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2021-02-01 18:02:10|
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起点商标网 专利名称：新抗菌化合物的制作方法
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本发明涉及一种新化合物，我们命名为“thiomarinol”，其通式如下所示。本发明也提供了制备thiomarinol的方法，包括利用互生单胞菌属(Alternomonas)的微生物，特别是新互生单胞rava菌种中，标示为SANK73390的一种菌株发酵，该菌株本身也是新的，构成了本发明的一个部分。Thiomarinol具有广泛的治疗，特别是抗菌效果，因此本发明也提供了该化合物用于治疗和预防的组合物和方法。
互生单胞菌属的有机物可从海水中分离出来，其中一些已显示出可以产生具有潜在治疗作用的化合物。例如，已从互生单胞菌的某一种中得到的叫作“Viscebelin”的化合物显示具有抗肿瘤活性。(JapanesePatentKokaiApplicationNumberSho63-27484)。
关于thiomarinol化合物的结构，已经知道一些具有类似结构的抗生素，我们可将这些化合物分为三组。
第一组包括假单胞菌酸，它首先由假单胞菌属spp.中分离。假单胞菌酸包括假单胞菌酸A[由莹光假单胞菌产生，公开在J.Chem.Soc.PerkinTrans.I，294(1977)]，假单胞菌酸B[ibid，318(1977)]，假单胞菌酸C[ibid，2827(1982)]及假单胞菌酸D[ibid，2655(1983)]。假单胞菌酸A的商品名为“bactroban”(Beechan注册商标)，是一种抗菌作用的，2%的皮肤软膏。
已从海洋细菌中得到其它的假单胞菌酸衍生物[Am.Chem.Soc.Abstr.Pap.，200(2)，(1990)]，但是，其中并没有公开任何抗菌效果。
与发明化合物具有类似结构的第二组物质包括具有抗生素全霉素[Helv.Chem.Acta，42，563(1959)]，pyrrothine[J.Am，Chem.Soc.，77，2861(1955)]，硫煌黄菌素[Angew.Chem.，66，745(1954)]，金色抗霉素[J.Am.Chem.Soc.，74，6304(1952)]及其它抗生素的基因。这些抗生素一般由放线菌属产生，以含硫生色团为特征。XenorhabdinsⅠ-Ⅴ是与全霉素相关的物质，也可从细菌中分离(在WO84/01775中公开)。
已对这两组物质的衍生物进行了各种研究，但我们还没有发现公开任何具有thiomarinol分子结构，或者以其性质为特征的化合物。
第三组化合物在出版物如日本申请公开NO.52-102279，54-12375，54-90179，54-103871及54-125672中公开，它公开的假单胞菌酸衍生物具有与thiomarinol类似的结构，但在这里，终端的羧酸被酰胺基取代。这些化合物未显示出可比较的抗菌活性，也未显示出广谱的抗菌活性。实际上，证明这些化合物具有一种比原来的假单胞菌酸较弱的抗生活性的趋势。
上述的任一化合物都不能从互生单胞属spp.中分离，也都与thiomarinol不一致。例如，thiomarinol的结构特点之一是OH基团仅位于6员环及α、β不饱合羰基之间，因此，thiomarinol与现有技术有明显的区别。
本发明目的是提供一种较上述各组抗生素更高效的，具有更广谱抗菌活性的新化合物。
因此，本发明提供了具有通式(Ⅰ)的化合物
本发明还提供了制备thiomarinol的方法，包括培养可以产生thiomarinol的互生单胞菌属微生物，并从培养基中分离出thiomarinol。
本发明还提供了一种药物组合物，包括混有药学上可接受的载体或稀释剂的thiomarinol。
本发明进一步提供了thiomarinol在治疗上的用途，特别是用于细菌感染的治疗和预防。
本发明还进一步提供了thiomarinol用途，即制备药剂以治疗或预防细菌感染。
本发明更进一步提供了治疗或预防细菌感染的方法，该方法包括给患有这种感染或怀疑有感染的哺乳动物，也可以是人，施用有效量的thiomarinol。
从上面的通式可以很清楚地看到thiomarinol含有一系列的不对称碳原子及几个双键。thiomarinol中的α，β-不饱和羰基部分异构化是极其可能的，因此，thiomarinol可以形成多种的光学及几何异构体。虽然这些都由一个分子式表示，但本发明包括含外消旋物的单个，分离的异构体又包括它们的混合物，利用立体有择合成技术或者采用光学活性物质作为初始反应物，可以直接制备单个的异构体。另一方面，如果制得异构体的混合物，通过常规的拆分技术，也可得到单个异构体。
自然界中存在的thiomarinol倾向于采用标准光学构型。因此，尽管也提供其它构型，自然构型是优选的。
thiomarinol可以通过培养互生单胞菌属的，可产生thiomarinol的微生物制备，然后从培养基中收集thiomarinol。具有所需抗菌活性的thiomarinol的变体，也可以类似的方法，从可产生所需化合物的互生单胞菌的菌株或菌种中得到，或者，也可将上述发酵得到的化合物作适当的修饰得到，或者，也可直接化学合成。
特别地，我们很愿意利用这样的微生物，新种的互生单胞rava及特别是新分离出的互生单胞rava菌株，该菌株我们所给的标示号为SANK73390。菌株73390是一种海洋微生物，从海水中分离，在日本的Koina，Minami-IzvMachi，Shizuoka.Prefecture海滨收集，该菌株于1991.4.30，其入藏号为FERMBP-3381，按照BudapestTreaty术语，保藏于保藏机构，ResearchInstituteofMicrobiologicalTechnology，AgencyofIndustrialScience&Technology，日本。
互生单胞rava菌株SANK73390的分类学特征如下。
1.形态特征互生单胞rava菌株SANK73390在海水琼脂(Difico)中于23℃培养24小时，随后显微镜观察揭示细胞为杆状，每个直径0.8到1.0μm，长度2.0到3.6μm。该菌株为格兰氏阴性，利用极性单鞭毛的方式运动。
2.在海水琼脂中的生长SANK73390在海水琼脂(Difco)在23℃培养24小时，观察得到的菌落呈浅灰黄色、不透明、圆而平，完整。不形成水溶性色素。
3.生理性质(1)海水的要求SANK73390的生长需要海水。
(2)氧化发酵试验(Hugh-Leifson方法[J.Bact.，6624-26(1953)]，在人造海水的培养基中制备)碳水化物无反应。
(3)氧化酶+(4)催化酶+(5)氧气的要求需氧的(6)硝酸盐的还原-(7)淀粉水解+(8)琼脂的分解-(9)明胶的液化+(10)DN酶的产生+(11)脂酶的产生+(12)生长温度4℃生长不好，17℃和26℃生长良好，在35℃没有生长。
(13)生长因素的要求在JournalofBacteriology107，268-294(1971)描述的基本培养基中，SANK73390的需要不含维生素的酪蛋白氨基酸。
(14)对碳源的吸收在JournalofBacteriology107，268-294(1971)描述的基础培养基中，加入0.1%w/v不含维生素酪蛋白氨基酸，振荡培养
表L-阿拉伯糖-D-核糖-D-木糖-D-葡萄糖+D-半乳糖-D-果糖-麦芽糖+蔗糖-茧蜜糖+纤维二糖-蜜二糖-甘露醇-山梨糖醇-甘油-乙酸钠+丙酸钠+4.化学分类学特征(1)DNA中的mol%的鸟嘌呤及胞嘧啶(G+C含量)43.4%(HPLC方法)(2)醌系统泛醌Q-8考虑到上述分类学上的特点，互生单胞rava菌株SANK73390可与在Bergey'sManualofSystematicBacteriology，Vol.，1(1984)中描述过的菌株，以及与在theInternationJournalofSystematicBcateriology最近的出版物中描述的菌株比较。我们发现，互生单胞rava菌株SANK73390，与另一海洋微生物互生单胞citrea具有一定的类似性。SANK73390及互生单胞citrea、ATCC29719(标准株)，可作相应地培养，作相应地比较。
比起SANK73390的浅灰黄色，ATCC29719菌落呈绿黄色。SANK73390在4℃生长，以及利用海藻糖及丙酸钠作为碳源的能力方面也与互生单胞citrea不同。因此互生单胞rava菌株SANK73390是新种互生单胞rava中的一种新菌株，其基本特征不同于最新知的，入藏号为NO.ATCC29719的菌种。
上述的特点是SANK73390典型的特点。然而，很清楚，不论在自然和人工情况下，互生单胞菌属spp.的特征都是可变的。上述限定的特点是对保藏的互生单胞rava的限制，对其余可产生thiomarinol或其自然界中的变体的互生单胞菌菌株、或互生单胞菌菌种来说，这些特点并不一定是典型的。其它的菌株也包括在本发明范围之内。
我们意识到SANK73390，或任意其它能产生thiomarinol或它的变体的菌株，可以通过再培养或利用生物技术改变或修饰以产生具有不同特征的有机物。唯一的要求是所得有机物能产生所需化合物。
这样的改变和修饰可以采取任意所需形式，或者是随着培养条件而发生。例如，菌株可以通过培养进行修饰，以便有选择地显示如提高生长或在较低/高温度下生长的特性。
生物技术修饰通常是有意识的，并且可以选择性地引入各种特征，比如对抑菌剂的抵抗力或敏感性，或二者的结合，为了保持纯度，或者允许对培养，特别是接种培养不时地纯化。
在互生单胞菌spp.中，通过遗传学处理引入其它特征是可以允许的，例如合并质体编码抵抗力，或除去自然界中存在的质体。有利的质体包括那些具有营养缺陷型的质体，可以从任何适当的源获得质体，或可通过分离自然界存在的互生单胞菌属质体及插入一种所需基因或另一个源的基因组。可以根据需要以任何其它方法也可修饰自然界中的质体。
为了从合适微生物的培养中得到thiomarinol，该微生物应该在适当的培养基中发酵。这样的培养基在本领域是熟知的，而且是在生产其它发酵产品的过程中经常使用的。
一般地，培养基必须由碳源、氮源、通过相关微生物吸收的一种或多种无机盐一起组成。对培养基的最低要求是它必须含有供微生物生长的基本成份。
合适的碳源包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖醇、甘油、糊精、麦片、黑麦、玉米淀粉、土豆、玉米粉、大豆粉、棉籽油、糖浆、柠檬酸、酒石酸，任意一种可以单独或与其它的一种或多种结合使用。尽管其用量随需要及所需的结果而改变一般用量大约在培养基的量中1-10%w/v范围内。
合适的氮源包括含蛋白质的任何物质，有代表性的氮源的例子是来自于动物和植物的有机氮源，也可从这样的氮源象大豆粉、糠、花生粉、棉籽粉、酪蛋白的水解产物，fermamine、鱼粉、玉米浸泡液、胨、肉提取物、酵母、酵母提取物、麦芽提取物;及来自这样的无机氮源像硝酸钠、硝酸铵和硫酸铵。象碳源一样，这些氮源也可单独或结合使用。其合适的用量一般情况下大约在培养基量的0.1-6%w/v范围内。
合适的营养无机盐是可提供微量元素及盐的主要组成部分的那些。优选的，盐应能提供这样的离子如钠、钾、铵、钙、镁、铁、磷酸盐、硫酸盐、氯化物、碳酸盐。这样的微量金属如钴、锰、锶或者也可是能产生这样离子的盐如溴化物、氟化物、硼酸盐或硅酸盐离子。
我们知道互生单胞rava天然存在于海水中，因此，不用提示，理想的培养条件应与海洋环境相对应。因此，在海水中发现微量离子最好包括使用任何培养基培养互生单胞菌。
如果微生物作液体培养发酵，优选采用防沫剂如(聚)硅氧烷油或菜油，或者可采用其它合适的表面活性剂。
虽然对pH仅有的要求是不阻止微生物生长，或不相反地不可逆地影响最后产物的量，但在利用互生单胞rava菌株SANK73390生产thiomarinol时，培养基中的pH范围优选，保持在pH5.0到pH8.0。加入过量的酸或碱停止发酵也是优选的方法。
总的来说，互生单胞rava菌株SANK73390生长温度范围为4℃-32℃，在17℃-26℃生长良好。其它未包括在该范围内的温度也可能适用于一个已经发育的菌株，它可以在更低或更高的温度下生长。为产生thiomarinol，优选的温度范围为20℃-26℃。
理想地，thiomarinol可通过有氧培养得到，可以采用任意合适的有氧培养技术，例如可以使用固体培养，振荡培养或换气搅拌培养。
如果进行规模小培养，通常优选的是20℃-26℃振荡培养发酵几天。
为开始发酵培养，优选的技术是采用经一或两个步骤，比如在锥形瓶中制得的一个起始接种物。在培养基中碳源或氮源可结合使用。接种瓶于23℃在恒温箱中振荡1-3天，或者振荡直到可以观察到足够的生长。所得的接种培养物可再用来接种第二步接种培养，或者用来产生培养物。如果第二步接种培养完成了，也可以类似的方式进行，并且部份用于接种以产生培养基。将被接种的瓶在合适温度下振荡1-3天，或者振荡到可得到最大量的产物。完成接种后，瓶中内容可通过离心或过滤收集。
如果培养是大规模进行，优选的是在合适的换气搅拌发酵桶中培养。在这个步骤中，营养培养基的制备也是在发酵桶中进行。在125℃消毒后，冷却培养基并且接种一个先在经消毒的培养基中长成的接种物。培养是在20-26℃，在搅拌和有氧的条件下进行。该步骤适合得到大批量的产物。
随培养时间变化产生thiomarinol的量，例如，可以通过高效液相色谱监测。总之，经过19-96小时，产生的thiomarinol的量达到最大值。
经过一般合适的培养后，thiomarinol可以采用任何已知的方法分离和纯化。例如，存在于肉汤培养基中的thiomarinol可以通过滤除固体，如可用硅藻土作助滤器，或者根据thiomarinol的物化性质，离心后从上清液中萃取、纯化得到;又例如，存在于滤液或上清液中的thiomarinol，可在中性或酸性条件下，用与水不混溶的有机溶剂，如乙酸乙酯、氯仿、二氯乙烷、二氯甲烷或其任意混合物萃取异纯化。
此外，作为吸附剂，可以使用活性碳或吸附树脂，如AmberliteXAD-2、XAD-4(Rohm&Haas)或DiaionHP-10、HP-20、CHP-20、HP-50(MitsubishiKaseiCorporation)。含有thiomarinol的液体通过吸附层吸附后，杂质可被除去;或者，吸附后thiomarinol也可用合适的洗脱剂，如甲醇水溶液，丙酮水溶液或丁醇/水，洗脱而纯化。
胞内的thiomarinol可用-合适的溶剂，如50-90%丙酮水溶液或甲醇水溶液萃取，再除去有机溶剂，接着按上述的对滤液或上清液的方法萃取，进行纯化。
得到的thiomarinol可以采用熟知的技术进一步纯化，例如使用含载体的吸附色谱柱，载体如硅胶或镁硅胶，如商品名为“Florisil”的硅胶;采用吸附剂，如SephadexLH-20(Pharmacia产品的商品名)的分配色谱柱;或采用正相或反相柱的高效液相色谱。为分离和纯化所需的最终产物，这些分离和纯化步骤可单独作用或适当地结合使用，并且，若需要，也可重复使用，这一点在本领域是熟知的。
当本发明化合物用于治疗时，它们可以单独或按一合适的药物制剂给药，该制剂除活性化合物之外，还含有一种或多种常规的稀释剂、载体、赋形剂或辅剂。当然制剂的形式取决于给药的途径。然而，口服时，该化合物优选制成粉剂、粒剂、片剂、胶囊或糖浆。肠胃外给药，优选制成注射液(可为静脉、肌肉或此下)或滴剂或栓剂。
制剂的可按已知的方法制备，通过加入这样的添加剂如赋形剂、粘接剂、脱水剂、润滑剂、稳定剂、矫正药、溶解剂、悬浮剂或涂剂。虽然剂量取决于患者的症状和年龄、感染的性质和严重程度、给药的途径和方式，但在成年患者口服情况下，通常每日服用本发明化合物的剂量为20mg到2000mg。该化合物可以以单一剂量，或分成几个剂量，如一天分两或三次服用。
由于thiomarinol对动物(例如。人、狗、猫、兔)中的格兰氏阴性及格兰氏阳性菌的抗菌作用，经常需要使用局部给药，一般情况是以霜剂、软膏剂或凝胶的形式。对这些给药方式的制剂和制备与上面有类似的考虑。
下面实施例用以说明thiomarinol的制备及其抗菌活性，但无论如何不应解释为对本发明的限制。
实施例1thiomarinol的罐发酵A)培养互生单胞rava株SANK73390于22℃、在海水琼脂(Difco产品)中斜面培养3天，所得培养物悬浮于3ml人造海水中。0.1ml这种悬浮液作防腐处理后接种入含有100ml灭菌过的介质[37.4g海水肉汤(Difcop产品)于1L去离子水中，不调pH]的500ml锥形瓶中。
该瓶，于23℃恒温24小时，同时采用旋转搅拌器，于200rpm(旋转半径70mm)振荡。经过这段时间后，四个30L发酵桶中每一个都含有15L上述灭菌过的介质，然后各用15ml取自锥形瓶的经防腐处理的培养物接种。发酵桶在搅拌下(100rpm)，在氧气流速为7.5升/分钟时，在23℃恒温23小时。
B)分离23小时后，合并发酵桶中的内含物产生60L培养液。该液体的pH值通过加入盐酸调到3，接着加入60L丙酮，搅拌下，将反应混合物萃取30分钟。用1.2Kg硅藻土545助滤器(JohnsManvilleCo.产品的商品名)过滤该溶液。110L所得滤液用60L乙酸乙酯再萃取一次，再每次用30L乙酸乙酯萃取两次。有机相用30L5%w/v碳酸氢钠水溶液洗涤，再用30L饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，通过减压蒸发浓缩到干，得到14g油状物。
将该油状物溶于二氯甲烷中，所得溶液吸附到二氯甲烷的200g硅胶柱上。按照二氯甲烷/乙酸乙酯;乙酸乙酯;乙酸乙酯/甲醇提高展开剂的极性，将标题化合物洗脱。洗脱液每18ml收集一次，这样用乙酸乙酯/甲醇洗脱的部份含有的thiomarinol可保留。
通过蒸发将保留的部份浓缩到干得到7g油状物，溶于400ml50%的(体积比)甲醇水溶液中，再吸附到水浸的装有DiaionHP-20(从MitsubishiChem.Ind.所得产品的商品名)的600ml柱上。经50%v/v的甲醇水溶液洗涤后，将标题化合物用90%v/v的甲醇水溶液洗脱，经减压浓缩到干后可得到1g黄色粉末。将黄色粉末奖在有SephadexLH-20的色谱柱上进一步洗脱，并用二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇(体积比19∶19∶2)展开，收集活性组份，得到750mg的thiomarinol黄色粉末。
所得的thiomarinol性质如下1)性质与外观黄色粉末。
2)熔点84-89℃。
3)分子式C30H44N2O9S2。
4)分子量640，由FAB-MS法测定(“FAB-MS”为快速原子轰击质谱)。
5)高分辨质谱C30H45N2O9S2[(M+H)+通过FAB-MS法]计算值641.2567实测值641.2585。
6)元素分析计算值C，56.23%;H，6.92%;N，4.37%;S，10.01%实测值C，55.92%;H，6.82%;N，4.23%;S，9.90%7)红外吸收谱红外谱显示下列吸收峰(KBr disc法，Vmaxcm-1)3394，2930，1649，1598，1526，1288，1216，1154，1102，1052。
8)紫外吸收谱在甲醇、或甲醇+HCl中，thiomarinol具有下面紫外吸收谱[以λmaxnm(ε)给出]387(12，000)，300(3，500)，214(26，000)及在甲醇+NaOH中，具有下面紫外吸收谱[以λmaxnm(ε)给出]
386(9，600)，306(3，200)，206(25，000)9)旋光度[α]25D＝+4.3°(C＝1.0，甲醇)10)高效液相色谱分离柱Senshu-PakODSH-2151(柱尺寸，6×150mm，SenshuScientificCo.，Ltd产品)溶剂40%v/v乙腈水溶液流速1.5ml/分钟波长220-350nm(通过光电二极管组探测)保留时间5.9分钟11)1H-核磁共振谱(δppm)核磁共振谱(270Hz)如下如示，在十六氘代的二甲亚砜中，采用四甲基硅烷作内标。
0.91(3H，双峰，J＝6.8Hz);
0.95(3H，双峰，J＝5.9Hz);
1.30(6H，宽多重峰);
1.55(5H，宽多重峰);
2.03(3H，单峰);
2.09(3H，多重峰);
2.34(2H，三重峰，J＝7.3Hz);
3.33(1H，双峰，J＝10.7Hz);
3.52(2H，多重峰);
3.64(2H，多重峰);
3.73(1H，两个双重峰);
4.02(2H，三重峰，J＝6.6Hz);
4.18(1H，宽双峰，J＝7.3Hz);
4.30(1H，双峰，J＝4.4Hz);
4.44(1H，双峰，J＝7.8Hz);
4.63(1H，双峰，J＝3.4Hz);
4.89(1H，双峰，J＝7.3Hz);
5.37(2H，多重峰);
5.97(1H，宽单峰);
7.04(1H，单峰);
9.80(1H，宽单峰);
10.68(1H，宽单峰);
12)13C-核磁共振谱(δppm)核磁共振谱(68MHz)如下所示在四氘代甲醇中，采用四甲基硅烷作为内标。
174.3(单峰)，170.4(单峰)，168.6(单峰)，161.1(单峰)，137.9(单峰)，135.7(双峰)，135.1(单峰)，129.8(双峰)，116.3(双峰)，115.8(单峰)，113.7(双峰)，77.6(双峰)，74.4(双峰)，72.1(双峰)，71.8(双峰)，66.0(三峰)，65.7(双峰)，64.9(三峰)，45.3(双峰)，43.9(双峰)，36.6(三峰)，33.4(三峰)，30.1(三峰)，30.0(三峰)，29.7(三峰)，27.0(三峰)，26.7(三峰)，20.3(四峰)，16.6(四峰)，16.3(四峰)，
13)溶解度溶解于醇如甲醇、乙醇、丙醇及丁醇;并溶解于二甲亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、乙酸乙酯、丙酮及乙醚;不溶于己烷及水。
14)颜色反应对硫酸、碘及高锰酸钾呈阳性;
15)薄层层析Rf值0.57吸附剂硅胶(Merck&Co.，Inc.，Art5715)展开剂二氯甲烷∶甲醇＝85∶15体积比试验例1thiomarinol的抗菌活性thiomarinol抗格兰氏阳性及格兰氏阴性菌的最低抑菌浓度(MIC)，以μg/ml形式给出，通过琼脂培养基的稀释方法，使用的是营养琼脂培养基(EikenchemicalCo.，Ltd的产品)测定。
结果在表1中给出。
表1试验菌株MTC(μg/ml)金黄色葡萄球菌209P≤0.01金黄色葡萄球菌56R≤0.01金黄色葡萄球菌535(MRSA)≤0.01粪链球菌6810.02大肠埃希氏菌NHIJ0.8
大肠埃希氏菌6090.8肠炎沙门氏菌0.4肺炎杆菌8060.8肺炎杆菌846(R)0.2阴沟肠杆菌9631.5粘氏沙雷菌11843.1普通变形菌14200.05摩氏摩根菌15106.2铜绿假单胞菌10010.2铜绿假单胞菌N070.4试验例2thiomarinol的抗支原体活性按照试验例1同样的方法，测定thiomarinol抗各种支原体的活性。结果在下表2中给出。
表2株MTC(μg/ml)Mycoplasma bovis Donetta0.0125鸡败血支原体PG-310.05鸡败血支原体S-60.10鸡败血支原体K-10.05Mycoplasma synoviae WVU 1853<0.006
Mycoplasma hyosvnoviae S-160.025接种物0.005ml的105CFU/ml培养基的测定M.bovis及鸡败血支原体CHanock培养基[按P.N.A.S.，48，41-49(1962)所述的制备，并补充20%马血清]M.synoiaeFrey培养基[按Am.J.Vet.Res.，29，2163-2171(1968)所述的制备，并补充12%猪血清]M.hyosynoviae Mucin PPLO＊琼脂培养基(补充15%马血清)培养条件37℃，5天，需少量氧(BBL气体装置法[在任意的CO2发生装置Becton Dickinson Microbiology Systems，Cockeysville，MD 2103 USA中培养])＊-PPLO(类胸膜肺炎菌有机物)PPLO无CV肉汤(Difco)21g粘蛋白细菌学(Difco)5g蒸馏水800mlNoble琼脂(Difco)12g马血清150ml25%酵母提取物50ml
权利要求
1.制备通式化合物的方法
该方法包括培养能产生所说化合物的互生单胞菌属的微生物，并从所说的培养物中分离出该化合物。
2.制备具有下述性质的化合物的方法，该方法包括培养能产生所说化合物的互生单胞菌属的微生物，并从所说的培养物中分离出该化合物。性质与外观黄色粉末;熔点84-89℃;分子式C30H44N2O9S2;分子量640，由FAB-MS法测定(“FAB-MS”为快速原子轰击质谱)。高分辨质谱C30H45N2O9S2[(M+H)+通过FAB-MS法]计算值641.2567实测值641.2585。元素分析计算值C，56.23%;H，6.92%;N，4.37%;S，10.01%实测值C，55.92%;H，6.82%;N，4.23%;S，9.90%红外吸收谱红外谱显示下列吸收峰(KBr disc法，Vmaxcm-1)3394，2930，1649，1598，1526，1288，1216，1154，1102，1052。紫外吸收谱在甲醇、或甲醇+HCl中，thiomarinol具有下面紫外吸收谱[以λmaxnm(ε)给出]387(12，000)，300(3，500)，214(26，000)及在甲醇+NaOH中，具有下面紫外吸收谱[以λmaxnm(ε)给出]386(9，600)，306(3，200)，206(25，000)旋光度[α]25D＝+4.3°(C＝1.0，甲醇)高效液相色谱分离柱Senshu-Pak ODSH-2151(柱尺寸，6×150mm，Senshu Scientific Co.，Ltd产品)溶剂40%v/v乙腈水溶液流速1.5ml/分钟波长220-350nm(通过光电二极管组探测)保留时间5.9分钟1H-核磁共振谱(δppm)核磁共振谱(270Hz)如下如示，在十六氘代的二甲亚砜中，采用四甲基硅烷作内标。0.91(3H，双峰，J＝6.8Hz);0.95(3H，双峰，J＝5.9Hz);1.30(6H，宽多重峰);1.55(5H，宽多重峰);2.03(3H，单峰);2.09(3H，多重峰);2.34(2H，三重峰，J＝7.3Hz);3.33(1H，双峰，J＝10.7Hz);3.52(2H，多重峰);3.64(2H，多重峰);3.73(1H，两个双峰);4.02(2H，三重峰，J＝6.6Hz);4.18(1H，宽双峰，J＝7.3Hz);4.30(1H，双峰，J＝4.4Hz);4.44(1H，双峰，J＝7.8Hz);4.63(1H，双峰，J＝3.4Hz);4.89(1H，双峰，J＝7.3Hz);5.37(2H，多重峰);5.97(1H，宽单峰);7.04(1H，单峰);9.80(1H，宽单峰);10.68(1H，宽单峰);13C-核磁共振谱(δppm)核磁共振谱(68MHz)如下所示在四氘代甲醇中，采用四甲基硅烷作为内标。174.3(单峰)，170.4(单峰)，168.6(单峰)，161.1(单峰)，137.9(单峰)，135.7(双峰)，135.1(单峰)，129.8(双峰)，116.3(双峰)，115.8(单峰)，113.7(双峰)，77.6(双峰)，74.4(双峰)，72.1(双峰)，71.8(双峰)，66.0(三峰)，65.7(双峰)，64.9(三峰)，45.3(双峰)，43.9(双峰)，36.6(三峰)，33.4(三峰)，30.1(三峰)，30.0(三峰)，29.7(三峰)，27.0(三峰)，26.7(三峰)，20.3(四峰)，16.6(四峰)，16.3(四峰)，溶解度溶解于醇如甲醇、乙醇、丙醇及丁醇;并溶解于二甲亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、乙酸乙酯、丙酮及乙醚中;不溶于己烷及水。颜色反应对硫酸、碘及高锰酸钾呈阳性;薄层层析Rf值0.57吸附剂硅胶(Merck & Co.，Inc.，Art 5715)展开剂二氯甲烷∶甲醇＝85∶15体积比
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所说的微生物为互生单胞rava。
4.根据权利要求3所述的方法，其所说的微生物为互生单胞rava菌株SANK 73390，由入藏号FERM BP-3381识别。
全文摘要
本发明涉及一种可从互生单胞菌属中得到的新抗菌化合物，并且该化合物与假单胞菌酸的结构有类似性。
文档编号C07D495/06GK1067921SQ9210438
公开日1993年1月13日 申请日期1992年5月7日 优先权日1991年5月7日
发明者高桥秀次, 盐泽秀幸, 春山英幸, 加贺崎武之, 小玉健太郎, 石井晃 申请人:三共株式会社
技术领域：
本发明涉及一种新化合物，我们命名为“thiomarinol”，其通式如下所示。本发明也提供了制备thiomarinol的方法，包括利用互生单胞菌属(Alternomonas)的微生物，特别是新互生单胞rava菌种中，标示为SANK73390的一种菌株发酵，该菌株本身也是新的，构成了本发明的一个部分。Thiomarinol具有广泛的治疗，特别是抗菌效果，因此本发明也提供了该化合物用于治疗和预防的组合物和方法。
互生单胞菌属的有机物可从海水中分离出来，其中一些已显示出可以产生具有潜在治疗作用的化合物。例如，已从互生单胞菌的某一种中得到的叫作“Viscebelin”的化合物显示具有抗肿瘤活性。(JapanesePatentKokaiApplicationNumberSho63-27484)。
关于thiomarinol化合物的结构，已经知道一些具有类似结构的抗生素，我们可将这些化合物分为三组。
第一组包括假单胞菌酸，它首先由假单胞菌属spp.中分离。假单胞菌酸包括假单胞菌酸A[由莹光假单胞菌产生，公开在J.Chem.Soc.PerkinTrans.I，294(1977)]，假单胞菌酸B[ibid，318(1977)]，假单胞菌酸C[ibid，2827(1982)]及假单胞菌酸D[ibid，2655(1983)]。假单胞菌酸A的商品名为“bactroban”(Beechan注册商标)，是一种抗菌作用的，2%的皮肤软膏。
已从海洋细菌中得到其它的假单胞菌酸衍生物[Am.Chem.Soc.Abstr.Pap.，200(2)，(1990)]，但是，其中并没有公开任何抗菌效果。
与发明化合物具有类似结构的第二组物质包括具有抗生素全霉素[Helv.Chem.Acta，42，563(1959)]，pyrrothine[J.Am，Chem.Soc.，77，2861(1955)]，硫煌黄菌素[Angew.Chem.，66，745(1954)]，金色抗霉素[J.Am.Chem.Soc.，74，6304(1952)]及其它抗生素的基因。这些抗生素一般由放线菌属产生，以含硫生色团为特征。XenorhabdinsⅠ-Ⅴ是与全霉素相关的物质，也可从细菌中分离(在WO84/01775中公开)。
已对这两组物质的衍生物进行了各种研究，但我们还没有发现公开任何具有thiomarinol分子结构，或者以其性质为特征的化合物。
第三组化合物在出版物如日本申请公开NO.52-102279，54-12375，54-90179，54-103871及54-125672中公开，它公开的假单胞菌酸衍生物具有与thiomarinol类似的结构，但在这里，终端的羧酸被酰胺基取代。这些化合物未显示出可比较的抗菌活性，也未显示出广谱的抗菌活性。实际上，证明这些化合物具有一种比原来的假单胞菌酸较弱的抗生活性的趋势。
上述的任一化合物都不能从互生单胞属spp.中分离，也都与thiomarinol不一致。例如，thiomarinol的结构特点之一是OH基团仅位于6员环及α、β不饱合羰基之间，因此，thiomarinol与现有技术有明显的区别。
本发明目的是提供一种较上述各组抗生素更高效的，具有更广谱抗菌活性的新化合物。
因此，本发明提供了具有通式(Ⅰ)的化合物
本发明还提供了制备thiomarinol的方法，包括培养可以产生thiomarinol的互生单胞菌属微生物，并从培养基中分离出thiomarinol。
本发明还提供了一种药物组合物，包括混有药学上可接受的载体或稀释剂的thiomarinol。
本发明进一步提供了thiomarinol在治疗上的用途，特别是用于细菌感染的治疗和预防。
本发明还进一步提供了thiomarinol用途，即制备药剂以治疗或预防细菌感染。
本发明更进一步提供了治疗或预防细菌感染的方法，该方法包括给患有这种感染或怀疑有感染的哺乳动物，也可以是人，施用有效量的thiomarinol。
从上面的通式可以很清楚地看到thiomarinol含有一系列的不对称碳原子及几个双键。thiomarinol中的α，β-不饱和羰基部分异构化是极其可能的，因此，thiomarinol可以形成多种的光学及几何异构体。虽然这些都由一个分子式表示，但本发明包括含外消旋物的单个，分离的异构体又包括它们的混合物，利用立体有择合成技术或者采用光学活性物质作为初始反应物，可以直接制备单个的异构体。另一方面，如果制得异构体的混合物，通过常规的拆分技术，也可得到单个异构体。
自然界中存在的thiomarinol倾向于采用标准光学构型。因此，尽管也提供其它构型，自然构型是优选的。
thiomarinol可以通过培养互生单胞菌属的，可产生thiomarinol的微生物制备，然后从培养基中收集thiomarinol。具有所需抗菌活性的thiomarinol的变体，也可以类似的方法，从可产生所需化合物的互生单胞菌的菌株或菌种中得到，或者，也可将上述发酵得到的化合物作适当的修饰得到，或者，也可直接化学合成。
特别地，我们很愿意利用这样的微生物，新种的互生单胞rava及特别是新分离出的互生单胞rava菌株，该菌株我们所给的标示号为SANK73390。菌株73390是一种海洋微生物，从海水中分离，在日本的Koina，Minami-IzvMachi，Shizuoka.Prefecture海滨收集，该菌株于1991.4.30，其入藏号为FERMBP-3381，按照BudapestTreaty术语，保藏于保藏机构，ResearchInstituteofMicrobiologicalTechnology，AgencyofIndustrialScience&Technology，日本。
互生单胞rava菌株SANK73390的分类学特征如下。
1.形态特征互生单胞rava菌株SANK73390在海水琼脂(Difico)中于23℃培养24小时，随后显微镜观察揭示细胞为杆状，每个直径0.8到1.0μm，长度2.0到3.6μm。该菌株为格兰氏阴性，利用极性单鞭毛的方式运动。
2.在海水琼脂中的生长SANK73390在海水琼脂(Difco)在23℃培养24小时，观察得到的菌落呈浅灰黄色、不透明、圆而平，完整。不形成水溶性色素。
3.生理性质(1)海水的要求SANK73390的生长需要海水。
(2)氧化发酵试验(Hugh-Leifson方法[J.Bact.，6624-26(1953)]，在人造海水的培养基中制备)碳水化物无反应。
(3)氧化酶+(4)催化酶+(5)氧气的要求需氧的(6)硝酸盐的还原-(7)淀粉水解+(8)琼脂的分解-(9)明胶的液化+(10)DN酶的产生+(11)脂酶的产生+(12)生长温度4℃生长不好，17℃和26℃生长良好，在35℃没有生长。
(13)生长因素的要求在JournalofBacteriology107，268-294(1971)描述的基本培养基中，SANK73390的需要不含维生素的酪蛋白氨基酸。
(14)对碳源的吸收在JournalofBacteriology107，268-294(1971)描述的基础培养基中，加入0.1%w/v不含维生素酪蛋白氨基酸，振荡培养
表L-阿拉伯糖-D-核糖-D-木糖-D-葡萄糖+D-半乳糖-D-果糖-麦芽糖+蔗糖-茧蜜糖+纤维二糖-蜜二糖-甘露醇-山梨糖醇-甘油-乙酸钠+丙酸钠+4.化学分类学特征(1)DNA中的mol%的鸟嘌呤及胞嘧啶(G+C含量)43.4%(HPLC方法)(2)醌系统泛醌Q-8考虑到上述分类学上的特点，互生单胞rava菌株SANK73390可与在Bergey'sManualofSystematicBacteriology，Vol.，1(1984)中描述过的菌株，以及与在theInternationJournalofSystematicBcateriology最近的出版物中描述的菌株比较。我们发现，互生单胞rava菌株SANK73390，与另一海洋微生物互生单胞citrea具有一定的类似性。SANK73390及互生单胞citrea、ATCC29719(标准株)，可作相应地培养，作相应地比较。
比起SANK73390的浅灰黄色，ATCC29719菌落呈绿黄色。SANK73390在4℃生长，以及利用海藻糖及丙酸钠作为碳源的能力方面也与互生单胞citrea不同。因此互生单胞rava菌株SANK73390是新种互生单胞rava中的一种新菌株，其基本特征不同于最新知的，入藏号为NO.ATCC29719的菌种。
上述的特点是SANK73390典型的特点。然而，很清楚，不论在自然和人工情况下，互生单胞菌属spp.的特征都是可变的。上述限定的特点是对保藏的互生单胞rava的限制，对其余可产生thiomarinol或其自然界中的变体的互生单胞菌菌株、或互生单胞菌菌种来说，这些特点并不一定是典型的。其它的菌株也包括在本发明范围之内。
我们意识到SANK73390，或任意其它能产生thiomarinol或它的变体的菌株，可以通过再培养或利用生物技术改变或修饰以产生具有不同特征的有机物。唯一的要求是所得有机物能产生所需化合物。
这样的改变和修饰可以采取任意所需形式，或者是随着培养条件而发生。例如，菌株可以通过培养进行修饰，以便有选择地显示如提高生长或在较低/高温度下生长的特性。
生物技术修饰通常是有意识的，并且可以选择性地引入各种特征，比如对抑菌剂的抵抗力或敏感性，或二者的结合，为了保持纯度，或者允许对培养，特别是接种培养不时地纯化。
在互生单胞菌spp.中，通过遗传学处理引入其它特征是可以允许的，例如合并质体编码抵抗力，或除去自然界中存在的质体。有利的质体包括那些具有营养缺陷型的质体，可以从任何适当的源获得质体，或可通过分离自然界存在的互生单胞菌属质体及插入一种所需基因或另一个源的基因组。可以根据需要以任何其它方法也可修饰自然界中的质体。
为了从合适微生物的培养中得到thiomarinol，该微生物应该在适当的培养基中发酵。这样的培养基在本领域是熟知的，而且是在生产其它发酵产品的过程中经常使用的。
一般地，培养基必须由碳源、氮源、通过相关微生物吸收的一种或多种无机盐一起组成。对培养基的最低要求是它必须含有供微生物生长的基本成份。
合适的碳源包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖醇、甘油、糊精、麦片、黑麦、玉米淀粉、土豆、玉米粉、大豆粉、棉籽油、糖浆、柠檬酸、酒石酸，任意一种可以单独或与其它的一种或多种结合使用。尽管其用量随需要及所需的结果而改变一般用量大约在培养基的量中1-10%w/v范围内。
合适的氮源包括含蛋白质的任何物质，有代表性的氮源的例子是来自于动物和植物的有机氮源，也可从这样的氮源象大豆粉、糠、花生粉、棉籽粉、酪蛋白的水解产物，fermamine、鱼粉、玉米浸泡液、胨、肉提取物、酵母、酵母提取物、麦芽提取物;及来自这样的无机氮源像硝酸钠、硝酸铵和硫酸铵。象碳源一样，这些氮源也可单独或结合使用。其合适的用量一般情况下大约在培养基量的0.1-6%w/v范围内。
合适的营养无机盐是可提供微量元素及盐的主要组成部分的那些。优选的，盐应能提供这样的离子如钠、钾、铵、钙、镁、铁、磷酸盐、硫酸盐、氯化物、碳酸盐。这样的微量金属如钴、锰、锶或者也可是能产生这样离子的盐如溴化物、氟化物、硼酸盐或硅酸盐离子。
我们知道互生单胞rava天然存在于海水中，因此，不用提示，理想的培养条件应与海洋环境相对应。因此，在海水中发现微量离子最好包括使用任何培养基培养互生单胞菌。
如果微生物作液体培养发酵，优选采用防沫剂如(聚)硅氧烷油或菜油，或者可采用其它合适的表面活性剂。
虽然对pH仅有的要求是不阻止微生物生长，或不相反地不可逆地影响最后产物的量，但在利用互生单胞rava菌株SANK73390生产thiomarinol时，培养基中的pH范围优选，保持在pH5.0到pH8.0。加入过量的酸或碱停止发酵也是优选的方法。
总的来说，互生单胞rava菌株SANK73390生长温度范围为4℃-32℃，在17℃-26℃生长良好。其它未包括在该范围内的温度也可能适用于一个已经发育的菌株，它可以在更低或更高的温度下生长。为产生thiomarinol，优选的温度范围为20℃-26℃。
理想地，thiomarinol可通过有氧培养得到，可以采用任意合适的有氧培养技术，例如可以使用固体培养，振荡培养或换气搅拌培养。
如果进行规模小培养，通常优选的是20℃-26℃振荡培养发酵几天。
为开始发酵培养，优选的技术是采用经一或两个步骤，比如在锥形瓶中制得的一个起始接种物。在培养基中碳源或氮源可结合使用。接种瓶于23℃在恒温箱中振荡1-3天，或者振荡直到可以观察到足够的生长。所得的接种培养物可再用来接种第二步接种培养，或者用来产生培养物。如果第二步接种培养完成了，也可以类似的方式进行，并且部份用于接种以产生培养基。将被接种的瓶在合适温度下振荡1-3天，或者振荡到可得到最大量的产物。完成接种后，瓶中内容可通过离心或过滤收集。
如果培养是大规模进行，优选的是在合适的换气搅拌发酵桶中培养。在这个步骤中，营养培养基的制备也是在发酵桶中进行。在125℃消毒后，冷却培养基并且接种一个先在经消毒的培养基中长成的接种物。培养是在20-26℃，在搅拌和有氧的条件下进行。该步骤适合得到大批量的产物。
随培养时间变化产生thiomarinol的量，例如，可以通过高效液相色谱监测。总之，经过19-96小时，产生的thiomarinol的量达到最大值。
经过一般合适的培养后，thiomarinol可以采用任何已知的方法分离和纯化。例如，存在于肉汤培养基中的thiomarinol可以通过滤除固体，如可用硅藻土作助滤器，或者根据thiomarinol的物化性质，离心后从上清液中萃取、纯化得到;又例如，存在于滤液或上清液中的thiomarinol，可在中性或酸性条件下，用与水不混溶的有机溶剂，如乙酸乙酯、氯仿、二氯乙烷、二氯甲烷或其任意混合物萃取异纯化。
此外，作为吸附剂，可以使用活性碳或吸附树脂，如AmberliteXAD-2、XAD-4(Rohm&Haas)或DiaionHP-10、HP-20、CHP-20、HP-50(MitsubishiKaseiCorporation)。含有thiomarinol的液体通过吸附层吸附后，杂质可被除去;或者，吸附后thiomarinol也可用合适的洗脱剂，如甲醇水溶液，丙酮水溶液或丁醇/水，洗脱而纯化。
胞内的thiomarinol可用-合适的溶剂，如50-90%丙酮水溶液或甲醇水溶液萃取，再除去有机溶剂，接着按上述的对滤液或上清液的方法萃取，进行纯化。
得到的thiomarinol可以采用熟知的技术进一步纯化，例如使用含载体的吸附色谱柱，载体如硅胶或镁硅胶，如商品名为“Florisil”的硅胶;采用吸附剂，如SephadexLH-20(Pharmacia产品的商品名)的分配色谱柱;或采用正相或反相柱的高效液相色谱。为分离和纯化所需的最终产物，这些分离和纯化步骤可单独作用或适当地结合使用，并且，若需要，也可重复使用，这一点在本领域是熟知的。
当本发明化合物用于治疗时，它们可以单独或按一合适的药物制剂给药，该制剂除活性化合物之外，还含有一种或多种常规的稀释剂、载体、赋形剂或辅剂。当然制剂的形式取决于给药的途径。然而，口服时，该化合物优选制成粉剂、粒剂、片剂、胶囊或糖浆。肠胃外给药，优选制成注射液(可为静脉、肌肉或此下)或滴剂或栓剂。
制剂的可按已知的方法制备，通过加入这样的添加剂如赋形剂、粘接剂、脱水剂、润滑剂、稳定剂、矫正药、溶解剂、悬浮剂或涂剂。虽然剂量取决于患者的症状和年龄、感染的性质和严重程度、给药的途径和方式，但在成年患者口服情况下，通常每日服用本发明化合物的剂量为20mg到2000mg。该化合物可以以单一剂量，或分成几个剂量，如一天分两或三次服用。
由于thiomarinol对动物(例如。人、狗、猫、兔)中的格兰氏阴性及格兰氏阳性菌的抗菌作用，经常需要使用局部给药，一般情况是以霜剂、软膏剂或凝胶的形式。对这些给药方式的制剂和制备与上面有类似的考虑。
下面实施例用以说明thiomarinol的制备及其抗菌活性，但无论如何不应解释为对本发明的限制。
实施例1thiomarinol的罐发酵A)培养互生单胞rava株SANK73390于22℃、在海水琼脂(Difco产品)中斜面培养3天，所得培养物悬浮于3ml人造海水中。0.1ml这种悬浮液作防腐处理后接种入含有100ml灭菌过的介质[37.4g海水肉汤(Difcop产品)于1L去离子水中，不调pH]的500ml锥形瓶中。
该瓶，于23℃恒温24小时，同时采用旋转搅拌器，于200rpm(旋转半径70mm)振荡。经过这段时间后，四个30L发酵桶中每一个都含有15L上述灭菌过的介质，然后各用15ml取自锥形瓶的经防腐处理的培养物接种。发酵桶在搅拌下(100rpm)，在氧气流速为7.5升/分钟时，在23℃恒温23小时。
B)分离23小时后，合并发酵桶中的内含物产生60L培养液。该液体的pH值通过加入盐酸调到3，接着加入60L丙酮，搅拌下，将反应混合物萃取30分钟。用1.2Kg硅藻土545助滤器(JohnsManvilleCo.产品的商品名)过滤该溶液。110L所得滤液用60L乙酸乙酯再萃取一次，再每次用30L乙酸乙酯萃取两次。有机相用30L5%w/v碳酸氢钠水溶液洗涤，再用30L饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，通过减压蒸发浓缩到干，得到14g油状物。
将该油状物溶于二氯甲烷中，所得溶液吸附到二氯甲烷的200g硅胶柱上。按照二氯甲烷/乙酸乙酯;乙酸乙酯;乙酸乙酯/甲醇提高展开剂的极性，将标题化合物洗脱。洗脱液每18ml收集一次，这样用乙酸乙酯/甲醇洗脱的部份含有的thiomarinol可保留。
通过蒸发将保留的部份浓缩到干得到7g油状物，溶于400ml50%的(体积比)甲醇水溶液中，再吸附到水浸的装有DiaionHP-20(从MitsubishiChem.Ind.所得产品的商品名)的600ml柱上。经50%v/v的甲醇水溶液洗涤后，将标题化合物用90%v/v的甲醇水溶液洗脱，经减压浓缩到干后可得到1g黄色粉末。将黄色粉末奖在有SephadexLH-20的色谱柱上进一步洗脱，并用二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇(体积比19∶19∶2)展开，收集活性组份，得到750mg的thiomarinol黄色粉末。
所得的thiomarinol性质如下1)性质与外观黄色粉末。
2)熔点84-89℃。
3)分子式C30H44N2O9S2。
4)分子量640，由FAB-MS法测定(“FAB-MS”为快速原子轰击质谱)。
5)高分辨质谱C30H45N2O9S2[(M+H)+通过FAB-MS法]计算值641.2567实测值641.2585。
6)元素分析计算值C，56.23%;H，6.92%;N，4.37%;S，10.01%实测值C，55.92%;H，6.82%;N，4.23%;S，9.90%7)红外吸收谱红外谱显示下列吸收峰(KBr disc法，Vmaxcm-1)3394，2930，1649，1598，1526，1288，1216，1154，1102，1052。
8)紫外吸收谱在甲醇、或甲醇+HCl中，thiomarinol具有下面紫外吸收谱[以λmaxnm(ε)给出]387(12，000)，300(3，500)，214(26，000)及在甲醇+NaOH中，具有下面紫外吸收谱[以λmaxnm(ε)给出]
386(9，600)，306(3，200)，206(25，000)9)旋光度[α]25D＝+4.3°(C＝1.0，甲醇)10)高效液相色谱分离柱Senshu-PakODSH-2151(柱尺寸，6×150mm，SenshuScientificCo.，Ltd产品)溶剂40%v/v乙腈水溶液流速1.5ml/分钟波长220-350nm(通过光电二极管组探测)保留时间5.9分钟11)1H-核磁共振谱(δppm)核磁共振谱(270Hz)如下如示，在十六氘代的二甲亚砜中，采用四甲基硅烷作内标。
0.91(3H，双峰，J＝6.8Hz);
0.95(3H，双峰，J＝5.9Hz);
1.30(6H，宽多重峰);
1.55(5H，宽多重峰);
2.03(3H，单峰);
2.09(3H，多重峰);
2.34(2H，三重峰，J＝7.3Hz);
3.33(1H，双峰，J＝10.7Hz);
3.52(2H，多重峰);
3.64(2H，多重峰);
3.73(1H，两个双重峰);
4.02(2H，三重峰，J＝6.6Hz);
4.18(1H，宽双峰，J＝7.3Hz);
4.30(1H，双峰，J＝4.4Hz);
4.44(1H，双峰，J＝7.8Hz);
4.63(1H，双峰，J＝3.4Hz);
4.89(1H，双峰，J＝7.3Hz);
5.37(2H，多重峰);
5.97(1H，宽单峰);
7.04(1H，单峰);
9.80(1H，宽单峰);
10.68(1H，宽单峰);
12)13C-核磁共振谱(δppm)核磁共振谱(68MHz)如下所示在四氘代甲醇中，采用四甲基硅烷作为内标。
174.3(单峰)，170.4(单峰)，168.6(单峰)，161.1(单峰)，137.9(单峰)，135.7(双峰)，135.1(单峰)，129.8(双峰)，116.3(双峰)，115.8(单峰)，113.7(双峰)，77.6(双峰)，74.4(双峰)，72.1(双峰)，71.8(双峰)，66.0(三峰)，65.7(双峰)，64.9(三峰)，45.3(双峰)，43.9(双峰)，36.6(三峰)，33.4(三峰)，30.1(三峰)，30.0(三峰)，29.7(三峰)，27.0(三峰)，26.7(三峰)，20.3(四峰)，16.6(四峰)，16.3(四峰)，
13)溶解度溶解于醇如甲醇、乙醇、丙醇及丁醇;并溶解于二甲亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、乙酸乙酯、丙酮及乙醚;不溶于己烷及水。
14)颜色反应对硫酸、碘及高锰酸钾呈阳性;
15)薄层层析Rf值0.57吸附剂硅胶(Merck&Co.，Inc.，Art5715)展开剂二氯甲烷∶甲醇＝85∶15体积比试验例1thiomarinol的抗菌活性thiomarinol抗格兰氏阳性及格兰氏阴性菌的最低抑菌浓度(MIC)，以μg/ml形式给出，通过琼脂培养基的稀释方法，使用的是营养琼脂培养基(EikenchemicalCo.，Ltd的产品)测定。
结果在表1中给出。
表1试验菌株MTC(μg/ml)金黄色葡萄球菌209P≤0.01金黄色葡萄球菌56R≤0.01金黄色葡萄球菌535(MRSA)≤0.01粪链球菌6810.02大肠埃希氏菌NHIJ0.8
大肠埃希氏菌6090.8肠炎沙门氏菌0.4肺炎杆菌8060.8肺炎杆菌846(R)0.2阴沟肠杆菌9631.5粘氏沙雷菌11843.1普通变形菌14200.05摩氏摩根菌15106.2铜绿假单胞菌10010.2铜绿假单胞菌N070.4试验例2thiomarinol的抗支原体活性按照试验例1同样的方法，测定thiomarinol抗各种支原体的活性。结果在下表2中给出。
表2株MTC(μg/ml)Mycoplasma bovis Donetta0.0125鸡败血支原体PG-310.05鸡败血支原体S-60.10鸡败血支原体K-10.05Mycoplasma synoviae WVU 1853<0.006
Mycoplasma hyosvnoviae S-160.025接种物0.005ml的105CFU/ml培养基的测定M.bovis及鸡败血支原体CHanock培养基[按P.N.A.S.，48，41-49(1962)所述的制备，并补充20%马血清]M.synoiaeFrey培养基[按Am.J.Vet.Res.，29，2163-2171(1968)所述的制备，并补充12%猪血清]M.hyosynoviae Mucin PPLO＊琼脂培养基(补充15%马血清)培养条件37℃，5天，需少量氧(BBL气体装置法[在任意的CO2发生装置Becton Dickinson Microbiology Systems，Cockeysville，MD 2103 USA中培养])＊-PPLO(类胸膜肺炎菌有机物)PPLO无CV肉汤(Difco)21g粘蛋白细菌学(Difco)5g蒸馏水800mlNoble琼脂(Difco)12g马血清150ml25%酵母提取物50ml
权利要求
1.制备通式化合物的方法
该方法包括培养能产生所说化合物的互生单胞菌属的微生物，并从所说的培养物中分离出该化合物。
2.制备具有下述性质的化合物的方法，该方法包括培养能产生所说化合物的互生单胞菌属的微生物，并从所说的培养物中分离出该化合物。性质与外观黄色粉末;熔点84-89℃;分子式C30H44N2O9S2;分子量640，由FAB-MS法测定(“FAB-MS”为快速原子轰击质谱)。高分辨质谱C30H45N2O9S2[(M+H)+通过FAB-MS法]计算值641.2567实测值641.2585。元素分析计算值C，56.23%;H，6.92%;N，4.37%;S，10.01%实测值C，55.92%;H，6.82%;N，4.23%;S，9.90%红外吸收谱红外谱显示下列吸收峰(KBr disc法，Vmaxcm-1)3394，2930，1649，1598，1526，1288，1216，1154，1102，1052。紫外吸收谱在甲醇、或甲醇+HCl中，thiomarinol具有下面紫外吸收谱[以λmaxnm(ε)给出]387(12，000)，300(3，500)，214(26，000)及在甲醇+NaOH中，具有下面紫外吸收谱[以λmaxnm(ε)给出]386(9，600)，306(3，200)，206(25，000)旋光度[α]25D＝+4.3°(C＝1.0，甲醇)高效液相色谱分离柱Senshu-Pak ODSH-2151(柱尺寸，6×150mm，Senshu Scientific Co.，Ltd产品)溶剂40%v/v乙腈水溶液流速1.5ml/分钟波长220-350nm(通过光电二极管组探测)保留时间5.9分钟1H-核磁共振谱(δppm)核磁共振谱(270Hz)如下如示，在十六氘代的二甲亚砜中，采用四甲基硅烷作内标。0.91(3H，双峰，J＝6.8Hz);0.95(3H，双峰，J＝5.9Hz);1.30(6H，宽多重峰);1.55(5H，宽多重峰);2.03(3H，单峰);2.09(3H，多重峰);2.34(2H，三重峰，J＝7.3Hz);3.33(1H，双峰，J＝10.7Hz);3.52(2H，多重峰);3.64(2H，多重峰);3.73(1H，两个双峰);4.02(2H，三重峰，J＝6.6Hz);4.18(1H，宽双峰，J＝7.3Hz);4.30(1H，双峰，J＝4.4Hz);4.44(1H，双峰，J＝7.8Hz);4.63(1H，双峰，J＝3.4Hz);4.89(1H，双峰，J＝7.3Hz);5.37(2H，多重峰);5.97(1H，宽单峰);7.04(1H，单峰);9.80(1H，宽单峰);10.68(1H，宽单峰);13C-核磁共振谱(δppm)核磁共振谱(68MHz)如下所示在四氘代甲醇中，采用四甲基硅烷作为内标。174.3(单峰)，170.4(单峰)，168.6(单峰)，161.1(单峰)，137.9(单峰)，135.7(双峰)，135.1(单峰)，129.8(双峰)，116.3(双峰)，115.8(单峰)，113.7(双峰)，77.6(双峰)，74.4(双峰)，72.1(双峰)，71.8(双峰)，66.0(三峰)，65.7(双峰)，64.9(三峰)，45.3(双峰)，43.9(双峰)，36.6(三峰)，33.4(三峰)，30.1(三峰)，30.0(三峰)，29.7(三峰)，27.0(三峰)，26.7(三峰)，20.3(四峰)，16.6(四峰)，16.3(四峰)，溶解度溶解于醇如甲醇、乙醇、丙醇及丁醇;并溶解于二甲亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、乙酸乙酯、丙酮及乙醚中;不溶于己烷及水。颜色反应对硫酸、碘及高锰酸钾呈阳性;薄层层析Rf值0.57吸附剂硅胶(Merck & Co.，Inc.，Art 5715)展开剂二氯甲烷∶甲醇＝85∶15体积比
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所说的微生物为互生单胞rava。
4.根据权利要求3所述的方法，其所说的微生物为互生单胞rava菌株SANK 73390，由入藏号FERM BP-3381识别。
全文摘要
本发明涉及一种可从互生单胞菌属中得到的新抗菌化合物，并且该化合物与假单胞菌酸的结构有类似性。
文档编号C07D495/06GK1067921SQ9210438
公开日1993年1月13日 申请日期1992年5月7日 优先权日1991年5月7日
发明者高桥秀次, 盐泽秀幸, 春山英幸, 加贺崎武之, 小玉健太郎, 石井晃 申请人:三共株式会社
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