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2021-02-01 17:02:44|
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起点商标网 专利名称：N-苯硫脲衍生物及其药物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及N-苯硫脲衍生物以及它们的药物用途。
它涉及式Ⅰ化合物
其中R1为丙基，异丙基或2-甲基丙基;
R2为原子序数为9到35的囟素，而且，R3为碳原子数为1至4的烷基。
R1最好是丙基或2-甲基丙基。R2最好是氯。R3最好是甲基、乙基、异丙基或叔丁基，优选的是甲基、乙基或异丙基，特别是甲基。
在一类式Ⅰ化合物中，R1为丙基，或2-甲基丙基以及R3为碳原子数为1至3的烷基;更加优选的，R1为丙基，R2为氟或氯，R3为甲基或乙基;尤其优选的是，R3为甲基，R1为2-甲基乙基。
一些式Ⅰ化合物可以有一不对称中心。因此，一个这样的化合物有两个对映体。所有可能的同分异构体及外消旋体都在本发明的范围中。这些化合物最好没有任何不对称中心。
碳原子数为1至4的烷基优选的为甲基或乙基，特别是乙基。囟素优选的为氯。
一类式Ⅰ化合物中(化合物Ⅰp)R3不是4个碳原子的烷基。
在还有一类式Ⅰ化合物中，R3不是多于一个碳原子的烷基。
另一类式Ⅰ化合物可经如下方法获得。它包括将式Ⅱ对应的化合物
其中，R2与R3同前定义，与式Ⅲ对应的化合物
其中R1同前定义，发生反应。
上述式Ⅰ化合物的制备方法可以按传统方法进行。
它是一个异硫氰酸酯与胺的反应。反应温度优选地为约10°至约40℃，优选地为约20°至约30℃。常使用无水惰性有机溶剂，如囟化低级烷烃，即二氯甲烷或是C1-3烷基(C2-3)烷酮盐，即乙酸乙酯。
式Ⅰ的化合物可用传统方法从反应混合物中分离，若需要，可提纯。
有不对称中心的化合物可用任意纯度的原料得到不同纯度的产物。
原料的制备方法不在此处描述，作为原料的化合物是周知的，或可从已知化合物用已知方法制得，即如描述于实施例中的那样。
以下用实施例来说明本发明。所有温度均为摄氏温度。MP即熔点。
实施例一N-(5-氯-2-甲基苯基)-N′-丙硫脲。
(R1为正丙基;R2为氯;R3为甲基)163克正丙胺(式Ⅲ化合物)在40分钟内滴加到溶于700毫升乙酸乙酯中的390克5-氯-2-甲苯基异硫氰酸(式Ⅱ化合物)中，在氮气氛下，于15℃搅拌，控制其滴加速度使温度保持在25°～30℃。滴加完毕后，反应混合物在25～30℃下搅拌5分钟，加入2.1升正庚烷，然后混合物在20分钟内冷却至0℃。所得白色悬浮液于0℃搅拌1小时，真空过滤收集固体，用冷的(5℃)正庚烷洗涤两次，每次250毫升，并在25毫米汞柱1240℃时干燥约18个小时至恒重。便获得标题化合物(白色固体，MP为97-98℃)。
实施例二N-(5-氯-2-甲苯基)-N′-2-甲基丙硫脲。
(R1为2-甲基丙基;R2为氯;R3为甲基)将25.0克 5-氯-2-甲苯基异硫氰酸酯溶于25毫升二氯甲烷所得的溶液，一滴滴加入到克溶于150毫升二氯甲烷的10.0克异丁胺(式Ⅲ化合物)溶液中，于20～25℃下搅拌，反应混合物于20～25℃搅拌2个小时。蒸馏二氯甲烷，而且，在蒸馏的同时慢慢加入甲基叔丁基醚。所得的甲基叔丁基醚溶液可冷却至20～25℃，经过滤收集所得固体，用甲基叔丁基醚洗涤并真空干燥至恒重。即获标题化合物(MP 为114～116℃)。
用类似实施例一和二的方法可获得如下式Ⅰ化合物实施例 R1R2R3MPNo.
3 -CH(CH3)2-Cl -CH3126°-128°4 -CH2CH2CH3-Cl -CH2CH379°-81°5 -CH2CH2CH3-F -CH368°-71°6 -CH2CH2CH3-Br -CH3109°-112°式Ⅰ化合物有着有趣的药理学活性。它们可用作药物。
特别地，它们提高了血清中高密度脂蛋白(HDL;HDL-胆固醇)及阿朴脂蛋的A-I(脱辅基A-I)含量。化合物中大多数有着降低血清中甘油三酯含量的功效。
这种功效可通过传统鉴定方法来得到证实，即，如下述a)试验A柱身HDL-胆固醇试验雄性Sprague-Dawley鼠，体重200～225克，每笼两只，喂食Purina Rodent Chow Special Mix 5001-S加上0.25%胆酸和0.75%胆固醇及Purina和水随意达7或8天。然后每种试验物在增加的食谱上用于6只鼠一组达8或21天。在服食食物、试验物及试验结束时记录体重及食物消耗情况。一般说试验物的剂量为4～200毫克/千克/天。
实验结束时，麻醉所有的试验用鼠，放血，收集其血液，凝结时保持冰点温度，分离，然后血清即被分离出来，用氯化钠溶液调整一等分试样密度为1.06克/毫升，然后冰冻贮存过夜。其它残余血清等分试样则冰冻贮存。
HDL通过微超速离心法(mUC)或快速蛋白液层析法(FPLC)技术得到离析。mUC方法如下所述175微升的密度调整为1.06克/毫升的血清试样于20℃在Beckmann 42.2Ti旋机上以4200转/分离心2.5小时。95微升从顶部分出，而80微升则在下面。FPLC分离方法是采用Kieftet al.J.Lipid Res.32(1991年，第859～866页)上的方法，通过France et al.，Latoratory Robotics and Automation 2(1990年，第155～173页)上所述的改良技术，用Superose 6(有着干缘直径为20～40微米的高度交联凸缘琼脂糖)冻胶溶透层析法来进行。所用柱缓冲剂为Tris缓冲块溶液(即，0.05摩尔浓度Tris(2-氨基-2-羟基甲基-1，3-丙二醇)及0.15摩尔浓度的含0.01%叠氮化钠，溶于蒸馏的去离子水(ddHO)的氯化钠溶液。注入200微升血清，40份0.5毫升分级试样则收存起来。
用Sigma鉴定仪来分析总体，42.2Ti旋转机底部及FPLC分级试样的胆固醇，以鉴定胆固醇的酶分析，方法第352号，改为使用96凹陷式微向型滴定盘。在PH＝6.5的缓冲液中，再生试剂(加了水以后)含300U/l胆固醇氧化酶，100/外胆固醇酯酶，1000U/l过氧化物酶(辣根)，0.3毫摩尔/升4-氨基安替比林及30.0毫摩尔/升对羟基苯磺酸盐。这种方法用胆固醇酯酶来水解胆固醇酯以游离出胆固醇。氧化游离态的胆固醇以产生过氧化氢用来形成醌亚胺染料。因为该反应定量地进行，染料的浓度，通过比色可测得，直接与样品中胆固醇含量成比例。校准液，校准液及样品可用盐水稀释，若胆固醇浓度使得读数在线性范围之外的话。
20微升校准液，校准液或试样与200微升等分试剂于96凹陷式微滴定盘内混合。每一混合物在20～25℃恒温25分钟，然后用一比色微滴定盘读数器在490492或500nm处读取吸光度。
位于上部的胆固醇(即，LDL-胆固醇)可通过减法得出。微超速离心法的定性分离可用科尔宁(Corning)大众琼脂糖冻胶电流与Fat红色7B着色剂来分析。
FPLC分级试样阿朴A-I含量可根据France et al.，I.Lipid Res 30(1989年，第1997～2004页)上的非减量SDS-PAGE方法来分析。通过鉴定含阿朴A-I及不含免疫反应的阿朴B蛋白分级试样胆固醇含量来定量分析HDL-胆固醇。
血清中总甘油三酯可用Mannheim诊断Reagentset甘油三酯-GB仪(Cat第877557号)，经如下方法改良微滴定盘鉴定法来测量根据前述方法制备试剂。100微升工作溶液及20微升稀释血清[1∶1血清∶盐水(盐水为0.15摩尔浓度的溶于ddH O的氯化钠溶液]分别加到两个96凹陷式微滴定盘，混合并在20～25℃时恒温至少5分钟。100微升工作溶液2加到每个盘中，然后混合并于20～25℃时恒温至少5分钟。100微升工作溶液2加到每个盘中，然后混合并于20～25℃时恒温至少5分钟，然后在490，492或500nm处读数。血清中甘油三酯总含量(mg/dl)通过对比已知样品的吸光度来计算得出。
可用其它传统方法来鉴定血清样品中HDL-胆固醇及甘油三酯总含量。
b)试验B阿朴A-I试验通过如下鼠阿朴A-I酶交联免疫吸附剂鉴定法(ELISA)来分析试验A中试验动物的阿朴A-I血清含量1.兔子防鼠疫阿朴A-I抗体的产生与提纯通过连续的超速离心法及鼠高密度脂蛋白(HDL)的分离从沉淀的鼠血清中提纯鼠可朴A-I。尾随着脱酯质酶，通过冻胶过滤层析法，阿朴A-I从其它HDL-蛋白中解析出来。从传统的免疫原始记录中，通过连续皮下注射提纯了的鼠阿朴A-I，在三种兔子(Pocono兔子场，Candensis，PA)产生了血清抗体。经过一年的重复放血，血清抗体沉淀，等分及于-20℃冰冻。原血清抗体除去泡沫，加入到活化的溴化氰Sepharose Cl-4B(有着干缘直径为60～140微米的凸缘琼脂糖)柱，它与提纯了的人类HDL共价键接，用盐水洗涤柱，提纯的抗体用1M PH＝3的甘氨酸溶液洗脱。用Tris缓冲盐溶液通过透析来除去甘氨酸以获得提纯了的兔子防鼠疫阿朴A-I抗体的浓缩液。
2.缓冲液，试剂及标准液-碳酸钠吸附缓冲液2.25克碳酸钠，4.40克碳酸氢钠及0.15克叠氮化钠溶于1.4升ddH2O中，用氢氧化钠调整PH值为9.6，缓冲液用ddH O衡释至总体积为1.5升;
-PH＝8，0.5M Tris溶液60.55克Tris.HCl(2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇.盐酸盐)溶于1.0升ddH2O溶液，用10N氢氧化钠溶液调PH值至8.0;
-次抗体缓冲液200毫升PH＝8的0.5MTris溶液加到溶于1.8升ddH2O含40克中血清蛋白(BSA)Cohn级数五的溶液中，加入0.2克叠氮化钠及18.0克氯化钠;
-底物缓冲液0.1克叠氮化钠搅拌加入到105.1克二乙醇胺及500毫升ddH2O中，加入10毫升0.5M六水氯化镁溶液，用12N盐酸调PH为9.8，然后用ddH2O稀释至总体积为1升;
-30X ELISA洗涤缓冲液525.96克氯化钠，76.68克Tris，6克叠氮化钠和30毫升Tween 20[聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯]混合，用12N盐酸调PH值至7.3，然后用ddH2O稀释至总体积为2升;
-1X ELISA洗涤缓冲液由一体积30 X ELISA洗涤缓冲液与29体积ddH2O稀释而成;
-样品稀释缓冲液886.34毫升次抗体缓冲液与113.66毫升Tween 20充分混合获得11.366%(体积比)Tween 20溶液;
-标准稀释缓冲液(A)780毫升次抗体缓冲液与220毫升Tween 20充分混合获得22%(体积比)Tween 20溶液。(B)890毫升次抗体缓冲液及110毫升Tween 20充分混合获得11%(体积比)的Tween 20溶液;
-鼠血清沉淀A用这种鼠血清来绘制每次鉴定中的标准曲线。用以校准提纯化的阿朴A-Ⅰ和含有45±2.7毫克阿朴A-Ⅰ/dl血清;
-鼠血清沉淀B在每次鉴定中用作低内标以监测漂移及含40毫克阿朴A-Ⅰ/dl血清;
-鼠血清沉淀C来自用所提化合物(二甲苯氧庚酸)处理过的老鼠，用作监测鉴定漂移得含70毫克阿朴A-Ⅰ/dl血清的高内标。
3.试验程序含942微克/毫升的冰冻提纯了的鼠阿朴A-I用碳酸钠吸附缓冲液稀释至最终浓度为3.7微克/毫升。向7个Nunc聚苯乙烯96凹陷式微滴定盘的每个中加入100微升这种溶液。阿朴A-I在4℃，48个小时内吸附到盘内，滴定盘用1X ELISA洗涤缓冲液洗涤，盘中的非特异点用同样在冰冷状态下恒温过夜的次抗体缓冲液(200微升/孔)来填充。所有鉴定盘以这种方式贮存直至使用(三个星期之久)。
鉴定时，ELISA Platees(2个盘，每盘有36种鼠血清样)用1X ELISA洗涤缓冲液刷洗4次。在试样加入前每个盘为有100微升1X ELISA洗涤缓冲液，10微升欲分析的每种鼠血清样品与290微升样品稀释缓冲液混合获得最终1∶30稀释液及11%的最终Tween 20浓度。作为内标鼠血清沉淀B和C的复制成6份样之一试样以同样的方式处理。
2.0毫升鼠血清沉淀A与等体积的标准稀释缓冲液A混合获得1∶2的稀释液及浓度为11%的Tween 20。然后该样品连续用标准稀释缓冲液B稀释以获得1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，和1∶128的稀释液。
非ELISA微滴定盘中的稀释后的标准液及试样量于加热至52℃的恒温稍2小时。与冷却至20～25℃后，洗涤缓冲液从ELISA试验盘中移去，换上75微升标准液及试样。75微升提纯过的防鼠疫阿朴A-I抗体溶液用次抗体缓冲液稀释至1∶75，然后加到每个试验盘。轻摇每个盘使抗体与试样混合，密封后在20～25℃恒温18个小时。恒温后每个盘用1X ELISA洗涤缓冲液洗4次。然后往每个盘加入100微升碱性磷酸酯酶共轭山羊防兔疫IGG抗体，用次抗体缓冲液稀释成1∶1000。并在20～25℃相互反应3个小时。然后重洗每个盘并抽气干燥，向每个盘加含1毫克/毫升硝基苯磷酸酯二钠的底物缓冲液，它是一种色原的底物，其色域与样品中阿朴A-I数量成反比每个盘在ELISA分光光度计监测(至3小时)。当所有没有阿朴A-I(最大色)的盘在405纳米处达到任意密度为1.0时，用ELISA读数器读取每个盘的读数。
标准曲线绘制成任意密度对浓度的对数的函数形式。未知数与该曲线相关，且阿朴A-I含量表示为毫克/dl。
上述试验A与B结果表明，上述化合物的剂量在约10毫克/千克。天至约200毫克/千克。天时是有效的。
因此上述化合物可用于提高血清高密度脂蛋白(HDL;HDL即为胆固醇与阿朴脂蛋白A-I)含量，其中许多也可用于降低血清甘油之酯总含量因而可用于治疗动脉粥样硬化。
使用的准确剂量取决于几个因素，包括宿主、特性及治疗的剧烈情况，施用的方式及特别功效物质。然而，总的来说，实验表明满意的结果是每天剂量为约400毫克至约200毫克，一般是每天分成2至4次使用。
化合物可经各种途径服用，较多地是通过肠内，优选地是口服，即以片剂或胶囊的形式，或不经肠内，即以无菌可注射的溶液或悬浮液的形式。
实施例1，2和3的化合物是优选的，特别是实施例1和2的化合物，尤其是实施例2的化合物。
因而下述活性已被测定
上述结果表明，当作为所述药物用途时，实施例1和2的化合物所需的剂量要比相似服用方法采用常用的二甲苯氧庚酸所需的剂量要低，即口服约400～1000毫克/天。
含有式Ⅰ的化合物以单一形式或药理学上可接受的盐的形式以及与至少一种药理学上可接受的载体或稀释剂共同存在的药物可用一般方法制得。它们可以是，如单位剂量形式，含有如约100毫克至约500毫克的有效组合物。
本发明也涉及一种药物，它包含式Ⅰ化合物以及至少一种药理学上可接受的载体或稀释剂。
它还包含式Ⅰ化合物的药物用途特别是用于动脉粥样硬化的预防或有疗效治疗。
它还涉及一种药物的制备方法，该药物包含式Ⅰ化合物与至少一种药理学上可接受的载体或稀释剂的混合。
它还包含式Ⅰ化合物用于生产一种治疗动脉粥样硬化的药物。
权利要求
1.式Ⅰ化合物
其中R1为丙基，异丙基或2-甲丙基；R2为原子序数为9到35的囟素；且R3为碳原子数为1至4的烷基。
2.权利要求1的化合物，其中R3为4个碳原子的烷基。
3.权利要求1的化合物，其中R1为正丙基，R2为氯和R3为甲基。
4.权利要求1的化合物，其中R1为2-甲丙基，R2为氯和R3为甲基。
5.权利要求1的化合物，其中R1，R2和R3分别是-CH(CH3)2，-Cl， -CH3，或-CH2CH2CH3，-Cl， -CH2CH3，或-CH2CH2CH3，-F， -CH3，或-CH2CH2CH3，-Br， -CH3.
6.权利要求1的化合物的制备方法，其中包含将式Ⅱ对应的化合物
其中R2与R3如权利要求1所定义的那样，与式Ⅲ对应的化合物其中R1为权利要求1所定义的那样，发生反应。
7.一种药物，它包含权利要求1的化合物以及至少一种药理学上可接受的载体或稀释剂。
8.权利要求1的化合物用作药物。
9.一种药物的制备方法，它包含将式Ⅰ化合物与至少一种药理学上可接受的载体或稀释剂混合。
10.权利要求1的化合物，用于生产治疗动脉粥样理化的药物。
全文摘要
本发明涉及式I的化合物，它们可用于治疗动脉粥样硬化。本发明也涉及含有式I化合物的药物。式I的化合物可经一般方法制备，如将异硫氰酸酯与胺反应而得到。
文档编号C07C335/16GK1089257SQ93100330
公开日1994年7月13日 申请日期1993年1月1日 优先权日1993年1月1日
发明者G·M·科波拉, R·E·达蒙 申请人:山道士有限公司
技术领域：
本发明涉及N-苯硫脲衍生物以及它们的药物用途。
它涉及式Ⅰ化合物
其中R1为丙基，异丙基或2-甲基丙基;
R2为原子序数为9到35的囟素，而且，R3为碳原子数为1至4的烷基。
R1最好是丙基或2-甲基丙基。R2最好是氯。R3最好是甲基、乙基、异丙基或叔丁基，优选的是甲基、乙基或异丙基，特别是甲基。
在一类式Ⅰ化合物中，R1为丙基，或2-甲基丙基以及R3为碳原子数为1至3的烷基;更加优选的，R1为丙基，R2为氟或氯，R3为甲基或乙基;尤其优选的是，R3为甲基，R1为2-甲基乙基。
一些式Ⅰ化合物可以有一不对称中心。因此，一个这样的化合物有两个对映体。所有可能的同分异构体及外消旋体都在本发明的范围中。这些化合物最好没有任何不对称中心。
碳原子数为1至4的烷基优选的为甲基或乙基，特别是乙基。囟素优选的为氯。
一类式Ⅰ化合物中(化合物Ⅰp)R3不是4个碳原子的烷基。
在还有一类式Ⅰ化合物中，R3不是多于一个碳原子的烷基。
另一类式Ⅰ化合物可经如下方法获得。它包括将式Ⅱ对应的化合物
其中，R2与R3同前定义，与式Ⅲ对应的化合物
其中R1同前定义，发生反应。
上述式Ⅰ化合物的制备方法可以按传统方法进行。
它是一个异硫氰酸酯与胺的反应。反应温度优选地为约10°至约40℃，优选地为约20°至约30℃。常使用无水惰性有机溶剂，如囟化低级烷烃，即二氯甲烷或是C1-3烷基(C2-3)烷酮盐，即乙酸乙酯。
式Ⅰ的化合物可用传统方法从反应混合物中分离，若需要，可提纯。
有不对称中心的化合物可用任意纯度的原料得到不同纯度的产物。
原料的制备方法不在此处描述，作为原料的化合物是周知的，或可从已知化合物用已知方法制得，即如描述于实施例中的那样。
以下用实施例来说明本发明。所有温度均为摄氏温度。MP即熔点。
实施例一N-(5-氯-2-甲基苯基)-N′-丙硫脲。
(R1为正丙基;R2为氯;R3为甲基)163克正丙胺(式Ⅲ化合物)在40分钟内滴加到溶于700毫升乙酸乙酯中的390克5-氯-2-甲苯基异硫氰酸(式Ⅱ化合物)中，在氮气氛下，于15℃搅拌，控制其滴加速度使温度保持在25°～30℃。滴加完毕后，反应混合物在25～30℃下搅拌5分钟，加入2.1升正庚烷，然后混合物在20分钟内冷却至0℃。所得白色悬浮液于0℃搅拌1小时，真空过滤收集固体，用冷的(5℃)正庚烷洗涤两次，每次250毫升，并在25毫米汞柱1240℃时干燥约18个小时至恒重。便获得标题化合物(白色固体，MP为97-98℃)。
实施例二N-(5-氯-2-甲苯基)-N′-2-甲基丙硫脲。
(R1为2-甲基丙基;R2为氯;R3为甲基)将25.0克 5-氯-2-甲苯基异硫氰酸酯溶于25毫升二氯甲烷所得的溶液，一滴滴加入到克溶于150毫升二氯甲烷的10.0克异丁胺(式Ⅲ化合物)溶液中，于20～25℃下搅拌，反应混合物于20～25℃搅拌2个小时。蒸馏二氯甲烷，而且，在蒸馏的同时慢慢加入甲基叔丁基醚。所得的甲基叔丁基醚溶液可冷却至20～25℃，经过滤收集所得固体，用甲基叔丁基醚洗涤并真空干燥至恒重。即获标题化合物(MP 为114～116℃)。
用类似实施例一和二的方法可获得如下式Ⅰ化合物实施例 R1R2R3MPNo.
3 -CH(CH3)2-Cl -CH3126°-128°4 -CH2CH2CH3-Cl -CH2CH379°-81°5 -CH2CH2CH3-F -CH368°-71°6 -CH2CH2CH3-Br -CH3109°-112°式Ⅰ化合物有着有趣的药理学活性。它们可用作药物。
特别地，它们提高了血清中高密度脂蛋白(HDL;HDL-胆固醇)及阿朴脂蛋的A-I(脱辅基A-I)含量。化合物中大多数有着降低血清中甘油三酯含量的功效。
这种功效可通过传统鉴定方法来得到证实，即，如下述a)试验A柱身HDL-胆固醇试验雄性Sprague-Dawley鼠，体重200～225克，每笼两只，喂食Purina Rodent Chow Special Mix 5001-S加上0.25%胆酸和0.75%胆固醇及Purina和水随意达7或8天。然后每种试验物在增加的食谱上用于6只鼠一组达8或21天。在服食食物、试验物及试验结束时记录体重及食物消耗情况。一般说试验物的剂量为4～200毫克/千克/天。
实验结束时，麻醉所有的试验用鼠，放血，收集其血液，凝结时保持冰点温度，分离，然后血清即被分离出来，用氯化钠溶液调整一等分试样密度为1.06克/毫升，然后冰冻贮存过夜。其它残余血清等分试样则冰冻贮存。
HDL通过微超速离心法(mUC)或快速蛋白液层析法(FPLC)技术得到离析。mUC方法如下所述175微升的密度调整为1.06克/毫升的血清试样于20℃在Beckmann 42.2Ti旋机上以4200转/分离心2.5小时。95微升从顶部分出，而80微升则在下面。FPLC分离方法是采用Kieftet al.J.Lipid Res.32(1991年，第859～866页)上的方法，通过France et al.，Latoratory Robotics and Automation 2(1990年，第155～173页)上所述的改良技术，用Superose 6(有着干缘直径为20～40微米的高度交联凸缘琼脂糖)冻胶溶透层析法来进行。所用柱缓冲剂为Tris缓冲块溶液(即，0.05摩尔浓度Tris(2-氨基-2-羟基甲基-1，3-丙二醇)及0.15摩尔浓度的含0.01%叠氮化钠，溶于蒸馏的去离子水(ddHO)的氯化钠溶液。注入200微升血清，40份0.5毫升分级试样则收存起来。
用Sigma鉴定仪来分析总体，42.2Ti旋转机底部及FPLC分级试样的胆固醇，以鉴定胆固醇的酶分析，方法第352号，改为使用96凹陷式微向型滴定盘。在PH＝6.5的缓冲液中，再生试剂(加了水以后)含300U/l胆固醇氧化酶，100/外胆固醇酯酶，1000U/l过氧化物酶(辣根)，0.3毫摩尔/升4-氨基安替比林及30.0毫摩尔/升对羟基苯磺酸盐。这种方法用胆固醇酯酶来水解胆固醇酯以游离出胆固醇。氧化游离态的胆固醇以产生过氧化氢用来形成醌亚胺染料。因为该反应定量地进行，染料的浓度，通过比色可测得，直接与样品中胆固醇含量成比例。校准液，校准液及样品可用盐水稀释，若胆固醇浓度使得读数在线性范围之外的话。
20微升校准液，校准液或试样与200微升等分试剂于96凹陷式微滴定盘内混合。每一混合物在20～25℃恒温25分钟，然后用一比色微滴定盘读数器在490492或500nm处读取吸光度。
位于上部的胆固醇(即，LDL-胆固醇)可通过减法得出。微超速离心法的定性分离可用科尔宁(Corning)大众琼脂糖冻胶电流与Fat红色7B着色剂来分析。
FPLC分级试样阿朴A-I含量可根据France et al.，I.Lipid Res 30(1989年，第1997～2004页)上的非减量SDS-PAGE方法来分析。通过鉴定含阿朴A-I及不含免疫反应的阿朴B蛋白分级试样胆固醇含量来定量分析HDL-胆固醇。
血清中总甘油三酯可用Mannheim诊断Reagentset甘油三酯-GB仪(Cat第877557号)，经如下方法改良微滴定盘鉴定法来测量根据前述方法制备试剂。100微升工作溶液及20微升稀释血清[1∶1血清∶盐水(盐水为0.15摩尔浓度的溶于ddH O的氯化钠溶液]分别加到两个96凹陷式微滴定盘，混合并在20～25℃时恒温至少5分钟。100微升工作溶液2加到每个盘中，然后混合并于20～25℃时恒温至少5分钟。100微升工作溶液2加到每个盘中，然后混合并于20～25℃时恒温至少5分钟，然后在490，492或500nm处读数。血清中甘油三酯总含量(mg/dl)通过对比已知样品的吸光度来计算得出。
可用其它传统方法来鉴定血清样品中HDL-胆固醇及甘油三酯总含量。
b)试验B阿朴A-I试验通过如下鼠阿朴A-I酶交联免疫吸附剂鉴定法(ELISA)来分析试验A中试验动物的阿朴A-I血清含量1.兔子防鼠疫阿朴A-I抗体的产生与提纯通过连续的超速离心法及鼠高密度脂蛋白(HDL)的分离从沉淀的鼠血清中提纯鼠可朴A-I。尾随着脱酯质酶，通过冻胶过滤层析法，阿朴A-I从其它HDL-蛋白中解析出来。从传统的免疫原始记录中，通过连续皮下注射提纯了的鼠阿朴A-I，在三种兔子(Pocono兔子场，Candensis，PA)产生了血清抗体。经过一年的重复放血，血清抗体沉淀，等分及于-20℃冰冻。原血清抗体除去泡沫，加入到活化的溴化氰Sepharose Cl-4B(有着干缘直径为60～140微米的凸缘琼脂糖)柱，它与提纯了的人类HDL共价键接，用盐水洗涤柱，提纯的抗体用1M PH＝3的甘氨酸溶液洗脱。用Tris缓冲盐溶液通过透析来除去甘氨酸以获得提纯了的兔子防鼠疫阿朴A-I抗体的浓缩液。
2.缓冲液，试剂及标准液-碳酸钠吸附缓冲液2.25克碳酸钠，4.40克碳酸氢钠及0.15克叠氮化钠溶于1.4升ddH2O中，用氢氧化钠调整PH值为9.6，缓冲液用ddH O衡释至总体积为1.5升;
-PH＝8，0.5M Tris溶液60.55克Tris.HCl(2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇.盐酸盐)溶于1.0升ddH2O溶液，用10N氢氧化钠溶液调PH值至8.0;
-次抗体缓冲液200毫升PH＝8的0.5MTris溶液加到溶于1.8升ddH2O含40克中血清蛋白(BSA)Cohn级数五的溶液中，加入0.2克叠氮化钠及18.0克氯化钠;
-底物缓冲液0.1克叠氮化钠搅拌加入到105.1克二乙醇胺及500毫升ddH2O中，加入10毫升0.5M六水氯化镁溶液，用12N盐酸调PH为9.8，然后用ddH2O稀释至总体积为1升;
-30X ELISA洗涤缓冲液525.96克氯化钠，76.68克Tris，6克叠氮化钠和30毫升Tween 20[聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯]混合，用12N盐酸调PH值至7.3，然后用ddH2O稀释至总体积为2升;
-1X ELISA洗涤缓冲液由一体积30 X ELISA洗涤缓冲液与29体积ddH2O稀释而成;
-样品稀释缓冲液886.34毫升次抗体缓冲液与113.66毫升Tween 20充分混合获得11.366%(体积比)Tween 20溶液;
-标准稀释缓冲液(A)780毫升次抗体缓冲液与220毫升Tween 20充分混合获得22%(体积比)Tween 20溶液。(B)890毫升次抗体缓冲液及110毫升Tween 20充分混合获得11%(体积比)的Tween 20溶液;
-鼠血清沉淀A用这种鼠血清来绘制每次鉴定中的标准曲线。用以校准提纯化的阿朴A-Ⅰ和含有45±2.7毫克阿朴A-Ⅰ/dl血清;
-鼠血清沉淀B在每次鉴定中用作低内标以监测漂移及含40毫克阿朴A-Ⅰ/dl血清;
-鼠血清沉淀C来自用所提化合物(二甲苯氧庚酸)处理过的老鼠，用作监测鉴定漂移得含70毫克阿朴A-Ⅰ/dl血清的高内标。
3.试验程序含942微克/毫升的冰冻提纯了的鼠阿朴A-I用碳酸钠吸附缓冲液稀释至最终浓度为3.7微克/毫升。向7个Nunc聚苯乙烯96凹陷式微滴定盘的每个中加入100微升这种溶液。阿朴A-I在4℃，48个小时内吸附到盘内，滴定盘用1X ELISA洗涤缓冲液洗涤，盘中的非特异点用同样在冰冷状态下恒温过夜的次抗体缓冲液(200微升/孔)来填充。所有鉴定盘以这种方式贮存直至使用(三个星期之久)。
鉴定时，ELISA Platees(2个盘，每盘有36种鼠血清样)用1X ELISA洗涤缓冲液刷洗4次。在试样加入前每个盘为有100微升1X ELISA洗涤缓冲液，10微升欲分析的每种鼠血清样品与290微升样品稀释缓冲液混合获得最终1∶30稀释液及11%的最终Tween 20浓度。作为内标鼠血清沉淀B和C的复制成6份样之一试样以同样的方式处理。
2.0毫升鼠血清沉淀A与等体积的标准稀释缓冲液A混合获得1∶2的稀释液及浓度为11%的Tween 20。然后该样品连续用标准稀释缓冲液B稀释以获得1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，和1∶128的稀释液。
非ELISA微滴定盘中的稀释后的标准液及试样量于加热至52℃的恒温稍2小时。与冷却至20～25℃后，洗涤缓冲液从ELISA试验盘中移去，换上75微升标准液及试样。75微升提纯过的防鼠疫阿朴A-I抗体溶液用次抗体缓冲液稀释至1∶75，然后加到每个试验盘。轻摇每个盘使抗体与试样混合，密封后在20～25℃恒温18个小时。恒温后每个盘用1X ELISA洗涤缓冲液洗4次。然后往每个盘加入100微升碱性磷酸酯酶共轭山羊防兔疫IGG抗体，用次抗体缓冲液稀释成1∶1000。并在20～25℃相互反应3个小时。然后重洗每个盘并抽气干燥，向每个盘加含1毫克/毫升硝基苯磷酸酯二钠的底物缓冲液，它是一种色原的底物，其色域与样品中阿朴A-I数量成反比每个盘在ELISA分光光度计监测(至3小时)。当所有没有阿朴A-I(最大色)的盘在405纳米处达到任意密度为1.0时，用ELISA读数器读取每个盘的读数。
标准曲线绘制成任意密度对浓度的对数的函数形式。未知数与该曲线相关，且阿朴A-I含量表示为毫克/dl。
上述试验A与B结果表明，上述化合物的剂量在约10毫克/千克。天至约200毫克/千克。天时是有效的。
因此上述化合物可用于提高血清高密度脂蛋白(HDL;HDL即为胆固醇与阿朴脂蛋白A-I)含量，其中许多也可用于降低血清甘油之酯总含量因而可用于治疗动脉粥样硬化。
使用的准确剂量取决于几个因素，包括宿主、特性及治疗的剧烈情况，施用的方式及特别功效物质。然而，总的来说，实验表明满意的结果是每天剂量为约400毫克至约200毫克，一般是每天分成2至4次使用。
化合物可经各种途径服用，较多地是通过肠内，优选地是口服，即以片剂或胶囊的形式，或不经肠内，即以无菌可注射的溶液或悬浮液的形式。
实施例1，2和3的化合物是优选的，特别是实施例1和2的化合物，尤其是实施例2的化合物。
因而下述活性已被测定
上述结果表明，当作为所述药物用途时，实施例1和2的化合物所需的剂量要比相似服用方法采用常用的二甲苯氧庚酸所需的剂量要低，即口服约400～1000毫克/天。
含有式Ⅰ的化合物以单一形式或药理学上可接受的盐的形式以及与至少一种药理学上可接受的载体或稀释剂共同存在的药物可用一般方法制得。它们可以是，如单位剂量形式，含有如约100毫克至约500毫克的有效组合物。
本发明也涉及一种药物，它包含式Ⅰ化合物以及至少一种药理学上可接受的载体或稀释剂。
它还包含式Ⅰ化合物的药物用途特别是用于动脉粥样硬化的预防或有疗效治疗。
它还涉及一种药物的制备方法，该药物包含式Ⅰ化合物与至少一种药理学上可接受的载体或稀释剂的混合。
它还包含式Ⅰ化合物用于生产一种治疗动脉粥样硬化的药物。
权利要求
1.式Ⅰ化合物
其中R1为丙基，异丙基或2-甲丙基；R2为原子序数为9到35的囟素；且R3为碳原子数为1至4的烷基。
2.权利要求1的化合物，其中R3为4个碳原子的烷基。
3.权利要求1的化合物，其中R1为正丙基，R2为氯和R3为甲基。
4.权利要求1的化合物，其中R1为2-甲丙基，R2为氯和R3为甲基。
5.权利要求1的化合物，其中R1，R2和R3分别是-CH(CH3)2，-Cl， -CH3，或-CH2CH2CH3，-Cl， -CH2CH3，或-CH2CH2CH3，-F， -CH3，或-CH2CH2CH3，-Br， -CH3.
6.权利要求1的化合物的制备方法，其中包含将式Ⅱ对应的化合物
其中R2与R3如权利要求1所定义的那样，与式Ⅲ对应的化合物其中R1为权利要求1所定义的那样，发生反应。
7.一种药物，它包含权利要求1的化合物以及至少一种药理学上可接受的载体或稀释剂。
8.权利要求1的化合物用作药物。
9.一种药物的制备方法，它包含将式Ⅰ化合物与至少一种药理学上可接受的载体或稀释剂混合。
10.权利要求1的化合物，用于生产治疗动脉粥样理化的药物。
全文摘要
本发明涉及式I的化合物，它们可用于治疗动脉粥样硬化。本发明也涉及含有式I化合物的药物。式I的化合物可经一般方法制备，如将异硫氰酸酯与胺反应而得到。
文档编号C07C335/16GK1089257SQ93100330
公开日1994年7月13日 申请日期1993年1月1日 优先权日1993年1月1日
发明者G·M·科波拉, R·E·达蒙 申请人:山道士有限公司
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