生产霉孢菌素样氨基酸的微生物及利用其生产霉孢菌素样氨基酸的方法与流程

[0001]
本公开涉及生产霉孢菌素样氨基酸的微生物，以及利用该微生物生产霉孢菌素样氨基酸的方法。


背景技术：

[0002]
从太阳发射的紫外(uv)光线由uva(具有约320nm至约400nm的波长)、uvb(具有约290nm至约320nm的波长)、和uvc(具有约100nm至约280nm的波长)组成。众所周知，uva光线穿透到真皮层中，主要诱发色素形成和皮肤老化，并参与光敏性皮肤病的发生，而uvb光线是能穿透表皮和真皮基底层的高能光线，参与晒斑、色素形成、和皮肤癌的发生。
[0003]
为了防止紫外光线的这些副作用，已经尝试了阻挡uv光线。防晒剂的种类包括化学防晒剂和物理防晒剂。化学防晒剂主要通过uv光线的吸收来防止uv光线的穿透，而物理防晒剂则通过反射和散射来防止uv光线的穿透。
[0004]
已知包含在化学防晒剂中的成分可以包括主要吸收uvb光线的成分(例如，paba、paba酯(戊基二甲基paba、辛基二甲基paba)、肉桂酸酯(西诺沙酯)、水杨酸酯(水杨酸高孟酯(homomenthyl salicylate))、樟脑等)；以及主要吸收uva光线的成分(例如，二苯甲酮(氧苯酮、二羟苯宗、和磺异苯酮(suliso benzene))、二苯甲酰甲烷、邻氨基苯甲酸酯等)。尽管这些化学防晒剂可提供吸收和阻挡uv光线的作用，但已知这些化学防晒剂中的一些可刺激皮肤或眼睛，且特别地，paba、paba酯、二苯甲酮、和肉桂酸酯等可引起接触性皮炎。另外，已经报道这些化学防晒剂中的其它一些在皮肤中引起光敏反应等。因此，在一些国家，这些化学防晒剂的使用或使用量受到限制。
[0005]
已知包含在物理防晒剂中的成分可以包括二氧化钛、滑石(硅酸镁)、氧化镁、氧化锌、高岭土等。物理防晒剂的优点在于它们不会引起副作用，如接触性皮炎，并且它们不容易被水移除。然而，它们的缺点在于，对于它们难以在实现期望的制剂同时维持有效含量，并且当它们被应用于皮肤时会发生白浊(white cast)等。
[0006]
霉孢菌素样氨基酸(maa)是存在于天然生物中的物质，并已知它们能有效地吸收uva和uvb。已知自然界中存在多于35种maa(mar.biol.,1991,108:157-166；planta med.,2015,81:813-820)。最近，已报道微观藻类中存在附着有各种糖的maa，并且它们具有优异的抗氧化功能(journal of photochemistry and photobiology,2015,142:154-168)。而且，已知maa不仅提供阻挡uv光线的能力，而且还提供抗氧化、抗渗透和抗热应力等(comp.biochem.physiol.ctoxicol.pharmacol.,2007,146:60-78；j.photochem.photobiol.b.,2007,89:29-35)。
[0007]
然而，微观藻类内生产的maa的量很低，仅为几微克的水平，而且微观藻类培养后，分离、提取、和纯化maa的条件复杂。因此，难于大量生产maa材料。
[0008]
[现有技术文献]
[0009]
[非专利文献]
[0010]
(非专利文献1)comp.biochem.physiol.b 1995,112:105-114。
[0011]
(非专利文献2)fems microbiol lett.2007,269:1-10。
[0012]
(非专利文献3)ann.rev.physiol.2002,64:223-262。
[0013]
(非专利文献4)mar.biol.1991,108:157-166。
[0014]
(非专利文献5)journal of photochemistry and photobiology b:biology.2015,142:154-168
[0015]
(非专利文献6)biol.rev.1999,74:311-345。
[0016]
(非专利文献7)mol.biol.evol.2006,23:1437-1443。
[0017]
(非专利文献8)science,2010,329:1653-1656。
[0018]
(非专利文献9)genomics 2010,95:120-128。
[0019]
(非专利文献10)geomicrobiol.j.1997.14:231-241。
[0020]
(非专利文献11)comp.biochem.physiol.c toxicol.pharmacol.2007.146:60-78。
[0021]
(非专利文献12)can.j.bot.2003.81:131-138。
[0022]
(非专利文献13)j.photochem.photobiol.b.2007,89:29-35。
[0023]
(非专利文献14)j.bacteriol.2011.193(21):5923-5928。
[0024]
(非专利文献15)planta med.2015.81:813-820
[0025]
(非专利文献16)acs appl.mater.interfaces.2015.7:16558-16564
[0026]
(非专利文献17)appl environ microbiol.2016,82(20):6167-6173
[0027]
(非专利文献18)chembiochem.2015,16:320-327
[0028]
(非专利文献19)methods mol biol.2013,1073:43-7
[0029]
(非专利文献20)nature review,2011,9:791-802


技术实现要素：

[0030]
技术问题
[0031]
本发明人已经作出了许多努力来增加微生物中maa的生产。结果，他们通过与微生物中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶(2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(phosphoenolpyruvate synthetase)和转酮醇酶(transketolase)蛋白质的活性增强相关的各种研究，确认了可以在生产maa的微生物中增加maa的生产，从而完成了本公开。
[0032]
技术方案
[0033]
本发明的目的是提供生产霉孢菌素样氨基酸(mma)的微生物，其中至少一种选自2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和转酮醇酶的蛋白质的活性被增强。
[0034]
本发明的另一个目的是提供生产霉孢菌素样氨基酸的方法，该方法包括：在培养基中培养微生物；以及从培养的微生物或培养基中回收霉孢菌素样氨基酸。
[0035]
本发明的又一个目的是提供该微生物用于生产霉孢菌素样氨基酸的用途。
[0036]
有益效果
[0037]
由于本公开的微生物具有提高的霉孢菌素样氨基酸(mma)生产能力，因此其可以
有效地用于生产霉孢菌素样氨基酸。
具体实施方式
[0038]
在下文中详细描述本公开。同时，本公开中公开的各自的描述和实施方式还可以应用于其它描述和实施方式。即，本公开中公开的各种要素的所有组合均落入本公开的范围内。另外，本公开的范围不受下面的具体描述限制。另外，本领域普通技术人员可仅使用常规实验就能够识别或鉴定关于本公开的某些方面的许多等同物。进一步，意图将这些等同物包括在本公开中。
[0039]
为了实现上述目的，本公开的一方面提供了生产霉孢菌素样氨基酸(mma)的微生物，其中增强了至少一种选自2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和转酮醇酶的蛋白质的活性。
[0040]
如本文所用，术语“2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶”是指催化以下反应方案的可逆反应的酶，并且可以具体地可以指合成3-脱氧-d-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphate)(dahp)的酶，但不限于此。
[0041]
[反应方案]
[0042][0043]
在本公开中，2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶可与3-脱氧-d-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合酶互换使用。
[0044]
如本文所用，术语“磷酸烯醇丙酮酸合酶”是指催化下述反应方案的可逆反应的酶，并且具体地，可以指合成磷酸烯醇丙酮酸的酶，但不限于此。
[0045]
[反应方案]
[0046][0047]
如本文所用，术语“转酮醇酶”是指催化下述反应方案的可逆反应的酶。
[0048]
[反应方案]
[0049][0050]
或
[0051][0052]
2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和转酮醇酶的遗传信息可从已知数据库获得(例如，美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information(ncbi))的genbank数据库等)，但是不限于此。
[0053]
因为存在展示活性的蛋白质根据微生物物种或微生物本身在氨基酸序列中有差异的情况，2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和转酮醇酶不限于它们的来源或序列。
[0054]
具体地，2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶可以是包括seq id no:2、37或124的氨基酸序列的蛋白质；磷酸烯醇丙酮酸合酶可以是包括seq id no:19或98的氨基酸序列的蛋
白质；以及转酮醇酶可以是包括seq id no:24、96或123的氨基酸序列的蛋白质，但这些蛋白质的氨基酸序列不限于此。如本文所用，术语“包括氨基酸序列的蛋白质”可以与“具有氨基酸序列的蛋白质”或“由氨基酸序列组成的蛋白质”的表述互换使用。
[0055]
另外，在本公开中，只要这些蛋白质具有与这些酶中的每种酶的生物活性相同或相应的生物活性，这些酶可以包括具有上述seq id nos的氨基酸序列的那些蛋白质，以及与上述氨基酸序列具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高的同源性或同一性的那些蛋白质。
[0056]
另外，明显的是，只要氨基酸序列具有与上述seq id nos的同源性或同一性，并且具有与上述seq id nos的酶蛋白实质上相同或相应的生物活性，则在部分序列中具有缺失、修饰、取代、或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也都包括在本公开的范围内。
[0057]
如本文所用，术语“同源性或同一性”是指与给定氨基酸序列或核苷酸序列的匹配程度，并且可以表示为百分比。在本公开中，具有与给定氨基酸序列或核苷酸序列相同或相似活性的同源序列表示为“％同源性”或“％同一性”。例如，可以使用用于计算参数(如得分、同一性和相似性)的标准软件(具体地，blast 2.0)，或通过在限定的严格条件下经由southern杂交比较序列，来确认同源性。限定的适当的杂交条件可在本领域范围内并且可以通过本领域技术人员众所周知的方法来确定(例如，j.sambrook等人,molecular cloning,a laboratory manual,2nd edition,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,new york,1989；f.m.ausubel等人,current protocols in molecular biology,john wiley&sons,inc.,new york)。术语“严格条件”是指在多核苷酸之间能够特异性杂交的条件。例如，这些条件被具体地公开于文献(例如，j.sambrook等人，同上)中。
[0058]
只要这些多核苷酸具有与这些酶中的每种酶相同或相应的生物活性，则本公开的2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和转酮醇酶可以包括编码具有上述seq id nos的氨基酸序列，或与上述seq id nos的氨基酸序列具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高同源性或同一性的蛋白质的多核苷酸。
[0059]
另外，由于密码子简并性，考虑到待表达的蛋白质所在的生物中优选的密码子，可以在不改变来自编码区待表达的蛋白质的氨基酸序列的范围内，对核苷酸序列的编码区进行各种修饰。因此，可以不受限制地包括具有编码每种酶蛋白的序列的任何多核苷酸。
[0060]
另外，可以不受限制地包括通过与任何探针杂交编码蛋白质(具有2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、或转酮醇酶蛋白的活性)的任何序列，所述探针可在严格条件下由已知基因序列(例如，与上述多核苷酸序列的全部或部分互补的序列)制备。
[0061]
术语“严格条件”是指使多核苷酸之间能够特异性杂交的条件。这些条件被具体地描述于文献(例如j.sambrook等人，同上)中。例如，可以列出，在具有高同源性或同一性(40％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，甚至更具体地97％或更高、和最具体地99％或更高的同源性或同一性)的基因之间的杂交，而在具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的基因之间不进行杂交的条件；或在southern杂交的常规洗涤条件
2006/065095)、spl启动子(kr 10-1783170b)、或o2启动子(kr 10-1632642b)，以提高编码酶的多核苷酸的表达率，但方法不限于此。
[0073]
进一步，修饰染色体上的多核苷酸序列的方法(3)的可以通过以下进行：通过缺失、插入、非保守或保守取代、或其组合来诱导表达控制序列中的修饰，以进一步增强多核苷酸序列的活性；或通过用具有更强活性的改进的多核苷酸序列置换核酸序列，但方法不特别限于此。
[0074]
最后，通过方法(1)至方法(3)的组合来增强的修饰的方法(4)可以通过应用方法中的一个或多个方法一起来进行：增加编码酶的多核苷酸的拷贝数的方法；修饰用于增加表达的表达控制序列的方法；以及修饰染色体上的多核苷酸序列的方法，或修饰展示酶的活性的外源多核苷酸或其密码子优化的修饰的多核苷酸的方法。
[0075]
当多核苷酸是能够发挥功能的多核苷酸的集合时，它们可以被描述为基因。在本公开中，多核苷酸和基因可以互换使用，并且多核苷酸序列和核苷酸序列可以互换使用。
[0076]
如本文所用，术语“载体”是指包括编码目标蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的dna构建体，其中目标蛋白可操作地被连接至适合的控制序列，使得它能够在适当的宿主中被表达。控制序列可以包括能够起始转录的启动子、用于控制转录的任何操纵子序列、编码适当的mrna核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译的终止的序列。在转化到适合的宿主细胞中之后，载体可以与宿主基因组无关地复制或起作用，或可以被整合到宿主基因组本身中。
[0077]
只要载体可在宿主细胞中复制，则本公开中使用的载体不受特别地限制，并且可以使用本领域中已知的任何载体。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pwe15、m13、mbl3、mbl4、ixii、ashii、apii、t10、t11、charon4a、和charon21a等，且作为质粒载体，可以使用pbr、puc、pbluescriptii、pgem、ptz、pcl、和pet等。具体地，可以使用载体如pdz、pacyc177、pacyc184、pcl、peccg117、puc19、pbr322、pmw118、pcc1bac、pskh、prs-413、prs-414、和prs-415等，但载体不限于此。
[0078]
可以在本公开中使用的载体不受特别地限制，并且可以使用任何已知的表达载体。另外，可通过用于在细胞中染色体插入的载体将编码染色体中目标蛋白的多核苷酸插入到染色体中。可以使用本领域已知的任何方法(例如通过同源重组)，将多核苷酸插入到染色体中，但插入的方法不限于此。可以进一步包括用于确认插入到染色体中的选择标记。选择标记用于选择用载体转化的细胞(即，为了确认目标核酸分子是否已被插入)，以及可以使用能够提供可选表型(例如，药物耐性、辅源营养、对细胞毒剂的耐性、和表面蛋白的表达)的标记。在用选择剂处理的环境下，只有能够表达选择标记的细胞才能存活或表达其它表型性状，并且因此转化的细胞可容易地被选择。
[0079]
如本文所用，术语“转化”是指将包括编码目标蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞中，使得由多核苷酸编码的蛋白质可在宿主细胞中表达。无论转化的多核苷酸是被插入到宿主细胞的染色体中以位于其中还是位于染色体外，只要转化的多核苷酸可在宿主细胞中表达，那么转化的多核苷酸不特别地被限制。另外，多核苷酸包括编码目标蛋白的dna和rna。只要多核苷酸可被引入到宿主细胞中并在其中表达，多核苷酸被引入的形式无关紧要。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式被引入到宿主细胞中，表达盒是包括用于自主表达
(self-expression)的所有必要元件的基因构建体。表达盒可包括常规地可操作地连接到多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点、和翻译终止信号。表达盒可以是能够自复制的表达载体。另外，多核苷酸可以是以多核苷酸本身被引入到宿主细胞中并被连接到在宿主细胞中表达所必要的序列的多核苷酸，但不限于此。转化的方法包括将核酸引入到细胞中的任何方法，并且可以通过根据宿主细胞选择本领域已知的适合的标准技术来进行。例如，转化方法可以包括电穿孔、磷酸钙(capo4)沉淀、氯化钙(cacl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(peg)方法、eae-葡聚糖方法、阳离子脂质体方法、乙酸锂-dmso方法等，但方法不限于此。
[0080]
另外，如本文所用，术语“可操作地连接”意指起始和介导编码本公开的目标蛋白的多核苷酸转录的启动子序列和多核苷酸序列之间的功能性连接。可操作连接可通过本领域已知的遗传重组技术制备，并且位点特异性dna切割和连接可使用本领域已知的限制酶、连接酶等制备，但不限于此。
[0081]
在本公开的微生物中，3-脱氢奎尼酸脱水酶的活性可以进一步被失活。
[0082]
如本文所用，术语“3-脱氢奎尼酸脱水酶”是指在下面的反应方案中催化可逆反应的酶，并且具体地，它可以将3-脱氢奎尼酸转化为3-脱氢莽草酸，但不限于此。
[0083]
[反应方案]
[0084][0085]
因为存在根据微生物的物种或微生物而显示3-脱氢奎尼酸脱水酶活性的蛋白质在它们的氨基酸序列中有差异的情况，所以3-脱氢奎尼酸脱水酶不受其来源或序列的限制。具体地，3-脱氢奎尼酸脱水酶可以是包括seq id no:90的氨基酸序列的蛋白质，但不限于此。另外，3-脱氢奎尼酸脱水酶可包括seq id no:90的氨基酸序列或与seq id no:90具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同源性或同一性的氨基酸序列。另外，明显地，只要氨基酸序列具有上述同源性或同一性并且具有与上述蛋白质相同或相应的生物活性，在部分的序列中具有缺失、修饰、取代、或添加的任何氨基酸序列也可被包括在本公开的范围内。
[0086]
如本文所用，术语“失活”是指酶蛋白的活性与微生物最初具有的酶蛋白的内源活性或修饰前的酶蛋白活性相比被减弱的情况；蛋白质完全不表达的情况；或蛋白质表达但无活性的情况。失活是这样的概念，其包括：由于编码酶的多核苷酸的修饰等，酶本身的活性与微生物具有的其内源活性相比被减弱或活性被移除的情况；由于编码酶的基因的表达的抑制或翻译的抑制等，酶的总细胞内活性程度与其野生型微生物相比较低或活性被移除的情况；编码酶的基因的部分或全部缺失的情况；以及其组合，但失活不限于此。即，酶的活性被失活的微生物是指其中酶蛋白的活性与其天然野生型微生物或未修饰微生物的活性相比较低或其中活性被移除的微生物。
[0087]
酶活性的失活可以通过应用本领域已知的各种方法而实现。以上方法的实例包括：1)缺失染色体上编码酶的基因的部分或全部的方法；2)修饰表达控制序列以减少染色体上编码蛋白质的基因的表达的方法；3)修饰染色体上编码蛋白质的基因序列使得蛋白质的活性被移除或减弱的方法；4)引入与染色体上编码蛋白质的基因的转录物互补结合的反义寡核苷酸(例如，反义rna)的方法；5)通过在染色体上编码蛋白质的基因的sd序列前端上添加与shine-dalgarno(sd)序列互补的序列以形成二级结构，使核糖体不可能附着的方
法；6)逆转录工程(rte)方法，其中将反向转录的启动子添加到编码蛋白质的多核苷酸序列的开放阅读框(orf)的3'端等；并且失活可以通过其组合来实现，但方法不特别限于此。
[0088]
缺失染色体上编码酶的基因的部分或全部的方法可以通过使用用于染色体插入的载体，用具有部分缺失的核苷酸序列的多核苷酸或标记基因置换染色体内编码内源性目标蛋白的多核苷酸来进行。作为缺失多核苷酸的全部或部分的方法的实例，可以使用通过同源重组缺失多核苷酸的方法，但方法不限于此。
[0089]
修饰表达控制序列的方法可以通过经由缺失、插入、保守或非保守取代、或其组合来诱导表达控制序列中的核酸序列的修饰，以进一步减弱表达控制序列的活性来进行；或通过用具有更弱活性的核酸序列置换核酸序列来进行。表达控制序列可包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、以及调控转录和翻译的序列，但不限于此。
[0090]
修饰染色体上的基因序列的方法可以通过经由缺失、插入、保守或非保守取代、或其组合来诱导基因序列中的修饰，以进一步减弱酶的活性来进行；或通过用修饰以具有更弱活性的基因序列、或修饰以完全不具有活性的基因序列置换基因序列来进行，但方法不限于此。
[0091]
在上面，尽管术语“部分”可根据多核苷酸的种类而变化，但可具体地指1个核苷酸至300个核苷酸、更具体地1个核苷酸至100个核苷酸、和甚至更具体地1个核苷酸至50个核苷酸，但不特别地限于此。
[0092]
在本公开的微生物中，与未修饰的微生物相比，3-脱氢奎尼酸合酶蛋白的活性可以进一步加强。
[0093]
3-脱氢奎尼酸合酶是指催化下述反应方案的可逆反应的酶，并且具体地可以合成3-脱氢奎尼酸(3-dhq)，但不限于此。
[0094]
[反应方案]
[0095][0096]
如本文所用，术语“霉孢菌素样氨基酸(maa)”是指吸收紫外(uv)光线的环状化合物。在本公开中，只要霉孢菌素样氨基酸能吸收uv光线，霉孢菌素样氨基酸不受限制，且具体地，其可以是具有环己烯酮或环己烯亚胺(cyclohexenimine)的中心环的化合物；或可以是其中各种物质(例如，氨基酸等)被结合到中心环的化合物，且更具体地，它可以是霉孢菌素-2-甘氨酸、palythinol、palythenic acid、deoxygadusol、霉孢菌素-甲胺-苏氨酸、霉孢菌素-甘氨酸-缬氨酸、palythine、asterina-330、shinorine、porphyra-334、euhalothece-362、霉孢菌素-甘氨酸、霉孢菌素-鸟氨酸、霉孢菌素-赖氨酸、霉孢菌素-谷氨酸-甘氨酸、霉孢菌素-甲胺-丝氨酸、霉孢菌素-牛磺酸、palythene、palythine-丝氨酸、palythine-丝氨酸-硫酸盐、palythinol、usujirene、或其组合。
[0097]
在本公开中，术语霉孢菌素样氨基酸可与maa和maas互换使用。
[0098]
如本文所用，术语“生产霉孢菌素样氨基酸(maa)的微生物”可以指包括参与maa的生物合成的酶的基因或这些基因的簇的微生物，或其中簇被引入或增强的微生物。另外，如本文所用，术语“霉孢菌素样氨基酸(maa)生物合成基因簇”可以指编码参与maa生物合成的酶的基因的组，且具体地，可以包括maa生物合成基因、具有将附加氨基酸残基附接到maa的活性的酶的基因、或上述基因的簇。只要包括这种基因的微生物可以生产maa，maa生物合成
基因包括微生物的外源基因和/或内源基因。外源基因可以是同源的和/或异源的。
[0099]
只要包括maa生物合成基因的微生物可生产参与maa生物合成的酶并因此生产maa，则微生物的物种(maa生物合成基因源自该微生物)不受限制。具体地，微生物的物种(maa生物合成基因源自该微生物)可以是蓝细菌(cyanobacteria)(例如，多变鱼腥藻(anabaena variabilis)、点状念珠藻(nostoc punctiforme)、产泡节球藻(nodularia spumigena)、蓝丝菌属pcc 7424(cyanothece sp.pcc 7424)、鞘丝藻属pcc 8106(lyngbya sp.pcc 8106)、铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa)、原型微鞘藻(microcoleus chthonoplastes)、蓝丝菌属atcc 51142(cyanothece sp.atcc 51142)、瓦氏鳄球藻(crocosphaera watsonii)、蓝丝菌属ccy 0110(cyanothece sp.ccy 0110)、静水柱孢藻属pcc 7417(cylindrospermum stagnale sp.pcc 7417)、嗜盐隐杆藻(aphanothece halophytica)或红海束毛藻(trichodesmium erythraeum))；或真菌(例如，稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)、小麦黄斑叶枯病菌(pyrenophora tritici-repentis)、棒曲霉菌(aspergillus clavatus)、赤球丛赤壳(nectria haematococca)、构巢曲霉(aspergillus nidulans)、玉蜀黍赤霉(gibberella zeae)、苜蓿黄萎病菌(verticillium albo-atrum)、灰葡萄孢霉(botryotinia fuckeliana)、或小麦颖枯病菌(phaeosphaeria nodorum))；或海葵(nematostella vectensis)、三角异囊藻(heterocapsa triquetra)、尖尾藻(oxyrrhis marina)、微小卡罗藻(karlodinium micrum)、奇迹束丝放线菌(actinosynnema mirum)等，但不限于此。
[0100]
根据实施方式，生产maa的本公开的微生物包括maa生物合成基因或其簇。具体地，在微生物中，可以引入maa生物合成基因簇，或者与内源活性或修饰前的活性相比，可以增强由基因编码的蛋白质的活性，但微生物不限于此。
[0101]
另外，虽然只要微生物可生产maa，则maa生物合成基因可以不受酶的它们的名称或这些基因源自的微生物限制，但maa生物合成基因可以包括编码酶蛋白的基因，酶蛋白具有与选自2-脱甲基(demetyl)4-deoxygadusol合酶、o-甲基转移酶和c-n连接酶的一种或多种、具体地一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或所有的酶蛋白相同和/或相似的活性。
[0102]
例如，2-脱甲基4-deoxygadusol合酶是将景天庚酮糖-7-磷酸转化为2-脱甲基-4-deoxygadusol的酶。o-甲基转移酶是将2-脱甲基-4-deoxygadusol转化为4-deoxygadusol的酶，并且4-deoxygadusol的糖基化(glycylation)由c-n连接酶催化。
[0103]
另外，生产maa的微生物可以包括具有将附加氨基酸残基附接到maa的活性的酶的基因，或者基因的簇。虽然只要生产maa的微生物可以生产附接有两个或更多个氨基酸残基的maa，则上述基因或基因簇不受酶的它们的名称或这些基因源自的微生物限制，但生产maa的微生物可以包括编码酶蛋白的基因，酶蛋白具有与选自以下酶蛋白的一种或多种、具体地一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或所有的酶蛋白相同和/或相似活性：非核糖体肽合成酶(nrps)、非核糖体肽合成酶样酶(non-ribosomal peptide synthetase-like enzyme)(nrps样酶(nrps-like enzyme))、和d-丙氨酸d-丙氨酸连接酶(d-ala d-ala连接酶；ddl)。
[0104]
maa中的一些在霉孢菌素-甘氨酸中包括第二个氨基酸残基。选自非核糖体肽合成酶、非核糖体肽合成酶样酶、和d-ala d-ala连接酶的一种或多种酶可以将第二个氨基酸残
基附接至霉孢菌素-甘氨酸。
[0105]
根据一个实施方式，只要酶(如非核糖体肽合成酶、非核糖体肽合成酶样酶、和d-ala d-ala连接酶)具有能够将第二个氨基酸附接至霉孢菌素-甘氨酸的活性，生产maa的微生物可以不受酶的名称或maa生物合成基因源自的微生物的物种限制地包括这些酶。
[0106]
例如，在多变鱼腥藻中的非核糖体肽合成酶样酶(ava_3855)或在点状念珠藻中的d-ala d-ala连接酶(npf5597)可以将丝氨酸残基附接到霉孢菌素-甘氨酸以形成shinorine。在另一个实例中，霉孢菌素-2-甘氨酸可以通过嗜盐隐杆藻中的d-ala d-ala连接酶同系物(ap_3855)使第二个甘氨酸残基附接而形成。相似地，在奇迹束丝放线菌中，丝氨酸或丙氨酸可通过d-ala d-ala连接酶被附接，并且从而可以形成shinorine或霉孢菌素-甘氨酸-丙氨酸。根据本公开的一个实施方式的微生物可以在上述酶或具有与上述酶相同和/或相似活性的酶中选择和包括适合于生产期望的maa的那些酶。
[0107]
可以在本公开中使用的2-脱甲基4-deoxygadusol合酶、o-甲基转移酶、c-n连接酶、非核糖体肽合成酶、非核糖体肽合成酶样酶、和/或d-ala d-ala连接酶可不受这些酶衍生自的微生物的物种限制，只要已知这些酶能够执行与上述酶的功能和作用相同和/或相似的功能和作用，且它们之间的同源性或相似性值的范围也不受限制。例如，静水柱孢藻pcc7417的myla、mylb、myld、myle和mylc与源自多变鱼腥藻和点状念珠藻的2-脱甲基4-deoxygadusol合酶、o-甲基转移酶、c-n连接酶、和d-ala d-ala连接酶同源，并且它们之间的相似性的程度在约61％至约88％的范围内(appl environ microbiol,2016,82(20),6167-6173；j bacteriol,2011,193(21),5923-5928)。即，只要已知可以用于本公开中的酶展示相同和/或相似的功能和效果，则可以用于本公开中的酶可以不显著地受酶源自的物种、序列同源性、或序列同一性限制。另外，将现有技术文件中描述的非专利文献通过引用以其整体总体上被包括到本公开中。
[0108]
另外，maa生物合成基因可以是编码包括seq id no:115、116、117、118、119、120、121、或122的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，但maa生物合成基因不限于此。
[0109]
另外，maa生物合成基因可以包括编码包括与seq id no:115、116、117、118、119、120、121、或122的氨基酸序列具有50％、60％、或70％或更高、具体地80％或更高、更具体地90％或更高、甚至更具体地95％或更高、和最具体地99％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列，以及只要微生物可生产maa，就可以不受限制地包括编码上述同源性或同一性范围外的蛋白质的核苷酸序列。具体地，maa生物合成基因可以包括seq id no:102、103、104、105、106、107、108、或109的核苷酸序列，但不限于此。
[0110]
另外，明显地，只要氨基酸序列具有与上述序列的同源性或同一性，且实质上具有与上述seq id nos的蛋白质相同或相应的生物活性，在部分序列中具有缺失、修饰、取代、或添加的任何氨基酸序列也可被包括在本公开中。
[0111]
另外，由于密码子简并性，考虑到待表达蛋白质的生物中优选的密码子，可以在不改变来自编码区的待表达蛋白质的氨基酸序列的范围内，在核苷酸序列的编码区域中进行各种修饰。因此，关于maa生物合成基因，只要核苷酸序列是编码参与maa生物合成的蛋白质的核苷酸序列，任何核苷酸序列都可以不受限制地被包括在本公开中。
[0112]
可选地，编码参与maa生物合成的蛋白质的任何序列——通过在严格条件下与可以由已知的基因序列制备的任何探针(例如，与全部或部分核苷酸序列互补的序列)杂
交——可以不受限制地被包括在本公开中。
[0113]
根据一个实施方式，生产maa的微生物可以包括具有不同来源的maa生物合成基因。
[0114]
在本公开中，蛋白质活性的增强和/或基因的引入可以不管顺序地同时、顺序地、和以相反的顺序进行。
[0115]
生产maa的微生物通过包括maa生物合成基因簇来生产maa，且另外，可以是其中通过增强选自2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶和转酮醇酶的一种或多种蛋白质的活性而增加maa生产能力的微生物。另外，只要它是通过增强选自2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶和转酮醇酶的一种或多种蛋白质的活性而提高maa生产能力的微生物，本公开的微生物不受限制。具体地，本公开的微生物可以是棒杆菌属(genus corynebacterium)的微生物、埃希氏菌属(genus escherichia)的微生物、或酵母。
[0116]
棒杆菌属的微生物可以具体地是谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(corynebacterium ammoniagenes)、乳发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、热氨基棒杆菌(corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒杆菌(corynebacterium efficiens)等，并且更具体地，可以是谷氨酸棒杆菌，但微生物不限于此。
[0117]
埃希氏菌属的微生物可以具体地是艾伯替埃希氏菌(escherichia albertii)、大肠埃希氏菌(escherichia coli)、弗氏埃希氏菌(escherichia fergusonii)、赫氏埃希氏菌(escherichia hermannii)、伤口埃希氏菌(escherichia vulneris)等，并且更具体地，可以是大肠埃希氏菌，但微生物不限于此。
[0118]
酵母可以具体地是属于子囊菌门(phylum ascomycota)的酵母亚门(saccharomycotina)、外囊菌亚门(taphrinomycotina)、或担子菌门(phylum basidiomycota)的伞菌亚门(agaricomycotina)、属于柄锈菌亚门(phylum pucciniomycotina)的微生物等，更具体地，酵母菌属(genus saccharomyces)的微生物、裂殖酵母属(genus schizosaccharomyces)的微生物、发夫酵母属(genus of phaffia)的微生物、克鲁维酵母属(genus of kluyveromyces)的微生物、毕赤酵母属(genus of pichia)的微生物、和假丝酵母属(genus of candida)的微生物、并且更具体地，酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，但微生物不限于此。
[0119]
本公开的又一方面提供了生产霉孢菌素样氨基酸的方法，其包括在培养基中培养本公开的微生物；以及从培养的微生物或培养基中回收霉孢菌素样氨基酸(maa)。
[0120]“微生物”和“霉孢菌素样氨基酸(maa)”如上所述。
[0121]
如本文所用，术语“培养”意指在适当控制的环境条件下使微生物生长。本公开的培养过程可以在本领域已知的适合的培养基和培养条件中进行。根据待选择的微生物，本领域技术人员可以容易地调节培养过程用于使用。培养微生物的步骤可以通过本领域已知的分批培养法、连续培养法、补料分批培养法等进行，但培养微生物的步骤不特别限于此。对用于培养本公开的微生物的培养基和其它培养条件没有特别限制，但可以使用用于微生物常规培养的任何培养基。具体地，本公开的微生物可以在含有适当的碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等的常规培养基中在需氧条件下，同时调节温度、ph等来培
养。具体地，可以使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)调节ph以获得最佳的ph(例如，ph 5至9、具体地ph 6至8、和最具体地ph 6.8)，但调节ph的方法不限于此。另外，为了维持培养物的需氧状态，可以将氧气或含氧气体注入到培养物中；或为了维持培养物的厌氧或微需氧状态，可以将氮气、氢气或二氧化碳气体注入到培养物中、或不注入气体，但气体不限于此。另外，培养温度可以维持在20至45℃、且具体地在25至40℃，并且培养可以进行约10至160小时，但不限于此。另外，在培养期间，可以添加消泡剂(例如，脂肪酸聚乙二醇酯)以防止泡沫生成，但不限于此。
[0122]
另外，作为在用于培养的培养基中使用的碳源，可以单独或组合使用糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油、和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、有机酸(例如，乙酸)等，但碳源不限于此。作为氮源，可以单独或组合使用含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉、和尿素)和无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、和硝酸铵)等，但氮源不限于此。作为磷源，可以单独或组合使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、和其相应的含钠盐等，但磷源不限于此。另外，培养基可包括必需的促生长物质，如金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、和维生素。
[0123]
通过培养生产的maa可能被分泌到培养基中，或者保留在细胞中。
[0124]
如本文所用，术语“培养基”是指用于培养本公开的微生物的培养基和/或培养后获得的产物。培养基是包括以下两种形式的概念：包含微生物的形式；通过离心、过滤等从含有微生物的培养溶液中移除微生物的形式。
[0125]
在回收在上述本公开的培养步骤中生产的maas的步骤中，可以根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养液中收集期望的maas。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、hplc等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养的微生物或培养基中回收期望的maas。另外，回收maas的步骤可以进一步包括分离步骤和/或纯化步骤。
[0126]
本公开的又一方面提供了本公开的微生物用于生产霉孢菌素样氨基酸(maa)的用途。
[0127]“微生物”和“霉孢菌素样氨基酸”如上所述。
[0128]
实施例
[0129]
在下文，将参考以下实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅是出于说明性目的，并且本公开的范围不受这些实施例限制。
[0130]
＜基于大肠埃希氏菌(e.coli)的生产maas的重组微生物的制备及使用其的maas的生产>
[0131]
实施例1：其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶的活性被增强的菌株的制备
[0132]
为了增加微生物的maas生产的能力，制备了其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚酸醛缩酶的活性被增强的大肠埃希氏菌菌株。具体地，基于大肠埃希氏菌w3110菌株进一步引入arog基因(2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶；seq id nos:1和2)。用于制备质粒的模板和引物显示在下面的表1中。
[0133]
[表1]
[0134][0135]
用上述模板和引物通过pcr扩增基因片段后，使用in-fusion
r hd克隆试剂盒(clontech)将扩增的片段连接到pskh载体(pct/kr2007/006933)(其中用bamh1-spei限制性酶处理了fhua arm 1和fhua arm 2基因片段)上，且制备的载体命名为pskh-δfhua。由于fhua基因的缺失，大肠埃希氏菌的噬菌体感染被抑制。
[0136]
使用in-fusion
r hd克隆试剂盒(clontech)将pn_arog基因片段连接到用spe1-ecorv限制性酶切割的pskh-δfhua载体上。用spe1-nde1限制性酶消化已知作为增强启动子的ptrc和pcj1基因片段并用nde1-ecorv限制性酶消化arog基因片段后，使用in-fusion
r hd克隆试剂盒(clontech)将ptrc和arog基因片段或pcj1(韩国专利号10-620092)和arog基因片段分别连接到用spe1-ecorv限制性酶切割的pskh-δfhua载体上。制备的载体分别命名为pskh-δfhua-pn-arog、pskh-δfhua-ptrc-arog、和pskh-δfhua-pcj1-arog。
[0137]
关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述载体进行了确认，然后将上述载体通过电穿孔转化到各野生型大肠埃希氏菌w3110菌株中。每个转化的基因通过一次重组(交叉(cross-over))被引入到染色体中，然后通过二次重组(交叉)将质粒区域从染色体切除。对于每种转化的大肠埃希氏菌菌株(其中完成了二次重组)，使用seq id no:14(正向)和8(反向)的引物通过pcr确认了arog基因的引入。
[0138]
实施例2：过表达源自微观藻类的shinorine生物合成基因的载体的制备
[0139]
基于多变鱼腥藻(a.variabilis)的用于shinorine生物合成的基因簇由四个基因(ava_abcd)组成，四个基因编码2-脱甲基4-deoxygadusol合酶、o-甲基转移酶、c-n连接酶和非核糖体肽合成酶。使用多变鱼腥藻atcc29413的基因组dna鉴定了用于shinorine生物合成的基因簇。使用peccg117_pcj1_gfp_终止子载体，制备了包括源自多变鱼腥藻atcc29413的shinorine生物合成基因的载体。shinorine生物合成基因表达载体的名称以及用于载体制备的各自模板和引物示于下表2中。
[0140]
[表2]
[0141][0142]
使用上面的模板和引物获得了基因片段，然后使用in-fusion
r hd克隆试剂盒(clontech)将每个基因片段连接到用ecorv-xbai限制性酶处理的peccg 117_pcj1_gfp_终止子载体上。制备的载体命名为peccg117_pcj1_ava_abcd，且通过测序确认了成功克隆和载体的基因序列。ava_abcd基因的核苷酸序列示于seq id no:17中。
[0143]
实施例3：其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶的活性被增强的菌株的shinorine生产能力的评价
[0144]
将实施例2中制备的peccg117_pcj1_ava_abcd质粒通过电穿孔引入到实施例1中制备的菌株(其中增强了arog基因)和野生型w3110菌株中的每一种菌株，并将每种转化的菌株平皿接种在lb固体培养基上。菌株在37℃培养箱中培养过夜，然后将一个铂环(platinum loop)的菌株接种到了25ml滴定培养基[培养基组成：40g/l的葡萄糖、0.3g/l的kh2po4、0.6g/l的k2hpo4、15g/l的(nh4)2so4、1g/l的mgso4·
7h2o、2.5g/l的nacl、1.2g/l的柠檬酸钠、2.5g/l的酵母提取物、40g/l的碳酸钙：ph7.0]中，将其在37℃培养箱中以200rpm温育了48小时。所得菌株通过hplc(waters corp.)进行了分析，且其结果显示于下表3中。
[0145]
[表3]
[0146][0147]
如上表3中所示，与对照组的浓度相比，在菌株(w3110δfhua::pn-arog/peccg117_pcj1_ava_abcd)(其中arog基因被增强)中生产的shinorine的浓度增加了约20％。特别地，在其中通过增强启动子增强arog基因的菌株(即，w3110δfhua::ptrc-arog/peccg117_pcj1_ava_abcd和w3110δfhua::pcj1-arog/peccg117_pcj1_ava_abcd)的情况下，shinorine浓度分别增加了69％和94％。
[0148]
实施例4：其中磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性被增强的菌株的制备
[0149]
为了增加微生物的maa生产能力，制备了其中磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性被增强的大肠埃希氏菌菌株。具体地，基于大肠埃希氏菌w3110菌株进一步引入pps基因(磷酸烯醇丙酮酸合酶；seq id no:18和seq id no:19)。用于制备质粒的模板和引物示于下表4中。
[0150]
[表4]
[0151][0152]
使用上述模板和引物扩增基因片段后，使用in-fusion
r hd克隆试剂盒(clontech)将pn_pps基因片段连接到用spe1-ecorv限制性酶切割的pskh-δfhu载体上。用spe1-nde1限制性酶消化实施例1中制备的ptrc和pcj1基因片段并且用nde1-ecorv限制性酶消化pps基因片段后，用in-fusion
r hd克隆试剂盒(clontech)将ptrc和pps基因片段或pcj1和pps基因片段分别连接到用spe1-ecorv限制性酶切割的pskh-δfhua载体上。制备的载体分别命名为pskh-δfhua-pn-pps、pskh-δfhua-ptrc-pps、和pskh-δfhua-pcj1-pps。
[0153]
关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述载体进行了确认，然后将上述载体通过电穿孔转化到各野生型大肠埃希氏菌w3110菌株中。将每种转化的基因通过一次重组(交叉)引入到染色体中，然后通过二次重组(交叉)将质粒区域从染色体切除。对于每种转化的大肠埃希氏菌菌株(其中完成了二次重组)，使用seq id no:14(正向)和seq id no:21(反向)的引物通过pcr确认了pps基因的引入。
[0154]
实施例5：其中磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性被增强的菌株的shinorine生产能力的评价
[0155]
将实施例2中制备的peccg117_pcj1_ava_abcd质粒通过电穿孔引入到实施例4中制备的其中引入了pps基因的菌株和野生型w3110菌株中的每一中菌株，并将每种转化的菌株平皿接种在lb固体培养基上。菌株在37℃培养箱中培养过夜，然后将一个铂环的菌株接种到实施例3的25ml滴定培养基中，然后将其在37℃培养箱中以200rpm温育了48小时。结果示于下文表5中。
[0156]
[表5]
[0157]
菌株的名称od(600nm)shinorine浓度(mg/l)w3110/peccg117_pcj1_ava_abcd19.4348w3110δfhua::pn-pps/peccg117_pcj1_ava_abcd21.3494w3110δfhua::ptrc-pps/peccg117_pcj1_ava_abcd20.8511w3110δfhua::pcj1-pps/peccg117_pcj1_ava_abcd21.4556
[0158]
如上表5中所示，与对照组的浓度相比，在pps基因增强的菌株中生产的shinorine浓度增加了41％，并且在通过用强启动子置换使其活性增强的情况下，shinorine浓度增加高达60％。
[0159]
实施例6：其中转酮醇酶i/ii的活性被增强的菌株的制备
[0160]
为了增加微生物的maa生产能力，制备了其中转酮醇酶的活性被增强的大肠埃希氏菌菌株。具体地，基于大肠埃希氏菌w3110菌株，将tkta基因(转酮醇酶；seq id no:23和seq id no:24)引入其中。质粒制备中使用的模板和引物示于下表6中。
[0161]
[表6]
[0162][0163]
使用上述模板和引物通过pcr扩增基因片段后，使用in-fusion
r hd克隆试剂盒(clontech)将pn_tkta基因片段连接到用spe1-ecorv限制性酶切割的pskh-δfhua载体上。用spe1、nde1限制性酶消化实施例1中制备的ptrc和pcj1基因片段并用nde1-ecorv限制性酶消化tkta基因片段后，使用in-fusion
r hd克隆试剂盒(clontech)将ptrc和tkta基因片段或pcj1和tkta基因片段分别连接到用spe1-ecorv限制性酶切割的pskh-δfhua载体上。制备的载体分别命名为pskh-δfhua-pn-tkta、pskh-δfhua-ptrc-tkta、和pskh-δfhua-pcj1-tkta。
[0164]
关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述载体进行了确认，然后将上述载体通过电穿孔转化到各野生型大肠埃希氏菌w3110菌株中。将每种转化的基因通过一次重组(交叉)引入到染色体中，然后通过二次重组(交叉)将质粒区域从染色体切除。对于每种转化的大肠埃希氏菌菌株(其中完成了二次重组)，使用seq id no:14(正向)和seq id no:26(反向)的引物通过pcr确认了tkta基因的引入。
[0165]
实施例7：其中转酮醇酶的活性被增强的菌株的shinorine生产能力的评价
[0166]
将实施例2中制备的peccg117_pcj1_ava_abcd质粒通过电穿孔引入到实施例6中制备的其中引入了tkta基因的菌株和野生型w3110菌株中的每一种菌株，并将每个转化的菌株平皿接种在lb固体培养基上。将菌株在37℃培养箱中培养过夜，然后将一个铂环的的每种菌株的过夜培养物接种到实施例3的25ml滴定培养基中，然后将其在37℃培养箱中以200rpm温育了48小时。结果示于下文表7中。
[0167]
[表7]
[0168][0169]
如上表7中所示，与对照组的浓度相比，在tkta基因增强的菌株中生产的shinorine浓度增加了4.5％，并且在通过用强启动子置换使其活性增强的情况下，shinorine浓度增加高达32％。
[0170]
实施例8：其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶/磷酸烯醇丙酮酸合酶/转酮醇酶的活性被增强的菌株的制备
[0171]
为了增加微生物的maa生产能力，制备了其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶/
磷酸烯醇丙酮酸合酶/转酮醇酶中的每种酶的活性都被增强的大肠埃希氏菌菌株。具体地，基于大肠埃希氏菌w3110菌株，进一步将arog基因、pps基因、和tkta基因中的每一个引入其中。质粒制备中使用的模板和引物示于下表8中。
[0172]
[表8]
[0173][0174]
使用上述模板和引物扩增基因片段后，使用in-fusion
r hd克隆试剂盒(clontech)将其每个基因片段连接到用spe1-ecorv限制性酶切割的pskh-δfhua载体上。制备的载体命名为pskh-δfhua-pcj1-arog-pcj1-ppsa-pcj1-tkta。
[0175]
关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述载体进行了确认，然后将上述载体通过电穿孔被转化到各野生型大肠埃希氏菌w3110菌株中。将转化的基因通过一次重组(交叉)引入到染色体中，然后通过二次重组(交叉)将质粒区域从染色体切除。对于转化的大肠埃希氏菌菌株(其中完成了二次重组)，使用seq id no:14(正向)和seq id no:26(反向)的引物通过pcr确认了arog、pps、和tkta基因的引入。
[0176]
实施例9：其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和转酮醇酶的活性被增强的菌株中shinorine生产能力的评价
[0177]
将实施例2中制备的peccg117_pcj1_ava_abcd质粒通过电穿孔引入实施例8中制备的其中引入了arog、pps、和tkta基因的菌株和野生型w3110菌株中的每一种菌株，然后将每种转化菌株平皿接种在lb固体培养基上。菌株在37℃培养箱中培养过夜，并将一个铂环的每种菌株的过夜培养物接种到实施例3的25ml滴定培养基中，然后将其在37℃培养箱中以200rpm温育了48小时。结果示于下文表9中。
[0178]
[表9]
[0179][0180]
如上表9中所示，与对照组的浓度相比，其中三种基因(即，arog、pps、和tkta)被组合并增强的菌株中生产的shinorine浓度增加了267％。这是意料之外的结果，显示出与用强启动子置换每个基因的启动子所获得的最大增加的总和相比，超出预期的提高。即，确认了当三种基因(即，arog、pps、和tkta)被组合时，有可能生产更高浓度的shinorine。
[0181]
实施例10：其中3-脱氢奎尼酸脱水酶的活性被失活的菌株的制备
[0182]
为了增加微生物的maa生产能力，制备了其中3-脱氢奎尼酸脱水酶(arod)的活性失活的大肠埃希氏菌菌株。
[0183]
具体地，使用pkd3质粒的氯霉素耐性基因作为基因插入标记，并且使用seq id no:32(正向)和seq id no:33(反向)的引物通过pcr制备包括部分arod基因和pkd3质粒的氯霉素耐性基因的arod缺失盒(arod-deleted cassette)。通过用包括λ红重组酶基因的pkd46质粒转化野生型大肠埃希氏菌w3110菌株和实施例8中制备的其中引入了arog、pps、和tkta基因的菌株，然后使用阿拉伯糖诱导相应基因的表达，来制备感受态细胞。通过电穿孔将arod缺失盒引入到感受态细胞中后，将所得感受态细胞平皿接种在含有30mg/l氯霉素的lb固体培养基上。使用seq id no:34(正向)和seq id no:35(反向)的引物对由此获得的菌株进行pcr，并且通过观察1,300bp的扩增片段来确认arod基因缺失。
[0184]
实施例11：其中3-脱氢奎尼酸脱水酶失活的菌株的shinorine生产能力的评价
[0185]
通过电穿孔将实施例2中制备的peccg117 pcj1_ava_abcd质粒引入到实施例10中制备的其中缺失了arod基因的菌株中，并将所得菌株平皿接种在lb固体培养基上。将菌株在37℃培养箱中培养过夜，并将一个铂环的菌株接种到实施例3的25ml滴定培养基中，将其在37℃培养箱中以200rpm温育48小时。结果示于下文表10中。
[0186]
[表10]
[0187][0188]
如上表10中所示，与其中arog、pps、和tkta基因被增强的生产shinorine的菌株的shinorine浓度相比，在进一步缺失了arod基因的菌株中生产的shinorine浓度增加了66％。w3110δfhua::pcj1-arog-pcj1-ppsa-pcj1-tkta/peccg117_pcj1_ava_abcd菌株是其中增强了arog、pps、和tkta基因的菌株，被命名为cb06-0020，并于2018年2月14日根据布达佩斯条约保藏在韩国微生物保藏中心(kccm)中，且保藏号为kccm12224p。
[0189]
<基于谷氨酸棒杆菌的生产maas的重组微生物的制备及使用其的maas的生产>
[0190]
实施例12：其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶的活性被增强的载体的制备及其shinorine生产能力的评价
[0191]
为了增加微生物的maa生产能力，制备了其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶的活性被增强的大肠埃希氏菌菌株。具体地，基于谷氨酸棒杆菌atcc13032菌株，进一步引入了arog基因(2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶；seq id no:36和seq id no:37)。用于制备质粒的模板和引物示于下表11中。
[0192]
[表11]
[0193][0194]
使用上述模板和引物获得基因片段后，使用in-fusion
r hd克隆试剂盒(clontech)将每个基因片段连接到用ecorv/xbai限制性酶处理的peccg 117和peccg 117_pcj7_gfp_终止子(韩国专利号10-620092，p117-cj7-gfp)载体上。制备的载体分别命名为peccg117_pn_cgl arog和peccg117_pcj7_cgl arog。关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述载体进行了确认。
[0195]
首先，由于棒杆菌属的微生物不能生产shinorine，因此制备了其中引入shinorine生物合成途径的菌株。具体地，使用peccg117_ptrc_ava_abcd作为模板，以及seq id no:42(正向)和seq id no:43(反向)的引物对，对ava_abcd基因进行pcr。通过使用in-fusion
r hd克隆试剂盒(clontech)将约7kb的pcr片段连接到用ndei限制性酶处理的pdztn载体(wo 2009-125992a)，制备了pdztn_ava_abcd。然后，使用seq id no:44(正向)和seq id no:45(反向)的引物对，对o2启动子(韩国专利号10-1632642)的片段进行pcr，并使用in-fusion
r hd克隆试剂盒(clontech)将o2启动子的片段连接到用ndei限制性酶处理的pdztn_ava_abcd，从而制备pdztn_po2_ava_abcd。
[0196]
通过电穿孔将重组质粒转化到野生型atcc13032中(van der rest等人1999)，并通过一次重组(交叉)将质粒引入到染色体中，然后通过二次重组(交叉)将质粒区域从染色体上切除。
[0197]
对于其中每种转化的谷氨酸棒杆菌菌株(完成了二次重组)，使用seq id no:42(正向)和seq id no:43(反向)的基因特异性引物对通过pcr确认了ava_abcd基因的引入。制备的菌株命名为谷氨酸棒杆菌13032δn1021po2_ava_abcd。
[0198]
将peccg117_pn_cgl arog和peccg117_pcj7_cgl arog载体各自通过电穿孔转化到谷氨酸棒杆菌13032δn1021_po2_ava_abcd菌株中。
[0199]
将上述制备的菌株和对照组谷氨酸棒杆菌atcc13032(c.gl 13032)在含有卡那霉素的bhis固体培养基中培养过夜，并将一个铂环的菌株接种到25ml滴定培养基[培养基组成：40g/l的葡萄糖、1g/l的kh2po4、10g/l的(nh4)2so4、5g/l的mgso47h2o、5g/l的nacl、5g/l的酵母提取物、30g/l的碳酸钙：ph7.0]中，将其在37℃培养箱中以200rpm温育48小时。结果示于下表12中。
[0200]
[表12]
[0201][0202]
如上表12中所示，当在含有shinorine生物合成基因的菌株中arog表达水平增加时，shinorine的浓度增加了39％。特别地，当启动子被增强时，确认了shinorine浓度可以提高高达80％。
[0203]
实施例13：其中磷酸烯醇丙酮酸合酶/转酮醇酶的活性被增强的载体的制备及其shinorine生产能力的评价
[0204]
为了增加微生物的maa生产能力，制备了其中tkt或pps的活性被增强的谷氨酸棒杆菌菌株。具体地，基于谷氨酸棒杆菌atcc13032菌株，进一步引入tkt(转酮醇酶；seq id no:95和seq id no:96)或pps(磷酸烯醇丙酮酸合酶；seq id no:97和seq id no:98)。用于制备质粒的模板和引物示于下表13中。
[0205]
[表13]
[0206][0207]
使用in-fusion
r hd克隆试剂盒(clontech)，通过将通过pcr技术(其中模板与引物的组合相匹配)获得的基因片段与用ecorv/xbai限制性酶处理的peccg117、peccg117_ptrc_gfp_终止子、和peccg117_pcj7_gfp_终止子载体连接，制备了载体。制备的载体分别命名为peccg117-pn-tkt/peccg117-pcj7-tkt和peccg117-ptrc-pps/peccg117-pcj7-pps。关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述载体进行了确认，然后将上述载体通过电穿孔法转化到谷氨酸棒杆菌13032δn1021_po2_ava_abcd菌株中。将每种菌株在含有卡那霉素的bhis固体培养基中培养过夜，然后将一个铂环的每种菌株接种到实施例12的25ml滴定培养基中，将其在37℃培养箱中以200rpm温育48小时。结果示于下表14中。
[0208]
[表14]
[0209][0210]
如上表14中所示，确认了当tkt基因或pps基因被增强时，shinorine的生产分别提高高达57％或72％。
[0211]
实施例14：其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶/磷酸烯醇丙酮酸合酶/转酮醇酶的活性被增强的菌株的制备及其的评价
[0212]
为了增加微生物的maa生产能力，制备了其中arog、pps和tkt基因的活性被增强的大肠埃希氏菌菌株，并且为了确认更高maa生产量的存在，进一步失活了3-脱氢奎尼酸脱水酶(arod)。具体地，为了增强arog、pps、和tkt基因，制备了pdz-δarod-pcj7-arog-pcj7-pps-pcj7-tkta质粒。用于制备pdz-δarod-pcj7-arog-pcj7-pps-pcj7-tkta质粒的模板和引物示于下表15中。
[0213]
[表15]
[0214][0215]
首先，为了制备其中缺失了谷氨酸棒杆菌的arod基因(seq id no:89和seq id no:90)的菌株，制备了其中内部缺失了arod基因的开放阅读框的pdz-δarod质粒。通过使用谷氨酸棒杆菌atcc 13032菌株的基因组dna作为模板，以及seq id no:91和seq id no:92以及seq id no:93和seq id no:94作为一对正向和反向引物进行交叉pcr(cross-pcr)，然后将所得的基因片段引入到pdz载体中，实现了pdz-δarod质粒的内部基因缺失。
[0216]
然后，使用上表15中所示的模板和引物通过pcr扩增了arog、pps和tkt基因的每个基因片段，然后将其分别引入到用spei限制性酶切割的pdz-δarod载体中。关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述两种载体进行了确认，然后将上述两种载体通过电穿孔转化到谷氨酸棒杆菌13032δn1021_po2_ava_abcd菌株中。将每种菌株在含有卡那霉素的bhis固体培养基中培养过夜，并将一个铂环的每种菌株的过夜培养物接种到实施例12的25ml的滴定培养基中，将其在37℃培养箱中以200rpm温育48小时。结果示于下表16
中。
[0217]
[表16]
[0218][0219]
如上表16中所示，在三种基因(arog、pps、和tkta)被增强的菌株中生产的shinorine的浓度增加了约25％。确认了即使在通过arod基因的缺失而增加了shinorine生产能力的菌株中，通过这三种基因的组合也可以以高浓度生产shinorine。另外，可以解释，当在组合了三种基因的菌株中进一步失活arod基因时，可以以甚至更高的浓度生产shinorine。
[0220]
<基于酵母的生产maas的重组微生物的制备和使用其的maas的生产>
[0221]
实施例15：生产shinorine的酿酒酵母(s.cerevisiae)菌株的制备
[0222]
为了将酿酒酵母(s.cerevisiae)菌株用作生产shinorine的菌株，将源自多变鱼腥藻atcc29413的shinorine生物合成基因引入到用于酵母表达的载体中。使用gpd启动子将ava_a和ava_b基因插入到prs-413载体中。具体地，通过重叠pcr将pgpd-ava_a区和pgpd-ava_b区连接。用bamhi和sali限制性酶处理了载体和pcr产物，然后使用t4连接酶连接，以制备prs-413-pgpd-ava_a-pgpd-ava_b载体。
[0223]
然后，使用gpd启动子将ava_a和ava_b基因插入到prs-414载体中。具体地，通过重叠pcr将pgpd-ava_c区和pgpd-ava_d区连接，然后将载体和pcr产物用bamhi和sali处理，并用t4连接酶连接以制备prs-414-pgpd-ava_c-pgpd-ava_d载体。用于制备载体的引物和模板dna显示在下表17中。
[0224]
[表17]
[0225][0226]
通过乙酸锂转化，将prs-413-pgpd-ava_a-pgpd-ava_b载体和prs-414-pgpd-ava_c-pgpd-ava_d载体引入到酿酒酵母cen.pk-1d(s.cerevisiae cen.pk-1d)菌株中，然后确认了shinorine生产的存在。将菌株平皿接种在其中不包括trp和his(即，营养缺陷型标记)的合成完全(sc)固体培养基上，然后在30℃培养箱中培养过夜。将一个铂环的在合成完全(sc)固体培养基(其中不包括trp和his)中培养过夜的菌株接种到25ml表18的滴定培养基中，然后在30℃培养箱中以150rpm培养24小时。结果示于下表19中。
[0227]
[表18]
[0228][0229]
[表19]
[0230][0231]
实验结果确认了，不生产shinorine的野生型酿酒酵母菌株由于shinorine生物合成基因的引入而生产了331mg/l的shinorine。
[0232]
实施例16：通过增强酿酒酵母的tkl1(转酮醇酶)而增加shinorine的生产量
[0233]
为了增加maa生产能力，制备了其中tkl1的活性被增强的酿酒酵母菌株。为此目的，通过将tkl1基因(seq id no:110和123)克隆到prs-415-pgpd、prs-415-padh、和prs-415-ptef载体中增强了tkl1基因的表达。
[0234]
prs-415-pgpd载体中包括的gpd启动子是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)和同工酶3(tdh3)基因的启动子，且其包括从thd3基因的orf起始密码子的-674bp至-1bp的序列。
[0235]
prs-415-padh载体中包括的adh启动子是醇脱氢酶(adh1)基因的启动子，且其包括从adh1基因的orf起始密码子的-1,500bp至-1bp的序列。
[0236]
prs-415-ptef载体中包括的tef启动子是翻译延伸因子ef-1α(tef1)基因的启动子，且其包括从tef1基因的orf起始密码子的-500bp至-1bp的序列。
[0237]
具体地，使用下表20的引物对tef1基因进行pcr，并将pcr产物和prs-415-pgpd、prs-415-padh、和prs-415-ptef载体用bamhi和sali限制性酶处理，然后使用t4连接酶连接以制备prs-415-pgpd-tkl1、prs-415-padh-tkl1、和prs-415-ptef-tkl1载体。
[0238]
[表20]
[0239][0240]
然后，将实施例15中制备的用于shinorine生物合成的质粒与prs-415-pgpd-tkl1、prs-415-padh-tkl1、和prs-415-ptef-tkl1一起引入到酿酒酵母cen.pk-1d菌株中，然后将每种所得菌株平皿接种在其中不包括trp、ura、和his的合成完全(sc)固体培养基
上，并在30℃培养箱中培养过夜。将一个铂环的在合成完全(sc)固体培养基(其中不包括trp、ura、和his)中培养过夜的菌株接种到25ml的滴定培养基中，然后在30℃培养箱中以150rpm培养24小时。结果示于下表21中。
[0241]
[表21]
[0242][0243]
如上表21中所示，确认了与wt菌株的shinorine生产量相比，在其中使用gpd启动子增强了tkl1基因表达的菌株中，shinorine生产量增加了。另外，进一步确认了，随着启动子强度增加(即，pgpd>ptef>padh)，shinorine生产量增加了。
[0244]
实施例17：通过增强酿酒酵母的aro4(3-脱氧-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸(dahp)合酶)的shinorine的生产量的增加
[0245]
为了增加maa生产能力，制备了其中aro4的活性被增强的酿酒酵母菌株。为此目的，采用了一种策略，其中通过将aro4基因(seq id no:111和124)克隆到prs-415-pgpd、prs-415-padh、和prs-415-ptef载体中增强了aro4基因的表达。具体地，使用下表22的引物，对aro4基因进行pcr，并且将aro4的pcr产物和prs-415-pgpd、prs-415-padh、和prs-415-ptef载体用bamhi和sali限制性酶处理，然后使用t4连接酶连接以制备prs-415-pgpd-aro4、prs-415-padh-aro4、和prs-415-ptef-aro4载体。
[0246]
[表22]
[0247][0248]
然后，将实施例15中制备的用于shinorine生物合成的质粒与prs-415-pgpd-aro4、prs-415-padh-aro4、和prs-415-ptef-aro4一起引入到酿酒酵母cen.pk-1d菌株中，然后将每种所得菌株平皿接种在其中不包括trp、ura和his的合成完全(sc)固体培养基上，
并在30℃培养箱中培养过夜。将一个铂环的在合成完全(sc)固体培养基(其中不包括trp、ura和his)中培养过夜的菌株接种到25ml的滴定培养基中，然后在30℃培养箱中以150rpm培养24小时。结果示于下表23中。
[0249]
[表23]
[0250][0251][0252]
如上表23中所示，确认了与wt菌株的shinorine的生产量相比，在其中使用gpd启动子增强了aro4基因表达的菌株中，shinorine的生产量增加了187％。
[0253]
实施例18：通过增强酿酒酵母的磷酸烯醇丙酮酸合酶(pps)来增加shinorine的生产量
[0254]
为了增加maa生产能力，制备了其中pps的活性被增强的酿酒酵母菌株。为此目的，采用了一种策略，其中通过将pps基因克隆到prs-415-pgpd、prs-415-padh、和prs-415-ptef载体中增强了pps基因的表达。
[0255]
具体地，使用下表24的引物，对pps基因进行pcr，并将pps的pcr产物和prs-415-pgpd、prs-415-padh、和prs-415-ptef载体用bamhi和sali限制性酶处理，然后用t4连接酶连接以制备prs-415-pgpd-pps、prs-415-padh-pps、和prs-415-ptef-pps载体。
[0256]
[表24]
[0257][0258]
然后，将实施例15中制备的用于shinorine生物合成的质粒与prs-415-pgpd-pps、
prs-415-padh-pps、和prs-415-ptef-pps一起引入到酿酒酵母cen.pk-1d菌株中，并将每种所得到的菌株平皿接种在合成完全(sc)固体培养基(其中不包括trp、ura、和his)上，并在30℃培养箱中培养过夜。将一个铂环的在合成完全(sc)固体培养基(其中不包括trp、ura、和his)中培养过夜的菌株接种到25ml的滴定培养基中，然后在30℃培养箱中以150rpm培养了24小时。结果示于下表25中。
[0259]
[表25]
[0260][0261]
如上表25中所示，确认了与wt菌株的shinorine的生产量相比，在其中pps基因过表达的菌株中，shinorine的生产量增加了70％。另外，进一步确认了，随着启动子强度增加(即，pgpd>ptef>padh)，shinorine的生产量增加了。
[0262]
实施例19：通过在酿酒酵母菌株中tkl1的增强、aro4的增强、和pps基因的引入增加shinorine的生产量
[0263]
基于实施例16、17和18的结果，选择tkl1、aro4、和pps(大肠埃希氏菌)基因作为影响酿酒酵母中shinorine生物合成的有效因子，并尝试通过这三种基因的同时增强来增加shinorine的生物合成。为了这三种基因的引入，制备了prs-415-pgpd-tkl1-pgpd-aro4、和prs-416-pgpd-pps载体。具体地，在通过重叠pcr将pgpd-tkl1区和pgpd-aro4区连接后，将载体和pcr产物用bamhi和sali限制性酶处理，然后用t4连接酶连接，以制备prs-415-pgpd-tkl1-pgpd-aro4载体。
[0264]
然后，对源自大肠埃希氏菌的pps基因进行了pcr。将pps基因的pcr产物和prs-416-pgpd载体用bamhi和sali限制性酶处理，然后用t4连接酶连接以制备prs-416-pgpd-pps载体。用于制备载体的引物和模板dna示于下表26中。
[0265]
[表26]
[0266][0267]
然后，将实施例15中制备的用于shinorine生物合成的质粒与prs-415-pgpd-tkl1-pgpd-aro4和prs-416-pgpd-pps载体一起引入到酿酒酵母cen.pk-1d菌株中，并将每种所得菌株平皿接种在合成完全(sc)固体培养基(其中不包括leu、trp、ura和his)上，并在30℃培养箱中培养过夜。将一个铂环的在合成完全(sc)固体培养基(其中不包括leu、trp、ura和his)中培养过夜的菌株接种到25ml的滴定培养基中，然后在30℃培养箱中以150rpm培养了24小时。结果示于下表27中。
[0268]
[表27]
[0269][0270]
如上表27中所示，确认了与wt菌株的shinorine的生产量相比，在其中三种有效基因(即，pps、tkl1、和aro4)过表达的菌株中，shinorine的生产量显著增加了230％。
[0271]
在本说明书中，省略了可以由本公开所属领域的普通技术人员完全认识和推断的内容的详细描述。除了在本说明书中描述的具体实施方式之外，在不改变本公开的技术精神或必要构成的情况下，各种修改是可能的。因此，可以以不同于本说明书中具体描述和示例的那些方式来实施本公开，这可以被本领域普通技术人员所理解。
[0272]

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