H9N2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用与流程

h9n2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用
技术领域
[0001]
本发明属于兽用生物制品领域，具体地说，涉及一种h9n2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用。


背景技术：

[0002]
h9n2亚型禽流感病毒流传在世界各地的鸟类中，并跨越欧亚大陆流行于地方性家禽种群中。自1878年首次报道禽流感以来，世界各地都相继报道了该病的暴发，给当地养禽业带来了巨大的经济损失。近年来，不断有禽流感从哺乳动物和人体分离的报道，给人类生命健康造成巨大威胁。
[0003]
流感病毒会经常发生变异，以前流行的h9n2亚型禽流感主要属于以bj/94毒株为代表分支；2004~2008年分离的毒株逐渐属于以f/98株为代表分支，并且在2002~2003年可能发生了重要的抗原漂变并逐渐适应在鸡群内复制和传播，而近些年分离的h9n2毒株主要属于y28株为代表的的分支，即calde9.4.2.5分支。
[0004]
目前国内h9亚型禽流感疫苗主要用鸡胚生产，鸡胚由于其本身特殊性容易受到孵化等周期影响，并且生产过程中操作活毒，人工成本高，并且生产后的鸡胚需要昂贵的处理费用。杆状病毒表达系统具有高效表达、安全、易操作等特点，昆虫细胞可以完全无血清悬浮培养，生产易放大，非常适合用于基因工程亚单位疫苗开发。
[0005]
因此研制一种生产成本低、生产效率高以及免疫效果好的h9n2亚型禽流感基因工程亚单位疫苗具有重要意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种h9n2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用。
[0007]
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽由h9n2亚型禽流感病毒ha蛋白胞外区如seq id no:1所示的氨基酸序列组成。
[0008]
第二方面，本发明提供编码所述多肽的核酸分子，其核苷酸序列如seq id no:2所示。
[0009]
第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
[0010]
第四方面，本发明提供所述多肽、编码所述多肽的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料在制备h9n2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。
[0011]
第五方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含所述多肽和药学上可接受的载体。
[0012]
第六方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含所述免疫原性组合物。
[0013]
第七方面，本发明提供一种重组杆状病毒，所述重组杆状病毒包含编码所述多肽
的核酸分子。
[0014]
第八方面，本发明提供所述重组杆状病毒在h9n2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗生产中的应用。
[0015]
第九方面，本发明提供一种h9n2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗，所述疫苗包含所述多肽和疫苗佐剂。
[0016]
第十方面，本发明提供h9n2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，包括：采用所述重组杆状病毒感染sf9或hi5昆虫细胞后，培养细胞并收集上清，从上清中分离纯化获得抗原蛋白，与疫苗佐剂混合，即得。
[0017]
具体方法如下：（1）人工合成如seq id no:2所示的基因序列，将改基因序列构建到pfastbac1载体中，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选阳性穿梭载体；然后将穿梭载体转化到大肠杆菌dh10bac感受态细胞，筛选（蓝白斑筛选）阳性重组bacmid；接种白斑到含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的lb液体培养基中过夜培养；收集菌液，提取重组穿梭质粒bacmid dna并对重组bacmid进行测序鉴定；（2）取无血清悬浮培养的sf9细胞，待细胞密度为2.0
×
106~3.0
×
10
6 cells/ml（优选2.5
×
10
6 cells/ml），用重组bacmid进行转染，培养转染后的细胞，当细胞活率降至20%~40%（优选20%）时收获培养上清，即为p0代病毒重组杆状病毒；（3）取无血清悬浮培养的sf9细胞，待细胞密度为2.0
×
106~3.0
×
10
6 cells/ml（优选2.5
×
10
6 cells/ml），按1%-1
‰
体积比接种重组杆状病毒，培养72-96h收获上清，即为p1代病毒重组杆状病毒；（4）按照（3）同样的方法连续传5-6代。取无血清悬浮培养的hi5细胞，待细胞密度为2.0
×
106~3.0
×
10
6 cells/ml（优选2.5
×
10
6 cells/ml），按1%-1
‰
体积比接种重组杆状病毒，培养72-96h收获上清；（5）将（4）收获的上清过his亲和层析柱，用洗脱液洗脱，收集洗脱液，即为抗原蛋白溶液，并检测抗原蛋白溶液中蛋白的纯度和浓度；（6）取抗原蛋白溶液94~96份，加入吐温-80 4~6份搅拌溶解，作为水相，另取白油94~96份，司本-80 4~6份混匀，作为油相；取油相2~3份，加入水相1~1.5份，乳化20~40min（优选取抗原蛋白溶液96份，加入吐温-80 4份搅拌溶解，作为水相，另取白油94份，司本-80 6份混匀，作为油相；取油相2份，加入水相1份，乳化30min），即得h9n2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗。
[0018]
本发明中，所述份为重量份。
[0019]
第十一方面，本发明提供所述疫苗或按照上述方法制备的疫苗在制备治疗或预防h9n2亚型禽流感病毒感染的药物中的应用。
[0020]
本发明通过截取h9n2亚型禽流感病毒保护性抗原ha蛋白的胞外区，构建含有ha胞外区基因的穿梭载体，转染sf9昆虫细胞，拯救重组病毒，并通过hi5细胞进行分泌表达，通过亲和层析进行纯化，获得ha蛋白抗原，加入佐剂，乳化，制备得到h9n2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗。本发明制备方法简单，克服了以鸡胚生产疫苗的缺点，耗时短，表达量高，可在反应器中实现细胞悬浮培养，有利于大规模生产，所制备的基因工程亚单位疫苗免疫效果良好，能有效预防h9n2亚型禽流感病毒的感染。
nacl和20mm咪唑）处理预装柱，5个柱体积，处理完毕后，将抽滤的细胞上清结合his亲和层析柱（购自ge公司，商品型号histrap hp），直至结合完毕，然后用洗脱缓冲液（20mm tris、50mm nacl和300mm咪唑）进行洗脱，洗脱完毕的重组蛋白制样，进行sds-page电泳鉴定，结果显示蛋白正确表达（图3），经分光光度计检测，其表达水平为200mg/l，血凝效价达2
20
。
[0033]
实施例5 h9n2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗的制备及免疫原性鉴定1、将重组蛋白稀释至相应浓度，作为水相，每羽份剂量分别为10μg、20μg、30μg、40μg、50μg，取96份上清，加入4份吐温-80，搅拌溶解，作为水相，取白油94份，司本-80 6份，混合均匀，作为油相，取油相2份，缓缓加入1份水相，3000rpm乳化30分钟，即得h9n2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗，4℃保存。
[0034]
2、取70只21日龄spf鸡，肌肉注射疫苗，平均分成7组，每组10只，第一组为空白对照组（注射无菌pbs，0.5ml/只），第二组免疫常规h9亚型胚苗wj57株（配制方法为：将制备好的血凝价为29的尿囊液，加入终浓度为0.2%的甲醛溶液37℃灭活24h，经灭活检验、无菌检验合格后4℃无菌保存，取96份灭活尿囊液，加入4份吐温-80，搅拌溶解，作为水相，取白油94份，司本-80 6份，混合均匀，作为油相，取油相2份，缓缓加入1份水相，3000rpm乳化30分钟，即得h9亚型全病毒灭活疫苗，灭活后水相抗原ha效价为1:256），0.5ml/只，第三组至第七组免疫上述制备的基因工程亚单位疫苗，抗原剂量分别为10μg、20μg、30μg、40μg、50μg，免疫21天后采集血清进行抗体检测，结果显示30μg以上抗原剂量免疫后抗体平均水平分别为11.5log2、11.8log2、13log2，显著优于常规胚苗9.2log2（表1）。
[0035]
3、免疫21天后，进行攻毒a/chicken/jiangsu/js-1/2002（liu jh, et al.genetic conservation of hemagglutinin gene of h9 influenza virus in chicken population in mainland china），攻毒剂量为106eid
50
，攻毒方式为滴鼻点眼，攻毒后观察鸡群状态，表现为精神沉郁、羽毛松乱，食欲不振的判定为发病，结果显示对照组全部发病，商品苗及基因工程亚单位疫苗免疫组发病率为0（表2）。
[0036]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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