一种Tks4基因敲除鼠的构建方法与流程

一种tks4基因敲除鼠的构建方法
技术领域
[0001]
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种tks4基因敲除鼠的构建方法。


背景技术：

[0002]
tks4(tyrosine kinase substrate with four sh3 domains)是一种隐性遗传疾病-fths综合征(frank-ter haar syndrome)的致病基因sh3pxd2b(也被称为tks4基因)的蛋白产物，具有1个px结构域、4个sh3结构域。现有研究表明，tks4主要在伪足的形成与运动、肌动蛋白细胞骨架重塑、活性氧物质的产生和脂肪组织发生与分化中发挥作用。tks4基因在小鼠基因组第11号染色体上，大约跨越80.4kb的基因组范围，共包含13个外显子和12个内含子。作为重要的致病因子，现有技术中还未有关于如何敲除tks4基因的报道。


技术实现要素：

[0003]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种tks4基因敲除鼠的构建方法，本发明利用sgrna1和sgrna9对鼠的tks4基因进行敲除，获得了tks4基因敲除鼠。
[0004]
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0005]
本发明提供了一种tks4基因敲除鼠的构建方法，利用sgrna1和sgrna9对鼠的tks4基因进行敲除，获得tks4基因敲除鼠；
[0006]
所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sgrna9的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0007]
优选的，所述sgrna1和sgrna9的质量比为0.5～1.5:0.5～1.5。
[0008]
优选的，所述sgrna1和sgrna9的质量比为1:1。
[0009]
优选的，还包括：将cas9 mrna与sgrna1、sgrna9导入小鼠受精卵细胞核中，获得tks4基因敲除鼠。
[0010]
优选的，所述cas9 mrna的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0011]
优选的，所述cas9 mrna与sgrna1、sgrna9的质量比为1.5～2.5:0.3～0.8:0.3～0.8。
[0012]
优选的，所述cas9 mrna与sgrna1、sgrna9的质量比为2:0.5:0.5。
[0013]
优选的，使用引物对对tks4基因敲除鼠进行鉴定，所述引物对的上下游引物的核苷酸序列分别如seq id no.4和5所示。
[0014]
本发明提供了一种tks4基因敲除鼠的构建方法，利用sgrna1和sgrna9对鼠的tks4基因进行敲除，获得tks4基因敲除鼠；所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sgrna9的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0015]
本发明敲除tks4基因的机理：当cas9 mrna与sgrna1和sgrna9注射到受精卵的细胞核中以后，cas9 mrna会翻译产生cas9蛋白，cas9蛋白分别与sgrna1或sgrna9结合，借助sgrna1或sgrna9的序列特异性，分别靶向结合到tks4基因2号内含子和3号内含子区域，进而在这两个区域形成dna双链的剪切，导致2号内含子和3号内含子之间的3号外显子区域从
11号染色体上缺失，使得tks4蛋白不能正确表达。
附图说明
[0016]
图1为sgrna基因编辑效率的检测；
[0017]
图2为单链sgrna的体外转录及纯化结果；
[0018]
图3为tks4敲除小鼠的基因编辑示意图；
[0019]
图4为f0代小鼠的基因型鉴定结果；
[0020]
图5为f1代小鼠的基因型鉴定结果；
[0021]
图6为tks4基因敲除鼠的敲除效率检测。
具体实施方式
[0022]
本发明提供了一种tks4基因敲除鼠的构建方法，利用sgrna1和sgrna9对鼠的tks4基因进行敲除，获得tks4基因敲除鼠；所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sgrna9的核苷酸序列如seq id no.2所示。在本发明中，所述sgrna1和sgrna9的质量比优选为0.5～1.5:0.5～1.5，更优选为1:1。
[0023]
本发明根据tks4基因(gene id是268396)序列特点，使用http://crispr.mit.edu/网站针对tks4的3号外显子两侧的内含子序列设计sgrna1和sgrna9，用于tks4基因的敲除，所述sgrna1是根据tks4的3号外显子的3
’
端内含子区域设计，所述sgrna9是根据tks4的3号外显子的5
’
端内含子区域设计。本发明选择剪切3号外显子的原因有两个，第一个原因，在选择剪切的外显子时要尽量靠前，这样剪切后达到的敲除效果最明显，第二个原因，剪切的外显子在长度上不能是3的倍数，否则可能导致一个新的读码框产生，这样不能完全达到基因敲除的目的，综合这两个因素，3号外显子是该基因第一个长度不是3的倍数的外显子，所以被选为构建敲除鼠的靶点。在本发明中，所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体如下：
[0024]
ctgttgtaactcgccaatga；
[0025]
所述sgrna9的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体如下：
[0026]
tggtcgtataaagatggtgc。
[0027]
在本发明中，所述tks4基因敲除鼠的构建方法还优选包括：将cas9mrna与sgrna1、sgrna9导入小鼠受精卵细胞核中，获得tks4基因敲除鼠。本发明对鼠的来源还没有特殊限定，采用常规用于基因敲除使用的c57bl/6j小鼠即可，c57bl/6j小鼠通过购买即可。
[0028]
在本发明中，所述cas9 mrna的作用是：在受精卵中翻译为cas9蛋白，之后cas9蛋白在sgrna的引导下剪切基因组dna分子。在本发明中，所述cas9 mrna的核苷酸序列如seq id no.3所示，具体如下：
[0029]
atggacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccg
acctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggaaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagcccca
ccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgactaa。
[0030]
在本发明中，所述cas9 mrna与sgrna1、sgrna9的质量比优选为1.5～2.5:0.3～0.8:0.3～0.8，更优选为2:0.5:0.5。
[0031]
在本发明中，将所述cas9 mrna与sgrna1、sgrna9导入小鼠受精卵后，获得小鼠，优选使用引物对对小鼠进行鉴定，所述引物对的上下游引物的核苷酸序列分别如seq idno.4和5所示，具体如下：
[0032]
seq id no.4：gaagggcattctaacacacctgtca；
[0033]
seq id no.5：cagaggccaaccaagagagagaagc。
[0034]
在本发明中，对获得的小鼠的鼠尾组织利用上述引物对进行pcr扩增，当扩增得到的片段在700～800bp之间时，得到了tks4基因敲除鼠。在本发明中，所述pcr扩增使用的体系包括小鼠鼠尾dna溶液1μl，taq酶0.5μl，dntps 1μl，引物各1μl和buffer 10μl，蒸馏水5.5μl，共20μl体系；所述pcr扩增使用的反应程序包括：94℃2min；98℃10s，67℃30s(-0.7℃/循环)，68℃1kb/min，15个循环；98℃10s，56℃30s，68℃1kb/min，25个循环；68℃10min；4℃保存。
[0035]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0036]
实施例1
[0037]
利用uca
tm
(universal crispractivity assay)方法在体外非细胞体系中检测sgrna1和sgrna9的基因编辑效率，结果见图1。
[0038]
利用该方法检测sgrna1的剪切效率，三次实验的结果分别为25.42％；26.34％和38.08％。利用该方法检测sgrna9的剪切效率，三次实验结果分别为23.36％；22.89％和23.24％
[0039]
对比例1
[0040]
根据tks4的3号外显子的3
’
端内含子区域设计sgrna2-7，序列如下：
[0041]
sgrna2(seq id no.6)：taccatggagccgtccctcc；
[0042]
sgrna3(seq id no.7)：catgcatacagcataggacc；
[0043]
sgrna4(seq id no.8)：caacatgtcgctctgtattc；
[0044]
sgrna5(seq id no.9)：cgtgtgagataccacaaaac；
[0045]
sgrna6(seq id no.10)：gtggctcatgcatacagcat；
[0046]
sgrna7(seq id no.11)：cagagcatacaagaattgag。
[0047]
根据tks4的3号外显子的5
’
端内含子区域设计sgrna8/10-14，序列如下：
[0048]
sgrna8(seq id no.12)：gctctacacccgtgtcacaa；
[0049]
sgrna10(seq id no.13)：tgagaatggtcgtataaaga；
[0050]
sgrna11(seq id no.14)：aaggaggaactgggtcccgg；
[0051]
sgrna12(seq id no.15)：gccagatctgggatgcaaac；
[0052]
sgrna13(seq id no.16)：catttatagggatccaagaa；
[0053]
sgrna14(seq id no.17)：tgttgttgctcatatatgac。
[0054]
采用与实施例1相同的方法检测sgrna的基因编辑效率，结果如图1。
[0055]
不同sgrna介导的剪切效率如表1。
[0056]
表1不同sgrna介导的剪切效率
[0057]
sgrna2sgrna3sgrna4sgrna5sgrna6sgrna724.48％21.8％0.77％5.59％6.59％7.33％22.28％19.07％0.69％6.5％8.76％7.11％35.59％31.75％1.23％8.84％8.7％9.65％sgrna8sgrna10sgrna11sgrna12sgrna13sgrna1410.09％12.33％16.97％5.94％6.67％22.7％9.76％13.38％18.41％6.13％7.99％23.4％10.17％14.85％19.87％6.57％8.42％23.9％
[0058]
根据实施例1和对比例可以得出，sgrna1和sgrna9分别在tks4的3号外显子的3
’
端和5
’
端具有最高的dna剪切效率，因此选择sgrna1和sgrna9来敲除tks4基因。sgrna1和sgrna9分别通过体外转录的方式，获得纯化的单链sgrna(图2)，用于后续的受精卵注射实验。
[0059]
实施例2
[0060]
实施例1纯化后的sgrna1和sgrna9等质量比例混合，配置浓度为50ng/μl的sgrna溶液，然后与100ng/μl cas9 mrna混合，sgrna与cas9 mrna的混合比例为1:2。混合后共同注射到小鼠受精卵的细胞核中，受精卵体外培养至胚胎阶段，然后转入代孕母鼠子宫，之后在出生小鼠中进行pcr鉴定，确定每只小鼠的tks4基因是否存在基因编辑情况，具体的编辑情况如图3所示。
[0061]
注射后共获得六只f0代小鼠，通过表2所示的引物进行pcr检测，野生型小鼠应该pcr获得1787bp的条带，基因敲除小鼠获得大约700-800bp的条带。
[0062]
表2 tks4基因敲除鼠鉴定引物
[0063][0064]
pcr扩增使用的体系为小鼠鼠尾dna溶液1μl，taq酶0.5μl，dntps 1μl，引物各1μl和buffer 10μl，蒸馏水5.5μl，共20μl体系；反应程序为：94℃2min；98℃10s，67℃30s(-0.7℃/循环)，68℃1kb/min，15个循环；98℃10s，56℃30s，68℃1kb/min，25个循环；68℃10min；4℃保存。
[0065]
pcr结果显示，在所获得的六只f0代小鼠中，6号小鼠显示出纯合基因敲除的结果，
1号，2号，3号和5号显示出杂合敲除的结果，另外一只小鼠的pcr结果和野生型一致(图4)。
[0066]
为了确定具体敲除的片段，对f0代1号，2号，3号和5号的小鼠基因组进行了测序，结果显示每一只小鼠分别形成了不同片段长度的缺失。
[0067]
表3 f0代小鼠基因组测序结果
[0068][0069]
其中f0代5号小鼠与c57bl6小鼠交配后，获得了稳定遗传的f1代小鼠，其中两只f1代2号和4号小鼠为tks4+/-小鼠，其余为tks4+/+(图5)。对2号和4号小鼠的tks4基因进行了测序鉴定，该子代小鼠所敲除的片段大小与亲本一致，为1200bp。
[0070]
实施例3
[0071]
tks4基因敲除鼠的敲除效率检测
[0072]
将实施例2得到的f1代杂合鼠与c57鼠交配，获得f2代小鼠，取tks4+/-杂合型相互交配，获得f3小鼠后，使用表1中的两对引物进行基因型鉴定，可通过pcr条带判断小鼠的基因型为野生型，杂合敲除型以及纯合敲除型(示例如图6中a所示)。获得纯合小鼠后，提取了tks4#2基因敲除鼠和它的同窝野生型#4小鼠的脑、心脏、肺、肝等区域的蛋白质样品，通过tks4抗体验证了tks4基因敲除鼠中的敲除情况(图6中b)，结果表明tks4蛋白在该敲除鼠中的各个部位均无法检测到。这一结果说了tks4基因敲除鼠构建的成功。
[0073]
图6中a为鉴定tks4基因敲除鼠后代，首先使用表1中引物验证子代小鼠的基因组dna中是否含有tks4敲除后片段，敲除后条带为768bp。随后使用引物(f:gaagggcattctaacacacctgtca和r:gaaagctcaaaagctgcaagagacc)验证子代小鼠基因组dna中是否含有野生型，条带为366bp，图中所示分别为野生型小鼠、杂合型小鼠和纯合敲除型小鼠的pcr鉴定结果。b.western blot实验检测f3代的tks4基因敲除鼠中tks4是否被完全敲除，通过以同窝的野生型小鼠为对照，在小鼠的脑、肺、心脏中皆证实了tks4已被完全敲除。
[0074]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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