较佳地，所述的体细胞包括：成纤维细胞，上皮细胞，血液细胞，组织或器官来源的细胞。
[0021]
在本发明的另一方面，提供一种对衰老细胞进行定位(包括荧光定位)、示踪、分选、诱导衰老细胞凋亡和/或清除衰老细胞的方法，所述方法包括：
[0022]
(1)将所述的构建体转染受试细胞，获得基因组中整合有外源构建体的细胞；
[0023]
(2)观察细胞中报告基因的表达情况，从而定位、示踪、分选衰老细胞，诱导所述衰老细胞凋亡和/或清除衰老细胞；
[0024]
较佳地，所述的受试细胞包括：胚胎干细胞、体细胞、生殖细胞或肿瘤细胞；较佳地，所述生殖细胞包括受精卵，卵母细胞，精子；较佳地，所述的体细胞包括：成纤维细胞，上皮细胞，血液细胞，组织或器官来源的细胞。
[0025]
在另一优选例中，所述细胞是离体细胞。
[0026]
在另一优选例中，所述细胞包括原代或传代培养的细胞系或细胞株。
[0027]
在另一优选例中，所述方法为离体的方法。
[0028]
在另一优选例中，所述改造细胞或动物的基因组的方法不以诊断或治疗为直接目的。
[0029]
在另一优选例中，所述对衰老细胞进行定位、示踪、分选、诱导衰老细胞凋亡和/或清除衰老细胞的方法不以诊断或治疗为直接目的。
[0030]
在本发明的另一方面，提供一种制备动物的方法，所述动物中的衰老细胞能被定位、示踪、被诱导凋亡和/或被清除，所述方法包括：
[0031]
(1)将所述的构建体引入到胚胎干细胞或生殖细胞中，获得基因组中整合入所述构建体的胚胎干细胞或生殖细胞；
[0032]
(2)利用所述胚胎干细胞或生殖细胞产生动物体，所述动物体能进行衰老细胞示踪，或其衰老细胞能被诱导发生凋亡；
[0033]
较佳地，所述的动物为包括：啮齿类动物；较佳地，所述的啮齿类动物包括小鼠或大鼠(等)。
[0034]
在一个优选例中，所获得的动物体还能进一步产生后代，其后代能定位、示踪衰老细胞或诱导衰老细胞凋亡。
[0035]
在本发明的另一方面，提供利用所述的构建体、所述的细胞或前述方法制备获得的动物的应用，用于研究细胞衰老(较佳地，为不以诊断或治疗为目的的)，或用于制备研究细胞衰老的模型。
[0036]
在另一优选例中，所述模型包括：动物模型或细胞(细胞培养物)模型。
[0037]
在本发明的另一方面，提供用于进行衰老研究的试剂盒，其中包括：前面任一所述的构建体；或前面所述的细胞。
[0038]
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
[0039]
图1、小鼠构建策略示意图。
[0040]
图2、同源重组载体质粒图谱。
[0041]
图3、同源重组载体酶切鉴定电泳图。1：ecori酶切鉴定结果，理论条带大小为7548bp、5363bp、2240bp、1891bp；m：1kb dna ladder。
[0042]
图4、同源重组阳性es细胞pcr鉴定电泳图。数字：es克隆号码；wt：野生型对照；m：1kb dna marker。
[0043]
图5、对es阳性克隆用d-半乳糖诱导衰老后进行阳性akaluc的发光检测的结果。
[0044]
图6、f1代小鼠pcr鉴定产物的电泳验证图。
[0045]
图7、f2代小鼠及wt小鼠衰老皮肤成纤维细胞的sa-β-gal染色(上图)；以及细胞内p21、akalumin、tdtomato、dtr、p16的mrna表达量(下图)的测定结果。
[0046]
图8、h2o2诱导衰老的tdtomato荧光以及荧光强度检测。
[0047]
图9、dtr在p21-atd小鼠细胞中的表达检测。
[0048]
图10、wt小鼠和p21-atd小鼠皮肤成纤维细胞接种黑壁透底96孔板培养后ivis活体光学成像系统检测的发光结果。
[0049]
图11、dt白喉毒素有效诱导衰老的小鼠皮肤成纤维细胞凋亡。
具体实施方式
[0050]
本发明人经过深入的研究，揭示了一种集衰老细胞定位、示踪、分选、诱导衰老细胞凋亡和/或清除衰老细胞于一体的构建体，以及由该构建体改造的细胞或动物模型。所述构建体通过靶向于基因组中p21基因并插入其适当的位置而发挥作用，该构建体包含有报告基因和白喉毒素受体基因。本发明的方法获得的细胞或动物模型是一种具有多功能性，可用于研究衰老及衰老相关疾病。
[0051]
术语
[0052]
如本文所用，所述的“构建体(或称构建物)”指一种已经通过人为干预，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的dna片段的单链或者双链dna分子。所述的“构建体”包括“(表达)载体”。
[0053]
如本文所用，“元件”是指功能性的核酸序列，本发明的优选方式中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种用于基因打靶的构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能。
[0054]
如本文所用，“同源臂”是指与基因组中选定的基因靶向位点同源的用于载体与靶位点重组的dna序列。在确定了基因靶向位点后，可以根据靶向位点附近的序列来进行同源臂的设计。
[0055]
如本文所用，所述的“操作性相连”，“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
[0056]
如本文所用，所述的“动物”为存在p21 cip1基因或其同源基因的动物；较佳地所述动物为自身不表达白喉毒素受体(dtr)的动物。在一些优选方式中，所述的动物包括啮齿类动物，例如小鼠或大鼠。
[0057]
如本文所用，除非另外说明，所述的“细胞”为存在p21 cip1基因或其同源基因的细胞；较佳地所述细胞为自身不表达白喉毒素受体(dtr)的细胞。所述的细胞可以是生殖细胞、胚胎干细胞和体细胞；所述的细胞也可以是恶性增殖细胞/良性增殖细胞，例如为肿瘤。
[0058]
如本文所用，所述的“胚胎干细胞”是人或非人哺乳动物的胚胎干细胞。例如为非人哺乳动物的胚胎干细胞，例如为鼠(如小鼠)的胚胎干细胞。所述的“胚胎干细胞”可以是商品化的或已建系的细胞。
[0059]
p21 cip1(简称p21)
[0060]
为了实现衰老细胞定位、示踪、分选等，建立良好的细胞或动物模型，本发明人进行了大量的研究工作。经过比较和分析，本发明人确定将p21基因作为靶向进行细胞基因组改造的靶点。本发明人发现，通过建立基因打靶构建体，靶向于p21基因的第3外显子，在特定位点插入构建体，可以有效地实现衰老细胞定位、示踪、分选，同时，还能诱导衰老细胞的凋亡。
[0061]
人p21(p21cip1(cdnk1a))基因定位于6号染色体短臂，dna长度为85kb，有3个外显子，其cdna长度约2.1kb。
[0062]
p21基因在动物体中是保守的，鼠p21基因与人p21基因高度同源。鼠p21基因的转录本ensembl号：p21-205(ensmust00000233296.1。
[0063]
应理解，本发明所述的“p21”还包括各种天然存在的p21基因的变异形式、同源基因，其具体形式可经由ncbi的gene数据库，ensemble genome browser的数据库，ucsc genome database以及uniprot的数据库等查询而得。代表性的例子包括：因密码子的简并性而编码与野生型相同的p21蛋白的核苷酸序列，编码野生型p21蛋白的保守性变异多肽的核苷酸序列。
[0064]
p21参与细胞的多种功能活动，其基本生物学作用包括参与细胞周期的调控，为一种细胞周期抑制因子，其调控作用包括p53依赖的调控以及非p53依赖的调控。并且，p21与肿瘤的发生发展具有相关性，其也被认为是一种抑癌基因。尽管p21在现有技术中已被进行功能研究，但是鉴于其在细胞内所发挥的功能的复杂性，本领域没有成功地利用其实现衰老细胞定位、示踪、分选和/或诱导衰老细胞凋亡。
[0065]
构建体
[0066]
本发明提供了一种用于基因打靶的构建体，所述构建体靶向于p21基因、特别是其3号外显子(第3外显子中)，且包含有报告基因和白喉毒素受体基因；所述构建体能够改造细胞或动物的基因组，在细胞或动物体中进行衰老细胞定位、示踪、分选、诱导衰老细胞凋亡和/或清除衰老细胞。在本发明的特别优选方式中，所述构建体靶向插入于3号外显子的第47位碱基之后。
[0067]
本发明中，通过报告基因来进行示踪、分选。可以运用多种报告基因来实现这一目的，包括但不限于荧光素酶基因，tdtomato，绿色荧光蛋白基因，增强型绿色荧光蛋白编码基因，红色荧光蛋白基因，β-半乳糖苷酶编码基因等。作为本发明中特别优选的方式，所述报告基因包括：荧光素酶基因和tdtomato；更佳地，所述荧光素酶为akaluc。
[0068]
本发明人对于多种报告基因进行了比较，发现当运用于本发明时，akaluc是相对效果最为理想的，其能够配合本发明的构建体的其它元件、良好地表达并发挥作用。活体生物发光成像(bli)技术可以在无创条件下对活体组织或小动物体内的生物学行为进行成像跟踪，其最广泛使用的荧光素即d-luciferin(luciferease的底物)。然而，d-luciferin当运用于本发明的技术方案时，其效果相对而言要次于akaluc。
[0069]
在本发明的优选方式中，还同时运用其它荧光基因作为报告基因，优选地，运用了tdtomato。根据本发明人对多种光谱类型的荧光蛋白的比较，发现tdtomato是相对最为理想的，其能够配合本发明的构建体的其它元件、良好地表达并发挥作用，其亮度高于红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白。它是一种原始的水果蛋白的橙色衍生物。tdtomato来源于一种被
命名为dimer2的中间体，这种中间体是在四聚体dsred蛋白崩解过程中产生的。tdtomato基因的存在，可以实现衰老细胞的分选及组织定位。
[0070]
本发明中，将白喉毒素受体(dtr)的编码基因构建于所述的构建体上，以在细胞或动物中表达dtr，其能够配合本发明的构建体的其它元件、良好地表达并发挥作用。dtr不存在于啮齿动物中，当给啮齿动物注射大量白喉毒素(dt)时，动物本身的安全不会受到大的影响。当给动物注射白喉毒素后，白喉毒素与p21阳性的衰老细胞上的白喉毒素受体(dtr)结合后，可通过发挥其adp核糖基化活性而抑制细胞蛋白合成，引发细胞凋亡。本发明人发现，基于dtr-dt的杀伤系统，具有很好的安全性，其在靶向衰老细胞发挥杀伤作用的同时，衰老细胞周围的正常细胞影响很小。
[0071]
作为本发明的优选方式，所述构建体从5
’
至3
’
依次包含以下可操作性相连的元件：akaluc，tdtomato，白喉毒素受体基因。
[0072]
在本发明的更为优选的方式中，akaluc的5
’
端、akaluc与tdtomato之间、tdtomato与白喉毒素受体基因之间，还包括核糖体跳跃序列(ribosomal skipping sequence 2a)(简称2a)序列，其是来自口蹄疫病毒的一段核心序列，具备“自剪切”功能，用于进行上游和下游基因共表达。
[0073]
在本发明的更为优选的方式中，白喉毒素受体基因的3
’
端，还包括终止子；较佳地所述终止子为多聚a。
[0074]
在本发明的更为优选的方式中，所述构建体还包括flp识别位点(frt)；较佳地，所述flp识别位点为2个且两者之间还包括正筛选标记基因。该正筛选标记基因例如为neo基因。
[0075]
在本发明的更为优选的方式中，所述构建体还包括单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选基因，以配合该构建体的基因打靶筛选。在本发明的具体实施例中，建立了mc1-tk-polya负筛选标记。
[0076]
在本发明的更为优选的方式中，所述构建体的两端，较佳地所述akaluc的上游和终止子的下游；更佳地位于2a的5
’
端和正筛选标记基因的3
’
端，还分别包括5
’
同源臂序列和3
’
同源臂序列。在本发明的具体实施方式中，运用了包含5.3kb的5
’
同源臂和1.3kb的3
’
同源臂，其可使得构建体在转入细胞内后，可以整合至基因组中合适的位置上，实现正确的基因打靶。
[0077]
在本发明的具体实施例中，藉由同源重组原理，采用细胞打靶的方式，在p21基因终止密码子位点定点敲入2a-akaluc-2a-tdtomato-2a-dtr-pa-frt-neo-frt表达框。
[0078]
根据本发明所披露的信息，本领域技术人员可以在本发明提供的构建体或其各元件的基础上，进行适当的变化，这些变化形式仍应被包含在本发明中。本发明所述元件的变异体或密码子优化后的形式也包括在本发明中。
[0079]
本发明的各元件所指向的基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。
[0080]
构建体中各元件之间还可包括限制性的酶切位点，这样有利于各元件的有机连接。
[0081]
通常，所述的构建体位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建体。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
[0082]
包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化需要进行基因打靶的宿主细胞中。用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，例如显微注射、电穿孔等。
[0083]
本发明构建的构建体转染动物胚胎干细胞后，可良好地在目标基因组的p21基因特定位置处进行靶向性插入，且各个元件表达稳定、活性理想。
[0084]
本发明人构建的构建体集单个衰老细胞示踪、荧光定位、荧光分选，自杀式诱导衰老细胞凋亡等多功能与一体，可应用与多种动物疾病模型中，具有极其优异的技术效果。
[0085]
细胞或动物模型的制备
[0086]
本发明人设计了一种对集p21表达阳性的衰老细胞进行示踪、分选、清除效果于一体的载体。根据本发明，所述构建体可以应用于制备细胞或动物模型。
[0087]
本发明中，提供了运用所述构建体制备细胞的方法，包括：将所述的构建体转染细胞，获得基因组中整合有所述外源构建体的细胞。
[0088]
本发明中，也提供了制备动物模型的方法。所述方法包括：将所述的构建体引入到生殖细胞或胚胎干细胞中，获得基因组中整合入所述构建体的生殖细胞或胚胎干细胞；利用所述生殖细胞或胚胎干细胞产生动物体，所述动物体能进行衰老细胞示踪，或其衰老细胞能被诱导发生凋亡；较佳地，所述的动物为包括：啮齿类动物；较佳地，所述的啮齿类动物包括小鼠或大鼠(等)。
[0089]
所述的细胞模型包括哺乳动物细胞模型或其它真核细胞模型，如人类细胞或小鼠细胞。所述的动物包括但不限于：啮齿类动物(包括大鼠，小鼠，仓鼠等)等模式动物，这些动物中，p21基因具有保守性。优选地，所述动物为啮齿类动物。
[0090]
在本发明的具体实施例中，获得了p21基因定点敲入2a-akaluc-2a-tdtomato-2a-dtr-pa-frt-neo-frt的杂合子小鼠。更具体地，本发明实施例中建立了同源重组载体质粒p21-(2a-akaluc-2a-tdtomato-2a-dtr-pa-frt-neo-frt-pa)1；该载体经线性化后，电转转染jm8a3 es细胞；经长片段pcr鉴定，获得正确同源重组的阳性克隆；阳性es细胞克隆经扩增后，注射入c57bl/6j小鼠的囊胚中，获得嵌合鼠；高比例嵌合小鼠与flp小鼠交配获得阳性f1代去neo杂合子小鼠。
[0091]
本发明的方法可以非常有效地追踪衰老细胞的分布、类型、末端分化。
[0092]
试剂盒
[0093]
基于本发明所披露的内容，本发明还提供了用于进行衰老研究的试剂盒，其中包括：本发明所述的构建体；或整合有本发明的构建体的细胞。
[0094]
所述的试剂盒中，还可包括说明实施本发明的方法(包括建立构建体、建立改造的细胞或动物模型的方法)的使用说明书，以便于本领域技术人员应用。
[0095]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明
而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0096]
实施例1、构建体的建立
[0097]
针对于p21基因，本发明人进行了大量的研究工作，通过基因打靶来进行针对动物的基因改造。反复研究后，本发明人确定了适合于进行打靶的靶向位置，针对p21基因的第3个外显子上特定的位置作为靶向目标。
[0098]
基因改造动物的构建策略如图1所示，针对野生型动物的外显子3中第47位碱基之后的位置，通过打靶质粒插入外源的构建体，使得其整合于动物的基因组中。所述外源的构建体如下：
[0099]
2a-akaluc-2a-tdtomato-2a-dtr-pa-frt-neo-frt。
[0100]
基于该构建策略，具体的构建方法如下：
[0101]
1、打靶质粒(同源重组载体质粒)的构建
[0102]
建立如图2的同源重组载体质粒p21-(2a-akaluc-2a-tdtomato-2a-dtr-pa-frt-neo-frt)1。该同源重组载体质粒的各个元件如表1所示。
[0103]
表1
[0104]
元件名称rep复制起始位点amp氨苄抗性筛选基因5
’
arm5
’
同源臂pgkpgk启动子neoneo正筛选标记基因3
’
arm3
’
同源臂hsv-tk单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选基因
[0105]
在构建该质粒时，首先建立载体p21-5arm+3arm，建立方法为：以野生型小鼠的基因组为模板、以引物p21-5f和p21-3r扩增获得5arm扩增产物；获得目的基因p21-5arm+3arm。
[0106]
p21-5f：cgcggtcgacaagcttacagagtctgaactccaggaccac(seq id no:8)；
[0107]
p21-3r：cgactctagaggatccgagaagtatttattgagcaccagc(seq id no:9)。
[0108]
其次，以引物p21-3f和p21-5r，以构建好的载体p21-5arm+3arm为模板进行pcr扩增，获得目的片段p21-3f5r。
[0109]
p21-3f：agcttcgtggcagggaacaataggtgatggtacttgaacctaaagccttgaagtgcccacgggagc cccg ccctct(seq id no:10)；
[0110]
p21-5r：gggttttctcttgcagaagaccaat(seq id no:11)。
[0111]
用引物p21-aka-f和p21-aka-r，以p21-3f5r为模板，通过pcr扩增得到目的片段2a-akaluc。
[0112]
p21-aka-f：tgcaagagaaaacccggaagcggagctactaacttcagcc(seq id no:12)；
[0113]
p21-aka-r：cagcctgcttcagcaggctgaagttagtagctccgctacccacggcgatcttgccgtccttcttg(seq id no:13)。
[0114]
用引物p21-td-f和p21-td-r，以p21-3f5r为模板，通过pcr扩增得到目的片段2a-tdtomato-2a-dtr。
[0115]
p21-td-f：tgctgaagcaggctggcgacgtggaggagaaccctggtcctatggtgagcaagggcgaggaggt ca(seq id no:14)；
[0116]
p21-td-r：tcagtgggaattagtcatgcccaac(seq id no:15)。
[0117]
用引物p21-neo-f和p21-neo-r，以p21-3f5r为模板，通过pcr扩增得到目的片段pa-frt-neo-frt-pa。
[0118]
p21-neo-f：actaattcccactgacctccccgcatcgataccgtcgatc(seq id no:16)；
[0119]
p21-neo-r：ccctgccacgaagcttggatccattatgtacctgactgat(seq id no:17)。
[0120]
通过hd cloning kit酶将所得目的片段2a-akaluc、2a-tdtomato-2a-dtr、pa-frt-neo-frt-pa和p21-3f5r进行重组，即可得到上述载体。
[0121]
同源重组载体酶切鉴定电泳图如图3，理论条带大小为7548bp、5363bp、2240bp、1891bp。根据图中结果，获得构建正确的重组质粒p21-(2a-akaluc-2a-tdtomato-2a-dtr-pa-frt-neo-frt)1。
[0122]
实施例2、同源重组es细胞的获得及其鉴定
[0123]
对同源重组载体质粒p21-(2a-akaluc-2a-tdtomato-2a-dtr-pa-frt-neo-frt-pa)1进行线性化。
[0124]
利用jm8a3 es细胞(上海南方模式生物研究中心)进行胚胎干细胞打靶。通过显微注射将前述经线性化的载体引入胚胎干细胞中。
[0125]
经胚胎干细胞(es)打靶，本发明人获得一系列抗性es细胞克隆。对抗性es细胞克隆基因组dna抽提后，通过长片段pcr的方式对同源重组阳性克隆进行筛选。
[0126]
es细胞鉴定：利用表2～3的5
’
或3
’
同源臂检测引物对进行pcr扩增；5
’
臂同源重组阳性克隆应扩增出5.5kb片段，阴性克隆应无产物；3
’
臂同源重组阳性克隆应扩增出1.6kb片段，阴性克隆应扩增出7.0kb片段。
[0127]
表2
[0128]
引物序列(5
’→3’
)seq id no:i(正向)aaggcttcgtttgttggagtgtg18ii(反向)gcgcttcatggctttgtg19
[0129]
表3
[0130]
引物序列(5
’→3’
)seq id no:iii(正向)agcttcgtggcagggaacaatag20iv(反向)gggtgcaaacagcacaagtagcc21
[0131]
pcr获得的阳性克隆经测序确认，获得8个正确同源重组的阳性es细胞克隆，如图4。双臂同源重组阳性es克隆命名为a2、a7、a9、b8、c2、d2、d4、d11。
[0132]
同时，本发明人对相应es阳性克隆进行d-半乳糖诱导衰老，之后进行阳性akaluc的发光检测，如图5。根据图5可见，多个阳性es细胞克隆能够测得高于wt的荧光，其中以a2荧光最理想、d11其次。
[0133]
实施例3、嵌合体雄鼠及f1代小鼠的制备
[0134]
前述获得的同源重组阳性es细胞克隆，经扩增后，注射到c57bl/6j小鼠囊胚中，通过胚胎移植，获得高嵌合雄鼠。
[0135]
高嵌合小鼠与flp小鼠(上海南方模式生物研究中心)交配，繁育获得f1代小鼠，通过pcr鉴定及测序对其进行基因型鉴定。鉴定结果如图6所示。
[0136]
因此，本发明人成功获得p21基因改造的小鼠模型(去neo杂合子小鼠)，本发明人将之命名为p21-atd。
[0137]
实施例4、衰老细胞鉴定
[0138]
取获得的f2代新生3天的p21-atd阳性小鼠和wt小鼠的鼠尾，75％酒精进行消毒之后，剪碎放入6cm培养皿中，加入500ul的dmem培养基进入培养皿中，24h后将培养基补足到3ml。约3天后小鼠皮肤成纤维细胞数量达到10％，1周后数量达到70％，分别利用200μm的h2o2诱导p21-atd阳性小鼠和wt小鼠的成纤维细胞衰老，诱导时间1h，后更换dmem培养基正常培养基培养3天。弃培养基后pbs清洗3次，利用碧云天sa-β-gal衰老细胞染色试剂盒固定液固定15min，pbs洗3次。滴加2ml工作液(β-半乳糖c：β-半乳糖a：β-半乳糖b：x-gal引物＝930：10：10：50)，37℃细菌培养箱中避光孵育15h，pbs清洗3次后镜下观察。结果如图7上图，与p21-atd小鼠成纤维细胞非h2o2处理组相比，h2o2处理组β-半乳糖苷酶染色明显，证明h2o2诱导小鼠成纤维细胞衰老效果良好。
[0139]
未加h2o2处理的wt小鼠成纤维细胞与h2o2诱导衰老的成纤维细胞、未加h2o2处理的p21-atd小鼠成纤维细胞与h2o2诱导衰老的成纤维细胞加入1ml trizol裂解液，后加入200μl氯仿，溶液分层，rna在水相层，中层为dna，下层为蛋白质。取出200μl水相，加入500μl异丙醇，12000rpm离心15min。弃上清加入1ml 75％酒精，12000rpm离心15min，重复上述操作，沉淀风干，加入20ul ddh2o溶解。取500ng rna加入2μl逆转录酶以及适量ddh2o构建10μl逆转录体系，经过程序pcr后得到cdna。将上述所有的cdna样本分配至实时定量pcr反应体系，检测衰老相关分泌表型基因以及相关插入基因的表达情况。根据图7下图可见，h2o2能有效诱导小鼠成纤维细胞衰老，衰老相关分泌表型基因表达升高。小鼠衰老成纤维细胞内p21、akalumin、tdtomato、dtr、p16的mrna表达量均比非衰老细胞(ns，没有经过h2o2处理的细胞)显著性提高。
[0140]
实施例5、荧光定位
[0141]
1、实验方法
[0142]
取获得的f2代新生3天的p21-atd阳性小鼠尾巴及新生wt小鼠尾巴，75％酒精进行消毒之后，剪碎放入6cm培养皿中，加入500ul的dmem培养基进入培养皿中，24h后将培养基补足到3ml。约3天后小鼠皮肤成纤维细胞数量达到10％，1周后数量达到70％，利用200μm的h2o2诱导p21-atd阳性小鼠及wt小鼠成纤维细胞，另一组p21-atd阳性小鼠成纤维细胞不作诱导处理，h2o2处理组诱导1h后更换dmem培养基正常培养基培养3天。3天后荧光显微镜下观察不同处理情况下的p21-atd小鼠成纤维细胞tdtomato荧光发光情况。
[0143]
结果如图8，可以发现h2o2诱导处理的p21-atd小鼠成纤维细胞中tdtomato荧光强度显著高于非处理组，wt小鼠则呈现为tdtomato阴性。
[0144]
2、dtr表达检测
[0145]
取培养的p21-atd阳性p2代鼠尾成纤维细胞及wt鼠尾成纤维细胞接种于载玻片制备的细胞爬片上，培养过夜后，用200μm h2o2诱导1h，更换正常完全培养基继续培养4d后弃
培养基，加pfa固定30min，pbs洗3次。3％bsa-pbs封闭1h，pbs洗3次。0.25％tritonx-100-3％bsa-pbs透化30min，pbs洗3次。用3％bsa-pbs稀释rabbit anti-hbegf/dtr(abcam,ab92620)，终浓度为5μg/ml，4℃孵育过夜，pbs洗3次。用3％bsa-pbs稀释羊抗兔-alexa fluor 488(1:1000)并混合1:1000稀释的dapi，室温孵育1h，pbs洗3次。晾干，镜检。
[0146]
结果如图9，与诱导衰老组的wt小鼠成纤维细胞相比，可见dtr在诱导衰老组的p21-atd小鼠成纤维细胞中高表达。
[0147]
3、akaluc表达检测
[0148]
取培养的p21-atd阳性p2代鼠尾成纤维细胞及wt鼠尾成纤维细胞接种黑壁透底96孔板，培养过夜后用200μm h2o2诱导1h，更换正常完全dmem培养基继续培养5d。
[0149]
ivis检测：弃培养基，加100ul 250μm akalumine-hcl，曝光180sec。
[0150]
结果如图10，可见akaluc在被诱导衰老后的p21-atd小鼠成纤维细胞中高表达。
[0151]
实施例6、自杀式诱导衰老细胞凋亡
[0152]
来自wt小鼠和p21-atd小鼠的皮肤成纤维细胞分别接种至6cm皿中，当生长到70％汇合时加入200μm h2o2诱导1h，后更换正常完全dmem培养基继续培养2d，后加入50ng/ml白喉毒素(dt,sigma)。2天后，与野生型皮肤成纤维细胞相比，发现来自p21-atd阳性小鼠的皮肤成纤维细胞数量显著减少。
[0153]
利用罗氏凋亡荧光检测试剂盒进行tunel荧光检测：成纤维细胞以pbs清洗3次后，利用4％pfa固定细胞15min，pbs清洗3次后加入tunel工作液(a液：b液＝50：450)，37℃避光孵育60min。pbs清洗3次，滴加dapi(1：1000)5min，清洗后镜检。
[0154]
结果如图11，白喉毒素(dt)能够非常有效地诱导衰老的皮肤成纤维细胞凋亡。
[0155]
序列信息
[0156]5’
同源臂序列(seq id no:1)：
[0157]
tacagagtctgaactccaggaccacggatggcagccactcttccagtccttggagaccgggtccgagcgatggctggcggggatcggctaccgggagctcgcttctggttgccaatgtttctagggattccaggtgcggctcgcccaaagcgtgagaatgaagctcacggtgccccgagatgggtcctgggtggcggttgtgacaagcttcggcgagtctatctagagcttagcgcagagcggttctccgatcccatgggtgccgccggatccccggtccttgtgaaccaagtgccctgtttcgcggtagccaccaccccactgggctctgaggtcagcgcgagctgtgtcctccgccctcgggatcgtgcctgggcacgtcctagaggacaggcgaggaggtgactcattgtgacaaggagaccccgggcactggattgagaccagaatcgcgccacaactggggatgggtcagtggcagcccagaagcccctttccctgcccgggtacagcctcgttcctgccccgtcccctcccccgcgcggcacagtgacctatttggcgggcacagtatgttcccagggaacccgggacacggggaggtccaggacgcggtgtccggtccccgctcggcggcgcgccctcggggacagggagtctgggcgggtcctgtccaccctgccagcccgggaagcgcaaagggtcccacccaccgcgcccaccacgacccggaccagtgaccgtggggcgcgagaggagcccgcactgtagagcggccggtatcctcgcggagtgaggcttacgggtgccgtacatcagacgccccggggctggggccctcgacccagtccacacccagtgtaggaaggtgaccaggctgagtgcgcccactagggcacatccattccactcggaacctccggggacaagggctacacttgcaccctggtcgtgcgggaaatactttgggcttgggtttggcatttgggggcgcgctggcagcttcctctgtcccctacgtcgcgtttcagagaggacactcaggcggttttttgttgtcctcgccctcatctatttttattttccagggatctgactcatcgcgtgctttgggcgtggagatcaaggtggagggggccagagctaagagcactttctttgctctcgagtgtccgtgcgtgcgtgtgtgcgtgcgtgcgtatgtgtgtgtgtgtgtgtgtctgtgtacgtgcgtgtgtgtgtgtgtgtgtatgcgtgcgcgcgcgcgcgctcagtctggtttcc
caacataggcgggaatttaggaagcctgggctcatcgtgacgtgttttgtggcccggggtccccctcctttcctctcctctctccaccccagggtgacgcgcagctccggtgcccaagcagttttggcgggcgggcagcgccgggcaggaaactgactcaccactccttgctcggcctacgcgccgcctaccgagcgccatttcctgagtgcacagcgccccctaccggcatcagtgaggactgcaaggccggctaggcgcgggtggcaccacgggcttctgccacccccaccgcggcttaaagggaattaaaatatgcctgatggccagatacaagtgattttagcagggtgtgctagcggactattagggaggcgtggcccttgagagacaaggtggagatcgtgcccctcttgggttcctggtcttatcttcagctatgaaaaactggggactatccagccttagccgagtccattggtgtcttcccttccttcctctggcccctgtgagctaccgtctggggaagggcaccaaacttgtttttcggctcagtttgtctggggaaatgagccaatctatatttctatatctatatagatctctctctctgtctctgtgtgtgtgtgaaagagagacagagacagagagacaagcttacaaaatggccccagctaccagtactatatagacaggctggcccagtggcctggaactcataaggatcacgtgcctctggtggagtgctgggattaaagactctccccataacatggagctcagtctatatttaataaaaaagcttttccagctgattttaatggagtcctctggtcatgcccctcaaggtgagaagacgagagaatgatcaatactagaccaaaagggtctgaattcaaaccccgcttgtgagccctgtgcctttggacacacattctgaacctggattagctctgccgtaaaagaatgtgatattgccatctattaacgatagcttttggtggcttacaactgcaatcccagcacactagaggcagaggcaggaggatgactgagttgtactaaaggatgtgaataggccccaagctctacctgtaggcagaggccatctgaggtcctttaggcctctgaggtctgcaccttgagaatccttttgcgggcagtgggaatccttgttagacctgtgtttcggttggttggtgtttagccaggctctcactatgcacaccaggatggccttcaactcacagacattttgcctctgcctcccgagtgctgtgttttgggaattggctgttttacttatttatggaagccacaatgctggccacgttccctatgtagtagccaaggtagaccctgaacttctttccctacctctgcctccagcgattacaggtgtgtgccgccacacccagttttatagagagctccttgcttagcacaaggcccaggctttaccatcggggccccagacgcttcatctcttctggcttcctaccttgaatcatagtctgggtacccccttctctcttccagctgtgggcaaactcaccctgaggtcttaaggagctgggcgtgtgtatgtgtgtggtagtgtatgtggtaagagcccagggggtcttgcctcaggaagccactggggctcaccttgcaagctcaaaggccctccttagaagctgcatcccctagtcttggagtcaggatgggccactcaggtatccctctttcctggagaggagccaggtaaaccaacacctttaacttttttttttttttcagtgcctgtaaaacgggttccttgggcacaggctataggcacgtctggggctgggaggtgtctagactccagattacctgatctgcctggcaggatgtggctcagcctgggagagagccttaaccccgctccaccccttcagactctcctctcccccaggctactgcctccccccaggctgctgcctccccccaggctactgcctccccccaggctgctgcctcctcccaggctactgcctcctcccaggctgctgcctcctcccaggctactgcctgccagcgtcctttggaaaggcctccagcctggagcacctgtcagtgacagtgggagggagggaggggcagggaggaggctctgtcagaattaggggcagagaggcacgctcatggcttctgtttctcaggattgcctatgttaacttagttcattctcaaatagggagcccagagatgttagggtacttattcggggtcacccagcaaagccttgattctgatctgggcagtctagctccggcattctcgcgcctctctcccagccaccatgccagcctcgcgagtatgctgccacaaccacactggctaagaaacagaggctggagacatggagtcactttttaaaactggtgccaagtagcagcactaatgctatacagtttatgtgtagtatcccaaagtccagggcacttttttttttttttttttttttttttttttttttttttgagacaggatgtctctgtatagccctggctgtcctggaactcactttgtagaccaggctggcctcgaactcagaaatccgcctgcctctgcctcccgagtgctgggattaaaggcgtgtgccaccacgcccggctgtccagggtacttttgattggcctgatggagttaatcaccaagacagcagggtagggagaccactggacctagcaattcacacgtatttgggatgttcacacccatgaagaacacgttagcacattgattttggctaatagaattcctggggtaaacaggacggtgactcctacttctgtggacatcacccgtgaccttggggtgcagggctggctgaactcaacacccaccttagtctcatggtgtggtggaaaagcacctgcaaggaccagagggagcctgaagactgtgatggggtagtttccatagtgacccgggtcc
ttcttgtgtttcagccacaggcaccatgtccaatcctggtgatgtccgacctgttccgcacaggagcaaagtgtgccgttgtctcttcggtcccgtggacagtgagcagttgcgccgtgattgcgatgcgctcatggcgggctgtctccaggaggcccgagaacggtggaactttgacttcgtcacggagacgccgctggagggcaacttcgtctgggagcgcgttcggagcctagggctgcccaaggtctacctgagccctgggtcccgcagccgtgacgacctgggaggggacaagaggcccagtacttcctctgccctgctgcaggggccagctccggaggaccacgtggccttgtcgctgtcttgcactctggtgtctgagcggcctgaagattccccgggtgggcccggaacatctcagggccgaaaacggaggcagaccagcctgacaggtaaggacaggagcagagaaggagaaagatcctgcaagaggcctggagaggagaggccaccatttgaggatggcctttacagagaacattccagcccttccccaccaccaagccattccataggcgtgggacctcgtggggctcagaggaacagttgatgttcatatgatccaggcatttttctctgcagtgaccgaaatgcccaggatagtgtggtgattggcagtagagctctaagaagggagccgggctgaagagatggctcagcagatgagggcacttactcttgctgagggcctgattcccagcaccggaaatgacaacttcctataactaactctgggcgttgggggatctaccctctctagagccctgtccctctgaccaggaggtgttgtgccctgtggctgtggcttttccccacgatgagccacatgtcccttagactctggggaatgatgtccttccccttggcatctggcctgacatctgttctctctccacagatttctatcactccaagcgcagattggtcttctgcaagagaaaacccggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggcgacgtggaggagaaccctggtcct
[0158]3’
同源臂序列(seq id no:2)：
[0159]
agtgcccacgggagccccgccctcttctgctgtgggtcaggaggcctcttccccatcttcggccttagccctcactctgtgtgtct
[0160]
taattattatttgtgttttaatttaaacgtctcctgtatatacgctgcctgccctctcccagtctccaaacttaaagttatttaaaaaaagaacaaaacaaaacaaaaaaaaccaaaacaaaacaaacctaaattagtaggacggtagggcccttagtgtgggggatttctattatgtagattattattatttaagcccctcccaacccaagctctgtgtttcctataccggaggaacagtcctactgatatcaacccatctgcatccgtttcacccaacccccctccccccattccctgcctggttccttgccacttcttacctgggggtgatcctcagacctgaatagcactttggaaaaatgagtaggactttggggtctccttgtcacctctaaggccagctaggatgacagtgaagcagtcacagcctagaacagggatggcagttaggactcaaccgtaatatcccgactcttgacattgctcagacctgtgaagacaggaatggtccccactctggatcccctttgccactcctggggagcccacctctcctgtgggtctctgccagctgcccctctattttggagggttaatctggtgatctgctgctcttttcccccaccccatacttccccttctgcaggtcggcaggaggcatatctaggcacttgccccacagctcagtggactggaagggaatgtatatgcagggtacactaagtgggattccctggtcttaccttaggcagctccagtggcaaccccctgcattgtgggtctagggtgggtccttggtggtgagacaggcctcccagagcattctatggtgtgtggtggtgggggtgggcttatctgggatggggaccccagttggggttctcagtgacttctcccatttcttagtagcagttgtacaaggagccaggccaagatggtgtcttgggggctaagggagctcacaggacactgagcaatggctgatcctttctcagtgttgaataccgtgggtgtcaaagcacttagtgggtctgactccagccccaaacatccctgtttctgtaacatcctggtctggactgtctacccttagcccgcaccccaagaacatgtattgtggctccctccctgtctccactcagattgtaagcgtctcacgagaagggacagcaccctgcattgtcccgagtcctcacacccgaccccaaagctggtgctcaataaatacttctcg
[0161]
2a序列(seq id no:3)：
[0162]
ggtagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggcgacgtggaggagaaccctggtcct
[0163]
akaluc序列(seq id no:4)：
[0164]
atggaagatgccaaaaacattaagaagggcccagcgccgttctacccactcgaagacgggaccgccgg
cgagcagctgcacaaagccatgaagcgctacgccctggtgcccggcgccatcgcctttaccgacgcacatattcaggtggacgttacctacgccgagtacttcgagatgagcgttcggctggcagaagctatgaggcgctatgggctgaatacaaaccatcggatcgtggtgtgcagcgagaatagctcgcagttcttcatgcccgtgttgggtgccctgttcatcggtgtggctgtggccccagctaacgacatctacaacgagcgcgagctgctgaacagcatgggcatcagccagcccaccgtcgtattcgtgagcaagaaagggctgcgaaaggtcctcaacgtgcaaaagaagctaccgatcatacgaaagatcatcatcatggatagcaagaccgactaccagggcttccaaagcatgtacaccttcgtgacttcccatttgccacccagcttcaacgagtacgacttcgtgcccgagagcttcgaccgggacaaaaccatcgccctgatcatgaacagtagtggtagtacaggattacccaagggcgtagccctaccgcaccgcaccgcttgtgtccgattcagtcatgcccgcgaccccatcttcggctaccagaacatccccgacaccgctatcctcagcgtggtgccatttcaccacggcttcggcatgttcaccacgctgggctacttgatctgcggctttcgggtcgtgctcatgtaccgcttcgaggaggagctattcttgcgcagcttgcaagactataagattcaatctgccctgctggtgcccacactatttagctgcctcgctaagagcactctcatcgacaagtacgacctaagcagcttgcgcgagatcgccagcggcggggcgccgctcagcaaggaggtaggtgaggccgtggccaaacgcttccgcctaccaggcatccgccagggctatggcctgacagaaacaaccaacgccgtcatgatcacccccgagggggaccgtaagcctggctcagtaggcaaggtggtgcccttcttcgaggctaaggtggtagacttggtcaccggtaagacactgggtgtgaaccagcgcggtgagctgtgcgtccgtggccccatgatcatgagcggctacgttaacaaccccgaggctacgaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaagggctaccaggtagccccagccgaactggagggcatcctgctgcaacacccctacatcttcgacgccggagtcgccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcccgccgcagtcgtcgtgttggaacacggtaaaaccatgaccgagaaagagatcgtggactatgtggccagccaggttacaaccgccaagaagctgcgcggtggtgttgtgtttgtggatgaagtccctagaggatcgaccggcaagttagacgcccgcaagatccgcgagattctcactaaggccaagaaggacggcaagatcgccgtg
[0165]
tdtomato序列(seq id no:5)：
[0166]
atggtgagcaagggcgaggaggtcatcaaagagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggctccatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttcatgtacggctccaaggcgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgattacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggcaccaacttcccccccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgagatccaccaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagaccatctacatggccaagaagcccgtgcaactgcccggctactactacgtggacaccaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgctccgagggccgccaccacctgttcctggggcatggcaccggcagcaccggcagcggcagctccggcaccgcctcctccgaggacaacaacatggccgtcatcaaagagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggctccatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttcatgtacggctccaaggcgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgattacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggcaccaacttcccccccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgagatccaccaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagaccatctacatggccaagaag
cccgtgcaactgcccggctactactacgtggacaccaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgctccgagggccgccaccacctgttcctgtacggcatggacgagctgtacaag
[0167]
白喉毒素受体(dtr)序列(seq id no:6)：
[0168]
atgaagctgctgccgtcggtggtgctgaagctccttctggctgcagttctttcggcactggtgactggcgagagcctggagcagcttcggagagggctagctgctggaaccagcaacccggacccttccactggatctacggaccagctgctacgcctaggaggcggccgggaccggaaagtccgtgacttgcaagaggcagatctggaccttttgagagtcactttatcctccaagccacaagcactggccacaccaagcaaggaggagcacgggaaaagaaagaagaaaggcaagggactagggaagaagagggacccatgtcttcggaaatacaaggacttctgcatccacggagaatgcaaatatgtgaaggagctccgggctccctcctgcatctgccacccaggttaccatggagagaggtgtcatgggctgagcctcccagtggaaaatcgcttatatacctatgaccatacaactatcctggctgtggtggccgtggtgctgtcctctgtctgtctgctggtcatcgtggggcttctcatgtttaggtaccataggagaggtggttatgatgtggaaaacgaagagaaagtgaagttgggcatgactaattcccactga
[0169]
重组酶识别位点frt序列为(seq id no:7)：
[0170]
gaagttcctattctctagaaagtataggaacttc
[0171]
neo序列：念珠菌gene symbol loc110847127。
[0172]
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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