猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用的制作方法

猪星状病毒2型taqman荧光定量pcr试剂盒及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及猪星状病毒2型taqman荧光定量pcr及其应用，属于生物医药领域，具体属于分子生物学技术领域。


背景技术：

[0002]
星状病毒是一种无囊膜包被的单股正链rna病毒，其基因组全长约6.4kb～7.3kb。星状病毒的宿主范围极广，可感染人、猪、牛、犬、猫等多种哺乳动物，以及鸡、鸭、火鸡等禽类动物。猪在感染星状病毒后常常表现为无症状或轻微腹泻等临床症状，因而被认为是一种腹泻相关病原。猪星状病毒目前可分为5个基因型(pastv1～pastv5)，遗传进化分析结果显示，各基因型可能存在不同的进化祖先。流行病学调查结果显示，pastv在我国猪群内的流行率较高，且5个基因型均有发现。因此，建立一种快速、准确的pastv2实验室诊断方法，对于了解pastv2在我国猪群中的流行情况具有重要意义。本发明旨在建立一种可以快速、准确地检测pastv2的taqman荧光定量pcr方法，并以此为基础制备试剂盒，为pastv2的流行病学调查以及检测诊断pastv2提供准确、可靠的技术工具。


技术实现要素：

[0003]
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速、准确地检测pastv2的taqman荧光定量pcr的试剂盒。
[0004]
因此，本发明一方面提供了一种猪星状病毒2型taqman荧光定量pcr检测试剂盒，所述的试剂盒包括检测猪星状病毒2型orf1ab保守基因序列的pcr反应液，所述的pcr反应液包括引物对和taqman探针，所述引物对和taqman探针的序列如下：
[0005]
pastv2-f：5
’-
ctgcgcctaccaccgcgcaggagg-3
’
；
[0006]
pastv2-r：5
’-
cgagagtcctcvaggaagttgta-3
’
；
[0007]
pastv2-probe：5
’-
fam-taccaccatgtgacccagacctnccyttc-3
’
bhq1。
[0008]
优选地，本发明所述的猪星状病毒2型taqman探针的核苷酸序列的5
’
端标记fam荧光报告基团，3
’
端标记bhq1淬灭基团。
[0009]
优选地，本发明所述的pcr反应液还包括2
×
primdirect probe rt-qpcr mix with ung
[0010]
优选地，本发明所述的试剂盒的反应体系为2
×
primdirect probe rt-qpcr mix with ung 12.5μl，pastv2-f、pastv2-r各0.5μl，pastv2-probe 0.5μl，处理后样本2μl，灭菌水补齐至25μl。
[0011]
优选地，本发明所述的试剂盒还包括标准品，所述标准品为猪星状病毒2型阳性样品cdna扩增片段回收纯化后克隆至pmd18-t中所得，所述标准品浓度为1.4
×
107copies/μl、1.4
×
106copies/μl、1.4
×
105copies/μl、1.4
×
104copies/μl、1.4
×
103copies/μl、1.4
×
102copies/μl。
[0012]
优选地，本发明所述的标准品中目的片段的序列如seq id no.1所示。
[0013]
优选地，本发明所述的试剂盒的反应条件为：90℃3min，56℃5min，为第一步循环；95℃5s，56℃30s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
[0014]
另一方面，本发明还提供了一种使用所述的试剂盒检测猪星状病毒2型的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：1)样品的处理；2)将上述步骤所得样品作为模板，加到试剂盒的反应体系中，进行荧光定量pcr反应，并同时以标准品作为样品进行荧光定量pcr反应；3)以标准品ct值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标做标准曲线，将样品的ct值代入标准曲线中计算样品的拷贝数。
[0015]
优选地，本发明所述的试剂盒检测猪星状病毒2型的方法中的步骤1)中的样品为粪便。
[0016]
再一方面，本发明还提供了一种所述的猪星状病毒2型taqman荧光定量pcr检测试剂盒在猪星状病毒2型诊断中的应用。
[0017]
本发明根据ncbi数据库上公布的pastv2的orf1ab基因序列进行比较分析，在保守区域设计1对特异性引物和探针，建立检测pastv2的taqman实时定量pcr的方法，并在此基础上形成了一种检测猪星状病毒2型taqman荧光定量pcr检测试剂盒。该试剂盒的重复性试验得到的平均变异系数结果较好(＜2％)；运用该试剂盒建立的标准曲线有良好的线性关系，相关系数可达0.9971。与其他病毒同时检测无交叉反应，能特异性检测pastv2，并具有较好的稳定性和重复性。目前，针对pastv2的研究尚处于初级阶段，pastv2尚未被分离到，pastv2单独感染以及与其他pastv基因型混合感染的致病力均有待于进一步研究。本发明所建立的pastv2 taqman荧光定量检测试剂盒，为pastv2的快速检测及其流行病学调查提供了快速、简便、可靠的检测手段。
[0018]
相比于传统的sybr green法，本发明所使用的的taqman探针法具有如下优点：(1)本发明无需提取样品内rna，收集的粪便等样品经处理后可直接加入反应液中进行rt-qpcr反应，节约了大量的时间成本。(2)本发明根据保守性特异序列设计并合成特异性引物及taqman探针，采用荧光定量pcr方法快速灵敏地检测猪星状病毒2型，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，可实现对待测样本的快速、有效检测。(3)由于采用定量检测技术-taqman-荧光定量pcr(real-time pcr)，该方法(real-time pcr)具有单管封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点，有效地解决了传统方法只能终点检测的局限。(4)由于探针的3
’
端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间上的位置更接近，实验灵敏度更高，特异性更强。(5)taqman探针法荧光定量pcr方法简便、快速，整个过程可在一个小时内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作，即方便了操作又减少了污染。
附图说明
[0019]
图1为本发明中标准品重组质粒的pcr扩增结果。
[0020]
图2为本发明中pastv2 taqman pcr扩增曲线(a)和标准曲线(b)。
[0021]
图3为本发明中pastv2 qpcr扩增引物的熔解曲线，其中1～7：猪星状病毒2型1.4
×
101copies/μl～1.4
×
107copies/μl的dna；8：阴性对照。
[0022]
图4为本发明中pastv2 taqman荧光定量qpcr的特异性分析图。
具体实施方式
[0023]
以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所涉及各种原料，如无特别说明，均为市售。
[0024]
实施例1材料与方法
[0025]
1.1阳性样品材料
[0026]
猪星状病毒2型(pastv2)、猪肠道病毒(porcine enteric virus，pev)、猪塞内卡病毒(senecavirus，svv)、猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus，prv)、猪瘟病毒(classical swine fever virus，csfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory virus，prrsv)的阳性核酸样本，均由本实验室鉴定保存。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus，tgev)、猪轮状病毒(porcine rotavirus，rv)三联活疫苗购自哈尔滨维科生物技术开发公司。猪乙脑病毒(japanense encephalitis virus，jev)购于武汉科前生物股份有限公司。
[0027]
1.2主要试剂
[0028]
pmd18-t载体、e.coli dh5α感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。premix taq
tm
、dl2000 dna marker、rnaiso plus、2
×
primdirect probe rt-qpcr mix with ung均为宝日医生物技术公司产品。
[0029]
1.3主要仪器
[0030]
nanodrop onec超微量紫外分光光度计购自美国赛默飞世尔科技公司。lightcycler 96实时荧光定量pcr仪购自德国罗氏诊断有限公司。核酸水平电泳仪购自北京六一生物科技有限公司。pcr仪购自美国伯乐bio-rad公司。
[0031]
1.4引物、探针的设计与合成
[0032]
收集genbank上登录的pastv2 orf1ab基因序列，并进行比对分析，在其保守区域设计特异性引物(pastv2-f/r)和荧光探针(pastv2-probe)，序列见表1，探针及引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并用ddh2o稀释至浓度为10μmol/l，-20℃保存备用。
[0033]
表1引物序列
[0034][0035]
1.5样品处理
[0036]
用pbs将粪便样品进行10倍漩涡震荡稀释，8 000
×
g，4℃离心，取上清，-80℃保存。
[0037]
1.6标准品的制备
[0038]
以阳性pastv2样品cdna作为模板，利用以上qpcr引物pcr扩增相应片段，经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收纯化目的片段并克隆至pmd18-t载体。将所得重组质粒转化e.coli dh5α感受态细胞，取单克隆菌落，lb培养基增菌培养16h后提取质粒。提取的重组质粒经双酶切
鉴定和测序鉴定为阳性后命名为pmd19-t-pastv2，利用分光光度计测定质粒的浓度，根据公式：dna拷贝数＝质粒浓度(ng/μl)
×
10-9
/(660
×
标准质粒碱基数)计算质粒的拷贝数，标准质粒碱基数为2899。重组质粒以10倍稀释后作为标准品，-20℃保存备用。
[0039]
1.7标准曲线的建立
[0040]
在不同退火温度下(52℃、55℃、58℃、60℃、62℃和65℃)进行pcr反应，以确定引物的最适退火温度，采用矩阵法对探针浓度(1.25μmol/l、2.5μmol/l、5.0μmol/l、10μmol/l)和引物浓度(1.25μmol/l、2.5μmol/l、5.0μmol/l、10μmol/l)进行优化，最终获得最适合的探针引物浓度配比，确定反应体系。将1.6中制备的标准品进行荧光定量pcr反应，以获得标准曲线和熔解曲线。
[0041]
1.8荧光定量pcr方法的特异性试验
[0042]
利用建立的taqman qpcr方法对本实验室保存的pev、prrsv、svv、csfv、jev及猪三联活疫苗(pedv、rv、tgev)阳性样本的cdna及prv阳性样本的dna模板进行扩增，以pastv2的重组质粒为阳性对照，设ddh2o为阴性对照，以验证该方法的特异性。
[0043]
实施例2试验结果
[0044]
2.1标准质粒的制备
[0045]
以提取的pastv2阳性样品的cdna为模板进行pcr扩增，结果显示，目的条带为299bp(图1和seq id no.1)，与预期相符。目的片段回收纯化后克隆至载体pmd18-t中，构建的重组质粒标准品，经pcr和测序鉴定，结果显示目的片段与预期插入片段相同，表明重组质粒标准品正确构建。
[0046]
2.2反应条件的优化
[0047]
优化后的荧光定量反应体系：2
×
primdirect probe rt-qpcr mix with ung 12.5μl，pastv2-f、pastv2-r各0.5μl，pastv2-probe 0.5μl，处理后样本2μl，灭菌水补齐至25μl。优化后的反应条件：90℃3min，56℃5min，为第一步循环；95℃5s，56℃30s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
[0048]
2.3荧光标准曲线的建立
[0049]
测定的标准质粒后换算拷贝数为1.4
×
10
10
copies/μl，10倍稀释后，取1.4
×
102～1.4
×
107copies/μl的标准品质粒进行荧光定量pcr反应，获得标准曲线(图2)，结果显示，标准曲线线性关系良好，相关系数r2为0.9932，可作为后续试验的参照。
[0050]
2.3熔解曲线分析
[0051]
熔解曲线(图3)显示，质粒标准品均出现了单峰，熔解温度在85℃
±
0.5℃，说明建立的pastv2 qpcr检测方法无非特异性扩增。
[0052]
2.4特异性试验
[0053]
利用建立的taqman qpcr方法对本实验室保存的pev、prrsv、svv、csfv、jev、猪3联活疫苗(pedv、rv、tgev)阳性样本的cdna及prv阳性样本的dna模板进行特异性检测。结果显示，除pastv2阳性对照扩增得到目的片段以外，其他病原的检测结果均为阴性，该方法与其他主要猪病病原无交叉反应，表明该方法具有良好的特异性(图4)。
[0054]
上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

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