FRT细胞株在制备筛选CaCC调节剂的制剂或试剂盒中的应用的制作方法

frt细胞株在制备筛选cacc调节剂的制剂或试剂盒中的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及生物医药领域，特别涉及frt细胞株在制备筛选cacc调节剂的制剂或试剂盒中的应用。


背景技术：

[0002]
第二信使是细胞内的信号转导的启动组成部件之一，主要包括：钙离子(ca2+)、环腺苷酸(camp)、环磷酸鸟苷(cgmp)、肌醇三磷酸(ip3)、甘油二酯(dag)等。ca
2+
作为胞浆内一种普遍存在的第二信使，可调控细胞内多种重要的生理过程，如参与神经递质合成与释放，调控生殖细胞的成熟和受精，调节体内多种酶的活性等。胞浆内ca
2+
也参与高血压、冠状动脉硬化性心脏病、阿尔茨海默病等疾病的发生。因此，胞浆内第二信使ca
2+
一直是近来年的研究热点。目前，检测胞浆内ca
2+
的方法主要有ca
2+
活化的荧光蛋白检测法、荧光指示剂法、膜片钳技术等。ca
2+
活化的荧光蛋白检测法缺点是敏感性低，荧光蛋白无法通透细胞膜，需要微注射等方法负载细胞，对技术要求高。荧光指示剂法缺点是操作繁琐，试剂耗费高，检测周期长，重复差。膜片钳技术缺点是需要特定的仪器设备，对操作人员技术要求高，成本昂贵。


技术实现要素：

[0003]
有鉴于此，本发明建立一种基于cacc可敏感检测胞浆内第二信使ca
2+
的细胞模型。
[0004]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0005]
本发明还提供了frt细胞株在检测胞浆内第二信使ca
2+
的应用；所述frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达；
[0006]
其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现良好的正相关；
[0007]
所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0008][0009]
0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0010]
y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0011]
本发明还提供了frt细胞株在制备检测胞浆内第二信使ca
2+
的制剂或试剂盒中的应用；所述frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达；
[0012]
其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现良好的正相关；
[0013]
所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0014][0015]
0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0016]
y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0017]
本发明还提供了frt细胞株在制备预防和/或治疗与胞浆内第二信使ca
2+
相关疾病的药物中的应用；所述frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达；
[0018]
其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现良好的正相关；
[0019]
所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0020][0021]
0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0022]
y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0023]
在本发明的一些具体实施方案中，所述与胞浆内第二信使ca
2+
相关疾病包括高血压、冠状动脉硬化性心脏病、阿尔茨海默病中的一种或多种。
[0024]
本发明还提供了检测胞浆内第二信使ca
2+
的制剂或试剂盒，包括frt细胞株以及可接受的助剂；所述frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达；
[0025]
其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现良好的正相关；
[0026]
所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0027][0028]
0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0029]
y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0030]
本发明提供了frt细胞株在制备筛选cacc调节剂的制剂或试剂盒中的应用；所述frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达；
[0031]
所述frt细胞株通过荧光信号反应细胞内ca
2+
浓度的变化进而筛选cacc调节剂；
[0032]
所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值，所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与cacc调节剂浓度成剂量依赖关系；
[0033]
其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现良好的正相关；
[0034]
所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0035][0036]
0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0037]
y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0038]
钙激活氯离子通道(calcium-activated chloride channel，cacc)是一类在哺乳动物组织(包括肠上皮)中广泛表达的离子通道蛋白，它可以反映胞浆内第二信使ca
2+
的浓度改变，当胞浆内ca
2+
浓度升高，即可敏感激活cacc，使cacc通道开放。yfp-h148q/i152l是对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体，具有遇到i-会发生淬灭的特性。当胞浆内ca
2+
浓度升高时，cacc开放，可将细胞外i-转运到胞浆内，使黄色荧光蛋白的荧光发生淬灭，因此yfp-h148q/i152l相当于一个可检测cacc是否开放的检测器。本研究利用此原理构建稳定共转染钙激活氯离子通道蛋白1(anoctamin 1，ano1)和yfp-h148q/i152l的fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(fischer rat thyroid，frt)细胞模型作为基于cacc的胞浆内第二信使ca
2+
检测方法，测定原理如图1所示。该模型可敏感检测胞浆内ca
2+
浓度的变化，通过荧光斜率值反映细胞内ca
2+
浓度的变化，具有灵敏度高、重复性好、适用性广等特点。本研究解决了以往检测ca
2+
方法试剂耗费高、操作繁琐、对技术要求高等问题，具有步骤简便、检测灵敏、耗材低、周期短的优点。本研究不仅可以简便快速地检测胞浆内ca
2+
浓度，还为基于cacc信号通路的第二信使ca
2+
相关靶点提供了筛选平台，为第二信使ca
2+
信号转导途径的研究奠定了良好的基础。
[0039]
在本发明的一些具体实施方案中，所述frt细胞株的构建方法为：构建钙激活氯离子通道ano1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体yfp-h148q/i152l真核表达载体，经脂质体转染、抗生素筛选和稀释，获取共表达ano1和yfp-h148q/i152l的frt细胞。
[0040]
在本发明的一些具体实施方案中，所述cacc调节剂包括激活剂或抑制剂；所述激活剂包括ionomycin、calcimycin或eact中的一种或多种；所述抑制剂包括nfa、nppb或t16ainh-a01中的一种或多种。
[0041]
本发明还提供了筛选cacc调节剂的制剂或试剂盒，包括frt细胞株以及可接受的助剂；所述frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达；
[0042]
所述frt细胞株通过荧光信号反应细胞内ca
2+
浓度的变化进而筛选cacc调节剂；
[0043]
所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值，所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与cacc调节剂浓度成剂量依赖关系；
[0044]
其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现良好的正相关；
[0045]
所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0046][0047]
0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0048]
y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0049]
本发明还提供了预防和/或治疗与cacc通道相关疾病的药物，采用frt细胞株筛选获得；所述frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达；
[0050]
所述frt细胞株通过荧光信号反应细胞内ca
2+
浓度的变化进而筛选cacc调节剂；
[0051]
所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值，所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与cacc调节剂浓度成剂量依赖关系；
[0052]
其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现良好的正相关；
[0053]
所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0054][0055]
0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0056]
y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0057]
本发明构建ano1和yfp-h148q/i152l真核表达载体，应用脂质体转染法构建共表达ano1和yfp-h148q/i152l的frt细胞，倒置荧光显微镜观察其表达情况，流式细胞仪检测细胞纯度；应用膜片钳技术研究cacc生理特性；荧光淬灭动力学实验验证细胞模型的有效
性；荧光淬灭动力学实验验证细胞模型可筛选cacc调节剂；荧光探针法检测加入cacc激活剂后胞浆内的ca
2+
浓度。
[0058]
倒置荧光显微镜下观察到ano1表达在细胞膜上，yfp-h148q/i152l表达于胞浆中；该模型具有经典的钙激活氯离子通道的生理特性；成功构建共表达ano1和yfp-h148q/i152l的frt细胞模型；该模型可筛选cacc调节剂，荧光变化斜率值与cacc调节剂浓度成剂量依赖关系；荧光变化斜率值可反映胞浆内ca
2+
浓度，该模型可敏感检测胞浆内ca
2+
浓度。此细胞模型可以高效敏感检测胞浆内第二信使ca
2+
浓度，为ca
2+
信号相关靶点的研究提供了一种简便快捷的方法。
附图说明
[0059]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0060]
图1示基于cacc的胞浆内第二信使ca2+检测方法的测定原理；
[0061]
图2示共表达ano1和yfp-h148q/i152l细胞模型的构建结果；其中，a：ano1表达在细胞膜上；b：yfp-h148q/i152l表达在胞浆中；c：对照组流式细胞仪结果；d：转染ano1-yfp-h148q/i152l流式细胞仪结果；a、b标尺10μm；
[0062]
图3示全细胞膜片钳结果；其中，a：通过全细胞膜片钳技术，在稳定地表达ano1-yfp-h148q/i152l的frt细胞中记录的cacc电流，保持初始电压为0mv，脉冲电压在+80mv和-80mv之间脉冲电压；b：在50μmol/l nfa的存在下，在稳定地表达ano1-yfp-h148q/i152l的frt细胞中记录的cacc电流吸附电位为0mv，保持初始电压为0mv，脉冲电压在+80mv和-80mv之间；c：电流-电压关系，曲线显示典型的外向整流特征；d：未转染ano1的frt细胞电流记录；
[0063]
图4示荧光淬灭动力学实验结果和cacc激活剂及抑制剂的剂量依赖曲线；其中，a：荧光淬灭动力学实验结果；b：荧光斜率值结果；c：cacc激活剂的剂量依赖曲线；d：cacc抑制剂的剂量依赖曲线；(mean
±
sd,n＝3)**p＜0.01；
[0064]
图5示荧光探针法的检测ca
2+
的变化；其中，a：荧光斜率值与激活剂浓度的剂量依赖关系；b：ca
2+
浓度与激活剂浓度的剂量依赖关系；c：ca
2+
浓度与荧光斜率值的关系；d：荧光强度与ca
2+
浓度的剂量关系曲线；e：荧光斜率值法与fluo-4荧光探针法对比；
[0065]
图6示cacc法和荧光探针法灵敏度比较结果；其中，a示在细胞内不同ca
2+
浓度情况下，cacc法和荧光探针法灵敏度比较结果；b示在细胞内ca
2+
浓度分别为40、50、100、200、400和800nmol/l的情况下，cacc法和荧光探针法灵敏度比较结果。
具体实施方式
[0066]
本发明公开了frt细胞株在制备筛选cacc调节剂的制剂或试剂盒中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0067]
本发明首次提出了相对荧光强度变化值/slope值/斜率值的概念：
[0068]
本方法通过动态检测相对荧光强度的变化，并进一步量化相对荧光强度的变化，
[0069]
每一个荧光强度变化值(也称作slope值/斜率值)对应一个细胞内的ca
2+
浓度，结果显示相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现良好的正相关。
[0070]
具体相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0071][0072]
0s～1.4s的相对荧光值的平均值。
[0073]
y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0074]
如，图4a量化后的结果如图4b所示。
[0075]
20世纪70年代初，ca
2+
受体蛋白-钙调素的发现及其功能的研究使rasmussen在1978年提出了ca
2+
第二信使学说。胞浆内ca
2+
浓度的增加调控着诸多生理病理过程，如细胞增殖，神经传导，平滑肌的收缩，细胞凋亡等。ca
2+
与许多疾病的发生密切相关，如细胞内钙稳态失衡是高血压的发病机制之一，细胞内ca
2+
浓度升高可引起冠状动脉硬化性心脏病，ca
2+
也与阿尔茨海默病的发生有关等。因此，胞浆内第二信使ca
2+
检测在ca
2+
机制等研究中扮演着越来越重要的角色。本研究构建了一种基于cacc的胞浆内第二信使ca
2+
的检测方法，利用稳定共表达的钙激活氯离子通道ano1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体yfp-h148q/i152l的frt细胞模型检测胞浆内ca
2+
的变化。当胞浆内ca
2+
浓度升高时，即可激活cacc通道，使cacc通道开放，细胞外i-进入胞浆内，细胞内的黄色荧光蛋白遇到i-会发生荧光淬灭，荧光信号显著下降，利用荧光变化的斜率值来表征胞浆内ca
2+
浓度的变化。
[0076]
膜片钳作为先进的细胞电生理技术，是研究离子通道的“金标准”。本研究不仅利用whole-cell膜片钳技术研究cacc的电生理特性，还采用流式细胞术对细胞纯度进行检测。利用对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体yfp-h148q/i152l具有对i-等卤族元素敏感的特性检测cacc通道转运i-功能来反映胞浆内ca
2+
浓度升高情况。本方法解决了以往直接检测ca
2+
浓度的方法的操作繁琐、试剂耗费高、周期长、对技术要求高等问题，具有操作简便、经济快速，易于检测的优点。本研究采用不同的cacc激活剂和抑制剂验证细胞模型的筛选cacc调节剂的有效性，调节剂浓度与荧光斜率值呈剂量依赖关系且方差较小，表明本方法具有良好的重复性。采用fura-2荧光探针法检测胞浆内ca
2+
浓度，荧光斜率值表征胞浆内ca
2+
浓度，与fluo-4荧光探针法比较，本方法有着其3倍的信号窗口，因此本模型可敏感检测胞浆内ca
2+
浓度的变化。此外，本模型经过反复传代至30代以上，依然保持其良好的特性和稳定状态，具有良好的稳定性。
[0077]
综上所述，本研究构建了一种基于cacc可敏感检测胞浆内第二信使ca
2+
的细胞模型，可以简便快速地检测胞浆内ca
2+
浓度，为基于cacc信号通路的第二信使ca
2+
相关靶点提供了筛选平台，同时为第二信使ca
2+
信号转导途径的深入研究奠定了坚实的基础。
[0078]
数据分析
[0079]
各实验数据均经过三次重复试验，采用graphpad prism 8软件对调节剂的剂量依赖关系进行非线性曲线拟合分析及计算半数有效浓度ec
50
、半数抑制浓度ic
50
值。显著性差异分析用graphpad prism 8软件进行。
[0080]
实验仪器
[0081]
fluo star多功能酶标仪(bmg公司)、倒置荧光显微镜(nikon公司)、co2培养箱(thermo公司)、流式细胞仪(bd公司)、膜片钳(heka公司)。
[0082]
实验试剂
[0083]
frt细胞本实验室保存；ano1真核表达载体和yfp-h148q/i152l真核表达载体由本实验室前期构建；lipofectamine 3000脂质体、zeocin抗生素、g418抗生素、ionomycin、calcimycin购自invitrogen公司；f-12营养培养基、t16ainh-a01、尼氟灭酸(niflumic acid，nfa)和5-硝基-2-苯酚丙胺苯甲酸盐[5-nitro-2(3-phenylpropylamino)benzoate,nppb]、fura-2/am均购自sigma公司；fluo-4/am购自solarbio公司。
[0084]
本发明提供的frt细胞株在制备筛选cacc调节剂的制剂或试剂盒中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0085]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0086]
实施例1共表达ano1和yfp-h148q/i152l细胞模型的构建
[0087]
1.构建共表达ano1和yfp-h148q/i152l细胞株：按照lipofectamine 3000说明书将ano1质粒瞬时转染到frt细胞中，利用zeocin抗生素进行筛选，两周后利用倒置荧光显微镜观察，挑取细胞膜上可见绿色荧光的细胞进行有限稀释，对得到的阳性克隆的细胞株进行扩大培养，经过两次传代仍表达ano1的细胞则为稳定表达ano1的frt细胞株。按照lipofectamine 3000说明书将yfp-h148q/i152质粒转染到已稳定表达ano1的frt细胞中，利用g418抗生素进行筛选，两周后利用倒置荧光显微镜观察，挑取胞浆中可见绿色荧光的细胞进行有限稀释，对得到的阳性克隆的细胞株进行扩大培养，经过两次传代仍表达yfp-h148q/i152的细胞则为稳定共表达ano1-yfp-h148q/i152l的frt细胞株。
[0088]
2.流式细胞仪检测细胞纯度：将稳定共表达ano1-yfp-h148q/i152l的frt细胞用胰酶消化，800
×
g离心5min，弃上清，加入pbs缓冲液，重悬细胞后上机进行检测。以未转染的frt细胞作为阴性对照，选择fl2通道，激发光波长488nm，检测光波长575nm，每管收集50000个细胞。阴性对照所检测到的荧光强度范围进行设门，该门内的细胞表示未转染上的细胞，将大于该范围的荧光强度表示为转染成功的细胞。
[0089]
实施例2电生理记录
[0090]
常温下进行whole-cell(全细胞)膜片钳技术记录，将状态良好的转染ano1和yfp-h148q/i152l的frt细胞接种到玻片上，第2天置于倒置荧光显微镜下，并用电极外液灌流，电极入水后电阻约为4～6mω，给予负压形成gω高阻抗封接后，快速给予负压使电极尖端的细胞膜破裂，形成whole-cell记录模式。初始钳制电压为0mv，记录10ms后，给予阶梯式电压刺激，电压从-80mv到+80mv，每增加20mv，各记录800ms，800ms后电压变为0mv，继续记录100ms。电极外液：140mmol/l nmdg-cl，2mmol/l mgcl2，5mmol/l cacl2，10mmol/l hepes(nmdg调节ph至7.4)。电极内液：0.8ml高浓度钙溶液和0.2ml零浓度钙溶液混合得到600nmol/l ca
2+
溶液即为电极内液。高浓度钙溶液146mmol/l cscl，2mmol/l mgcl2，5mmol/l ca-egta-nmdg，8mmol/l hepes，ph 7.3(300mosm)；零浓度钙溶液：146mmol/l csc1，2mmol/l mgc12，5mmol/l egta-nmdg，8mmol/l hepes，ph 7.3(300mosm)。cacc抑制剂nfa(50μmol/l nfa)作为对照。
[0091]
实施例3荧光淬灭动力学实验鉴定细胞模型的有效性
[0092]
将稳定共转染ano1-yfp-h148q/i152l的frt细胞接种于到黑壁透明底的96孔板
中，培养18h。将细胞分为两组：实验组和对照组。以含钙镁离子的pbs缓冲液洗涤两组细胞3次，加入50μl含钙镁pbs缓冲液，向实验组组加入120μl含有ionomycin(cacc激活剂)的碘化钠pbs缓冲液，对照组加入t16ainh-a01(cacc特异性抑制剂)孵育10min，再加入120μl含有ionomycin碘化钠pbs缓冲液，采用fluo star多功能酶标仪检测相对荧光强度动态变化。具体设置如下：发射光波长540nm，激发光波长500nm。以每秒5个点的速度动态检测相对荧光强度，其中前2s为基线，2s后以260μl/s的速度向两组孔中加入120μl含有ionomycin的碘化钠pbs缓冲液。利用excel软件对原始数据进行宏计算，求出斜率值(slope)。
[0093]
实施例4验证细胞模型可筛选cacc调节剂
[0094]
为了验证cacc细胞模型的功能活性，将细胞分为6组(激活剂3组，抑制剂3组)，每组3个复孔，采用倍比稀释的方法获得不同浓度的激活剂和抑制剂。其中3组分别加入不同浓度的ionomycin、calcimycin、eact三种cacc激活剂，采用多功能酶标仪进行检测，加入碘化钠pbs缓冲液120μl，记录相对荧光强度动态变化。另外3组用钙镁pbs缓冲液洗涤细胞3次后，吸出液体后加入50μl pbs缓冲液，分别加入不同浓度的nfa、nppb、t16ainh-a01三种抑制剂，孵育10min，同样采用多功能酶标仪进行检测，加入含有ionomycin的碘化钠pbs缓冲液120μl，记录相对荧光强度动态变化。
[0095]
实施例5荧光探针法的检测ca
2+
的变化
[0096]
将稳定共表达ano1-yfp-h148q/i152l的frt细胞消化离心后制成细胞悬液，加入fura-2/am(终浓度为5μmol/l)，37℃孵育30min，并轻轻振动。采用无钙镁pbs缓冲液洗涤细胞1次，以去除细胞外残留的fura-2/am。离心后，加入无钙镁pbs缓冲液制成细胞悬液。在fluo star多功能酶标仪中使用340和380nm双激发源在510nm处记录荧光强度，测定时记录静息时和加入不同浓度的ionomycin后的340nm/380nm荧光比值。加入tritonx-100及egta测定最大荧光和最小荧光。根据荧光比值计算ca
2+
浓度。
[0097]
将稳定共转染ano1-yfp-h148q/i152l的frt细胞接种于到黑壁透明底的96孔板中培养18h。加入fluo-4/am负载，在37℃下孵育45min。在fluo star多功能酶标仪中使用494nm激发源在516nm处记录荧光强度。
[0098]
效果例1
[0099]
1.共表达ano1和yfp-h148q/i152l细胞模型的构建
[0100]
转染ano1的frt细胞共挑出6个单克隆细胞团，在倒置荧光显微镜下可见细胞膜呈绿色荧光，取表达量最高的单克隆细胞团进行扩大培养。稳定表达ano1的frt细胞镜下可见绿色荧光在细胞膜上均匀分布，结果表明ano1表达在细胞膜上(图2a)；共转染ano1-yfp-h148q/i152l的frt细胞共挑出5个单克隆细胞团，在倒置荧光显微镜下可见胞浆呈绿色荧光，同样取表达量最高的进行扩大培养。镜下可见绿色荧光在胞浆内均匀分布，结果表明yfp-h148q/i152l表达在胞浆中(图2b)。结果表明，成功获得稳定共表达ano1和yfp-h148q/i152l的frt细胞株。流式细胞仪检测结果表明，稳定转染的细胞纯度达到96.8％，如图2c、d。
[0101]
2.电生理记录
[0102]
应用whole-cell膜片钳技术记录到，初始电压0mv时和1μmol/l游离ca
2+
存在时，电流为0mv，但随着电压的增加电流逐渐增大，即电流与电压和时间呈正相关，且电流随着时间的增加逐渐增大(图3a)。加入cacc抑制剂nfa电流大小与图3a相比显著下降(图3b)，对图
3a和3b进行整理和分析得出i/v曲线图(电流与电压的关系图)，曲线呈明显的外向整流特性(图3c)。结果表明：构建的cacc通道具有时间、电压和ca
2+
依赖性以及外向整流特性，且cacc抑制剂nfa可抑制cacc通道。证实本研究记录的ano1电流属于经典的钙激活氯离子电流，具有经典的钙激活氯离子通道的生理特性。
[0103]
3.荧光淬灭动力学实验鉴定细胞模型的有效性
[0104]
酶标仪结果显示，实验组加入ionomycin后，细胞相对荧光强度显著下降，表明cacc开放，i-内流，对照组在t16ainh-a01孵育后加入ionomycin，细胞相对荧光强度无明显变化，表明t16ainh-a01抑制了cacc的开放，如图4a，所示。根据宏计算两组数据的荧光斜率值，实验组荧光斜率值显著高于对照组，两组数据具有显著性差异(p＜0.001)，如图4b所示。上述结果表明，共表达ano1-yfp-h148q/i152l的frt细胞具有cacc通道特性，细胞模型构建成功。
[0105]
表1图4a数据
[0106]
[0107]
[0108]
[0109][0110]
表2图4b数据
[0111]
t16ainh-a01ionomycin4.262.31.968.23.270
[0112]
4.验证细胞模型可筛选cacc调节剂
[0113]
激活剂组在加入不同浓度的cacc激活剂后，所检测的荧光信号呈现不同的变化。随着激活剂浓度的增加，荧光斜率不断增强，呈现剂量依赖关系。结果采用graphpad prism 8软件分析，见图4c，其ec
50
分别为39.70μmol/l、62.15μmol/l、115.2μmol/l。抑制剂组：首先加入不同浓度抑制剂，孵育10min后再加入含有激活剂的碘化钠pbs缓冲液后，随着抑制剂浓度的增加，荧光信号不断减弱，即抑制剂浓度越大其抑制作用越强，呈现剂量依赖关系。结果同样采用graphpad prism 8软件分析，见图4d，其ic
50
分别为51.19μmol/l、78.83μmol/l、137.9μmol/l。
[0114]
表3图4c数据
[0115]
[0116][0117]
表4图4d数据
[0118][0119][0120]
5.荧光探针法的检测ca
2+
的变化
[0121]
加入不同浓度的ionomycin后，相对荧光强度产生不同程度的下降，激活剂浓度的越大，相对荧光强度下降的幅度越大，荧光斜率值越大，如图5a所示，结果表明荧光斜率值
与激活剂浓度呈剂量依赖关系。同时细胞内ca
2+
浓度瞬时升高，随着激活剂浓度的升高，胞浆内ca
2+
浓度越高，其浓度与激活剂浓度呈剂量依赖关系，如图5b所示。根据图5a、5b分析结果表明，荧光斜率值随着胞浆内ca
2+
浓度增加而增加，ca
2+
浓度越大，荧光斜率值越大，如图5c所示。
[0122]
加入fluo-4后，随着ca
2+
浓度升高，荧光强度上升幅度越大，如图5d所示。与图5c进行敏感性比较，本方法比fluo-4法有着其3倍的信号窗口，如图5e所示。结果表明，通过荧光变化的斜率值可反映细胞内ca
2+
浓度，因此该细胞模型可敏感检测细胞内ca
2+
浓度的变化。
[0123]
表5图5a数据
[0124][0125][0126]
表6图5b数据
[0127][0128]
表7图5c数据
[0129][0130][0131]
表8图5d数据
[0132][0133]
表9图5e数据
[0134][0135][0136]
效果例2荧光探针法和基于cacc检测细胞内钙浓度的检测方法(下面简称为cacc法)比较
[0137]
表10
[0138][0139]
备注：1234比较结果显示cacc法优于荧光探针法；5比较结果显示荧光探针法优于cacc法。
[0140]
详细说明如下：价格：invitrogen公司的检测细胞内钙浓度的荧光探针(fluo4)市场价格为4196.00人民币。
[0141]
cacc法灵敏度高于荧光探针法的原因：
[0142]
(1)细胞内ca
2+
浓度仅仅为nm级别或者μm级别，很少能达到mm级别，也就是说细胞内ca
2+
浓度的微量性决定了其直接检测的难度；
[0143]
(2)cacc法是通过yfp双突变体的相对荧光信号的变化间接反映细胞内ca
2+
浓度，yfp双突变体具有极强的碘离子敏感的特性；cacc单个通道在碘离子依次通过的情况下，每秒钟可转运106个碘离子；而且通过稳定转染，本细胞模型具有高表达cacc的特性(也就是说每个细胞上表达多个cacc)；此外yfp的荧光信号强(yfp的荧光强度是普通荧光信号如gfp即绿色荧光蛋白的数倍)。
[0144]
如图6所示，结果表明：在细胞内ca
2+
浓度在40、50、100、200、400和800nm时cacc法灵敏度均显著优于荧光探针法。
[0145]
综上所述，cacc灵敏度高于荧光探针法。
[0146]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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