一种乳腺癌标志物及应用的制作方法

[0001]
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种乳腺癌标志物及应用。


背景技术：

[0002]
肿瘤细胞与微环境之间的关系类似于种子与土壤的关系。肿瘤微环境的非细胞成分包括细胞外基质、细胞因子、外泌体等，在微环境与肿瘤细胞间的信号转导中作用不容忽视，参与肿瘤转移、血管生成、免疫抑制等。肿瘤微环境的变化在促进肿瘤发生发展中的作用及其机制研究具有广阔应用前景，越来越多研究发现，微环境变化不仅影响肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，还影响放化疗及靶向药物治疗的效果。微环境为肿瘤生长、进展提供必要的支持的同时，肿瘤细胞也通过与微环境的作用改造着微环境。微环境和肿瘤细胞形成了一个复制的生态环境共同进化促进肿瘤的进展。因此，研究微环境调控肿瘤的分子机制不仅具有理论价值，还可为肿瘤治疗提供针对微环境的新靶标和新思路。低氧是肿瘤微环境的特点之一，而低氧状态是由于细胞内氧气供应和消耗之间不平衡造成，肿瘤组织生长快，其内部血流灌注低下，虽然肿瘤内有异常新生血管形成，但肿瘤细胞的氧消耗量超过组织的供氧能力，因此表现出相对不足。低氧微环境引起肿瘤细胞发生一系列生物学改变，如细胞代谢的变化、基因表达及基因表型改变、蛋白合成变化等，其结果主要表现在以下几个方面：促进肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡、影响细胞周期、促进肿瘤的侵袭和远处转移、对放化疗产生抵抗等。
[0003]
低氧微环境在实体瘤中普遍存在，尤其是乳腺癌。乳腺癌起源于乳腺上皮组织，是威胁女性身心健康的严重疾病，99％的乳腺癌来自女性。乳腺癌细胞间连接比较松散，癌细胞脱落后容易通过血液和淋巴结转移，最终威胁生命，然而乳腺癌的发病机制尚不十分明确。
[0004]
近年来发现长链非编码rna(lncrna)作为细胞信号和行为精细调控的主要手段，与肿瘤发生发展密切相关。以非编码rna为核心的表观遗传调控机制在生命活动中的作用越来越受到重视。人类基因组中编码蛋白的基因数相对于线虫等低等生物并无成倍增长，这与不同物种生物功能的复杂程度极不匹配。非编码区在基因组的比例随着物种进化水平的上升呈逐渐升高，非编码rna在生命活动中精确多样的调控功能很好地解释了基因组的复杂性。占人类基因组转录本高达62％的lncrna是一类转录本长度在200nt以上的非编码rna，在体内会折叠形成类似于蛋白质的复杂高级结构，功能及作用方式多样。在不到十年的时间里，lncrna由不为人知到成为生物医学领域研究的热点，足见其功能的重要性，目前已经认识到lncrna领域蕴含巨大宝藏，亟待更加广泛和深入研究。越来越多研究显示lncrna与肿瘤的发生发展关系密切，然而对lncrna在微环境，尤其是非细胞成分中，调控肿瘤中的作用知之甚少。因此，发掘那些对乳腺癌发生和发展以及分型至关重要，且受低氧微环境调控的新型lncrnas具有重要的临床意义。


技术实现要素：

[0005]
本发明目的在于提供一种乳腺癌标志物及应用，为乳腺癌的早期诊断提供基础，为乳腺癌的科学研究提供理论依据。
[0006]
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007]
本发明第一方面提供一种乳腺癌标志物，所述标志物为低氧肿瘤微环境激活的lncrna loc105369301，其序列如seq id no.1。
[0008]
本发明第二方面提供一种乳腺癌标志物在制备乳腺癌诊断芯片或试剂盒中的应用。所述芯片或试剂盒包括针对loc105369301的特异性引物对或探针，所述特异性引物对或探针的序列如seq id no.1和seq id no.2所示。所述特异性引物对用于sybr green、taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
[0009]
进一步地，所述芯片或试剂盒用于体外检测样品中lncrna loc105369301表达水平。所述样品包括细胞、组织或体液。
[0010]
进一步地，试剂盒或芯片可用于检测包括loc105369301基因在内的多个基因(例如，与乳腺癌相关的多个基因)的表达水平，将乳腺癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高乳腺癌诊断的准确率。
[0011]
本发明第三方面提供一种乳腺癌标志物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。所述治疗乳腺癌药物包括lncrna loc105369301的抑制剂，所述抑制剂包括以lncrna loc105369301为靶序列、且能够抑制loc105369301表达水平的试剂。包括核酸抑制物shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物等。
[0012]
进一步地，所述shrna的序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
[0013]
进一步地，所述治疗乳腺癌药物还包括药学上可接受的载体，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。
[0014]
本发明第四方面提供一种乳腺癌标志物在乳腺癌非诊断性研究中的应用。
[0015]
本发明第五方面提供一种乳腺癌标志物在乳腺癌精准治疗中的应用。所述乳腺癌标志物成为乳腺癌精准治疗的分子靶标。
[0016]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0017]
本发明提供一种乳腺癌标志物低氧肿瘤微环境激活的lncrna loc105369301，能够用于制备乳腺癌诊断芯片或试剂盒，通过检测标志物loc105369301的表达水平即可对早期乳腺癌进行判断，从而进行早期干预，提高患者的生存率。同时为乳腺癌的精准治疗提供分子靶标，通过靶向靶标loc105369301，改变loc105369301的表达水平，进而起到治疗乳腺癌的作用。
附图说明
[0018]
图1为本发明实施例1中利用qpcr检测loc105369301基因在正常乳腺细胞和乳腺癌细胞中的表达情况图；
[0019]
图2为本发明实施例2中利用qpcr检测shrna沉默loc105369301的情况图；
[0020]
图3为本发明实施例3中利用流式细胞仪检测沉默loc105369301对mda-mb-231细胞凋亡影响图。
具体实施方式
[0021]
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0022]
本发明所述的低氧肿瘤微环境激活的lncrna loc105369301能够应用于制备乳腺癌诊断芯片或试剂盒。所述芯片或试剂盒包括针对loc105369301的特异性引物对或探针，所述特异性引物对或探针的序列如seq id no.1和seq id no.2所示。所述特异性引物对用于sybr green、taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。所述芯片或试剂盒用于体外检测样品中lncrna loc105369301表达水平。所述样品包括细胞、组织或体液。
[0023]
而且，所述试剂盒或芯片可用于检测包括loc105369301基因在内的多个基因(例如，与乳腺癌相关的多个基因)的表达水平，将乳腺癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高乳腺癌诊断的准确率。
[0024]
低氧肿瘤微环境激活的lncrna loc105369301能够应用于制备治疗乳腺癌药物。所述治疗乳腺癌药物包括lncrna loc105369301的抑制剂，所述抑制剂包括以lncrna loc105369301为靶序列、且能够抑制loc105369301表达水平的试剂。包括核酸抑制物shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物等。所述shrna的序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
[0025]
治疗乳腺癌药物还包括药学上可接受的载体，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。
[0026]
低氧肿瘤微环境激活的lncrna loc105369301能够应用于在乳腺癌非诊断性研究中。
[0027]
低氧肿瘤微环境激活的lncrna loc105369301能够应用于乳腺癌精准治疗中应用。乳腺癌标志物成为乳腺癌精准治疗的分子靶标。
[0028]
下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0029]
实施例1低氧条件下loc105369301在乳腺癌细胞系中的表达情况
[0030]
1.细胞培养
[0031]
培养乳腺癌mda-mb-231细胞系，于5％co2，37℃的恒温培养箱中进行培养，所有细胞培养基中加10％胎牛血清以及1％青霉素/链霉素双抗。隔天换液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶进行常规消化，按1:3的比例将细胞进行传代。
[0032]
2.提取rna
[0033]
向经1％o2浓度培养24h后的细胞加入1ml trizol，室温放置数分钟以便充分裂解细胞，收集所有细胞至新的ep管中。4℃，12000rpm离心5分钟，弃沉淀，将上清转入另一个新的ep管中。每管加入200μl氯仿，温和颠倒混匀，室温放置5分钟后，4℃，12000rpm离心15分钟。吸取上部分水相层至另一全新ep管中，注意宁可少吸一些也要避免吸到下层液体。每管加入500μl异丙醇用以沉淀rna，混匀，室温静置5分钟后，4℃，12000rpm离心10分钟，吸净上清，可发现rna沉于ep管底部。用1ml 75％乙醇(depc水配制)清洗沉淀一遍。室温晾干后，用适量depc水溶解rna，测定浓度。需特别注意的是，整个实验操作过程均需在无rna酶的环境下进行。
[0034]
3.反转录获取cdna
[0035]
按照反转录试剂盒使用手册中的提示，10μl反转录体系里需要500ng rna作为模板，根据所测得的rna浓度，计算出所需rna的体积，具体的反转录体系如下：
[0036]
模板rna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
？μl
[0037]5×
mix buffer
ꢀꢀꢀ
2μl
[0038]
超纯水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
补齐至10μl
[0039]
反应条件如下：
[0040]
37℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
30分钟
[0041]
85℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10秒钟
[0042]
4℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
保存
[0043]
4.实时荧光定量pcr(qpcr)
[0044]
表1扩增引物
[0045][0046][0047]
将上步所得cdna作为模板，根据qpcr试剂盒使用手册，按如下体系进行qpcr，以20μl体系为例：
[0048][0049]
反应条件如下：
[0050][0051]
反应过程中每个样品设置4个重复。反应完成后，比较相同模板下目的基因和内参基因的ct值(cycle threshold，循环阈值)，得出相应的比值。对照组这一比值标准化处理为1，同时其它各组的比值与之相比较，从而得出各组mrna表达水平的相对变化。
[0052]
5.结果
[0053]
低氧显著激活乳腺癌细胞系中loc105369301的表达如图1所示。
[0054]
实施例2在乳腺癌细胞系mda-mb-231中沉默loc105369301的效率
[0055]
1.shrna序列
[0056]
本申请所用的shloc105369301序列由北京擎科生物科技有限公司合成，沉默loc105369301的序列如表6所示。
[0057]
表2 shrna序列
[0058][0059][0060]
2.慢病毒包装
[0061]
将1μg的目的质粒与100μl的opti-mem无血清培养基混合均匀，配制成mix 1；将3μl的lip2000转染试剂与100μl的opti-mem无血清培养基混合均匀，配制成mix 2，然后静置5min；将mix 1和mix 2混合均匀，配制成mix 3，室温静置20min；将转染复合物mix 3逐滴加入细胞培养基中，轻轻晃动细胞培养皿，使转染复合物与培养基混合均匀，然后放于细胞培养箱进行培养。慢病毒包装的体系中，包括了包装质粒pmd2.g(0.5μg)/pspax2(0.75μg)和目的质粒(1μg)，然后按照上述普通质粒转染步骤进行细胞转染。
[0062]
3.感染细胞
[0063]
在目的质粒转染细胞7h后，去除旧的细胞培养基，加入1ml的含量10％fbs的新鲜培养基，24h后第一次收取病毒；再次向培养皿中加入1ml含量10％fbs的新鲜培养基，48h后第二次收取病毒。将两次收取的病毒液体混合在一起，在4℃离心机中，12000
×
rpm速度离
心10min，取上清病毒放于4℃备用。取500μl的病毒上清液体，添加到1.5ml新鲜的培养基中，同时加入试剂polybrene(终浓度8μg/ml)，然后混合均匀液体添加到细胞培养孔中，并将细胞放于培养箱进行24h感染培养。去除培养孔中的细胞培养基，用pbs漂洗细胞，然后加入200μl的胰酶进行细胞消化，并用新鲜培养基中和离心；用新鲜的培养基重悬细胞，然后转移到6cm的培养皿中，并用嘌呤霉素(终浓度2μg/ml)进行48h的筛选。
[0064]
4.提取rna
[0065]
同实施例1
[0066]
5.反转录获取cdna
[0067]
同实施例1
[0068]
6.qpcr
[0069]
同实施例1
[0070]
7.结果
[0071]
shrna1和shrna2小分子对loc105369301都有较好的沉默效果，其中shrna2的沉默效果最为显著(p<0.05)(图2)，因此选择shrna2作为沉默序列应用于后续的功能验证，本实验中所有细胞实验均重复3次(图2)。
[0072]
实施例3常氧和低氧条件下分别沉默loc105369301对乳腺癌细胞系mda-mb-231细胞凋亡的影响
[0073]
1.细胞消化
[0074]
21％o2和1％o2分别培养两份沉默loc105969301的细胞样品24h后，取出细胞培养基，加入胰酶进行3min的消化；并用新鲜细胞培养基中和，用1ml的枪头吹打均匀细胞，再通过10μl的小枪头尽量吹打成单个细胞；放于水平离心机1000
×
rpm离心5min，弃上清，用pbs重悬，同样条件再离心。
[0075]
2.细胞处理
[0076]
用pbs稀释binding buffer到1
×
，然后用100μl的1
×
buffer重悬细胞，加入1μl的annexinv-fitc染料，吹打均匀，避光10min；加入2μl的pi染料，轻轻吹打均匀，并室温避光5min，然后用流式细胞仪器检测细胞凋亡。
[0077]
3.结果
[0078]
低氧条件下shrna2沉默loc105369301引起的乳腺癌细胞凋亡显著多于常氧条件下沉默loc105369301引起的乳腺癌细胞凋亡(图3)。
[0079]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

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