碱性蛋白酶低温突变体及其在污泥处理中的应用的制作方法

[0001]
本申请属于蛋白领域和环保领域，具体地，本发明提供了碱性蛋白酶pb92的低温突变体spl-12、spl-17，其氨基酸序列为seq id no.1-3；相比亲本酶，spl-12、spl-17提供了改善的稳定性和低温性能，适用于碱性污泥产酸处理过程。


背景技术：

[0002]
污水处理的常用方法均包括将水中污染物、有机物、微生物等转移到污泥中以洁净水体的步骤，因此富含污染物、有机物、微生物的污泥的处理便成为了污水处理中的最关键和最根本的步骤，其处理成本占到污水处理成本的一半以上，也是污染排放达标的根本。
[0003]
目前常用的污泥处理方式为填埋、自然干化、高温焚烧等，这些方法不仅有较高的二次污染风险，而且土地、燃料等成本也日益成为处理企业和政府的负担。为降低污泥处理的成分以及提高处理的可持续性，污泥的资源化是必然的选择，欧洲发达国家中污泥厌氧发酵处理占污泥处理总量的50％左右。
[0004]
无论是以甲烷为产品的厌氧发酵还是以有机酸为产品的厌氧发酵，多需要水解以破解微生物细胞和胞外聚合物以提高厌氧发酵速率和效率，目前可用的酶包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶等(dai xh et al.simultaneous enhancement of methaneproduction and methane content in biogas from waste activated sludge and perennial ryegrass anaerobic co-digestion:the effects of ph and c/n ratio，bioresource technology，2016，216：323-330)。其中的蛋白酶是破坏污泥中的团聚物的主要作用酶，对破坏细胞也有作用。目前污泥处理中可使用的蛋白酶多为中性和酸性蛋白酶，对于呈碱性的污泥，如印染企业和某些有色金属冶炼加工企业的污泥以及经过碱处理的污泥效果不佳。


技术实现要素：

[0005]
为解决上述问题，申请人尝试使用了常见的pb92碱性蛋白酶处理污泥，发现蛋白溶出效果和产酸效果均不理想，推测原因是pb92的稳定性不佳造成作用时间超过2小时后酶活降低。随后申请人通过易错pcr的方法筛选pb92的稳定性变体，特别是低温稳定性改善变体，获得的spl-12、spl-17在此方面有明显的改善，用于污泥溶解时蛋白溶出效果和产酸量都有明显提高。
[0006]
一方面，本申请提供了一种碱性丝氨酸蛋白酶变体，其在氨基酸序列为seq id no.1的碱性丝氨酸蛋白酶基础上引入了选自s76d、p129e、s130k、g260h、s130a、a166d的突变。
[0007]
进一步地，所述变体的稳定性提高。
[0008]
进一步地，突变为s76d、p129e、s130k和g260h组成的组，或者p129e、s130a和a166d组成的组。
[0009]
进一步地，变体的氨基酸序列为seq id no.2。
[0010]
进一步地，变体的氨基酸序列为seq id no.3。
[0011]
另一方面，本申请提供了上述变体在污泥处理中的应用。
[0012]
进一步地，所述污泥为碱性污泥。
[0013]
进一步地，所述污泥处理为发酵产酸。
[0014]
进一步地，所述变体处理污泥促进蛋白和多糖的溶出。
[0015]
本申请中的变体可以通过本领域公知的分子生物学和发酵工程方法生产，使用的宿主菌可以为分子生物学和发酵工程中的常用种类，包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌。
[0016]
本申请中的污泥可以为含蛋白和多糖的工业污泥，生活污泥，农业污泥等，特别优选呈碱性的污泥，包括但不限于印染厂污泥，有色金属冶炼厂污泥，以及经过碱处理的生活污泥。
[0017]
本申请中的发酵产酸产品包括但不限于乙酸、丙酸、丁酸、戊酸及其衍生物。
[0018]
本申请中的发酵产酸所用菌种可以来自发酵效果好的污泥接种，也可以按照本领域对发酵菌株的研究，以纯培养菌株配制。
附图说明
[0019]
图1为亲本pb32、spl-12、spl-17的酶活-ph曲线图；
[0020]
图2为亲本pb32、spl-12、spl-17的酶活-温度曲线图。
具体实施方式
[0021]
主要试剂和仪器
[0022]
福林试剂由上海联迈生物工程有限公司生产；
[0023]
分光光度计754n由上海仪电分析仪器有限公司生产；
[0024]
易错pcr试剂盒genemorph ii random mutagenesis kit由安捷伦生产；
[0025]
bca蛋白浓度检测试剂盒由solarbio生产；
[0026]
浓硫酸-苯酚检测糖浓度试剂盒由深圳子科生物科技有限公司生产；
[0027]
基因工程菌和载体为申请人所在实验室自保存；
[0028]
溶菌酶购自北京夏盛生物科技有限公司(标注40000u/mg，最适ph 6.5)；
[0029]
纤维素酶购自河南铭之鑫化工产品有限公司(标注100u/mg，最适ph 6.0)。
[0030]
实施例3所用污泥采集自东莞某镇工业园区污水处理厂二沉池(除少量写字楼办公/生活污水外，该污水处理厂的主要污水来源为临近三家印染企业)，基本指标为：tss13.2-14.8g/l、vss 10.9-12.2g/l、scod 0.16-0.18g/l(消解法)，ph为8.4-8.9；
[0031]
其他试剂和仪器均为常规国产种类。
[0032]
蛋白酶活性测定方法：
[0033]
使用福林法测定：在系列管中加入2ml所需ph的硼酸缓冲液配制的100ug/ml酵素溶液；将管在所需温度下保温5min；加入酶液1ml，混合后静置反应10min；加入3ml0.4m三氯乙酸终止；取上清液1ml加入福林试剂1ml，0.4m na2co
3 5ml，混合置于40摄氏度下显色20min；测定od660nm；构建标准曲线并基于此测定酶活。
[0034]
污泥溶解实验方法：
[0035]
将所用污泥样本和酶加入500ml烧瓶中，充氮气后密封；30摄氏度下100rpm摇动，按时取样分析；10000g离心10分钟后，将所得上清用于检测cod、溶解蛋白、溶解多糖等参数。
[0036]
溶解蛋白测定
[0037]
使用二喹啉甲酸法检测，具体过程参照如上试剂盒的说明书进行。
[0038]
溶解多糖测定
[0039]
使用浓硫酸-苯酚法检测，具体过程参照如上试剂盒的说明书进行。
[0040]
实施例1突变体获取过程
[0041]
易错pcr和突变酶文库构建
[0042]
本申请所用的亲本蛋白为上世纪90年代初从嗜碱性芽孢杆菌中分离的碱性丝氨酸蛋白酶pb92(seq id no.1)，其以高ph值下的高活性为最显著特征，产品相关专利由诺维信及其关联公司申请，目前已过期，pb92序列、基本性质和研究方法可以从ncbi，相关专利和非专利文献获得。
[0043]
参照现有技术(如cloning,characterization,and multiple chromosomal integration of a bacillus alkaline protease gene，applied and environmental microbiology，1991，vol.57，no.4)合成pb92基因序列；转化至大肠杆菌；培养后取单菌落质粒测序验证；含正确序列的质粒为模板，进行多轮易错pcr(安捷伦genemorph ii random mutagenesis kit)。
[0044]
将易错pcr产物连接于载体pet32a上；转化至bl21(de3)大肠杆菌；筛选阳性克隆构成突变酶文库；将所构建文库中的阳性克隆到培养板上诱导培养96小时，取上清测定ph 8.0和50摄氏度下蛋白酶活性、ph 8.0和30摄氏度下蛋白酶活性，置于30摄氏度下3小时后，ph 8.0和30摄氏度下蛋白酶活性。
[0045]
突变体的筛选、表达和测序
[0046]
主要考虑基本活性、低温活性和活性维持时间因素，在总计三轮筛选中得到22个酶活表现符合要求的突变体，进一步实验后选取其中两个进行进一步实用研究。将基因工程菌菌接于装有100ml的lb培养基的摇瓶中，加入100um的iptg诱导培养72小时；离心获得粗酶液、再通过透析、浓缩、gst纯化获得纯化的亲本pb32、spl-12、spl-17；电泳均显示为基本单一条带，分子量约28kda。测序后确定其序列为seq id no.1-3：
[0047]
亲本pb32(seq id no.1)；
[0048]
spl-12(seq id no.2)在亲本基础上引入了s76d、p129e、s130k、g260h；
[0049]
spl-17(seq id no.3)在亲本基础上引入了p129e、s130a、a166d。
[0050]
实施例2spl-12和spl-17相比亲本pb92的性质改善
[0051]
基本酶学性质检测表明：如图1所示，spl-12和spl-17与亲本pb92具有近似的高ph适应性，最适ph在8.0-9.0附近，在ph11.0时，亲本pb92、spl-12和spl-17的残余酶活仍能保持在80％左右；如图2所示，三者最适温度均为40摄氏度，spl-121、spl-17的酶活-温度曲线与亲本pb92相比，低温适应性较好(酶活-温度曲线向低温偏移)。
[0052]
使用ph8.0的pbs将亲本pb92、spl-12和spl-17配制成0.5mg/ml的溶液。保温于30和50摄氏度下，每30分钟/60分钟取样检测酶活性，结果如表1和2所示：
[0053]
表1：spl-12和spl-17与亲本pb92残余酶活-时间对照表(30摄氏度)
[0054]
时间(min)亲本pb92spl-12spl-173075.2％85.2％79.2％6063.3％77.8％66.9％9058.4％68.5％60.4％12050.2％60.1％51.2％15044.5％55.3％44.9％18038.9％50.5％41.3％24027.5％48.8％39.8％30017.3％43.2％26.0％360<5％39.6％17.5％
[0055]
表2：spl-12和spl-17与亲本pb92残余酶活-时间对照表(50摄氏度)
[0056][0057][0058]
结果表明，spl-12和spl-17在较高温度下的稳定性均得到了明显的提高。在污泥处理的一般温度(20-30摄氏度下)，spl-12和spl-17，特别是spl-12的稳定性得到明显延长，6小时后仍能剩余接近40％的酶活，有潜力用于解决污泥处理中酶作用时间短的问题。
[0059]
实施例3使用复合酶制剂的污泥溶解实验
[0060]
配制的复合酶中碱性蛋白酶(亲本pb92/spl-12)、溶菌酶、纤维素酶加入量分别为2
×
106u/g污泥干重、1
×
106u/g污泥干重、1
×
104u/g污泥干重。用于污泥溶解实验，结果如表3和表4所示：
[0061]
表3复合酶制剂的蛋白溶出效果(计算的蛋白含量，mg/l)
[0062][0063]
可见低温下稳定性增强的spl-12相比亲本pb92有效提高了蛋白溶出效果：特别是在2小时后，亲本pb92组的蛋白含量增长缓慢甚至停滞，而spl-12仍然能相当幅度的增长(约30％)。
[0064]
表4复合酶制剂的多糖溶出效果(计算的糖含量，mg/l)
[0065][0066][0067]
糖溶出趋势与蛋白溶出趋势类似，虽然spl-12相比亲本pb92的效果区别不及蛋白溶出实验明显，也可以证明蛋白酶稳定性的改善对多糖的溶出同样有帮助。

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