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您当前的位置： 抗非典病毒转移因子的制备方法
2021-02-01 17:02:52|
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起点商标网 专利名称：抗非典病毒转移因子的制备方法
技术领域：
本发明属于病毒学领域，涉及一种用于预防和治疗变异冠状病毒(Coronavirus)或称为非典(SARS)病毒感染的药物制备方法，特别涉及一种采用非典病毒的特异性抗原免疫哺乳动物而制备的抗非典病毒转移因子方法。
本发明根据转移因子分子量小，无免疫原性，且在哺乳动物间无种属性异性的免疫学原理。采用非典病毒提取的特异性抗原，免疫哺乳动物，取其脾脏、淋巴结组织，用分子筛过滤及透析方法提取有效成份，研制出抗非典病毒特异性转移因子。因为人体抗病毒主要是通过细胞免疫和体液免疫的特异性免疫细胞及抗体识别，引起特异性的免疫反应，从而杀灭及清除体内病毒。转移因子可以把通过特异性抗原免疫的具有针对病毒特异性的免疫信息传递给人体免疫细胞，从而引起人体特异和快速的免疫反应，杀灭及清除病毒。另外，目前认为非典病毒主要是通过呼吸道传播，呼吸道病毒侵害人体，一般是必须首先在上呼吸道找到合适的病毒受体，造成上皮细胞感染，然后侵入人体。
本发明的抗非典病毒转移因子药物的制备方法如下首先，制备非典病毒抗原。把从病人呼吸道分泌物中分离获得的非典病毒，接种于已长成单层的Hep-2细胞、人胚肾细胞、人胚肺细胞或鸡胚，37℃孵育，每天观察细胞病变情况，当CPE出现+++时或经病毒抗原检测阳性。收集细胞及上清，经病毒灭活后超声打碎，放冰箱冰冻保存。或按非典病毒基因序列用基因工程方法表达制备保护性抗原。
其次，以20％蔗糖沉层浓缩抗原或以不连续梯度密度离心纯化病毒原抗原。将超声打碎的抗原5000rpm离心20min，弃去沉渣留上清，装入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，165000×g，3h，根据病毒的分子量确定该病毒所在离心管位置，吸出冰冻保存备用。
然后，用所提取的病毒抗原免疫动物。挑选健康哺乳动物(羊体重30kg～50kg，猪体重60kg～90kg)，取上述制备的病毒抗原，免疫动物，共免疫5～6次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次以后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾及淋巴结节组织，低温冰冻保存备用。
最后，提取抗非典病毒转移因子。病毒免疫的动物脾及淋巴结组织，去其表面的筋膜、脂肪等组织，灭菌生理盐水反复冲洗，剪碎，经组织匀浆机高速粉碎，反复冻融4～6次，每次融化后均再以组织匀浆机高速匀浆粉碎，然后以超滤或透析的方法提取。以透析方法提取时，透析液为0.9％生理盐水，放4℃冰箱透析，放置24h后收集透析液，并以小于0.2μm的微孔滤膜过滤除菌，放冰箱冰冻保存备用。
本发明的抗非典病毒转移因子药物通过增强呼吸道的免疫杀伤细胞特异性杀伤功能及调节粘膜免疫机制，能够起到预防及治疗上述病毒感染的作用。
具体实施例方式
以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细描述。
依照上述的技术方案，对于提取的抗非典病毒转移因子药物进行抗非典病毒转移因子的安全试验。
抗非典病毒转移因子的安全试验包括①热原试验取健康成年兔子5只，耳缘静脉注射抗非典病毒转移因子2ml，分别于注射前、注射后30min、1h、2h，肛门测体温，平均升温，不超过0.5℃。
②急性毒性实验取健康小白鼠5只尾静脉注射抗非典病毒转移因子0.5ml，72h内没有死亡。
③过敏试验取体重250g～350g健康豚鼠5只，连续3次隔日注射本品0.5ml，2周后，再自静脉注射本品1ml，注射后15min内，观察动物没有显竖毛、呼吸困难、痉挛、虚脱及死亡等现象。
④无菌试验将抗呼吸道病毒转移因子，分别接种于需氧菌、厌氧菌及霉菌培养管内，30℃～35℃培养5日内没有细菌生长。
⑤活性测定采用活性淋巴细胞E-玫瑰花试验，本品的淋巴细胞花结百分率比对照管高30％以上。
按本发明方法提取的抗非典病毒转移因子具有如下的理化性质1.本发明因含有少量次黄嘌呤，对光检查外观为无色或呈微黄色液体。
2.PH值为7.0～7.2。
3.紫外吸收光谱是本品的一个重要特性，因含有核苷酸，多肽类小分子物质成份，其中含有嘌呤及嘧呤硷基都具有共轭的双键结构，能强烈吸收250nm～255nm波长的紫外光，其最大吸收波长在252±2nm。
4.本发明因不含大分子蛋白成份，以紫外吸收光谱OD值260nm/280nm≥2.0作为制剂的纯度指标。
5.多肽含量测定，按Lowry法进行(中国生物制品规程，1990年版第一部301页)，多肽含量每ml≥500μg。
6.核糖含量测定(按中国生物制品规程1990年版第一部321页)，核糖含量每ml≥50μg。
以下是发明人给出的具体实施例。
实施例1抗非典病毒转移因子雾化滴鼻液按上述方法制备的抗非典病毒转移因子每ml加入8000单位庆大霉素或其他可局部应用的广谱抗生素。
因非典病毒主要是通过呼吸道传播，呼吸道病毒感染首先是病毒感染呼吸道上皮细胞并在局部繁殖或其代谢产物扩散入血造成全身症状，同时破坏局部粘膜功能，造成局部菌群失调致病菌侵入，引起继发感染。抗非典病毒转移因子雾化滴鼻液所含的抗非典病毒转移因子可起到特异性增强人体T淋巴细胞识别及杀灭病毒能力，阻止病毒在人体进一步扩散，同时所含的抗生素成份可抑制或杀灭局部致病菌的繁殖，防止继发感染，减轻或消除临床症状。
用法滴鼻成人每次4～5滴，小儿每次2～3滴，每日4～5次。
滴眼每次1～2滴，每日3～4次。
雾化每次2ml，每日1～2次(可与化痰药物及抗生素联用)。
贮藏及有效期冰冻保存(勿反复冻融)有效期30个月。每次用后放4℃冰箱。
实施例2抗非典病毒转移因子注射液上述方法制备的抗非典病毒转移因子经除菌过滤后，无菌分装安瓿内，每支2ml，火燃封口。
抗非典病毒转移因子注射液可直接将较大剂量的活性抗病毒转移因子注入肌体内，能快速高效调动人体免疫系统，增强非典抗病毒能力。
用法肌肉注射儿童每次1ml～2ml，成人每次2ml～4ml，每日或隔日注射一次。
贮藏及有效日期冰冻保存(勿反复冻融)有效期30个月。
权利要求
1.抗非典病毒转移因子制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)制备非典病毒抗原将从病人呼吸道分泌物中分离获得的非典病毒，接种于已长成单层的Hep-2细胞、人胚肾细胞、人胚肺细胞或鸡胚，37℃孵育，每天观察细胞病变情况，当CPE出现+++时或经病毒抗原检测阳性；收集细胞及上清，经病毒灭活后超声打碎，放冰箱冰冻保存；或按非典病毒基因序列用基因工程方法表达制备保护性抗原；2)以蔗糖沉层浓缩，以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原将超声打碎的抗原5000rpm离心20min，弃去沉渣留上清，装入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，165000×g、3h，根据病毒的分子量确定该病毒所在离心管位置，吸出冰冻保存备用。3)用所提取的病毒抗原免疫动物挑选健康哺乳动物，取上述制备的病毒抗原免疫动物，共免疫5～6次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次以后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾及淋巴结节组织，低温冰冻保存备用；4)从免疫动物中提取抗非典病毒转移因子病毒免疫的动物脾及淋巴结组织，去其表面的筋膜、脂肪等组织，灭菌生理盐水反复冲洗，剪碎，经组织匀浆机高速粉碎，反复冻融4～6次，每次融化后均再以组织匀浆机高速匀浆粉碎，然后以超滤或透析的方法提取抗非典病毒转移因子。
2.根据权利要求1所述的抗非典病毒转移因子制备方法，其特征在于，所述以透析或超滤方法提取时，透析液为0.9％生理盐水，放4℃冰箱透析，放置24h后收集透析液并以小于0.2μm的微孔滤膜过滤除菌即可。
全文摘要
本发明公开了一种抗非典病毒转移因子制备方法，首先，非典病毒经Hep－2细胞、人胚肾细胞、人胚肺细胞或鸡胚培养增殖，制备非典病毒抗原以及根据非典病毒的基因序列用基因工程方法表达制备的保护性抗原。其次，以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原，或以20％蔗糖沉层浓缩抗原。然后，用所提取的病毒抗原免疫动物。最后，从免疫动物中提取抗非典病毒转移因子。本发明的抗非典病毒转移因子药物通过增强呼吸道的免疫杀伤细胞特异性杀伤功能及调节粘膜免疫机制，能够起到预防及治疗上述病毒感染的作用，可以制备成注射液或滴鼻液药物，具有既可预防，又可治疗，标本兼治的特点。
文档编号C07K14/495GK1439424SQ0310800
公开日2003年9月3日 申请日期2003年4月30日 优先权日2003年4月30日
发明者许东亮, 张国成 申请人:中国人民解放军第四军医大学第一附属医院
技术领域：
本发明属于病毒学领域，涉及一种用于预防和治疗变异冠状病毒(Coronavirus)或称为非典(SARS)病毒感染的药物制备方法，特别涉及一种采用非典病毒的特异性抗原免疫哺乳动物而制备的抗非典病毒转移因子方法。
本发明根据转移因子分子量小，无免疫原性，且在哺乳动物间无种属性异性的免疫学原理。采用非典病毒提取的特异性抗原，免疫哺乳动物，取其脾脏、淋巴结组织，用分子筛过滤及透析方法提取有效成份，研制出抗非典病毒特异性转移因子。因为人体抗病毒主要是通过细胞免疫和体液免疫的特异性免疫细胞及抗体识别，引起特异性的免疫反应，从而杀灭及清除体内病毒。转移因子可以把通过特异性抗原免疫的具有针对病毒特异性的免疫信息传递给人体免疫细胞，从而引起人体特异和快速的免疫反应，杀灭及清除病毒。另外，目前认为非典病毒主要是通过呼吸道传播，呼吸道病毒侵害人体，一般是必须首先在上呼吸道找到合适的病毒受体，造成上皮细胞感染，然后侵入人体。
本发明的抗非典病毒转移因子药物的制备方法如下首先，制备非典病毒抗原。把从病人呼吸道分泌物中分离获得的非典病毒，接种于已长成单层的Hep-2细胞、人胚肾细胞、人胚肺细胞或鸡胚，37℃孵育，每天观察细胞病变情况，当CPE出现+++时或经病毒抗原检测阳性。收集细胞及上清，经病毒灭活后超声打碎，放冰箱冰冻保存。或按非典病毒基因序列用基因工程方法表达制备保护性抗原。
其次，以20％蔗糖沉层浓缩抗原或以不连续梯度密度离心纯化病毒原抗原。将超声打碎的抗原5000rpm离心20min，弃去沉渣留上清，装入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，165000×g，3h，根据病毒的分子量确定该病毒所在离心管位置，吸出冰冻保存备用。
然后，用所提取的病毒抗原免疫动物。挑选健康哺乳动物(羊体重30kg～50kg，猪体重60kg～90kg)，取上述制备的病毒抗原，免疫动物，共免疫5～6次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次以后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾及淋巴结节组织，低温冰冻保存备用。
最后，提取抗非典病毒转移因子。病毒免疫的动物脾及淋巴结组织，去其表面的筋膜、脂肪等组织，灭菌生理盐水反复冲洗，剪碎，经组织匀浆机高速粉碎，反复冻融4～6次，每次融化后均再以组织匀浆机高速匀浆粉碎，然后以超滤或透析的方法提取。以透析方法提取时，透析液为0.9％生理盐水，放4℃冰箱透析，放置24h后收集透析液，并以小于0.2μm的微孔滤膜过滤除菌，放冰箱冰冻保存备用。
本发明的抗非典病毒转移因子药物通过增强呼吸道的免疫杀伤细胞特异性杀伤功能及调节粘膜免疫机制，能够起到预防及治疗上述病毒感染的作用。
具体实施例方式
以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细描述。
依照上述的技术方案，对于提取的抗非典病毒转移因子药物进行抗非典病毒转移因子的安全试验。
抗非典病毒转移因子的安全试验包括①热原试验取健康成年兔子5只，耳缘静脉注射抗非典病毒转移因子2ml，分别于注射前、注射后30min、1h、2h，肛门测体温，平均升温，不超过0.5℃。
②急性毒性实验取健康小白鼠5只尾静脉注射抗非典病毒转移因子0.5ml，72h内没有死亡。
③过敏试验取体重250g～350g健康豚鼠5只，连续3次隔日注射本品0.5ml，2周后，再自静脉注射本品1ml，注射后15min内，观察动物没有显竖毛、呼吸困难、痉挛、虚脱及死亡等现象。
④无菌试验将抗呼吸道病毒转移因子，分别接种于需氧菌、厌氧菌及霉菌培养管内，30℃～35℃培养5日内没有细菌生长。
⑤活性测定采用活性淋巴细胞E-玫瑰花试验，本品的淋巴细胞花结百分率比对照管高30％以上。
按本发明方法提取的抗非典病毒转移因子具有如下的理化性质1.本发明因含有少量次黄嘌呤，对光检查外观为无色或呈微黄色液体。
2.PH值为7.0～7.2。
3.紫外吸收光谱是本品的一个重要特性，因含有核苷酸，多肽类小分子物质成份，其中含有嘌呤及嘧呤硷基都具有共轭的双键结构，能强烈吸收250nm～255nm波长的紫外光，其最大吸收波长在252±2nm。
4.本发明因不含大分子蛋白成份，以紫外吸收光谱OD值260nm/280nm≥2.0作为制剂的纯度指标。
5.多肽含量测定，按Lowry法进行(中国生物制品规程，1990年版第一部301页)，多肽含量每ml≥500μg。
6.核糖含量测定(按中国生物制品规程1990年版第一部321页)，核糖含量每ml≥50μg。
以下是发明人给出的具体实施例。
实施例1抗非典病毒转移因子雾化滴鼻液按上述方法制备的抗非典病毒转移因子每ml加入8000单位庆大霉素或其他可局部应用的广谱抗生素。
因非典病毒主要是通过呼吸道传播，呼吸道病毒感染首先是病毒感染呼吸道上皮细胞并在局部繁殖或其代谢产物扩散入血造成全身症状，同时破坏局部粘膜功能，造成局部菌群失调致病菌侵入，引起继发感染。抗非典病毒转移因子雾化滴鼻液所含的抗非典病毒转移因子可起到特异性增强人体T淋巴细胞识别及杀灭病毒能力，阻止病毒在人体进一步扩散，同时所含的抗生素成份可抑制或杀灭局部致病菌的繁殖，防止继发感染，减轻或消除临床症状。
用法滴鼻成人每次4～5滴，小儿每次2～3滴，每日4～5次。
滴眼每次1～2滴，每日3～4次。
雾化每次2ml，每日1～2次(可与化痰药物及抗生素联用)。
贮藏及有效期冰冻保存(勿反复冻融)有效期30个月。每次用后放4℃冰箱。
实施例2抗非典病毒转移因子注射液上述方法制备的抗非典病毒转移因子经除菌过滤后，无菌分装安瓿内，每支2ml，火燃封口。
抗非典病毒转移因子注射液可直接将较大剂量的活性抗病毒转移因子注入肌体内，能快速高效调动人体免疫系统，增强非典抗病毒能力。
用法肌肉注射儿童每次1ml～2ml，成人每次2ml～4ml，每日或隔日注射一次。
贮藏及有效日期冰冻保存(勿反复冻融)有效期30个月。
权利要求
1.抗非典病毒转移因子制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)制备非典病毒抗原将从病人呼吸道分泌物中分离获得的非典病毒，接种于已长成单层的Hep-2细胞、人胚肾细胞、人胚肺细胞或鸡胚，37℃孵育，每天观察细胞病变情况，当CPE出现+++时或经病毒抗原检测阳性；收集细胞及上清，经病毒灭活后超声打碎，放冰箱冰冻保存；或按非典病毒基因序列用基因工程方法表达制备保护性抗原；2)以蔗糖沉层浓缩，以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原将超声打碎的抗原5000rpm离心20min，弃去沉渣留上清，装入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，165000×g、3h，根据病毒的分子量确定该病毒所在离心管位置，吸出冰冻保存备用。3)用所提取的病毒抗原免疫动物挑选健康哺乳动物，取上述制备的病毒抗原免疫动物，共免疫5～6次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次以后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾及淋巴结节组织，低温冰冻保存备用；4)从免疫动物中提取抗非典病毒转移因子病毒免疫的动物脾及淋巴结组织，去其表面的筋膜、脂肪等组织，灭菌生理盐水反复冲洗，剪碎，经组织匀浆机高速粉碎，反复冻融4～6次，每次融化后均再以组织匀浆机高速匀浆粉碎，然后以超滤或透析的方法提取抗非典病毒转移因子。
2.根据权利要求1所述的抗非典病毒转移因子制备方法，其特征在于，所述以透析或超滤方法提取时，透析液为0.9％生理盐水，放4℃冰箱透析，放置24h后收集透析液并以小于0.2μm的微孔滤膜过滤除菌即可。
全文摘要
本发明公开了一种抗非典病毒转移因子制备方法，首先，非典病毒经Hep－2细胞、人胚肾细胞、人胚肺细胞或鸡胚培养增殖，制备非典病毒抗原以及根据非典病毒的基因序列用基因工程方法表达制备的保护性抗原。其次，以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原，或以20％蔗糖沉层浓缩抗原。然后，用所提取的病毒抗原免疫动物。最后，从免疫动物中提取抗非典病毒转移因子。本发明的抗非典病毒转移因子药物通过增强呼吸道的免疫杀伤细胞特异性杀伤功能及调节粘膜免疫机制，能够起到预防及治疗上述病毒感染的作用，可以制备成注射液或滴鼻液药物，具有既可预防，又可治疗，标本兼治的特点。
文档编号C07K14/495GK1439424SQ0310800
公开日2003年9月3日 申请日期2003年4月30日 优先权日2003年4月30日
发明者许东亮, 张国成 申请人:中国人民解放军第四军医大学第一附属医院
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