大麦条纹病致病性基因pgsln及其应用的制作方法

[0001]
本发明属于生物技术工程领域，具体涉及大麦条纹病致病基因pgsln及其调控菌丝生长速率，参与渗透压胁迫调控，提高大麦条纹病菌对异菌脲、多菌灵和咯菌腈的耐受性，调控菌丝细胞壁完整性以及与大麦条纹病的致病性有关的应用。


背景技术：

[0002]
大麦条纹病(barley leaf stripe)是大麦的主要病害之一，在大麦种植区普遍发生。近年来，由于耕作制度的变化以及多年的连茬种植，该病害发生日趋严重，研究该病病原菌的致病机制就显得尤为重要。现已得知，该病是由种子带菌引起的系统侵染性真菌病害，其病原菌的无性阶段drechslera graminea(rabenh&schlecht)schoemaker为禾内脐蠕孢，半知菌亚门、内脐蠕孢属，有性阶段pyrenophora graminea为麦类核腔菌，子囊菌亚门、核腔菌属。
[0003]
tchk信号途径在细菌、真菌、黏菌和植物中调控许多细胞生命过程，如：细胞运动性、细胞周期控制、发育、耐药性、细菌和真菌的致病性、以及对激素刺激的反应和环境压力胁迫响应，真菌细胞壁在维持细胞的形状和调节细胞之间及其与环境之间的交换中起着重要作用。虽然细胞壁的硬度足以维持细胞内很高的浓度压力，但是随着生长和发育细胞壁的组织和结构都持续被改造。因此，在致病真菌中，维持细胞壁的完整性对宿主的致病能力的发生至关重要。一些细胞壁完整性相关的基因已经在酿酒酵母中研究的比较清楚，包括mekk (bck1)、meks(mkk1/2)和一个map激酶(slt2)。几种植物病原体中，mosln、slt2和bck1 的同系物对维持细胞壁完整性和致病性是必要的。到目前为止，关于大麦条纹病菌在tchk 信号途径的研究未见报道，本发明涉及一个大麦条纹病菌麦菌假定的hpk新基因pgsln及其功能，为tchk的一个组成部分，旨在为大麦条纹病菌的抗病育种奠定基础。
[0004]
现有技术存在的问题：现有技术中未见大麦条纹病(麦类核腔菌)pgsln基因及功能的报道。


技术实现要素：

[0005]
鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种大麦条纹病(麦类核腔菌)致病性基因pgsln，通过基因敲除和回补技术获得pgsln突变体，进一步提供了该基因在调控菌丝生长分化，渗透胁迫，抑菌剂耐受性，细胞壁完整性及致病性等方面的功能。
[0006]
为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
[0007]
1.一种大麦条纹病致病性基因pgsln，该基因全长序列如序列表seq id no:1所示。
[0008]
2.一种大麦条纹病致病基因pgsln基因克隆及其基因功能验证方法，包括如下步骤：
[0009]
(1)pgsln基因克隆及序列分析；
[0010]
(2)pgsln基因的敲除载体、回补载体构建；
[0011]
(3)原生质体制备及载体的遗传转化；
[0012]
(4)菌丝生长实验；
[0013]
(6)渗透压敏感性及抑菌剂耐受性实验；
[0014]
(7)细胞壁完整性实验。
[0015]
(8)大麦条纹病致病性的测定。
[0016]
3.一种大麦条纹病致病基因pgsln基因在调控菌丝生长速率中的应用。
[0017]
4.一种大麦条纹病致病基因pgsln基因在调节渗透压及真菌抑制剂敏感性方面的应用。
[0018]
5.一种大麦条纹病致病基因pgsln基因在参与细胞壁完整性的应用。
[0019]
6.一种大麦条纹病致病基因pgsln在调控大麦条纹病菌致病性方面的应用。
[0020]
本申请至少具有以下有益效果：
[0021]
(1)本申请提供了一个来源于大麦条纹病菌-麦类核腔菌(pyrenophora graminea)新的基因pgsln。
[0022]
(2)新基因pgsln可以调控大麦条纹病菌丝的生长及发育，通过pgsln基因敲除突变体，培育大批量抗大麦条纹病病菌的突变体植株，可高效解决大麦条纹病病害的侵袭，实现了简单、易行、高效培育抗大麦条纹病植株的目的。
[0023]
(3)新基因pgsln与渗透胁迫及重金属胁迫调控有关，并且能够提高大麦条纹病病菌植株对异菌脲、多菌灵和咯菌腈的耐受性，参与细胞壁的完整性，即该基因可调控植物对逆境胁迫的应对能力，培育转pgsln基因的作物(抗性品种)，可以使环境得到保护，有利于农业的可持续发展。
附图说明
[0024]
图1：pgsln的全长序列；
[0025]
图2：敲除载体pcm-hyg-pgsln构建示意图；
[0026]
图3：回补载体pcmbia1300-zeo-pgsln构建示意图；
[0027]
图4：pgsln基因全长dna(1)和cdna(2)的扩增结果；
[0028]
图5：pgsln与其他病原菌氨基酸序列比对；
[0029]
其中，黑色阴影表示相同的氨基酸，绿色或粉红色阴影表示相似的氨基酸，跨膜结构域加了下划线，预测的磷酸化位点域加注了“*”；缺少的氨基酸用“.”表示；
[0030]
图6：pgsln基因系统发育分析；
[0031]
图7：pgsln基因的功能域和跨膜结构域；
[0032]
图8：pgsln基因的跨膜结构域；
[0033]
图9：敲除载体pbs-hyg-pgsln酶切及pcr验证；
[0034]
其中，m：markdl2000；1：上臂的pcr验证，大小为1086bp；2：smaⅰ/sac i酶切，大小为1086bp；3：下臂的pcr验证，大小为745bp；4：hindⅲ/xhoⅰ酶切大小为745bp；
[0035]
图10：回补载体pcmbia1300-zeo-pgsln的pcr验证；
[0036]
其中，m：markdl15000+2000；1：pgsln的pcr验证，大小为3634bp；2：zeo的pcr 验证，大小为834bp；
[0037]
图11：敲除株
△
pgsln和互补株
△
pgsln-c的pcr验证；
[0038]
其中，m：markdl2000；1：
△
pgsln中hygb的pcr鉴定(引物hyg-1/hyg-1)；2：
△ꢀ
pgsln中pgpbs基因的pcr鉴定(引物pgpbs-f1/pgpbs-r1)；3：
△
pgsln中pgsln的pcr鉴定(pgsln-f1/pgsln-r1)；4：wt菌株中hygb的pcr鉴定(引物hyg-1/hyg-1)；5：wt菌株中基因的pcr鉴定(引物pgpbs-f1/pgpbs-r1)；6：wt菌株中pgsln的pcr鉴定 (pgsln-f1/pgsln-r1)；7：
△
pgsln-c中hygb的pcr鉴定(引物hyg-1/hyg-1)；8：
△
pgsln-c 中pgpbs基因的pcr鉴定(引物pgpbs-f1/pgpbs-r1)；9：
△
pgsln-c中pgsln的pcr鉴定 (pgsln-f1/pgsln-r1)；10：质粒pbs-hyg-pgsln中hygb的pcr片段(引物hyg-1/hyg-1)； 11：质粒中pgpbs基因的pcr片段(引物pgpbs-f1/pgpbs-r1)；12：质粒中pgsln的pcr鉴定(pgsln-f1/pgsln-r1)；
[0039]
图12：敲除株westernblot验证；
[0040]
其中，m：蛋白marker；1：wt菌株；2：
△
pgsln菌株；3：
△
pgsln-c菌株；4：阳性对照；
[0041]
图13：野生株wt、敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c在不同培养基上的生长；
[0042]
图14：野生株wt、敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c的菌丝显微观察；
[0043]
图15：野生株wt、敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c在不同渗透压培养基生长；
[0044]
图16：野生株wt、敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c在不同抑菌剂培养基生长；
[0045]
图17：野生株wt和干扰株
△
pgsln在不同细胞壁抑制剂培养基生长；
[0046]
图18：野生株及干扰株对大麦叶片的致病性检测；
[0047]
其中，(a)两周大的大麦叶片接种5mm的wt、
△
pgsln和
△
pgsln-c菌株，接种3天后拍照记录。(b)用wt、
△
pgsln和
△
pgsln-c菌株在4℃采用三明治法处理大麦种子30天后栽培，栽培20天后观察拍照叶片。(c)接种wt、
△
pgsln和
△
pgsln-c菌株后大麦的感染率，星号表示野生株和干扰株之间存在显著差异(p≤0.05)。(d)感染了wt、
△
pgsln和
△
pgsln-c 菌株的大麦叶片生长趋势。(e)在野生株wt中pgsln基因在mrna的转录水平，星号表示寄生状态和非寄生状态下存在显著差异(p≤0.05)。
[0048]
图19：pgsln基因cdna和dna序列比对。
具体实施方式
[0049]
为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
[0050]
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
[0051]
实施例1
[0052]
本实施例提供一种大麦条纹病致病性基因pgsln，该基因全长序列如序列表seq id no:1 和图1和图19所示。
[0053]
实施例2
[0054]
本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgsln基因克隆及其基因功能验证方法，包括如下步骤：
[0055]
1、pgsln基因克隆及序列分析
[0056]
对大麦条纹病wt菌株进行单孢分离，菌丝平板培养在pda培养基，培养温度 23-25
℃，菌丝液体培养在pd培养基，23-25℃，180rpm。培养菌丝用于dna提取、rna 提取和原生质体制备。将酿酒酵母sln(genbank id：np edv09625)的序列与大麦条纹病 wt基因组测序(待公布)结果进行同源比对，发现sln的同源序列，将其命名为pgsln，对 pgsln基因序列进行同源克隆，pcr扩增分别以cdna和dna为模板，以引物对 pgsln-f1/pgsln-r1(见表1)为引物扩增目的片段，pcr扩增获得的产物经纯化后连接 pmd19-t vector(takara biotech)，送公司测序。采用smart软件 (http://smart.embl-heidelberg.de/)和cdart(conserved domain architecture retrieval tool)程序对pgsln蛋白进行结构域预测。
[0057]
表1 pgsln基因克隆及功能研究用到的引物
[0058]
100μg/ml的pda平板。连续转3-5代，生长状况稳定的菌落进行后续pcr检测。
[0065]
回补载体的遗传转化，在1.5ml的离心管悬浮新鲜制备的敲除菌株原生质体(1
×
108个 /ml)100μl于stc buffer中，并混合1-10μg的质粒pcmbia1300-zeo-pgsln，置于新制的碎冰15-20min，然后向悬浮物离心管加入100μl ptc buffer温柔混匀，混合液置于新制的碎冰15-20min，然后加入800μl ptc buffer，混合液室温放置10-15min。用玻璃涂布器将原生质体转化混合液(500μl/plate)涂布在含有15ml的再生培养基平板上，将再生平板置于25℃培养48h，向再生平板上铺盖一层10ml的含有70μg/ml博来霉素(zeocin)的pda培养基，23-25℃继续培养2-3天直到长出再生菌落。再生单菌落转接到博来霉素浓度为100μg/ml 的pda平板。连续转3代，生长状况稳定的菌落进行后续pcr检测。
[0066]
4、转化株pcr及western blot验证
[0067]
为了确认转基因株及回补株，以野生株为对照，提取rna，使用特异性引物对 hyg-1/hyg-2对转基因株进行pcr扩增验证，使用特异引物对pgpbs-f1/pgpbs-r1对下游基因 pgpbs进行pcr扩增验证，使用特异引物对pgsln-f1/pgsln-r1对敲除基因pgsln进行pcr扩增验证(表1)。
[0068]
采用western blot方法检测pgsln基因，将pgsln基因连接表达载体pet32a，诱导表达 pgsln蛋白，ni-nta his resin柱纯化，收集蛋白液经sds-page电泳分析，纯化蛋白免疫小鼠获得一抗。以小鼠抗重组pgsln的血清为一抗，以羊抗鼠igg(bioss，中国)为二抗，使用免疫联合化学发光检测(bio-star,hercules，ca)。
[0069]
5、菌丝生长实验
[0070]
从培养5-8d的野生株wt、敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c菌丝pda平板菌落边缘取直径3-5mm的菌栓，接种到培养平板，23-25℃黑暗培养7-10d，测定菌落直径，计算生长速度，并拍照观察菌落形态。培养平板包括：
[0071]
完全培养基[cm：10g葡萄糖，2g蛋白胨，1g酵母提取物，1.8g硝酸钾，1ml微量元素(母液：0.166g/l的碘化钾、1.24g/l的硼酸、4.46g/l的四水硫酸锰、1.72g的七水硫酸锌、 0.05g/l的二水钼酸钠、0.005g/l的五水硫酸铜、0.005g/l的六水氯化钴)，15g的琼脂，蒸馏水定容到1l]。基本培养基(mm：10g葡萄糖，6g硝酸钠，0.52g的氯化钾，0.15g硫酸镁，1.52g磷酸二氢钾，0.01g硫胺素，1ml微量元素，15g琼脂，蒸馏水定容到1l)。大麦琼脂培养基(bm：50g大麦在1l蒸馏水煮沸1小时，4层纱布过滤，琼脂15克)。v8琼脂培养基(100ml的v8果汁，0.2克碳酸钙，15g琼脂，蒸馏水定容到1l)。pda培养基 (马铃薯200g，煮汁过滤，加葡萄糖20g，15g琼脂，蒸馏水定容到1l)。
[0072]
从培养5d的野生株wt、敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c菌丝培养平板菌落边缘取直径5mm的菌栓，接种到大麦叶片(ganpi-5)上，25℃黑暗培养3天后，观察叶片的致病状况。
[0073]
6、渗透压敏感性及抑菌剂耐受性实验
[0074]
从培养5-7d的野生株wt、敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c菌丝pda培养平板菌落边缘取直径3-5mm的菌栓，接种到处理平板培养，以pda平板菌落为对照，23-25℃黑暗培养 7-10d后，测定菌落直径，计算生长相对生长率，菌丝的相对生长速率用gr表示，gr ＝[(n-0.196))/(c-0.196)]
×
100(0.196＝3.14
×
0.252)，c是野生株wt、敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c菌落在对照pda培养基上的面积，n为菌落在处理培养基上生长的面积，
0.196 为接菌5mm菌栓的面积。每组处理均进行3次生物学重复，t检验结果差异有统计学意义。并拍照观察菌落形态。处理培养平板以pda为基础，分别包括：
[0075]
h2o2培养基：h2o
2 5mm，马铃薯200g，煮汁过滤，加葡萄糖20g，15g琼脂，蒸馏水定容到1l。nacl培养基：nacl 1m，马铃薯200g，煮汁过滤，加葡萄糖20g，15g琼脂，蒸馏水定容到1l。cocl2培养基：cocl
2 0.5mm，马铃薯200g，煮汁过滤，加葡萄糖20g，15g琼脂，蒸馏水定容到1l。山梨醇培养基：山梨醇1m，马铃薯200g，煮汁过滤，加葡萄糖20g，15g琼脂，蒸馏水定容到1l。异丙脲培养基：异丙脲0.5μg/ml，马铃薯200g，煮汁过滤，加葡萄糖20g，15g琼脂，蒸馏水定容到1l。戊唑醇培养基：戊唑醇1.0μg/ml，马铃薯200g，煮汁过滤，加葡萄糖20g，15g琼脂，蒸馏水定容到1l。
[0076]
7、细胞壁完整性实验
[0077]
从培养5-7d的野生株wt、敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c菌丝pda培养平板菌落边缘取直径3-5mm的菌栓，接种到处理培养平板，以pda平板为对照，23-25℃黑暗培养 7-10d后，测定菌落直径，计算生长相对生长率，菌丝的相对生长速率用gr表示，gr ＝[(n-0.196)/(c-0.196)]
×
100(0.196＝3.14
×
0.252)，c是野生株wt、敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c菌落在对照pda培养基上的面积，n为菌落在处理培养基上生长的面积，0.196 为接菌5mm菌栓的面积。每组处理均进行3次生物学重复，t检验结果差异有统计学意义。并拍照观察菌落形态。处理培养平板以pda为基础，分别包括：
[0078]
cr培养基：100μg/ml刚果红，马铃薯200g，煮汁过滤，加葡萄糖20g，15g琼脂，蒸馏水定容到1l。sds培养基：0.01％sds，马铃薯200g，煮汁过滤，加葡萄糖20g，15g 琼脂，蒸馏水定容到1l。cfw培养基：200μg/ml cfw，马铃薯200g，煮汁过滤，加葡萄糖20g，15g琼脂，蒸馏水定容到1l。
[0079]
8、致病性实验
[0080]
选取大麦(ganpi 5)两叶期的叶片接菌进行致病性实验，接种野生株wt、敲除株
△
pgsln 和回补株
△
pgsln-c菌栓(直径3-5mm)。3-5d后观察对大麦叶片的感染情况，接种量为每片大麦叶片接种一个菌栓。接种菌栓的大麦叶片在23-25℃，16/8h的光/暗周期培养3-5d后观察叶片生长情况。
[0081]
采用qrt-pcr方法比较接种3-5d后野生株在大麦叶上的寄生(接种菌栓)和在pda平板上的非寄生(接种菌栓)阶段的pgsln表达情况。将野生株、敲除株和回补株长满菌丝的 pda平板，采用三明治法在4℃处理大麦种子(ganpi 5)25-30d，将处理后的大麦种子播种 20-25d后观察其生长情况。每种菌株处理3次，50株组成1个试验重复。
[0082]
所有的统计分析都使用spss软件(version 19.0，ibm corp，armonk，ny)。结果采用 t检验和duncan检验进行分析。
[0083]
实施例3
[0084]
本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgsln基因在调控菌丝生长速率中的应用，该应用的验证包括如下步骤：
[0085]
1、pgsln基因克隆及序列分析
[0086]
对大麦条纹病wt菌株进行单孢分离，菌丝平板培养在pda培养基，培养温度23℃，菌丝液体培养在pd培养基，23℃，180rpm。培养菌丝用于dna提取、rna提取和原生质体制备。将酿酒酵母sln(genbank id：np edv09625)的序列与大麦条纹病wt基因组测序结果进行同
源比对，发现sln的同源序列，将其命名为pgsln，对pgsln基因序列进行同源克隆，pcr扩增分别以cdna和dna为模板，以引物对pgsln-f1/pgsln-r1(见表1)为引物扩增目的片段，pcr扩增获得的产物经纯化后连接pmd19-t vector(takara biotech)，送公司测序，得出pgsln是长度为3634bp的基因，3531bp的cdna(图4)。采用smart软件 (http://smart.embl-heidelberg.de/)和cdart(conserved domain architecture retrieval tool)程序对pgsln蛋白进行结构域预测，得到序列包含53bp和49bp两个内含子，分别于核苷酸 88-140bp和3284-3332bp的位置，pgsln编码1177个氨基酸的蛋白质。pgsln序列与 alternaria alternata(owy52086)，stemphylium lycopersici(kng48819)，periconiamacrospinosa(pvi08300.1)，exophiala dermatitidis(xp_009156732.1)和s.cerevisiae的同源性为87％，83％，69％，50％和47％(图5)。系统发育分析结果显示，p.graminea和a.alternate 聚在一起(图6)。cdart(conserved domain architecture retrieval tool)程序(geer et al.2002) 预测了pgsln中保守的组氨酸激酶a结构域(hiska domain)(542-607aa)、类组氨酸激酶 atp水解酶位点结构域(hatpase-c domain)(680-869aa)、chey同源的受体结构域 (chey-homologous receiver，rec domain)(983-1100aa)，9-31具跨膜结构域(图7和图8)。因此克隆到了大麦条纹病病原菌hpk基因pgsln。
[0087]
2、大麦条纹病菌pgsln基因的敲除载体及回补载体的构建
[0088]
按照pgsln的敲除载体构建图(图2)，通过酶切和连接构建了pbs-hyg-pgsln载体，依据pbs-hyg-pgsln载体上的限制性位点对其进行pcr和酶切分析，以pgsln-sacⅰ/pgsln-smaⅰ为引物，以pbs-hyg-pgsln载体质粒为模板，进行上臂pcr验证，获得了1086bp左右特异条带(图9，泳道1下面箭头所示)，同时该质粒经smaⅰ/sac i酶切在1086bp左右处出现了特异条带(图9，泳道2下面箭头所示)，以pgsln-hindⅲ/pgsln-xhoi为引物，以pbs-hyg-pgsln 载体质粒为模板，对下臂进行pcr验证，获得了745bp左右特异条带(图9，泳道3下面箭头所示)，同时该质粒经hindⅲ/xhoⅰ酶切，在745bp左右处出现了相同的特异条带(图9，泳道4下面箭头所示)，上下臂片段的pcr和酶切结果均与预期片段大小相符。
[0089]
按照pgsln的回补载体构建(图3)，采用同源重组一步克隆法构建基因pgsln的回补载体 pcmbia1300-zeo-pgsln，用引物对r-pgsln-zeo1/r-pgsln-zeo2、r-pgsln-p1/r-pgsln-p2和 r-pgsln-1/r-pgsln-2进行pcr验证，分别获得834bp和3634bp的特异性片段(图10)。
[0090]
3、敲除株的获得
[0091]
将构建好的敲除载体pbs-hyg-pgsln转化大麦条纹病菌原生质体，从501个转化子中筛选到1个pgsln敲除突变体，以敲除株、野生株和互补株的dna为模板，利用引物对 hyg-1/hyg-1、pgpbs-f1/pgpbs-r1和pgsln-f1/pgsln-r1分别进行pcr扩增；在突变株
△
pgsln 扩增获得了hgyb基因1000bp的条带和pgpbs基因2355bp的条带，无法扩增获得pgsln基因的条带；在野生株wt扩增获得了pgsln基因3634bp的条带和pgpbs基因2355bp的条带，无法扩增获得hgyb基因的条带；在互补株
△
pgsln-c同时扩增获得了pgsln基、pgpbs基因和 hgyb基因的条带(图11)。
[0092]
进一步进行western blot验证。表达结果如图12所示，野生株wt和互补株
△
pgsln-c均可获得128kd的杂交条带，而基因敲除株
△
pgsln没有目标条带，以上结果证实了本研究已经获得了pgsln的基因敲除株。
[0093]
4、
△
pgsln的互补
[0094]
为了确认菌丝的表现型缺陷是由pgsln引起的，进行回补实验，用构建好的回补载体转化敲除株
△
pgsln原生质体，得到的转化子在含有50μg/ml的博来霉素(zeoin)和100μg/ml 的卡纳霉素平板筛选，得到表型恢复突变株
△
pgsln-c，提取dna，用引物对hyg-1/hyg-1、 pgpbs-f1/pgpbs-r1和pgsln-f1/pgsln-r1分别进行pcr扩增验证(图11)和western blot验证 (图12)，pcr扩增回补株获得pgsln基因、pgpbs基因和hgyb基因的特异条带；western blot 验证互补株
△
pgsln-c获得128kd的杂交条带。
[0095]
5、pgsln与大麦条纹病菌菌丝营养生长的关系
[0096]
为了确定pgsln基因的敲除显著影响了大麦条纹病的营养生长，将敲除株与野生株分别置于不同的培养基进行培养，发现与野生株相比，pgsln敲除株
△
pgsln在pda，cm，bm， v8和mm培养基上有较慢的生长速度，在pda，cm，bm，v8和mm培养基上生长速度分别为：
△
pgsln：7.3，7.1，7.7，6.9和5.3mm/d；
△
pgsln-c：10.2，10.3，8.9，9.1和8.4mm/d； wt：10.4，9.5，9.3，8.9和9.3mm/d(图13；表2)，
△
pgsln与
△
pgsln-c和野生株wt间存在显著差异(p≤0.01)。通过显微观察发现，wt与
△
pgsln-c菌丝分叉较少，菌丝平滑，
△ꢀ
pgsln的菌丝分叉十分密集而且菌丝有畸变(图14)。以上结果说明，pgsln和大麦条纹病菌丝的生长及发育相关。
[0097]
表2 菌丝在不同培养基上的生长率
[0098][0099]
实施例4
[0100]
本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgsln基因在调节渗透压及真菌抑制剂敏感性方面的应用，该应用的验证包括如下步骤：
[0101]
1、pgsln基因克隆及序列分析
[0102]
对大麦条纹病wt菌株进行单孢分离，菌丝平板培养在pda培养基，培养温度25℃，菌丝液体培养在pd培养基，24℃，180rpm。培养菌丝用于dna提取、rna提取和原生质体制备。将酿酒酵母sln(genbank id：np edv09625)的序列与大麦条纹病wt基因组测序结果进行同源比对，发现sln的同源序列，将其命名为pgsln，对pgsln基因序列进行同源克隆，pcr扩增分别以cdna和dna为模板，以引物对pgsln-f1/pgsln-r1(见表1)为引物扩增目的片段，pcr扩增获得的产物经纯化后连接pmd19-t vector(takara biotech)，送公司测序，得出pgsln是长度为3634bp的基因，3531bp的cdna(图4)。采用smart软件 (http://smart.embl-heidelberg.de/)和cdart(conserved domain architecture retrieval tool)程序对pgsln蛋白进行结构域预测，得到序列包含53bp和49bp两个内含子，分别于核苷酸 88-140bp和3284-3332bp的位置，pgsln编码1177个氨基酸的蛋白质。pgsln序列与 alternaria alternata(owy52086)，stemphylium lycopersici(kng48819)，periconiamacrospinosa
(pvi08300.1)，exophiala dermatitidis(xp_009156732.1)和s.cerevisiae的同源性为87％，83％，69％，50％和47％(图5)。系统发育分析结果显示，p.graminea和a.alternate 聚在一起(图6)。cdart(conserved domain architecture retrieval tool)程序(geer et al.2002) 预测了pgsln中保守的组氨酸激酶a结构域(hiska domain)(542-607aa)、类组氨酸激酶 atp水解酶位点结构域(hatpase-c domain)(680-869aa)、chey同源的受体结构域 (chey-homologous receiver，rec domain)(983-1100aa)，9-31具跨膜结构域(图7和图8)。因此克隆到了大麦条纹病病原菌hpk基因pgsln。
[0103]
2、大麦条纹病菌pgsln基因的敲除载体及回补载体的构建
[0104]
按照pgsln的敲除载体构建图(图2)，通过酶切和连接构建了pbs-hyg-pgsln载体，依据pbs-hyg-pgsln载体上的限制性位点对其进行pcr和酶切分析，以pgsln-sacⅰ/pgsln-smaⅰ为引物，以pbs-hyg-pgsln载体质粒为模板，进行上臂pcr验证，获得了1086bp左右特异条带(图9，泳道1下面箭头所示)，同时该质粒经smaⅰ/sac i酶切在1086bp左右处出现了特异条带(图9，泳道2下面箭头所示)，以pgsln-hindⅲ/pgsln-xhoi为引物，以pbs-hyg-pgsln 载体质粒为模板，对下臂进行pcr验证，获得了745bp左右特异条带(图9，泳道3下面箭头所示)，同时该质粒经hindⅲ/xhoⅰ酶切，在745bp左右处出现了相同的特异条带(图9，泳道4下面箭头所示)，上下臂片段的pcr和酶切结果均与预期片段大小相符。
[0105]
按照pgsln的回补载体构建(图3)，采用同源重组一步克隆法构建基因pgsln的回补载体 pcmbia1300-zeo-pgsln，用引物对r-pgsln-zeo1/r-pgsln-zeo2、r-pgsln-p1/r-pgsln-p2和 r-pgsln-1/r-pgsln-2进行pcr验证，分别获得834bp和3634bp的特异性片段(图10)。
[0106]
3、敲除株的获得
[0107]
将构建好的敲除载体pbs-hyg-pgsln转化大麦条纹病菌原生质体，从501个转化子中筛选到1个pgsln敲除突变体，以敲除株、野生株和互补株的dna为模板，利用引物对hyg-1/hyg-1、pgpbs-f1/pgpbs-r1和pgsln-f1/pgsln-r1分别进行pcr扩增；在突变株
△
pgsln 扩增获得了hgyb基因1000bp的条带和pgpbs基因2355bp的条带，无法扩增获得pgsln基因的条带；在野生株wt扩增获得了pgsln基因3634bp的条带和pgpbs基因2355bp的条带，无法扩增获得hgyb基因的条带；在互补株
△
pgsln-c同时扩增获得了pgsln基、pgpbs基因和 hgyb基因的条带(图11)。
[0108]
进一步进行western blot验证。表达结果如图12所示，野生株wt和互补株
△
pgsln-c均可获得128kd的杂交条带，而基因敲除株
△
pgsln没有目标条带，以上结果证实了本研究已经获得了pgsln的基因敲除株。
[0109]
4、
△
pgsln的互补
[0110]
为了确认菌丝的表现型缺陷是由pgsln引起的，进行回补实验，用构建好的回补载体转化敲除株
△
pgsln原生质体，得到的转化子在含有50μg/ml的博来霉素(zeoin)和100μg/ml 的卡纳霉素平板筛选，得到表型恢复突变株
△
pgsln-c，提取dna，用引物对hyg-1/hyg-1、 pgpbs-f1/pgpbs-r1和pgsln-f1/pgsln-r1分别进行pcr扩增验证(图11)和western blot验证 (图12)，pcr扩增回补株获得pgsln基因、pgpbs基因和hgyb基因的特异条带；western blot 验证互补株
△
pgsln-c获得128kd的杂交条带。
[0111]
5、pgsln基因与渗透压及真菌抑制剂敏感性的相关性
[0112]
为检测pgsln基因在适应渗透压及真菌抑制剂的相关性，野生株、敲除株和回补株(wt，
△
pgsln和
△
pgsln-c)菌株在以下培养基培养：离子胁迫(na
+
)，氧化胁迫(h2o2)，重金属胁迫(cocl2)，渗透压胁迫(山梨醇，甘油)和真菌抑制剂胁迫(二甲酰亚胺类真菌抑制剂异丙脲、三唑类真菌抑制剂戊唑醇、苯并咪唑多菌灵、苯并二氧杂环戊烯咯菌腈和咪鲜胺)。在重金属胁迫(cocl2)下野生株wt，敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c径向生长速度是9.0， 4.3和10.5mm/d，相对生长率百分比为74.9，34.3和73％，与野生株和回补株相比，敲除株
△
pgsln的相对生长率百分比显著下降(p≤0.05)；在渗透压胁迫(甘油)下野生株wt，敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c径向生长率是8.6，6.5和8.5mm/d，相对生长率百分比为66.1， 80.5和71.5％，与野生株和回补株相比，敲除株
△
pgsln的相对生长率百分比显著下降(p≤ 0.05)；在氧化胁迫(h2o2)、离子胁迫(na
+
)和渗透压胁迫(山梨醇)下没有显著差异(图 15，表3)。以上结果说明pgsln基因与渗透压胁迫(甘油)和重金属胁迫(cocl2)相关。
[0113]
表3 野生株wt、敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c在不同胁迫培养基上的生长率
[0114][0115]
发现
△
pgsln在异菌脲、多菌灵和咯菌腈的径向生长率为5.5，5.3和2.7mm/d，
△
pgsln-c 在异菌脲、多菌灵和咯菌腈的径向生长率为7.4，6.8和2.9mm/d，野生株wt在异菌脲、多菌灵和咯菌腈的径向生长率为6.2，6.3和2.9mm/d，敲除株
△
pgsln在异丙脲平板的相对生长率百分比为51.6％，显著高于野生株wt和回补株
△
pgsln-c在异丙脲平板的相对生长率百分比(37.5％和38.3％)(p≤0.05)；敲除株
△
pgsln在多菌灵平板的相对生长率百分比为49.3％，显著高于野生株wt和回补株
△
pgsln-c在多菌灵平板的生长率百分比(38.4％和39.6％)(p≤ 0.05)；敲除株
△
pgsln在咯菌腈平板的生长率百分比为11.7％，显著高于野生株wt和回补株
△
pgsln-c在咯菌腈平板的生长率百分比(8.0％和8.5％)(p≤0.05)(图16，4)。以上结果说明pgsln基因突变株加强了大麦条纹病菌对异菌脲、多菌灵和咯菌腈的耐受性。
[0116]
表4 野生株wt、敲除株
△
pgsln和回补株
△
pgsln-c在不同抑菌剂培养基上的生长速度
[0117][0118]
实施例5
[0119]
本实施例提供一种大麦条纹病致病基因pgsln基因在参与细胞壁完整性的应用，该应用的验证包括如下步骤：
[0120]
1、pgsln基因克隆及序列分析
[0121]
对大麦条纹病wt菌株进行单孢分离，菌丝平板培养在pda培养基，培养温度23℃，
菌丝液体培养在pd培养基，25℃，180rpm。培养菌丝用于dna提取、rna提取和原生质体制备。将酿酒酵母sln(genbank id：np edv09625)的序列与大麦条纹病wt基因组测序 (待公布)结果进行同源比对，发现sln的同源序列，将其命名为pgsln，对pgsln基因序列进行同源克隆，pcr扩增分别以cdna和dna为模板，以引物对pgsln-f1/pgsln-r1(见表1) 为引物扩增目的片段，pcr扩增获得的产物经纯化后连接pmd19-t vector(takara biotech)，送公司测序，得出pgsln是长度为3634bp的基因，3531bp的cdna(图4)。采用smart 软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)和cdart(conserved domain architecture retrieval tool) 程序对pgsln蛋白进行结构域预测，得到序列包含53bp和49bp两个内含子，分别于核苷酸88-140bp和3284-3332bp的位置，pgsln编码1177个氨基酸的蛋白质。pgsln序列与 alternaria alternata(owy52086)，stemphylium lycopersici(kng48819)，periconiamacrospinosa(pvi08300.1)，exophiala dermatitidis(xp_009156732.1)和s.cerevisiae的同源性为87％，83％，69％，50％和47％(图5)。系统发育分析结果显示，p.graminea和a.alternate 聚在一起(图6)。cdart(conserved domain architecture retrieval tool)程序(geer et al.2002) 预测了pgsln中保守的组氨酸激酶a结构域(hiska domain)(542-607aa)、类组氨酸激酶 atp水解酶位点结构域(hatpase-c domain)(680-869aa)、chey同源的受体结构域 (chey-homologous receiver，rec domain)(983-1100aa)，9-31具跨膜结构域(图7和图8)。因此克隆到了大麦条纹病病原菌hpk基因pgsln。
[0122]
2、大麦条纹病菌pgsln基因的敲除载体及回补载体的构建
[0123]
按照pgsln的敲除载体构建图(图2)，通过酶切和连接构建了pbs-hyg-pgsln载体，依据pbs-hyg-pgsln载体上的限制性位点对其进行pcr和酶切分析，以pgsln-sacⅰ/pgsln-smaⅰ为引物，以pbs-hyg-pgsln载体质粒为模板，进行上臂pcr验证，获得了1086bp左右特异条带(图9，泳道1下面箭头所示)，同时该质粒经smaⅰ/sac i酶切在1086bp左右处出现了特异条带(图9，泳道2下面箭头所示)，以pgsln-hindⅲ/pgsln-xhoi为引物，以pbs-hyg-pgsln 载体质粒为模板，对下臂进行pcr验证，获得了745bp左右特异条带(图9，泳道3下面箭头所示)，同时该质粒经hindⅲ/xhoⅰ酶切，在745bp左右处出现了相同的特异条带(图9，泳道4下面箭头所示)，上下臂片段的pcr和酶切结果均与预期片段大小相符。
[0124]
按照pgsln的回补载体构建(图3)，采用同源重组一步克隆法构建基因pgsln的回补载体 pcmbia1300-zeo-pgsln，用引物对r-pgsln-zeo1/r-pgsln-zeo2、r-pgsln-p1/r-pgsln-p2和 r-pgsln-1/r-pgsln-2进行pcr验证，分别获得834bp和3634bp的特异性片段(图10)。
[0125]
3、敲除株的获得
[0126]
将构建好的敲除载体pbs-hyg-pgsln转化大麦条纹病菌原生质体，从501个转化子中筛选到1个pgsln敲除突变体，以敲除株、野生株和互补株的dna为模板，利用引物对 hyg-1/hyg-1、pgpbs-f1/pgpbs-r1和pgsln-f1/pgsln-r1分别进行pcr扩增；在突变株
△
pgsln 扩增获得了hgyb基因1000bp的条带和pgpbs基因2355bp的条带，无法扩增获得pgsln基因的条带；在野生株wt扩增获得了pgsln基因3634bp的条带和pgpbs基因2355bp的条带，无法扩增获得hgyb基因的条带；在互补株
△
pgsln-c同时扩增获得了pgsln基、pgpbs基因和 hgyb基因的条带(图11)。
[0127]
进一步进行western blot验证。表达结果如图12所示，野生株wt和互补株
△
607aa)、类组氨酸激酶 atp水解酶位点结构域(hatpase-c domain)(680-869aa)、chey同源的受体结构域 (chey-homologous receiver，rec domain)(983-1100aa)，9-31具跨膜结构域(图7和图8)。因此克隆到了大麦条纹病病原菌hpk基因pgsln。
[0136]
2、大麦条纹病菌pgsln基因的敲除载体及回补载体的构建
[0137]
按照pgsln的敲除载体构建图(图2)，通过酶切和连接构建了pbs-hyg-pgsln载体，依据pbs-hyg-pgsln载体上的限制性位点对其进行pcr和酶切分析，以pgsln-sacⅰ/pgsln-smaⅰ为引物，以pbs-hyg-pgsln载体质粒为模板，进行上臂pcr验证，获得了1086bp左右特异条带(图9，泳道1下面箭头所示)，同时该质粒经smaⅰ/sac i酶切在1086bp左右处出现了特异条带(图9，泳道2下面箭头所示)，以pgsln-hindⅲ/pgsln-xhoi为引物，以pbs-hyg-pgsln 载体质粒为模板，对下臂进行pcr验证，获得了745bp左右特异条带(图9，泳道3下面箭头所示)，同时该质粒经hindⅲ/xhoⅰ酶切，在745bp左右处出现了相同的特异条带(图9，泳道4下面箭头所示)，上下臂片段的pcr和酶切结果均与预期片段大小相符。
[0138]
按照pgsln的回补载体构建(图3)，采用同源重组一步克隆法构建基因pgsln的回补载体 pcmbia1300-zeo-pgsln，用引物对r-pgsln-zeo1/r-pgsln-zeo2、r-pgsln-p1/r-pgsln-p2和r-pgsln-1/r-pgsln-2进行pcr验证，分别获得834bp和3634bp的特异性片段(图10)。
[0139]
3、敲除株的获得
[0140]
将构建好的敲除载体pbs-hyg-pgsln转化大麦条纹病菌原生质体，从501个转化子中筛选到1个pgsln敲除突变体，以敲除株、野生株和互补株的dna为模板，利用引物对 hyg-1/hyg-1、pgpbs-f1/pgpbs-r1和pgsln-f1/pgsln-r1分别进行pcr扩增；在突变株
△
pgsln 扩增获得了hgyb基因1000bp的条带和pgpbs基因2355bp的条带，无法扩增获得pgsln基因的条带；在野生株wt扩增获得了pgsln基因3634bp的条带和pgpbs基因2355bp的条带，无法扩增获得hgyb基因的条带；在互补株
△
pgsln-c同时扩增获得了pgsln基、pgpbs基因和 hgyb基因的条带(图11)。
[0141]
进一步进行western blot验证。表达结果如图12所示，野生株wt和互补株
△
pgsln-c均可获得128kd的杂交条带，而基因敲除株
△
pgsln没有目标条带，以上结果证实了本研究已经获得了pgsln的基因敲除株。
[0142]
4、
△
pgsln的互补
[0143]
为了确认菌丝的表现型缺陷是由pgsln引起的，进行回补实验，用构建好的回补载体转化敲除株
△
pgsln原生质体，得到的转化子在含有50μg/ml的博来霉素(zeoin)和100μg/ml 的卡纳霉素平板筛选，得到表型恢复突变株
△
pgsln-c，提取dna，用引物对hyg-1/hyg-1、 pgpbs-f1/pgpbs-r1和pgsln-f1/pgsln-r1分别进行pcr扩增验证(图11)和western blot验证 (图12)，pcr扩增回补株获得pgsln基因、pgpbs基因和hgyb基因的特异条带；western blot 验证互补株
△
pgsln-c获得128kd的杂交条带。
[0144]
5、pgsln基因与大麦条纹病菌致病性的相关性
[0145]
为了评价pgsln的致病性，进一步将野生株wt、敲除株
△
pgsln及回补株
△
pgsln-c的接种pda平板生长7天，取平板边缘的菌栓接种大麦(ganpi 5)二叶期的叶片。接种wt 和
△
pgsln-c菌株的大麦叶片呈现明显感染的症状，出现如叶子变黄和黄褐色病斑。对应的接种敲除株
△
pgsln菌株的大麦叶片症状较少，没有形成完整的病斑(图18-a)。将大麦种子
ganpi5号采用三明治法接种野生株wt、敲除株
△
pgsln及回补株
△
pgsln-c菌株30天，播种20 天后观察大麦生长趋势(图18-d)，由图可见，感染野生株wt及回补株
△
pgsln-c的大麦植株矮小、生长较弱、部分叶片表现出条纹叶表(图18-b)，感染
△
pgsln菌株的大麦植株较高，生长较强壮，大麦叶片条纹病的发病率
△
pgsln(1％)显著低于wt(20.1％)和
△
pgsln-c(18.3％) (p≤0.05)(图18-c)。因此，敲除株
△
pgsln的致病性比野生株wt和回补株
△
pgsln-c弱。本研究发现，与非寄生期相比，wt寄生期pgsln转录水平显著降低(p≤0.01)，寄生菌株pgsln 相对表达量为非寄生期的23.7％(图18-e)。这个结果表明，pgsln不直接参与发病机制。致病性降低可能是菌丝分叉增多，生长速度缓慢及菌丝畸形生长竞争力弱综合的结果。
[0146]
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

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