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2021-02-01 16:02:45|
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起点商标网 专利名称：药用化合物的制作方法
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本发明涉及N-[2-氨基-4-取代的-[[(吡咯或吡啶)并[2，3-d]嘧啶基]-烷基]苯甲酰基]-L-谷氨酸化合物、它们的某些还原形式、合成它们的中间体、含有这些化合物的药物制剂，及其作为抗肿瘤药的应用。
叶酸是一些酶促反应如核酸的生物合成、氨基酸和肽类代谢等中的辅酶。叶酸的衍生物叶酸辅助因子在核酸合成的两条途径-嘌呤合成和胸腺嘧啶核苷合成-中是必不可少的。叶酸在具有生物学活性前，一般经过两步还原才转变成有活力的辅酶形式。氨甲蝶呤等化合物能通过与所需的二氢叶酸还原酶的牢固的偶合而抑制二氢叶酸转变成四氢叶酸的第二步还原。这些抑制剂正不断地发展成抗肿瘤药物，因为它们干扰脱氧核糖核酸的合成，并阻止具有生物学活性的四氢叶酸盐的再生而使细胞死亡。
叶酸和氨基蝶呤的各种衍生物已被合成并试作叶酸代谢抑制剂。包括一些用亚甲基或次甲基分别取代原来的亚氨基或次氨基的各种去氮化合物。这些衍生物有不同程度的代谢抑制剂的活性。一种四氢氨基蝶呤抗肿瘤剂5，10-二脱氮-5，6，7，8-四氢氨基蝶呤(DDATHF)抑制甘氨酰胺核糖核苷酸转甲酰基酶，这是嘌呤生物合成开始阶段所需的酶(参见J.Med.Chem.，28，914(1985))。
目前，抗肿瘤剂对哺乳动物的各种肿瘤还不是广泛有效的治疗药。它们引起的发病率和死亡率是寻找新的抗肿瘤剂的重要动力。本发明满足这种需要，并提供新的抗肿瘤剂，详述如下。
本发明的一个方面涉及式Ⅰ的化合物及其药学上可接受的盐
式中R1是氢、氯、巯基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷氨基、或二(C1-C4)烷基氨基;
R2是C2-C3烷基。
本发明的另一方面是具式Ⅱ的化合物及其药学上可接受的盐
式中R1和R2的定义同上述式Ⅰ。
本发明的另一方面是具式Ⅲ的化合物及其药学上可接受的盐
式中R1是氢、氯、巯基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷氨基、或二(C1-C4)烷基氨基;
R2是C2-C3烷基。
本发明还有一个方面是具式Ⅳ的化合物及其药学上可接受的盐
式中R1和R2的定义同上述式Ⅲ。
本发明还涉及用于制备式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ化合物的中间体，涉及利用这些化合物防治肿瘤生长的组合物和方法。
本发明涉及式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ化合物及用于合成它们的中间体。这些中间体是具有下列结构式的化合物及其药学上可接受的盐
式中Y1是氢或一个氨基保护基团;
Z是氢、溴或碘;
和具有下式结构式的化合物及其药学上可接受的盐
式中W是化学键或-CH2-;
Y1是氨基保护基团;
Y2是相同或不同相的羧基保护基团。
在式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ中L-谷氨酸残基的构型已明确画出。本文中所有化合物的谷氨酸残基都是L型的。
本文中的术语“C2-C3烷基”意指具有所标明碳原子数的直链的二价烷基，如1，2-亚乙基及1，3-亚丙基。
“烷硫基”意指具有1至4个碳原子的直链、或支链烷基，并联于硫上，成为甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、异丁硫基、仲丁硫基或叔丁硫基。
“烷氧基”意指具有1至4个碳原子的直链或支链烷基并与氧相连，形成甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧或叔丁氧基。
“烷氨基”意指有1至4个碳原子的烷基并联于氨基上，成为甲氨基、乙氨基、丙氨基、异丙氨基或丁氨基。
“二烷基氨基”意指-NR3R4，其中R3和R4是相同或不相同的具有1至4个碳原子的烷基，如二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二异丙基氨基、二丁基氨基、或甲基乙基氨基。
说明书中所用的“氨基保护基”一词意指在化合物的其他官能团的反应中，通常用来阻断或保护氨基的取代基团。所述氨基保护基的实例包括甲酰基、三苯甲基、邻苯二甲酰亚氨基、三氯乙酰基、氯乙酰基、溴乙酰基、碘乙酰基、苯甲酰甲基磺酰基、2-(硝基)-苯基亚磺酰基、二苯基氧膦基及类似的氨基保护基团。所用的氨基保护基团的种类是不重要的，只要被保护的氨基在随后的中间体的其他部位的反应条件下是稳定的，并且在合适的阶段可选择性地被除去，而不破坏分子的其余部分，(包括其他氨基保护基团在内)即可。优选的氨基保护基团有(C1-C4烷基)羰基及三甲基乙酰基，最优选三甲基乙酰基。上述定义的保护基的另一些实例参见下列文献J.W.Barton，"Protective Groups in Organic Chemistry"，J.G.W.McOmie，Ed.，Plenum Press，New York，N.Y.，1973，Chapter 2，and T.W.Greene，"Protective Groups in Organic Synthesis"，John Wiley and sons，New York，N.Y.，1981，Chapter 7.
本文所用的“羧基保护基团”意指当化合物的其他基团进行反应时，通常用来阻断或保护羧基的羧酸酯衍生物之一，所述羧酸保护基的实例包括4-硝基苄基、4-甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、2，4-二甲氧基苄基、2，4，6-三甲氧基苄基、2，4，6-三甲基苄基、五甲基苄基、3，4-亚甲基二氧基苄基、二苯甲基、4，4′-二甲氧基二苯甲基、2，2′，4，4′-四甲氧基二苯甲基、甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、叔戊基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4，4′-二甲氧基三苯甲基、4，4′，4″-三甲氧基三苯甲基、2-苯基丙-2-基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、苯甲酰基甲基、2，2，2-三氯乙基、β-(三甲基甲硅烷基)乙基、β-(二(正丁基)甲基甲硅烷基)乙基、对甲基苯磺酰基乙基、4-硝基苄基磺酰基乙基、烯丙基、肉桂基、1-(三甲基甲硅烷基甲基)-丙-1-烯-3-基等。羧基保护基团的种类并不重要，只要被保护的羧基在随后的分子其他部位反应的条件下是稳定的，并能在适当的阶段将其除去而不破坏分子的其余部分。这些基团的另一些例子参见下列文献E.Haslam，"Protective Groups in Organic Chemistry"，J.G.W.McOmie，Ed.，Plenum Press，New York，N.Y.，1973，Chapter 5，and T.W.Greene，"Protective Groups in Organic Synthesis"，John Wiley and Sons，New York，N.Y.，1981，Chapter 5.
另一相关的术语“保护的羧基”指被上述羧基保护基团之一取代的羧基。优选的保护基是乙基和丙基。
如上所述，本发明包括上述结构式所定义的化合物的药学上可接受的盐。本发明的具体化合物具有一个足够酸性的官能团、一个足够碱性的官能团、或这两种官能团都存在，因而能与任何一种无毒的无机碱及无毒的无机或有机酸形成药学上可接受的盐。通常用于形成酸加成盐的酸是无机酸，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等;有机酸，例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对-溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。所述药学上可接受盐的实例有硫酸盐、焦硫酸盐、酸性硫酸盐、亚硫酸盐、酸性亚硫酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物，碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、反式丁烯二酸盐、顺式丁烯二酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟苯甲酸盐、甲氧苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。优选的药学上可接受的酸加成盐是那些有与矿物酸(如盐酸、氢溴酸)和有机酸(如顺丁烯二酸及甲磺酸)形成的盐。
碱加成盐包括那些与无毒的无机碱(如铵、碱金属或碱土金属的氢氧化物)形成的盐，以及碳酸盐、碳酸氢盐等。用以制备本发明盐的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾。钾盐和钠盐的形式是特别优选的。
制备本发明化合物的起始原料，优选2-氨基-4-氧代吡咯并[2，3-d]嘧啶(下列式Ⅴ)或2-(叔丁氧羰基)-氨基-4-氧代-6-乙炔基-吡啶并[2，3-d]嘧啶[下列式Ⅵ];这取决于所需产物是吡咯还是吡啶衍生物。
本发明的化合物及其前体，用普通专业人员熟悉的方法来制备。本发明的吡咯化合物，若市场上买不到(如2-氨基-4-氧代-吡咯立[2，3-d]嘧啶，Sigma化学公司名为7-鸟嘌呤)，可用买得到的试剂，用有机化学的传统方法来制备。
2-(三甲基乙酰基)氨基-4-氧代-5-乙炔基吡啶并[2，3-d]嘧啶化合物，根据Taylor等的方法(J.Org.Chem.，54，3618-3624(1989))制取，该文献作为参考文献并入本文。
合成本发明吡咯化合物的第一步，是在有或无惰性或基本惰性的溶剂或混合溶剂的存在下，将式Ⅴ的化合物与一种氯化剂反应，此反应用反应式1表示反应式1
任何能释放氯离子的化合物都是合适的氯化剂，优选的氯化剂是POCL3和PCL3。
虽然这个反应在有或无溶剂存在时都能进行，不用更好。
此反应中所用氯化剂的量是用足够量的氯取代4-氧基即可。一般每当量的吡咯并嘧啶用等当量的或过量的氯化剂，最好过量。
此步骤的温度，能使氯化完全即可，一般从室温至约回流温度，最好是回流温度。
第一步反应的时间是能产生置换反应的任何时间都行，一般约需2至6小时。可根据传统的反应进程监测方法，如薄层色谱法、高效液相色谱法或柱色谱法来确定最佳时间。
合成本发明吡咯化合物的第二步是在2-氨基上加一保护基团，第三步是将相应的保护的氨基化合物与N-碘(或溴)琥珀酰亚胺反应，反应顺序见反应式2反应式2
式中Z是碘或溴;和Y1是氨基保护基团。
引入氨基保护基团的反应，在专业人员所熟悉的那些反应的标准条件下进行。
卤取代基是碘或溴，优选碘。将氨基保护的中间体与N-碘琥珀酰亚胺或N-溴琥珀酰亚胺在弱碱的存在下于惰性或基本惰性的溶剂或混合溶剂中(或不用溶剂)反应，制得相应的5-卤代中间体。
此反应中合适的碱包括叔胺，例如三乙胺和吡啶，优选无水吡啶。
合适的溶剂通常是高沸点的极性溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)、甘醇二甲醚、四氢呋喃(THF)、和吡啶，优选溶剂是无水吡啶。
本反应中N-碘琥珀酰亚胺或N-溴琥珀酰亚胺的用量，一般以使氨基保护的化合物全部反应为准。通常采用等当量或稍过量的N-碘琥珀酰亚胺或N-溴琥珀酰亚胺。
所用温度足够使卤化完全即可，近于室温最好。
第三步的反应时间是发生卤化反应所需的时间，约需10分钟至4小时。可用传统的监测反应进程的色谱技术如薄层层析确定最合适的反应时间。
合成本发明化合物的第四步是5-卤吡咯并嘧啶与苯甲酸衍生物的偶合。这过程需将下式的不饱和化合物
与5-溴或5-碘吡咯并嘧啶中间体在合适的溶剂、钯催化剂、最好还有仲胺或叔胺的存在下反应;式中J1和J2都是氢或它们一起形成碳-碳键(即一个炔基)，Q是甲硅烷基保护基团，优选三甲基甲硅烷基。类似反应见Taylor等的美国专利4，818，819号，它作为参考文献并入本文。
所用钯催化剂，同以前用于芳基卤与烯丙醇反应中的催化剂，已有介绍，例如参见下列文献
Melpoler et al.，J.Org.Chem.，41，265，(1976);265;Chalk et al.，J.Orq.Chem.，41，1206，(1976);Arai et al.，J.Heterocvclic Chem.，15，351(1978);Tamuru et al.，Tetrahedron Papers，10，919(1978);Tetrehedron，35，329(1979).
在偶合反应中，苯甲酸衍生物的羧基，要用羧基保护基团加以保护。
偶合反应最好在至少1克分子当量的仲胺或叔胺(例如三乙胺或二乙胺)用作酸受体的存在下进行。
本反应中用的合适的溶剂最好是无水的惰性极性溶剂如乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、或N-甲基吡咯烷酮。
采用中等程度的升温，优选约75℃至约125℃，更优选约85℃到100℃。
下述变异反应使用钯催化剂，区别在于或者先使该不饱和化合物与吡咯并嘧啶反应，然后再和苯甲酸衍生物偶合;或者先将不饱和化合物与苯甲酸衍生物反应，然后再和吡咯并嘧啶偶合。所用不饱和化合物包括乙烯、乙炔、丙烯、或丙炔。
在第一种变异方法中，将吡咯并[2，3-d]嘧啶与不饱和化合物反应，产生的中间体用标准条件脱去甲硅烷基，然后将其用作下一步偶合反应的反应物。这一系列反应解释于下面的反应式中
式中Y2是羧基保护基团;
Z是碘或溴;
J1的J2都是氢，或一起形成碳-碳键;
Q是甲硅烷基保护基团;和X是碘或溴。
在第二种变异方法中，将苯甲酸衍生物与不饱和化合物反应先生成相应的不饱和谷氨酸酯中间体，在标准条件下脱去该中间体的甲硅烷基，然后再与吡咯并嘧啶偶合。这一系列反应解释于变异方法2中
式中Q是甲硅烷基保护基团。
制备相应的N-[2-三甲基乙酰氨基-4-取代的-[吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基]乙炔基]苯甲酰基]-L-谷氨酸酯，至少可用基本上与变异方法1中所述的制备吡咯并[2，3-d]嘧啶相同的方法，将上述2-(叔丁氧羰基氨基-4-氧代-5-乙炔基吡啶并[2，3-d]嘧啶化合物与上述苯甲酸衍生物偶合。
R2是1，3-亚丙基的本发明化合物按下法制备先用Meyers介绍的恶唑啉(Acc.Chem.Res.，14，375(1978))，此文献作为参考文献并入本文)合成具有对-丙烯-1-基的上述苯甲酸衍生物。然后酸水解(5NHCl，回流36小时)得4-烯丙基苯甲酸，将其先用亚硫酰氯(4.0当量，苯中回流4小时)处理，然后与L-谷氨酸二乙酯盐酸盐(2.1当量)、4-二甲氨基吡啶(0.01当量)及三乙胺反应18小时，被转变成相应的L-谷氨酸二乙酯衍生物。至少可通过变异方法2，再与吡咯并或吡啶并[2，3-d]偶合，得R2中1，3-亚丙烯基的本发明化合物。
制备本发明化合物的第五步是在适当的溶剂中，在催化剂的参与下，氢化式Ⅸ化合物，生成相应的2-保护的氨基-4-氯-[吡咯并或吡啶并[2，3-d]嘧啶基]烷基]苯甲酰基]-保护的L-谷氨酸(式Ⅹ)，见反应式6
反应式6
式中Ar是吡咯并或吡啶并;
Y1是氨基保护基团;
J1和J2都是氢或一起形成碳-碳键;
W是一个键或CH2;
Y2是羧基保护基团。
第五步所用的溶剂是在氢化条件下不起反应的任何溶剂。合适的溶剂包括醇类如甲醇、乙醇1-丙醇、及2-丙醇，最优选的是乙醇。
氢化的催化剂可用含有贵金属并能催化碳桥还原的任何物质。合适的催化剂实例包括载于炭上的贵金属、贵金属氧化物和以碱土金属碳酸盐为载体的贵金属。本文中“贵金属”指金、银、铂、钯、铱、铑、汞、钌、和锇。优选的催化剂是钯-炭、铂-炭和氧化铂，最优选钯-炭。
本步骤用的温度和压力应足以使氢化反应完全。优选约30℃到约150℃，最优选为约30℃到约75℃。所用压力为约1000psi至约1psi，优选约400psi到约2psi。
本发明包括4-位有不同原子或基团的化合物，选自氢、巯基、烷硫基、烷氧基、烷氨基、及二烷基氨基。氯的置换，除氢外，均可在第一步(反应式1)后、第三步(反应式2)后、或第四步(变异方法1及2的偶合反应)后进行，但必须在保护基团(Y1和Y2)去除以前。以氢置换氯可在第四步后或在保护基团去除之后(下述第六步)进行。
上述各步的最佳反应时间可用监测反应进程的传统色谱技术(如薄层色谱、高效液相色谱、或柱色谱)、光谱技术(如红外光谱、核磁共振谱、或质谱)、或两种技术结合来确定。
本发明中各种4-位取代基的进一步描述如下4-氢置换4-氯得本发明4-氢化合物按下法进行在碳桥饱和之后继续延长第五步氢化的时间。
4-巯基或4-烷硫基将本发明的第一、三、或五步的产物(式Ⅶ、Ⅷ或Ⅹ的化合物)，在合适溶剂的存在下，与硫脲或二烷基二硫化物反应，4-氯化合物即转变成本发明的相应的巯基或烷硫基化合物。这类氯取代反应是专业人员熟悉的，例如参见
March，Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms，and Structure，McGraw-Hill，lst ed.，p.500该文献作为参考文献并入本文。
此步骤中所用的溶剂是在反应条件下仍然惰性的任何溶剂，优选2-甲氧基乙醇。
4-烷氧基将本发明式Ⅶ、Ⅷ、或Ⅹ的化合物在合适的溶剂中，与能释放醇盐离子(R3O-)的亲核试剂反应，可置换4-氯而得本发明的相应的烷氧基化合物。相应的C1-C2烷基醇与活泼金属如钠或镁作用可得所需的醇盐离子。例如R3OH+Na→R3O-Na+一旦释放出醇盐离子，即可应用包括以醇盐离子取代4-氯的亲核取代反应在内的William合成法。
在反应条件下惰性的任何溶剂可用作本步骤的溶剂，优选2-甲氧乙醇。
4-烷氨基或4-二烷基氨基在适当的溶剂中，将本发明第一、第三、第五步的产物，与相应的亲核的烷胺或二烷胺反应，可将4-氯置换成本发明的烷氨基或二烷氨基化合物。类似的氯代反应有机化学专业人员是熟悉的，例如参见
March，Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms，and Structure，McGraw-Hill，lst ed.，p.502;
该文献作为参考文献并入本文。
任何在反应条件下惰性的溶剂都可作本步骤的溶剂，优选2-甲氧乙醇。
本发明的第六步是将式Ⅹ的化合物经碱水解除去保护基团Y1和Y2。此方法得到式Ⅰ或式Ⅲ的2-氨基-4-取代的-[[吡咯并或吡啶并(2，3-d)-嘧啶基]烷基]苯甲酰基]-L-谷氨酸。去除各种不同保护基团的方法前述标准文献已有介绍，它们作为文献并入本文。
本发明的任选的第七步是式Ⅰ或式Ⅲ化合物的催化氢化。氢化产物是式Ⅱ或式Ⅳ的吡咯并或吡啶并嘧啶化合物。
用来合成本发明化合物的起始原料是已知的。如市场上无法购到，很容易用本领域普通专业人员常用的方法合成。
本发明的药学上可接受的盐，通常以具有合适的酸性或碱性官能团的化合物，与等分子的或过量的酸成碱反应制取。反应物一般在互溶的溶剂中结合，例如，酸加成盐在二乙醚或苯中，碱加成盐在水或醇中。生成的盐能正常地在1小时至10天内以沉淀析出，并可用过滤或其他传统方法分离。
另外，本发明的某些化合物能和水或常用有机溶剂形成溶剂化物。这些溶剂化物作为本发明化合物也包括在本发明范围内。
本发明的化合物对以叶酸盐，特别是以叶酸盐的衍生物作底物的一种或几种酶有抑制作用。例如，下列有代表性的化合物证明对成淋巴白血病细胞衍生的人的T细胞(CCRF-CEM)的生长有抑制作用实施例1，N-[2-氨基-4-氯-[[吡咯并[2，3-d]-嘧啶-5-基]-乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸;
实施例2，N-[2-氨基-4-巯基-[[吡咯并[2，3-d]-嘧啶-5-基]-乙基]苯甲酰基-L-谷氨酸;
实施例3，N-[2-氨基-[[吡咯并[2，3-d]-嘧啶-5-基]-乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸;
实施例4，N-[2-氨基[二氢吡咯并[2，3-d]-嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸;
实施例5，N-[2-氨基-4-甲氧基-[[吡咯并[2，3-d]-嘧啶-5-基]-乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸;
实施例6，N-[2-氨基-4-二乙氨基-[[吡咯并[2，3-d]-嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸;
实施例7，N-[2-氨基-[[四氢吡啶并[2，3-d]-嘧啶-6-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸。
表Ⅰ是用人白血病细胞系CCRF-CEM细胞(Foley et al.，Cancer，18，522(1965))所作体外试验的数据，这种细胞的生长已有报导(Grindey，et al.，J.Mol.Pharmacol.，16，601，(1979))，二者均作为参考文献并入本文。为了确定50%生长抑制的浓度(IC50)作了各种化合物的剂量反应曲线。制备了双份不同浓度(自100μg/ml到0.005μg/ml)的化合物的Cluster板。被试化合物先溶于二甲基亚砜(DMSO)中，再进一步稀释到所需浓度。将加有10%透析的胎牛血清及16mM HEPES缓冲液和8mM MOPS缓冲液的Roswell ParK Memorial研究所1640培养基中的细胞加入小井中，使最后浓度为每井有4.8×104个细胞，总体积2.0ml。培养72小时(95%空气，5%CO2)后，用ZBI库尔特计数器计数细胞。培养结束时，对照组的细胞数通常为(4-6)×105个/井。
表Ⅰ化合物 IC50(μg/ml)1 >202 0.0323 0.0194 0.0055 >206 0.97 0.005本发明的化合物已被证明在体内有抗小鼠移植肿瘤的活性，是用带有6C3HED淋巴肉瘤(也叫做Gardner淋巴肉瘤(GLS))的C3H小鼠来测试这些化合物的。6C3HED淋巴肉瘤由国家肿瘤研究所肿瘤治疗系提供，保存在E.G.andG.Mason研究的肿瘤库中(麻省，乌斯特)。第一传代肿瘤用标准方法储存在液氮中。移植的肿瘤每六个月或必要时重新从肿瘤库取用，连续传代，每周在C3H小白鼠身上进行二次。
试验时自传代的小鼠身上取出肿瘤，用无菌技术切成1至3mm的方形薄片，用抗菌介质1和心脑浸出液(密西根州底特律Difco公司)验证确系无菌。接受移植的小鼠先剃毛，然后在腋下用套针将肿瘤薄片植入皮下。植入第二天按一定计划开始药物治疗。被试化合物与2.5%(重量百分数)名为“Emulphor EL620”表面活性剂(GAF化学公司出品)的聚氧乙基化油混和(用生理盐水1∶40稀释)。所有动物在开始时及治疗结束时都称体重，自由摄食和饮水。药物以0.5ml2.5%Emulphon溶液形式给药。除另有注明者外，都是每天给药一次，共给八天。治疗结束后一天用与微机相连的数字电子测径器测定肿瘤的长及宽(J.F.Worzalla，et al.，Investigational New Drugs，8，241-251(1990))。从测得的数字根据下式计算肿瘤重量肿瘤重(mg)＝(宽，mm)2×(长，mm)/2最少有一个同等鼠数并只用同体积2.5%Emulphor处理的对照组。1减去试验组肿瘤大小的平均数与对照组肿瘤大小之比的差，再乘以100，得抑制百分数(%INH)。实施例4化合物的试验结果列于表Ⅱ中。
表Ⅱ实施例4结果肿瘤系 剂量浓度 %INH 毒性/总数(mg/kg)6C3HED 50 TOX 10/10淋巴肉瘤 25 TOX 10/10(天x8) 12.5 100 8/106.25 100 6/104.00 100 1/102.00 97 0/101.00 36 0/100.50 1 0/100.25 0 0/10
6C3HED 16 100 0/10淋巴肉瘤 8 100 0/10(天数:1,3,5,7) 4 99 0/102 49 0/10
C3H 32 95 9/10乳腺瘤 16 92 6/10(天数1,3,5,7,9) 8 77 0/104 24 0/102 10 0/101 0 0/10本发明的化合物也被证明对离体的人二氢叶酸盐还原酶(DHFR)有抑制作用。纯化的人二氢叶酸盐还原酶是根据Delcapm的方法(Delcamp，T.J.et al.，Biochemistry，22，633-639(1983)，作为参考文献并入本文)自白血病患者的成淋巴细胞(WI-L2/M4细胞)得到的。抑制二氢叶酸盐还原酶的评价根据Rosowsky的方法(Rosowsky，A.et al.，Biochem.Pharmacol.，35，3327-3333(1986)，作为参考文献并入本文)进行，用剂量反应曲线确定各种化合物50%抑制酶活力的浓度(IC50)，结果见下列表Ⅲ。
表Ⅲ化合物 DHFR(5×10-8MIC50实施例4 9.6×10-8M实施例7 6.4×10-8M本发明的化合物是抗肿瘤剂。本发明还提供了治疗哺乳类动物(特别是人)敏感的肿瘤的方法。本方法包括以一种药用组合物形式施用化合物。本发明化合物能有效肿瘤的生长，它们包括绒毛膜癌、白血病、女性乳房腺癌、头和颈的表皮肿瘤、鳞状或小细胞肺癌及各种淋巴肉瘤。
这些速效的化合物常以药用组合物形式单独或合并地经口服或非肠道给药，优选非肠道给药。非肠道给药包括肌肉内、鞘内、静脉内和动脉内给药。剂量必须根据肿瘤的种类、病人的状况及反应来确定。一般每天约10至约100mg，持续5至10天，或单独一次给药250-500mg，定期重复(如每两周)。口服剂型(包括片剂或胶囊)每单元剂量1-100mg药物。非肠道给药时用每ml.含1-100mg药物的等渗盐水溶液。
组合物根据制药专业已知的方法制备，至少含一种活性化合物。因此，本发明也包括含有作为有效成分的一种式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ的化合物及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物，本发明还包括以一种式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ的化合物为有效成分的组合物治疗敏感的肿瘤的方法。
制备本发明的组合物以及含有其他式Ⅰ化合物的组合物时，通常有效成分与一种赋形剂混和，并用赋形剂稀释，或包含在载体内，所述载体可以是胶囊、香囊、纸、或其他容器形式。用作稀释剂的赋形剂可以是固体、半固体、或液体，用作有效成分的载体或介质。因此，本发明组合物的形式有片剂、丸剂、粉剂、酏剂、混悬液、乳化液、溶液、糖浆、软或硬的明胶胶囊、栓剂、无菌注射液及无菌包装的粉剂。
制备制剂时，在与其他成分混和前，有效成分需磨细到合适的颗粒程度。如有效成分基本上是不溶解的，常磨到200目或更细一些。如可溶，磨到能均匀分布即可，例如，约40目。
合适的赋形剂的一些实例有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、阿拉伯胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。制剂中还可包括润滑剂如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油，湿润剂，乳化剂和混悬剂，防腐剂如羟苯甲酸甲酯或丙酯，甜味剂或芳香剂。采用本专业熟知的方法，本发明的组合物可制剂成给药后能快速、持续、或延缓地释放有效成分的制剂。
组合物最好制成单位剂量的形式，每一剂量一般含有效成分约5mg到1g，经常是约25到800mg。“单位剂量形式”意指适合于人或其他哺乳类动物一次剂量的物理上独立的单位。每单位含根据计算能产生所需疗效的事前定好量的有效成分及合适的药用赋形剂。
应该知道，确切的给药量要由医生根据有关情况来确定，如治疗对象的状况，所选化合物，给药途径，病人的年令、体重及个体反应和症状的严重程序。所以上述剂量范围并不限制本发明的范围。
以下实施例意在进一步说明本发明，并不意味着限制本发明的范围。
在下述实施例中，溶点、核磁共振谱、电子冲击质谱、场解吸质谱、快速原子轰击质谱、红外光谱、紫外光谱、元素分析、比旋度、高效液相色谱和薄层色谱等术语，依次缩写成m.p.，n.m.r.，m.s.，f.d.m.s.，f.a.b.m.s.，i.r.，U.V.，anal，o.r.，HPLC和TLC。红外光谱中仅将有关的吸收峰列出，并不包括所有观察到的吸收峰。
THF和DMF分别是四氢呋喃和二甲基甲酰胺的缩写。
在核磁共振谱中，采用下列缩写s代表单峰、d双峰、dd双双峰、t三峰、q四峰、m多峰、dm双多峰、br·s宽单蜂、br·d宽双峰、br·t宽三峰、br·m宽多峰、J是用赫兹表示的偶合常数、DMSO-d6是用重氢置换了所有质子的二甲基亚砜。
核磁共振谱用Varian Associates EM-390 90MHz或T-60 60MHz仪器，或JeolFX-90Q90MHz，或Bruker Crop.270MHz仪器，或General Electric QE0300 300MHz仪器测得。化学位移用δ值表示(以四甲基硅烷为标准向低磁场移动的百万分之几)。场解吸质谱用有碳枝晶射频振荡器的Varian-MAT731仪器测得。电子冲击质谱用Consolidated Electrodynamics公司的CEC21-110仪器测得。红外光谱用Perkin-Elmer281仪器测得。紫外用Cary118仪器测定。比旋度用Perkin-ElmerQ-41仪器测得。薄层色谱用E.Merck硅胶板进行。熔点未校正。
实施例1A.2-氨基-4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在100ml圆底烧瓶中，将2.0g(13.3mmol)2-氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-酮悬浮于20ml三氯氧磷中，加热回流2小时，45分钟后形成黄色溶液。冷却到室温，真空去除溶剂，残留物在冰浴中用30ml冰水处理，滤去不溶物。滤液加浓氨水调pH到2。滤出沉淀，用水及20ml乙醚洗涤，真空干燥，得1.1g(49%)2-氨基-4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，浅黄色固体。
Rf＝0.15(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝225-226℃(dec)质谱(FD)＝169IR(KBr，cm-1)＝700，741，812，887，920，1203，1272，1310，1385，1407，1428，1485，1512，1564，1616，1637，2822，2927，2965，3111，3190，3309，3414，3450UV(EtOH)1max＝317，255，232，201(e＝6032，4002，26867，11240)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d 622(d，J＝3.3Hz，1H)6.46(s，2H)，7.06(d，J＝2.7Hz，1H)，11.43(s，1H)B.2-三甲乙酰氨基-4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在100ml圆底烧瓶中将4.0g(23.8mmol)2-氨基-4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶溶于50ml无水吡啶中。加10.2ml(83mmol)三甲基乙酰氯，几分钟后开始形成沉淀，在氮气下室温搅拌30分钟。真空去除挥发物。残渣溶于1L氯仿中，用0.1N HCl洗涤两次，Na2SO4干燥，真空去除溶剂。残余物在硅胶上闪层析，用100%CHCl3至2%MeOH/CHCl3梯度洗脱，收集所需部分，真空去除溶剂，得4.4g(73%)2-三甲乙酰氨基-4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，略带黄色的白色固体。
Rf＝0.67(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝217-220℃(dec)质谱(FD)＝378IR(KBr，cm-1)＝1371，1390，1421，1459，1493，1510，1573，1615，1694，2871，2963，3127，3163，3422UV(EtOH)1max＝278，241，201(e＝6553，24711，元素分析C11H13N4OClC，52.28;H，5.18;N，2217.测定值C，52.55;H，5.18;N，22.09.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.20(s，9H)，6.50(d，J＝3.3Hz，1H)，7.51(d，J＝3.2Hz，1H)，10.02(s，1H)，12.31(s，1H)C.2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在盖在铝箔的100ml圆底烧瓶中，溶1.5%(5.94mmol)2-三甲乙酰氨基-4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶于30ml无水THF中，加1.47g(6.5mmol)N-碘琥珀酰亚胺。此深棕色溶液在氮气下室温搅拌1小时。真空去除溶剂，残余物溶入氯仿，用水洗涤，Na2SO4干燥，真空去除溶剂，残余物用硅胶闪层析，用100%CHCl3至2%MeOH/CHCl3梯度洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得1.86g(83%)2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，黄褐色固体。
Rf＝0.47(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝242-244℃(dec)质谱(FD)＝378IR(KBr，cm-1)＝759，780，803，916，936，965，1021，1161，1178，1227，1259，1287，1315，1368，1414，1453，1500，1565，1603，1708，2871，2967，3213，3425UV(EtOH)1max＝306，251，202(e＝4566，28829，16837)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.20(s，9H)，7.74(s，1H)，10.09(s，1H)，12.67(s，1H)D.N-[2-三甲乙酰氨基-4-氯-[(吡咯并(2，3-d)嘧啶-5-基]乙炔基]-苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
在有铝箔盖的100圆底烧瓶中，加入1.5g(3.96mmol)2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶、1.88g(4.16mmol)N-对-乙炔基苯甲酰基-L-谷氨酸二乙酯、0.16g(0.83mmol)碘化铜(Ⅰ)及溶于30ml无水DMF中的四(三苯膦)钯(o)，再加1.16ml(8.3mmol)三乙胺。在氮气下室温搅拌此深棕色溶液4小时。真空去除挥发物，残余物用硅胶闪层析，用100%CHCl3至1%MeOH/CHCl3梯度洗脱，收集所需部分，真空去除溶剂，将固体在40ml2∶1己烷/乙醚中研磨，得1.35g化合物1，黄褐色固体。
Rf＝0.22(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝212-214℃(dec)质谱(FD)＝582IR(KBr，cm-1)＝785，851，926，1020，1099，1162，1300，1426，1497，1568，1612，1639，1737，2219，2978，3214UV(EtOH)1max＝315，257，203(e＝19105，20190，24301)元素分析C29H32N5O6ClC，59.84;H，5.54;N，12.03.测定值C，59.54;H，5.52;N，11.83.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.00-1.19(m，6H)，1.21(s，9H)，1.97-2.13(m，2H)，2.40-2.47(m，2H)，4.43(m，1H)，7.60(d，J＝8.2Hz，2H)，7.90(d，J＝8.2Hz，2H)，8.80(d，7.3Hz，1H)，10.14(s，1H)，12.80(s，1H)
E.N-[2-三甲乙酰氨基-4-氯-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
在50ml圆底烧瓶中，溶解化合物1 0.050g(0.086mmol)于1ml无水乙醇和1ml二氯甲烷中，再加0.04g10%Pd/C催化剂。加上氢气球，搅拌4小时。滤去催化剂，充分洗涤催化剂，滤液真空去除溶剂，残余物用硅胶闪层析，用2%MeOH/CHCl3洗脱，收集所需部分，真空去除溶剂，得0.45g(95%)化合物2，黄色固体。
Rf＝0.47(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝86-88℃质谱(FAB)＝586IR(KBr，cm-1)＝759，922，1020，1098，1165，1374，1427，1469，1502，1540，1569，1613，1648，1737，2977，3244UV(EtOH)1max＝248，203(e＝40126，36298)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.11-1.19(m，6H)，1.20(s，9H)，1.95-2.09(m，2H)，2.41(t，J＝7.4Hz，2H)，2.97-3.15(m，4H)，3.98-4.11(m，4H)，4.38(m，1H)，7.23(s，1H)，7.32(d，J＝8.1Hz，2H)，7.78(d，J＝8.0Hz，2H)，8.63(d，J＝8.0Hz，1H)，9.98(s，1H)，12.02(s，1H)。
F.N-[2-氨基-4-氯-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基-L-谷氨酸的制备
在15ml圆底烧瓶中，将0.015g(0.026mmol)化合物1混悬于1ml2N NaOH中。室温搅拌七天，再在50℃搅拌4小时。所得浅黄色溶液用5N HCl酸化，置冰浴中冷却，滤出白色沉淀，用15ml水洗涤，70℃真空干燥，得0.005g(49%)化合物2，黄褐色固体。
Rf＝0.05(50%MeOH/CHCl3)m.p.＝＞300℃(dec)质谱(FAB)＝446IR(KBr，cm-1)＝599，928，1020，1225，1435，1501，1555，1617，1714，3337UV(EtOH)1max＝322，239，202(e＝4085，38829，34937)1H NMR(300MHz，DMSOd6)d1.87-2.09(m，2H)，2.32(t，J＝7.3Hz，2H)，2.95(s，4H)，4.36(m，1H)，6.42(s，2H)，6.78(s，1H)，7.30(d，J＝7.7Hz，2H)，7.81(d，J＝7.6Hz，2H)，8.49(d，J＝7.2Hz，1H)，11.13(s，1H)，12.40(br s，2H).
实施例2A.N-[2-三甲乙酰氨基-4-巯基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
在15ml圆底烧瓶中，溶解0.22g(0.37mmol)化合物1于4ml2-甲氧乙醇中，加0.20g(2.6mmol)硫脲。在氮气下100℃加热20分钟。冷到室温后真空去除溶剂，残余物溶于100ml氯仿中，用水洗涤，分出有机层，Na2SO4干燥，真空去除溶剂，在硅胶上闪层析，用2%MeOH/CHCl3洗脱，收集所需部分，真空去除溶剂，得0.11g(50%)化合物2，黄色固体。
Rf＝0.39(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝185-187℃(dec)质谱(FD)＝583IR(KBr，cm-1)＝766，842，935，1023，1163，1360，1439，1564，1640，1735，2975，3195UV(EtOH)1max＝339，279，238，202(e＝16995，10601，34456，43227)元素分析C29H37N5O6SC，59.67;H，6.39;N，12.00.测定值C，59.44;H，6.33;N，11.91.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.11-1.24(m，15H)，1.90-2.10(m，2H)，2.41(t，J＝7.4Hz，2H)，2.98-3.03(m，2H)，3.14-3.22(m，2H)，3.99-4.11(m，4H)，4.38-4.40(m，1H)，6.88(s，1H)，7.33(d，J＝8.1Hz，2H)，7.77(d，J＝8.1Hz，2H)，8.62(d，J＝7.4Hz，1H)，11.05(s，1H)，11.62(s，1H)，13.14(s，1H).
B.N-[2-氨基-4-巯基[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸的制备
在15ml园底烧瓶中溶解化合物1 0.083g(0.14mmol)于6ml0.5N NaOH中，盖上铝箔，室温搅拌5.5天，所得桔色溶液用1N HCl酸化，在冰浴中冷却，滤出沉淀，用水洗涤，60℃真空干燥，得0.037g(59%)化合物2，黄褐色固体。
Rf＝0.04(50% MeOH/CHCl3)m.p.＝240-242℃(dec)质谱(FAB)＝444IR(KBr，cm-1)＝767，817，968，1020，1098，1191，1343，1402，1446，1502，1568，1637，1710，2929，3333UV(EtOH)1max＝347，238，203(e＝9999，30880，40868)元素分析C20H21N5O5SC，54.17;H，4.77;N，15.79.测定值C，53.90;H，4.73;N，15.52.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d2.22-2.35(m，4H)，2.94-3.20(m，4H)，4.29-4.31(m，1H)，6.39(s，2H)，6.52(s，1H)，7.30(d，J＝7.9Hz，2H)，7.73(d，J＝7.9Hz，2H)，8.48(d，J＝7.5Hz，1H)，10.95(s，1H)实施例3A.N-[2-三甲乙酰氨基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸的制备
在-Parr氢化瓶中溶解0.01g(0.17mmol)化合物1于8ml无水乙醇和2ml二氯甲烷中，再加0.05ml(1.3mmol)浓氨水。加0.20g10%Pd/C催化剂，在50psi氢气压力下氢化20小时。滤去催化剂，充分洗涤，真空去涂溶剂，残余物在硅胶上闪层析，用100%CHCl3到2%MeOH/CHCl3梯度洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.055g(59%)化合物2，浅黄色固体。
Rf＝0.33(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝148-149℃质谱(FD)＝551IR(KBr，cm-1)＝766，850，923，1021，1097，1165，1433，1477，1500，1545，1582，1613，1636，1701，1742，2978，3225，3363，3441UV(EtOH)1max＝246，203(e＝38574，36571)元素分析C29H37N5O6C，63.14;H，6.76;N，12.69.测定值C，63.02;H，6.75;N，12.39.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.11-1.20(m，15H)，1.90-2.10(m，2H)，2.41(t，J＝7.4Hz，2H)，3.01(s，4H)，3.99-4.12(m，4H)，4.38-4.41(m，1H)，7.14(s，1H)，7.32(d，J＝8.0Hz，2H)，7.76(d，J＝7.9Hz，2H)，8.60(d，J＝7.3Hz，1H)，9.69(s，1H)，11.57(s，1H)。
B.N-[2-氨基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基-L-谷氨酸的制备
在15ml圆底烧瓶中混悬0.045g(0.082mmol)化合物1于2ml1N NaOH中。室温搅拌7天，所得黄色溶液用1N HCl酸化，在冰浴中冷却，滤出沉淀，用水洗涤，70℃真空干燥，得0.019g(57%)化合物2，浅黄色固体。
Rf＝0.05(50%MeOH/CHCl3)m.p.＝260-264℃(dec)质谱(FAB)＝412IR(KBr，cm-1)＝845，963，1020，1093，1209，1291，1333，1404，1451，1500，1538，1558，1614，1655，2813，2857，2947，3138，3353UV(EtOH)1max＝318，237，203(e＝2239，24103，25087)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.87-2.09(m，2H)，2.30-2.34(m，2H)，2.90-3.01(m，4H)，4.32-4.39(m，1H)，6.01(s，2H)，6.70(s，1H)，7.30(d，J＝8.1Hz，2H)，7.76(d，J＝8.1Hz，2H)，8.41(s，1H)，8.50(d，J＝7.6Hz，1H)，10.76(s，1H)，12.40(br s，1H)。
实施例4A.N-[2-三甲乙酰氨基[[二氢吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
在Parr氢化瓶中，溶解0.068g(0.17mmol)化合物1于6ml无水乙醇和1ml二氯甲烷中，再加0.2g 10%Pd/C催化剂。在50psi压力下氢化18小时。过滤并充分洗涤催化剂，滤液在真空中去除溶剂，残余物在硅胶上闪层析，用2%MeOH/CHCl3洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.022g(34%)化合物2，白色固体。
Rf＝0.23(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝90-92℃质谱(FD)＝554IR(KBr，cm-1)＝853，925，1022，1181，1398，1504，1591，1623，1735，2978，3308UV(EtOH)1max＝296，222，203(e＝7464，31504，35543)元素分析C29H39N5O6C，62.91;H，7.10;N，12.65.测定值C，62.61;H，7.40;N，12.53.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.04-1.20(m，15H)，1.75-1.85(m，1H)，1.93-2.09(m，4H)，2.41(t，J＝7.4Hz，2H)，2.69(t，J＝7.6Hz，3H)，3.65-3.69(m，1H)，4.00-4.11(m，4H)，4.39-4.42(m，1H)，7.34(d，J＝8.0Hz，2H)，7.40(s，1H)，7.78(d，J＝8.4Hz，2H)，7.81(s，1H)，8.62(d，J＝7.4Hz，1H)，9.29(br s，1H)。
B.N-[2-氨基-[[二氢吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸的制备
在15ml圆底烧瓶中，混悬0.075g(0.13mmol)化合物1于3ml1N NaOH中，盖上铝箔，室温搅拌7.5天。所得黄色溶液用5N HCl酸化，冰浴冷却，滤出黄色沉淀，用水洗涤，70℃真空干燥。滤液在真空中去除挥发物，残余物用C-18反相色谱纯化，用10%MeCN/89.5%H2O/0.5%AcOH洗脱。收集所需部分，在真空中浓缩至近干，冰冻干燥。所得沉淀和冰冻所得固体合并，共得0.027g(48%)化合物2，浅黄色固体。
Rf＝0.07(50%MeOH/CHCl3)m.p.＝＞300℃(dec)质谱(FAB)＝414IR(KBr，cm-1)＝660，1180，1295，1380，1500，1608，1630，1640，2920，3340UV(EtOH)1max＝238，203(e＝8086，15837)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.89-1.99(m，1H)，2.10-2.20(m，4H)，2.26(t，J＝6.8Hz，3H)，2.61-2.66(m，2H)，4.30-4.40(m，1H)，5.76(br s，2H)，6.77(s，1H)，7.29(d，J＝7.9Hz，2H)，7.51(br s，1H)，7.72(d，J＝7.7Hz，2H)，8.10(br s，1H)。
实施例5
A.2-氨基-4-甲氧基-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在250ml圆底烧瓶中，溶解0.92g(40mmol)金属钠于80ml无水乙醇中，搅拌，在氮气下加入20g(11.9mmol)2-氨基-4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶。所得黄色溶液加热回流24小时，冷到室温后用冰醋酸中和到pH6.0，真空去除挥发物。残余物用50ml水处理，滤去少量不溶物。滤液用100ml氯仿提取三次，合并有机层，Na2SO4干燥，真空去除溶剂，残余物在硅胶上闪层析，用5%MeOH/CHCl3洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得1.36g(70%)2-氨基-4-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，米色固体。
Rf＝0.17(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝202-204℃(dec)质谱(FD)＝164IR(KBr，cm-1)＝711，740，793，823，902，1056，1093，1165，1194，1228，1321，1334，1390，1406，1440，1473，1490，1579，1610，1632，2828，3110，3370，3484UV(EtOH)λmax＝287，257，223(ε＝7287，7375，24330)元素分析C7H8N4OC，51.22;H，4.91;N，34.13.测定值C，51.02;H，4.95;N，34.23.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)δ3.88(s，3H)，5.96(s，2H)，6.15(d，J＝2.3Hz，1H)，6.78(d，J＝2.9Hz，1H)，10.99(s，1H)。
B.2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在50ml圆底烧瓶中，溶解0.90g(5.48mmol)2-氨基-4-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶于12ml无水吡啶中，加2.4ml(19.2mmol)三甲乙酰氯。在氮气下加热回流1.5小时。真空去除挥发物。残渣溶于9ml甲醇中，冰浴冷却。搅拌，加9ml10%氢氧化铵，滤出生成的沉淀，用水及10%氢氧化铵洗涤，干燥，得11.09g(80%)2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，白色固体。
Rf＝0.26(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝235-236℃质谱(FD)＝248IR(KBr，cm-1)＝709，720，738，789，844，881，901，934，969，1017，1049，1058，1100，1167，1209，1309，1358，1395，1460，1516，1588，1618，1693，2958，3130，3185，3430UV(EtOH)1max＝278，231，202(e＝12328，19978，18292)元素分析C12H16N4O2C，58.05;H，6.50;N，22.57.测定值C，57.75;H，6.48;N，22.62.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.20(s，9H)，6.38(d，J＝3.2Hz，1H)，7.20(d，J＝3.1Hz，1H)，9.49(s，1H)，11.77(s，1H)。
C.2-三甲乙酰氨基-4-甲氧-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在有铝箔盖的15ml园底烧瓶中，溶解0.266g(1.07mmol)2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶于6ml无水THF中，加入0.260gN-碘琥珀酰亚胺，在氮气下搅拌1.5小时。真空去除溶剂，残渣溶于100ml氯仿中。用水洗涤，分出有机层，Na2SO4干燥。经硅胶闪层析，用100%CHCl3到1%MeOH/CHCl3梯度洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.33g(82%)2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，米色固体。
Rf＝0.50(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝243-244℃(dec)质谱(FD)＝374IR(KBr，cm-1)＝652，723，785，806，843，965，1010，1096，1175，1212，1253，1279，1328，1390，1426，1461，1532，1579，1620，1705，2955，3200，3435UV(EtOH)1max＝283，242，202(e＝10018，30658，19457)1H NMR(300，DMSOd6)d1.20(s，9H)，4.01(s，3H)，7.40(d，J＝2.0Hz，1H)，9.55(s，1H)，12.11(s，1H)D.N-[2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙炔基]苯甲酰基]谷氨酸二乙酯的制备
在有铝箔盖的25ml圆底烧瓶中，加0.20g(0.53mmol)2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-5-碘-7H-吡啶并[2，3-d]嘧啶、0.19g(0.58mmol)N-对-乙炔基苯甲酰基-L-谷氨酸二乙酯、0.024g(0.13mmol)碘化铜(I)、及混悬于5ml无水DMF中的0.074g(0.06mmol)四(三苯膦)-钯(o)，再加0.18ml(1.28mmol)三乙胺。所得暗棕色混合物在氮气下于50℃搅拌0.5小时。真空去除挥发物，残余物在硅胶上闪层析，用100%CHCl3到1%MeOH/CHCl3梯度洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.085g(28%)化合物1，黄褐色固体。
Rf＝0.48(2%MeOH/CHCl3)m.p.＝215-216℃(dec)质谱(FD)＝577IR(KBr，cm-1)＝792，852，1097，1165，1346，1430，1527，1607，1737，2216，2978，3210UV(EtOH)1max＝321，263，254，201(e＝22757，22713，23239，39466)1H NMR(300MHz，DMSOd6)d1.06-1.21(m，15H)，1.97-2.11(m，2H)，2.41-2.51(m，2H)，3.99-4.13(m，7H)，4.38-4.45(m，1H)，7.56(d，J＝8.2Hz，2H)，7.61(s，1H)，7.90(d，J＝8.1Hz，2H)，8.79(d，J＝7.3Hz，1H)，9.61(s，1H)，12.28(s，1H)。
E.N-[2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]谷氨酸二乙酯的制备
在50ml圆底烧瓶中，溶解0.075g(0.13mmol)化合物1于8ml无水乙醇和2ml二氯甲烷中，再加0.05gPd/C催化剂，充氢气下搅拌6小时。滤去催化剂，充分洗涤，滤液在真空中去除溶剂，残余物在硅胶上闪层析，用3%MeOH/CHCl3洗脱，收集所需部分，真空去除溶剂，得0.062g(82%)化合物2，黄色固体。
Rf＝0.35(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝71-74℃(dec)质谱(FAB)＝582IR(KBr，cm-1)＝793，844，970，1020，1095，1168，1338，1587，1615，1648，1737，2979，3259UV(EtOH)1max＝277，238，202(e＝13505，35834，45830)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.06-1.20(m，15H)，1.95-2.09(m，2H)，2.41-2.51(m，4H)，2.95(s，2H)，3.98-4.11(m，7H)，4.36-4.40(m，1H)，6.89(s，1H)，7.28(d，J＝8.1Hz，2H)，7.76(d，J＝8.0Hz，2H)，8.62(d，J＝7.4Hz，1H)，9.47(s，1H)，11.43(s，1H)。
F.N-[2-氨基-4-甲氧基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]谷氨酸的制备
在15ml圆底烧瓶中，混悬0.07g(0.12mmol)化合物1于4ml0.5N NaOH中，室温搅拌7天。所得浅黄色溶液用1N HCl酸化，冰浴中冷却，滤出黄褐色沉淀，用水洗涤，70℃真空干燥，得0.044g(83%)化合物2，黄褐色固体。
Rf＝0.08(50%MeOH/CHCl3)m.p.＝230℃(dec)质谱(FAB)＝442IR(KBr，cm-1)＝777，958，1020，1090，1153，1197，1250，1394，1441，1483，1538，1614，1660，2941，3336UV(EtOH)1max＝230，203(e＝35345，34328)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.90-2.07(m，2H)，2.32(t，J＝7.3Hz，2H)，2.84-2.95(m，4H)，3.96(s，3H)，4.33-4.40(m，1H)，6.56(s，1H)，7.26(d，J＝8.0Hz，2H)，7.78(d，J＝8.1Hz，2H)，8.50(d，J＝7.6Hz，1H)，11.04(s，1H)，12.40(br s，2H)。
实施例6A.2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-(三甲基甲硅烷基)乙炔基-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在盖有铝箔的100ml圆底烧瓶中，加入1.0g(2.6mmol)2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶、0.2g(1.04mmol)碘化铜(I)、1.8ml(13mmol)(三甲基甲硅烷基)乙炔及溶于15ml无水DMF中的0.30g(0.26mmol)四(三苯膦)钯(o)，再加0.72ml(5.1mmol)三乙胺。所得暗棕色溶液在氮气下室温搅拌18小时。真空去除挥发物，残余物溶于1L氯仿中，用水洗涤，分出有机层，Na2SO4干燥，真空去除溶剂。此粗制品在硅胶上闪层析，用100%CHCl3到1%MeOH/CHCl3梯度洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.49g(54%)2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-(三甲基甲硅烷基)乙炔基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，黄褐色固体。
Rf＝0.45(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝＞300℃质谱(FD)＝348IR(KBr，cm-1)＝626，758，785，860，926，1021，1166，1232，1260，1291，1432，1456，1498，1568，1610，1698，2161，2961，3154，3424UV(EtOH)1max＝261，256，201(e＝29006，29104，20753)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d0.21(s，9H)，1.20(s，9H)，7.89(s，1H)，10.12(s，1H)，12.67(s，1H)。
B.2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-5-(三甲基甲硅烷基)乙炔基-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在100ml圆底烧瓶中，于氮气下，混悬0.49g(1.4mmol)2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-(三甲基甲硅烷基)乙炔基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶于15ml无水2-甲氧乙醇中，再加0.87ml(8.4mmol)二乙胺，100℃加热1小时，真空去除挥发物，残余物经闪层析，用3%MeOH/CHCl3洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂得0.43g(80%)2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-5-(三甲基甲硅烷基)乙炔基-7H-吡咯并(2，3-d]嘧啶，黄褐色固体。
Rf＝0.43(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝191-194℃(dec)质谱(FD)＝385IR(KBr，cm-1)＝695，711，759，786，838，862，1040，1064，1095，1176，1209，1250，1304，1357，1427，1532，1573，1690，2144，2962，3108，3428UV(EtOH)1max＝367，296，237，207，203(e＝966，18048，28781，22099，21727)1H NMR(300，DMSOd6)d0.19(s，9H)，1.13-1.18(m，15H)，3.86(q，J＝6.8Hz，4H)，7.52(s，1H)，9.08(s，1H)，11.88(s，1H)。
C.2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-5-乙炔基-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在15ml圆底烧瓶中，加入0.10g(0.26mmol)2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-5-(三甲基甲硅烷基)乙炔基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶、及溶于2ml无水THF的0.39ml(0.39mmol)氟化四丁铵。氮气下室温搅拌30分钟。立刻倒入50ml氯仿中，用水洗涤，分出有机层，Na2SO4干燥，真空去除溶剂。残余物闪层析，用2%MeOH/CHCl3洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.079g(97%)2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-5-乙炔基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，黄褐色固体。
Rf＝0.32(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝71-74℃(dec)质谱(FAB)＝314IR(KBr，cm-1)＝721，789，806，834，946，1033，1091，1162，1206，1279，1300，1358，1370，1428，1536，1571，1707，2102，2969，3195，3454UV(EtOH)1max＝295，237，206(e＝15267，26168，20274)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.11-1.22(m，15H)，3.80(q，J＝6.8Hz，4H)，4.01(s，1H)，7.47(s，1H)，9.02(s，1H)，11.81(s，1H)。
D.N-[2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙炔基]苯甲酰基]谷氨酸二乙酯的制备
在有铝箔盖的25ml圆底烧瓶中，加入0.21g(0.67mmol)2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-5-乙炔基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶、0.32g(0.74mmol)对-碘-N-苯甲酰基-L-谷氨酸二乙酯、0.51g(0.83mmol)碘化铜(I)、及溶于4ml无水DMF中的四(三苯膦)钯(o)。所得暗棕色溶液在氮气下室温搅拌1.5小时，真空除去挥发物，残渣在硅胶上闪层析，用100%CHCl3到2%MeOH/CHCl3梯度洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，固体在15ml乙醚中研磨，得0.18g(45%)化合物1，米色固体。
Rf＝0.32(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝171-174℃(dec)质谱(FAB)＝619IR(KBr，cm-1)＝1092，1174，1213，1261，1303，1392，1426，1494，1534，1571，1604，1650，1669，1738，2202，2933，2977UV(EtOH)1max＝340，291，272，245，202(e＝18314，21270，247273，34009，38018)1H NMR(300MHz，DMSOd6)d1.12-1.21(m，21H)，1.96-2.10(m，2H)，2.40-2.43(m，2H)，3.90(q，J＝6.4Hz，4H)，3.96-4.12(m，4H)，4.40-4.45(m，1H)，7.54(d，J＝8.0Hz，2H)，7.66(s，1H)，7.78(d，J＝8.1Hz，2H)，8.78(d，J＝7.3Hz，1H)，9.12(s，1H)，12.01(s，1H)。
E.N-[2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
在Parr氢化瓶中，加入溶于10ml无水乙醇和2ml二氯甲烷中的0.17g(0.27mmol)化合物1，再加0.25g10%Pd/C催化剂，于50psi压力下氢化18小时。滤去催化剂，充分洗涤，滤液在真空中去除溶剂。残余物在硅胶上闪层析，用2%MeOH/CHCl3洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.13g(76%)化合物2，米色固体。
Rf＝0.25(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝68-71℃质谱(FAB)＝623IR(KBr，cm-1)＝763，792，1020，1083，1167，1191，1260，1299，1377，1421，1468，1506，1537，1574，1612，1648，1704，1737，2872，2935，2975，3292，3455UV(EtOH)1max＝296，243，203(e＝11472，43662，43729)元素分析C33H46N6O6C，63.65;H，7.44;N，13.49.测定值C，63.45;H，7.52;N，13.46.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.07-1.19(m，21H)，1.90-2.10(m，2H)，2.40(t，J＝7.5Hz，2H)，3.30(s，4H)，3.52(q，J＝6.8Hz，4H)，3.98-4.11(m，4H)，6.91(s，1H)，7.26(d，J＝8.2Hz，2H)，7.74(d，J＝8.1Hz，2H)，8.60(d，J＝7.4Hz，1H)，9.15(s，1H)，11.26(s，1H)。
F.N-[2-氨基-4-二乙氨基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]谷氨酸的制备
在15ml圆底烧瓶中，混悬0.065g(0.10mmol)化合物1于3ml1N NaOH中，室温搅拌7.5天。所得黄色溶液用1N HCl酸化，冰浴中冷却，滤出沉淀，用水洗涤，70℃真空干燥，得0.021g(42%)化合物2，浅黄色固体。
Rf＝0.09(50%MeOH/CHCl3)m.p.＝160-163℃(dec)质谱(FAB)＝483IR(KBr，cm-1)＝724，766，851，930，990，1020，1079，1098，1206，1298，1354，1401，1436，1503，1533，1567，1612，1656，2873，2935，2975，3209，3331UV(EtOH)1max＝306，235，202(e＝5778，25046，26120)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d0.94-1.12(m，6H)，1.90-2.07(m，2H)，2.30-2.34(m，2H)，3.16-3.49(m，8H)，4.35-4.36(m，1H)，5.59(s，2H)，6.56(s，1H)，7.24(d，J＝7.8Hz，2H)，7.76(d，J＝7.8Hz，2H)，8.48(d，J＝7.6Hz，1H)，10.58(s，1H)，12.15(br s，1H)。
实施例7A.2-三甲乙酰氨基-4-乙硫基-6-乙炔基-吡啶并[2，3-d]嘧啶的制备
将1.0g2-三甲乙酰氨基-4-氧代-6-乙炔基-吡啶并[2，3-d]嘧啶在氮气下100℃与10ml三氯氧磷及1mlN，N-二乙基苯胺反应20分钟。真空除去挥发物，残渣溶于25ml二氯甲烷中，与1ml乙硫醇反应45分钟，真空去除挥发物。残余物溶于二氯甲烷中，用水洗涤两次，分出有机层，Na2SO4干燥，真空去除溶剂。残余物在硅胶上闪层析，用25%EtoAl/MeCl2洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，两步得0.262g(22%)黄色固体。
mp120-123℃UV(EtOH)-362，282，244，205质谱(FAB)＝314Rf＝0.48(11Etoac/MeCl2)1H NMR(300 MHz，CDCl3)d1.38(2，9H)，1.51(t，J＝7.4Hz，3H)，3.54(9，J＝7.4Hz，2H)8.28(s，1HO，8.44(d，J＝2.2Hz，1H)，9.09(d，J＝2.2H2，1H)IR(KBr，cm-1)＝666，763，812，847，893，923，978，1020，1137，1198，1224，1346，1376，1407，1551，1707，1743，2967，3236。
B.N-[2-三甲乙酰氨基-4-乙硫基[[吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基]乙炔基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
将0.009gPdCl2、0.028g三苯膦及3ml乙腈反应30分钟，然后加入0.30g化合物1、0.45g化合物2、0.005gCuI、7ml乙腈及0.31ml三乙胺，80℃加热20分钟。产物溶于过量的二氯甲烷中，用水洗涤，有机层用Na2SO4干燥，真空去除溶剂。残余物在硅胶上闪层析，用25%EtOAc/MeCl2洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.21g(36%)黄色固体。
Rf＝0.42(11EtOAc/MeCl2)UV(EtOH)＝373，326，306，252质谱(FAB)＝619mp＝97-100℃1H NMR(300，CDCl3)d1.26(t，J＝7.1Hz，3H)，1.34(t，J＝7.1Hz，3H)，1.50(s，9H)，1.57(t，J＝6.9Hz，3H)，2.16-2.20(m，1H)，2.23-2.36(M，1H)，2.48-2.59(m，2H)，3.70-3.77(m，2H)，4.14(9，J＝7.2Hz，2H)，4.28(9，J-8.2Hz，2H)，7.90(d，J＝8.2Hz，2HO，8.53(s，1H)，9.16(S，1H)
IR(KBr，Cm-1)＝662，769，792，856，905，979，1020，1132，1202，1261，1304，1332，1372，1400，1496，1552，1597，1660，1735，2976，3378。
C.N-[2-三甲乙酰氨基-[四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
溶解0.10g化合物1于3ml二氯乙烷中，用15ml乙醇稀释，所得溶液在60psi压力下用阮尼镍氢化，室温下反应2小时后于60℃三小时。真空去除溶剂。残余物闪层析，用5%MeOH/CHCl3洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.025g(27%)黄色固体。
Rf＝0.27 15%MeOH/CHCl3)UV(EtOH)＝298，225，202质谱(FAB)＝619mp＝168-170℃1H NMR(300，CDCl3)d1.21(t，J＝3.4Hz，3H)，1.24-1.39(m，12H)，1.69-1.75(m，2H)，1.80-2.14(m，1H)，2.16-2.19(m，1H，2.30-2.50(m，4H)，2.74-2.82(m，2H)，3.10-3.25(m1H)，3.46-3.51(m，2H)，4.15(9，J＝6.9Hz，2H)，4.26(9，J＝7.0Hz，2HO，4.75-4.85(m，1HO，5.40(s，1H)，7.00(d，J＝7.1Hz，1HO，7.3old，J＝10.0H2，2HO，7.75(s，1HO，7.80(d，J+10.2Hz)IRCKBr，CM-1)＝542，613，785，857，927，1022，1097，1155，1207，1260，1300，1373，1421，1503，1542，1574，1613，1658，1736，2931，3338。
D.N-[2-氨基-[甲氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸的制备
将溶于1ml甲醇中的0.039g化合物1与1.5ml 1 N NaOH反应，搅拌3.5天。用5N HCl酸化到pH6。滤出生成的黄色沉淀，用水洗涤，60℃真空干燥。
Rf＝0.05(50%MeOH/CHCl3)mp＝250-253℃质谱(FAB)＝428UV(EtOH)＝230，2021H NMR(300，DMsOd6)d1.57(t，J＝7.3，3H)，1.62-1.67(m，2H)，1.92-2.01(m，2H)，2.18-2.21(m，2H)，2.30(t，J＝7.0 Hz，2H)2.48-2.71(m，2H)，2.90-3.10(m，2H)，4.31-4.34(m，1H)6.31(s，2H)，7.29(d，J＝8.0Hz，2H)，7.36(d，J＝1.2Hz，1H)，7.41(d，J＝2.5Hz，1H)，7.77(d，J＝8.0Hz，2H)，8.39(d，J＝7.2Hz，1H)IR(KBr，cm-1)＝583，768，1100，1379，1451，1502，1537，1585，1662，2929，3333。
权利要求
1.具下式的化合物及其药学上可接受的盐；
式中Ar是二氢吡咯并、吡咯并、吡啶并、或四氢吡啶并；R1是氢、氯、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷氨基、或二(C1-C4)烷氨基；及R2是C2-C3烷基。
2.按权利要求1的化合物其中Ar是二氢吡咯并、四氢吡啶并、或吡咯并;R1是氢或氯;和R2是乙基;及其药学上可接受的盐。
3.N-[2-氨基-[[二氢吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸及其药学上可接受的盐。
4.N-[2-氨基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸及其药学上可接受的盐。
5.N-[2-氨基-[[四氢吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸及其药学上可接受的盐。
6.一种药物制剂，它含有权利要求1至5中任一权项的化合物作为有效成份，并含有一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
7.制备权利要求1至5中任一权项的化合物的方法，该方法包括(a)水解下式的中间体
式中Ar是吡咯并或吡啶并，R1是氢、氯、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷氨基、或二(C1-C4)烷氨基，R2是C2-C3烷基，Y1是氨基保护基团，和Y2是相同或不相同的羰基保护基团;(b)将步骤(a)产物任选地催化氢化;和(c)将步骤(a)或步骤(b)的产物任意地转变成药学上可接受的盐。
8.按权利要求7的方法制备的具下式的化合物及其药学上可接受的盐
式中Ar是二氢吡咯并、吡咯并、吡啶并、或四氢吡啶并;R1是氢、氯、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷氨基、或二(C1-C4)烷氨基;和R2是C2-C3烷基。
9.具下式的化合物及其药学上可接受的盐
式中Y1是氢或氨基保护基团;Z是氢、溴、或碘。
10.具下式的化合物及其药学上可接受的盐
式中Ar是吡咯并或吡啶并;R2是C2-C3烷基;Y1是氨基保护基团;和Y2是相同或不相同的羧基保护基团。
全文摘要
本发明涉及N-[2-氨基-4-取代的-[[(吡咯并或吡啶并)[2，3-d]嘧啶基]烷基]苯甲酰基]-L-谷氨酸化合物、合成它们的中间体、含有这些化合物的药物制剂，及其作为抗肿瘤剂的应用。
文档编号C07D471/04GK1078235SQ9310320
公开日1993年11月10日 申请日期1993年3月23日 优先权日1992年3月24日
发明者L·S·戈塞特, 石全 申请人:伊莱利利公司
技术领域：
本发明涉及N-[2-氨基-4-取代的-[[(吡咯或吡啶)并[2，3-d]嘧啶基]-烷基]苯甲酰基]-L-谷氨酸化合物、它们的某些还原形式、合成它们的中间体、含有这些化合物的药物制剂，及其作为抗肿瘤药的应用。
叶酸是一些酶促反应如核酸的生物合成、氨基酸和肽类代谢等中的辅酶。叶酸的衍生物叶酸辅助因子在核酸合成的两条途径-嘌呤合成和胸腺嘧啶核苷合成-中是必不可少的。叶酸在具有生物学活性前，一般经过两步还原才转变成有活力的辅酶形式。氨甲蝶呤等化合物能通过与所需的二氢叶酸还原酶的牢固的偶合而抑制二氢叶酸转变成四氢叶酸的第二步还原。这些抑制剂正不断地发展成抗肿瘤药物，因为它们干扰脱氧核糖核酸的合成，并阻止具有生物学活性的四氢叶酸盐的再生而使细胞死亡。
叶酸和氨基蝶呤的各种衍生物已被合成并试作叶酸代谢抑制剂。包括一些用亚甲基或次甲基分别取代原来的亚氨基或次氨基的各种去氮化合物。这些衍生物有不同程度的代谢抑制剂的活性。一种四氢氨基蝶呤抗肿瘤剂5，10-二脱氮-5，6，7，8-四氢氨基蝶呤(DDATHF)抑制甘氨酰胺核糖核苷酸转甲酰基酶，这是嘌呤生物合成开始阶段所需的酶(参见J.Med.Chem.，28，914(1985))。
目前，抗肿瘤剂对哺乳动物的各种肿瘤还不是广泛有效的治疗药。它们引起的发病率和死亡率是寻找新的抗肿瘤剂的重要动力。本发明满足这种需要，并提供新的抗肿瘤剂，详述如下。
本发明的一个方面涉及式Ⅰ的化合物及其药学上可接受的盐
式中R1是氢、氯、巯基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷氨基、或二(C1-C4)烷基氨基;
R2是C2-C3烷基。
本发明的另一方面是具式Ⅱ的化合物及其药学上可接受的盐
式中R1和R2的定义同上述式Ⅰ。
本发明的另一方面是具式Ⅲ的化合物及其药学上可接受的盐
式中R1是氢、氯、巯基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷氨基、或二(C1-C4)烷基氨基;
R2是C2-C3烷基。
本发明还有一个方面是具式Ⅳ的化合物及其药学上可接受的盐
式中R1和R2的定义同上述式Ⅲ。
本发明还涉及用于制备式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ化合物的中间体，涉及利用这些化合物防治肿瘤生长的组合物和方法。
本发明涉及式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ化合物及用于合成它们的中间体。这些中间体是具有下列结构式的化合物及其药学上可接受的盐
式中Y1是氢或一个氨基保护基团;
Z是氢、溴或碘;
和具有下式结构式的化合物及其药学上可接受的盐
式中W是化学键或-CH2-;
Y1是氨基保护基团;
Y2是相同或不同相的羧基保护基团。
在式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ中L-谷氨酸残基的构型已明确画出。本文中所有化合物的谷氨酸残基都是L型的。
本文中的术语“C2-C3烷基”意指具有所标明碳原子数的直链的二价烷基，如1，2-亚乙基及1，3-亚丙基。
“烷硫基”意指具有1至4个碳原子的直链、或支链烷基，并联于硫上，成为甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、异丁硫基、仲丁硫基或叔丁硫基。
“烷氧基”意指具有1至4个碳原子的直链或支链烷基并与氧相连，形成甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧或叔丁氧基。
“烷氨基”意指有1至4个碳原子的烷基并联于氨基上，成为甲氨基、乙氨基、丙氨基、异丙氨基或丁氨基。
“二烷基氨基”意指-NR3R4，其中R3和R4是相同或不相同的具有1至4个碳原子的烷基，如二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二异丙基氨基、二丁基氨基、或甲基乙基氨基。
说明书中所用的“氨基保护基”一词意指在化合物的其他官能团的反应中，通常用来阻断或保护氨基的取代基团。所述氨基保护基的实例包括甲酰基、三苯甲基、邻苯二甲酰亚氨基、三氯乙酰基、氯乙酰基、溴乙酰基、碘乙酰基、苯甲酰甲基磺酰基、2-(硝基)-苯基亚磺酰基、二苯基氧膦基及类似的氨基保护基团。所用的氨基保护基团的种类是不重要的，只要被保护的氨基在随后的中间体的其他部位的反应条件下是稳定的，并且在合适的阶段可选择性地被除去，而不破坏分子的其余部分，(包括其他氨基保护基团在内)即可。优选的氨基保护基团有(C1-C4烷基)羰基及三甲基乙酰基，最优选三甲基乙酰基。上述定义的保护基的另一些实例参见下列文献J.W.Barton，"Protective Groups in Organic Chemistry"，J.G.W.McOmie，Ed.，Plenum Press，New York，N.Y.，1973，Chapter 2，and T.W.Greene，"Protective Groups in Organic Synthesis"，John Wiley and sons，New York，N.Y.，1981，Chapter 7.
本文所用的“羧基保护基团”意指当化合物的其他基团进行反应时，通常用来阻断或保护羧基的羧酸酯衍生物之一，所述羧酸保护基的实例包括4-硝基苄基、4-甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、2，4-二甲氧基苄基、2，4，6-三甲氧基苄基、2，4，6-三甲基苄基、五甲基苄基、3，4-亚甲基二氧基苄基、二苯甲基、4，4′-二甲氧基二苯甲基、2，2′，4，4′-四甲氧基二苯甲基、甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、叔戊基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4，4′-二甲氧基三苯甲基、4，4′，4″-三甲氧基三苯甲基、2-苯基丙-2-基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、苯甲酰基甲基、2，2，2-三氯乙基、β-(三甲基甲硅烷基)乙基、β-(二(正丁基)甲基甲硅烷基)乙基、对甲基苯磺酰基乙基、4-硝基苄基磺酰基乙基、烯丙基、肉桂基、1-(三甲基甲硅烷基甲基)-丙-1-烯-3-基等。羧基保护基团的种类并不重要，只要被保护的羧基在随后的分子其他部位反应的条件下是稳定的，并能在适当的阶段将其除去而不破坏分子的其余部分。这些基团的另一些例子参见下列文献E.Haslam，"Protective Groups in Organic Chemistry"，J.G.W.McOmie，Ed.，Plenum Press，New York，N.Y.，1973，Chapter 5，and T.W.Greene，"Protective Groups in Organic Synthesis"，John Wiley and Sons，New York，N.Y.，1981，Chapter 5.
另一相关的术语“保护的羧基”指被上述羧基保护基团之一取代的羧基。优选的保护基是乙基和丙基。
如上所述，本发明包括上述结构式所定义的化合物的药学上可接受的盐。本发明的具体化合物具有一个足够酸性的官能团、一个足够碱性的官能团、或这两种官能团都存在，因而能与任何一种无毒的无机碱及无毒的无机或有机酸形成药学上可接受的盐。通常用于形成酸加成盐的酸是无机酸，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等;有机酸，例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对-溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。所述药学上可接受盐的实例有硫酸盐、焦硫酸盐、酸性硫酸盐、亚硫酸盐、酸性亚硫酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物，碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、反式丁烯二酸盐、顺式丁烯二酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟苯甲酸盐、甲氧苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。优选的药学上可接受的酸加成盐是那些有与矿物酸(如盐酸、氢溴酸)和有机酸(如顺丁烯二酸及甲磺酸)形成的盐。
碱加成盐包括那些与无毒的无机碱(如铵、碱金属或碱土金属的氢氧化物)形成的盐，以及碳酸盐、碳酸氢盐等。用以制备本发明盐的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾。钾盐和钠盐的形式是特别优选的。
制备本发明化合物的起始原料，优选2-氨基-4-氧代吡咯并[2，3-d]嘧啶(下列式Ⅴ)或2-(叔丁氧羰基)-氨基-4-氧代-6-乙炔基-吡啶并[2，3-d]嘧啶[下列式Ⅵ];这取决于所需产物是吡咯还是吡啶衍生物。
本发明的化合物及其前体，用普通专业人员熟悉的方法来制备。本发明的吡咯化合物，若市场上买不到(如2-氨基-4-氧代-吡咯立[2，3-d]嘧啶，Sigma化学公司名为7-鸟嘌呤)，可用买得到的试剂，用有机化学的传统方法来制备。
2-(三甲基乙酰基)氨基-4-氧代-5-乙炔基吡啶并[2，3-d]嘧啶化合物，根据Taylor等的方法(J.Org.Chem.，54，3618-3624(1989))制取，该文献作为参考文献并入本文。
合成本发明吡咯化合物的第一步，是在有或无惰性或基本惰性的溶剂或混合溶剂的存在下，将式Ⅴ的化合物与一种氯化剂反应，此反应用反应式1表示反应式1
任何能释放氯离子的化合物都是合适的氯化剂，优选的氯化剂是POCL3和PCL3。
虽然这个反应在有或无溶剂存在时都能进行，不用更好。
此反应中所用氯化剂的量是用足够量的氯取代4-氧基即可。一般每当量的吡咯并嘧啶用等当量的或过量的氯化剂，最好过量。
此步骤的温度，能使氯化完全即可，一般从室温至约回流温度，最好是回流温度。
第一步反应的时间是能产生置换反应的任何时间都行，一般约需2至6小时。可根据传统的反应进程监测方法，如薄层色谱法、高效液相色谱法或柱色谱法来确定最佳时间。
合成本发明吡咯化合物的第二步是在2-氨基上加一保护基团，第三步是将相应的保护的氨基化合物与N-碘(或溴)琥珀酰亚胺反应，反应顺序见反应式2反应式2
式中Z是碘或溴;和Y1是氨基保护基团。
引入氨基保护基团的反应，在专业人员所熟悉的那些反应的标准条件下进行。
卤取代基是碘或溴，优选碘。将氨基保护的中间体与N-碘琥珀酰亚胺或N-溴琥珀酰亚胺在弱碱的存在下于惰性或基本惰性的溶剂或混合溶剂中(或不用溶剂)反应，制得相应的5-卤代中间体。
此反应中合适的碱包括叔胺，例如三乙胺和吡啶，优选无水吡啶。
合适的溶剂通常是高沸点的极性溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)、甘醇二甲醚、四氢呋喃(THF)、和吡啶，优选溶剂是无水吡啶。
本反应中N-碘琥珀酰亚胺或N-溴琥珀酰亚胺的用量，一般以使氨基保护的化合物全部反应为准。通常采用等当量或稍过量的N-碘琥珀酰亚胺或N-溴琥珀酰亚胺。
所用温度足够使卤化完全即可，近于室温最好。
第三步的反应时间是发生卤化反应所需的时间，约需10分钟至4小时。可用传统的监测反应进程的色谱技术如薄层层析确定最合适的反应时间。
合成本发明化合物的第四步是5-卤吡咯并嘧啶与苯甲酸衍生物的偶合。这过程需将下式的不饱和化合物
与5-溴或5-碘吡咯并嘧啶中间体在合适的溶剂、钯催化剂、最好还有仲胺或叔胺的存在下反应;式中J1和J2都是氢或它们一起形成碳-碳键(即一个炔基)，Q是甲硅烷基保护基团，优选三甲基甲硅烷基。类似反应见Taylor等的美国专利4，818，819号，它作为参考文献并入本文。
所用钯催化剂，同以前用于芳基卤与烯丙醇反应中的催化剂，已有介绍，例如参见下列文献
Melpoler et al.，J.Org.Chem.，41，265，(1976);265;Chalk et al.，J.Orq.Chem.，41，1206，(1976);Arai et al.，J.Heterocvclic Chem.，15，351(1978);Tamuru et al.，Tetrahedron Papers，10，919(1978);Tetrehedron，35，329(1979).
在偶合反应中，苯甲酸衍生物的羧基，要用羧基保护基团加以保护。
偶合反应最好在至少1克分子当量的仲胺或叔胺(例如三乙胺或二乙胺)用作酸受体的存在下进行。
本反应中用的合适的溶剂最好是无水的惰性极性溶剂如乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、或N-甲基吡咯烷酮。
采用中等程度的升温，优选约75℃至约125℃，更优选约85℃到100℃。
下述变异反应使用钯催化剂，区别在于或者先使该不饱和化合物与吡咯并嘧啶反应，然后再和苯甲酸衍生物偶合;或者先将不饱和化合物与苯甲酸衍生物反应，然后再和吡咯并嘧啶偶合。所用不饱和化合物包括乙烯、乙炔、丙烯、或丙炔。
在第一种变异方法中，将吡咯并[2，3-d]嘧啶与不饱和化合物反应，产生的中间体用标准条件脱去甲硅烷基，然后将其用作下一步偶合反应的反应物。这一系列反应解释于下面的反应式中
式中Y2是羧基保护基团;
Z是碘或溴;
J1的J2都是氢，或一起形成碳-碳键;
Q是甲硅烷基保护基团;和X是碘或溴。
在第二种变异方法中，将苯甲酸衍生物与不饱和化合物反应先生成相应的不饱和谷氨酸酯中间体，在标准条件下脱去该中间体的甲硅烷基，然后再与吡咯并嘧啶偶合。这一系列反应解释于变异方法2中
式中Q是甲硅烷基保护基团。
制备相应的N-[2-三甲基乙酰氨基-4-取代的-[吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基]乙炔基]苯甲酰基]-L-谷氨酸酯，至少可用基本上与变异方法1中所述的制备吡咯并[2，3-d]嘧啶相同的方法，将上述2-(叔丁氧羰基氨基-4-氧代-5-乙炔基吡啶并[2，3-d]嘧啶化合物与上述苯甲酸衍生物偶合。
R2是1，3-亚丙基的本发明化合物按下法制备先用Meyers介绍的恶唑啉(Acc.Chem.Res.，14，375(1978))，此文献作为参考文献并入本文)合成具有对-丙烯-1-基的上述苯甲酸衍生物。然后酸水解(5NHCl，回流36小时)得4-烯丙基苯甲酸，将其先用亚硫酰氯(4.0当量，苯中回流4小时)处理，然后与L-谷氨酸二乙酯盐酸盐(2.1当量)、4-二甲氨基吡啶(0.01当量)及三乙胺反应18小时，被转变成相应的L-谷氨酸二乙酯衍生物。至少可通过变异方法2，再与吡咯并或吡啶并[2，3-d]偶合，得R2中1，3-亚丙烯基的本发明化合物。
制备本发明化合物的第五步是在适当的溶剂中，在催化剂的参与下，氢化式Ⅸ化合物，生成相应的2-保护的氨基-4-氯-[吡咯并或吡啶并[2，3-d]嘧啶基]烷基]苯甲酰基]-保护的L-谷氨酸(式Ⅹ)，见反应式6
反应式6
式中Ar是吡咯并或吡啶并;
Y1是氨基保护基团;
J1和J2都是氢或一起形成碳-碳键;
W是一个键或CH2;
Y2是羧基保护基团。
第五步所用的溶剂是在氢化条件下不起反应的任何溶剂。合适的溶剂包括醇类如甲醇、乙醇1-丙醇、及2-丙醇，最优选的是乙醇。
氢化的催化剂可用含有贵金属并能催化碳桥还原的任何物质。合适的催化剂实例包括载于炭上的贵金属、贵金属氧化物和以碱土金属碳酸盐为载体的贵金属。本文中“贵金属”指金、银、铂、钯、铱、铑、汞、钌、和锇。优选的催化剂是钯-炭、铂-炭和氧化铂，最优选钯-炭。
本步骤用的温度和压力应足以使氢化反应完全。优选约30℃到约150℃，最优选为约30℃到约75℃。所用压力为约1000psi至约1psi，优选约400psi到约2psi。
本发明包括4-位有不同原子或基团的化合物，选自氢、巯基、烷硫基、烷氧基、烷氨基、及二烷基氨基。氯的置换，除氢外，均可在第一步(反应式1)后、第三步(反应式2)后、或第四步(变异方法1及2的偶合反应)后进行，但必须在保护基团(Y1和Y2)去除以前。以氢置换氯可在第四步后或在保护基团去除之后(下述第六步)进行。
上述各步的最佳反应时间可用监测反应进程的传统色谱技术(如薄层色谱、高效液相色谱、或柱色谱)、光谱技术(如红外光谱、核磁共振谱、或质谱)、或两种技术结合来确定。
本发明中各种4-位取代基的进一步描述如下4-氢置换4-氯得本发明4-氢化合物按下法进行在碳桥饱和之后继续延长第五步氢化的时间。
4-巯基或4-烷硫基将本发明的第一、三、或五步的产物(式Ⅶ、Ⅷ或Ⅹ的化合物)，在合适溶剂的存在下，与硫脲或二烷基二硫化物反应，4-氯化合物即转变成本发明的相应的巯基或烷硫基化合物。这类氯取代反应是专业人员熟悉的，例如参见
March，Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms，and Structure，McGraw-Hill，lst ed.，p.500该文献作为参考文献并入本文。
此步骤中所用的溶剂是在反应条件下仍然惰性的任何溶剂，优选2-甲氧基乙醇。
4-烷氧基将本发明式Ⅶ、Ⅷ、或Ⅹ的化合物在合适的溶剂中，与能释放醇盐离子(R3O-)的亲核试剂反应，可置换4-氯而得本发明的相应的烷氧基化合物。相应的C1-C2烷基醇与活泼金属如钠或镁作用可得所需的醇盐离子。例如R3OH+Na→R3O-Na+一旦释放出醇盐离子，即可应用包括以醇盐离子取代4-氯的亲核取代反应在内的William合成法。
在反应条件下惰性的任何溶剂可用作本步骤的溶剂，优选2-甲氧乙醇。
4-烷氨基或4-二烷基氨基在适当的溶剂中，将本发明第一、第三、第五步的产物，与相应的亲核的烷胺或二烷胺反应，可将4-氯置换成本发明的烷氨基或二烷氨基化合物。类似的氯代反应有机化学专业人员是熟悉的，例如参见
March，Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms，and Structure，McGraw-Hill，lst ed.，p.502;
该文献作为参考文献并入本文。
任何在反应条件下惰性的溶剂都可作本步骤的溶剂，优选2-甲氧乙醇。
本发明的第六步是将式Ⅹ的化合物经碱水解除去保护基团Y1和Y2。此方法得到式Ⅰ或式Ⅲ的2-氨基-4-取代的-[[吡咯并或吡啶并(2，3-d)-嘧啶基]烷基]苯甲酰基]-L-谷氨酸。去除各种不同保护基团的方法前述标准文献已有介绍，它们作为文献并入本文。
本发明的任选的第七步是式Ⅰ或式Ⅲ化合物的催化氢化。氢化产物是式Ⅱ或式Ⅳ的吡咯并或吡啶并嘧啶化合物。
用来合成本发明化合物的起始原料是已知的。如市场上无法购到，很容易用本领域普通专业人员常用的方法合成。
本发明的药学上可接受的盐，通常以具有合适的酸性或碱性官能团的化合物，与等分子的或过量的酸成碱反应制取。反应物一般在互溶的溶剂中结合，例如，酸加成盐在二乙醚或苯中，碱加成盐在水或醇中。生成的盐能正常地在1小时至10天内以沉淀析出，并可用过滤或其他传统方法分离。
另外，本发明的某些化合物能和水或常用有机溶剂形成溶剂化物。这些溶剂化物作为本发明化合物也包括在本发明范围内。
本发明的化合物对以叶酸盐，特别是以叶酸盐的衍生物作底物的一种或几种酶有抑制作用。例如，下列有代表性的化合物证明对成淋巴白血病细胞衍生的人的T细胞(CCRF-CEM)的生长有抑制作用实施例1，N-[2-氨基-4-氯-[[吡咯并[2，3-d]-嘧啶-5-基]-乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸;
实施例2，N-[2-氨基-4-巯基-[[吡咯并[2，3-d]-嘧啶-5-基]-乙基]苯甲酰基-L-谷氨酸;
实施例3，N-[2-氨基-[[吡咯并[2，3-d]-嘧啶-5-基]-乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸;
实施例4，N-[2-氨基[二氢吡咯并[2，3-d]-嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸;
实施例5，N-[2-氨基-4-甲氧基-[[吡咯并[2，3-d]-嘧啶-5-基]-乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸;
实施例6，N-[2-氨基-4-二乙氨基-[[吡咯并[2，3-d]-嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸;
实施例7，N-[2-氨基-[[四氢吡啶并[2，3-d]-嘧啶-6-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸。
表Ⅰ是用人白血病细胞系CCRF-CEM细胞(Foley et al.，Cancer，18，522(1965))所作体外试验的数据，这种细胞的生长已有报导(Grindey，et al.，J.Mol.Pharmacol.，16，601，(1979))，二者均作为参考文献并入本文。为了确定50%生长抑制的浓度(IC50)作了各种化合物的剂量反应曲线。制备了双份不同浓度(自100μg/ml到0.005μg/ml)的化合物的Cluster板。被试化合物先溶于二甲基亚砜(DMSO)中，再进一步稀释到所需浓度。将加有10%透析的胎牛血清及16mM HEPES缓冲液和8mM MOPS缓冲液的Roswell ParK Memorial研究所1640培养基中的细胞加入小井中，使最后浓度为每井有4.8×104个细胞，总体积2.0ml。培养72小时(95%空气，5%CO2)后，用ZBI库尔特计数器计数细胞。培养结束时，对照组的细胞数通常为(4-6)×105个/井。
表Ⅰ化合物 IC50(μg/ml)1 >202 0.0323 0.0194 0.0055 >206 0.97 0.005本发明的化合物已被证明在体内有抗小鼠移植肿瘤的活性，是用带有6C3HED淋巴肉瘤(也叫做Gardner淋巴肉瘤(GLS))的C3H小鼠来测试这些化合物的。6C3HED淋巴肉瘤由国家肿瘤研究所肿瘤治疗系提供，保存在E.G.andG.Mason研究的肿瘤库中(麻省，乌斯特)。第一传代肿瘤用标准方法储存在液氮中。移植的肿瘤每六个月或必要时重新从肿瘤库取用，连续传代，每周在C3H小白鼠身上进行二次。
试验时自传代的小鼠身上取出肿瘤，用无菌技术切成1至3mm的方形薄片，用抗菌介质1和心脑浸出液(密西根州底特律Difco公司)验证确系无菌。接受移植的小鼠先剃毛，然后在腋下用套针将肿瘤薄片植入皮下。植入第二天按一定计划开始药物治疗。被试化合物与2.5%(重量百分数)名为“Emulphor EL620”表面活性剂(GAF化学公司出品)的聚氧乙基化油混和(用生理盐水1∶40稀释)。所有动物在开始时及治疗结束时都称体重，自由摄食和饮水。药物以0.5ml2.5%Emulphon溶液形式给药。除另有注明者外，都是每天给药一次，共给八天。治疗结束后一天用与微机相连的数字电子测径器测定肿瘤的长及宽(J.F.Worzalla，et al.，Investigational New Drugs，8，241-251(1990))。从测得的数字根据下式计算肿瘤重量肿瘤重(mg)＝(宽，mm)2×(长，mm)/2最少有一个同等鼠数并只用同体积2.5%Emulphor处理的对照组。1减去试验组肿瘤大小的平均数与对照组肿瘤大小之比的差，再乘以100，得抑制百分数(%INH)。实施例4化合物的试验结果列于表Ⅱ中。
表Ⅱ实施例4结果肿瘤系 剂量浓度 %INH 毒性/总数(mg/kg)6C3HED 50 TOX 10/10淋巴肉瘤 25 TOX 10/10(天x8) 12.5 100 8/106.25 100 6/104.00 100 1/102.00 97 0/101.00 36 0/100.50 1 0/100.25 0 0/10
6C3HED 16 100 0/10淋巴肉瘤 8 100 0/10(天数:1,3,5,7) 4 99 0/102 49 0/10
C3H 32 95 9/10乳腺瘤 16 92 6/10(天数1,3,5,7,9) 8 77 0/104 24 0/102 10 0/101 0 0/10本发明的化合物也被证明对离体的人二氢叶酸盐还原酶(DHFR)有抑制作用。纯化的人二氢叶酸盐还原酶是根据Delcapm的方法(Delcamp，T.J.et al.，Biochemistry，22，633-639(1983)，作为参考文献并入本文)自白血病患者的成淋巴细胞(WI-L2/M4细胞)得到的。抑制二氢叶酸盐还原酶的评价根据Rosowsky的方法(Rosowsky，A.et al.，Biochem.Pharmacol.，35，3327-3333(1986)，作为参考文献并入本文)进行，用剂量反应曲线确定各种化合物50%抑制酶活力的浓度(IC50)，结果见下列表Ⅲ。
表Ⅲ化合物 DHFR(5×10-8MIC50实施例4 9.6×10-8M实施例7 6.4×10-8M本发明的化合物是抗肿瘤剂。本发明还提供了治疗哺乳类动物(特别是人)敏感的肿瘤的方法。本方法包括以一种药用组合物形式施用化合物。本发明化合物能有效肿瘤的生长，它们包括绒毛膜癌、白血病、女性乳房腺癌、头和颈的表皮肿瘤、鳞状或小细胞肺癌及各种淋巴肉瘤。
这些速效的化合物常以药用组合物形式单独或合并地经口服或非肠道给药，优选非肠道给药。非肠道给药包括肌肉内、鞘内、静脉内和动脉内给药。剂量必须根据肿瘤的种类、病人的状况及反应来确定。一般每天约10至约100mg，持续5至10天，或单独一次给药250-500mg，定期重复(如每两周)。口服剂型(包括片剂或胶囊)每单元剂量1-100mg药物。非肠道给药时用每ml.含1-100mg药物的等渗盐水溶液。
组合物根据制药专业已知的方法制备，至少含一种活性化合物。因此，本发明也包括含有作为有效成分的一种式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ的化合物及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物，本发明还包括以一种式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ的化合物为有效成分的组合物治疗敏感的肿瘤的方法。
制备本发明的组合物以及含有其他式Ⅰ化合物的组合物时，通常有效成分与一种赋形剂混和，并用赋形剂稀释，或包含在载体内，所述载体可以是胶囊、香囊、纸、或其他容器形式。用作稀释剂的赋形剂可以是固体、半固体、或液体，用作有效成分的载体或介质。因此，本发明组合物的形式有片剂、丸剂、粉剂、酏剂、混悬液、乳化液、溶液、糖浆、软或硬的明胶胶囊、栓剂、无菌注射液及无菌包装的粉剂。
制备制剂时，在与其他成分混和前，有效成分需磨细到合适的颗粒程度。如有效成分基本上是不溶解的，常磨到200目或更细一些。如可溶，磨到能均匀分布即可，例如，约40目。
合适的赋形剂的一些实例有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、阿拉伯胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。制剂中还可包括润滑剂如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油，湿润剂，乳化剂和混悬剂，防腐剂如羟苯甲酸甲酯或丙酯，甜味剂或芳香剂。采用本专业熟知的方法，本发明的组合物可制剂成给药后能快速、持续、或延缓地释放有效成分的制剂。
组合物最好制成单位剂量的形式，每一剂量一般含有效成分约5mg到1g，经常是约25到800mg。“单位剂量形式”意指适合于人或其他哺乳类动物一次剂量的物理上独立的单位。每单位含根据计算能产生所需疗效的事前定好量的有效成分及合适的药用赋形剂。
应该知道，确切的给药量要由医生根据有关情况来确定，如治疗对象的状况，所选化合物，给药途径，病人的年令、体重及个体反应和症状的严重程序。所以上述剂量范围并不限制本发明的范围。
以下实施例意在进一步说明本发明，并不意味着限制本发明的范围。
在下述实施例中，溶点、核磁共振谱、电子冲击质谱、场解吸质谱、快速原子轰击质谱、红外光谱、紫外光谱、元素分析、比旋度、高效液相色谱和薄层色谱等术语，依次缩写成m.p.，n.m.r.，m.s.，f.d.m.s.，f.a.b.m.s.，i.r.，U.V.，anal，o.r.，HPLC和TLC。红外光谱中仅将有关的吸收峰列出，并不包括所有观察到的吸收峰。
THF和DMF分别是四氢呋喃和二甲基甲酰胺的缩写。
在核磁共振谱中，采用下列缩写s代表单峰、d双峰、dd双双峰、t三峰、q四峰、m多峰、dm双多峰、br·s宽单蜂、br·d宽双峰、br·t宽三峰、br·m宽多峰、J是用赫兹表示的偶合常数、DMSO-d6是用重氢置换了所有质子的二甲基亚砜。
核磁共振谱用Varian Associates EM-390 90MHz或T-60 60MHz仪器，或JeolFX-90Q90MHz，或Bruker Crop.270MHz仪器，或General Electric QE0300 300MHz仪器测得。化学位移用δ值表示(以四甲基硅烷为标准向低磁场移动的百万分之几)。场解吸质谱用有碳枝晶射频振荡器的Varian-MAT731仪器测得。电子冲击质谱用Consolidated Electrodynamics公司的CEC21-110仪器测得。红外光谱用Perkin-Elmer281仪器测得。紫外用Cary118仪器测定。比旋度用Perkin-ElmerQ-41仪器测得。薄层色谱用E.Merck硅胶板进行。熔点未校正。
实施例1A.2-氨基-4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在100ml圆底烧瓶中，将2.0g(13.3mmol)2-氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-酮悬浮于20ml三氯氧磷中，加热回流2小时，45分钟后形成黄色溶液。冷却到室温，真空去除溶剂，残留物在冰浴中用30ml冰水处理，滤去不溶物。滤液加浓氨水调pH到2。滤出沉淀，用水及20ml乙醚洗涤，真空干燥，得1.1g(49%)2-氨基-4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，浅黄色固体。
Rf＝0.15(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝225-226℃(dec)质谱(FD)＝169IR(KBr，cm-1)＝700，741，812，887，920，1203，1272，1310，1385，1407，1428，1485，1512，1564，1616，1637，2822，2927，2965，3111，3190，3309，3414，3450UV(EtOH)1max＝317，255，232，201(e＝6032，4002，26867，11240)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d 622(d，J＝3.3Hz，1H)6.46(s，2H)，7.06(d，J＝2.7Hz，1H)，11.43(s，1H)B.2-三甲乙酰氨基-4-氯-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在100ml圆底烧瓶中将4.0g(23.8mmol)2-氨基-4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶溶于50ml无水吡啶中。加10.2ml(83mmol)三甲基乙酰氯，几分钟后开始形成沉淀，在氮气下室温搅拌30分钟。真空去除挥发物。残渣溶于1L氯仿中，用0.1N HCl洗涤两次，Na2SO4干燥，真空去除溶剂。残余物在硅胶上闪层析，用100%CHCl3至2%MeOH/CHCl3梯度洗脱，收集所需部分，真空去除溶剂，得4.4g(73%)2-三甲乙酰氨基-4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，略带黄色的白色固体。
Rf＝0.67(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝217-220℃(dec)质谱(FD)＝378IR(KBr，cm-1)＝1371，1390，1421，1459，1493，1510，1573，1615，1694，2871，2963，3127，3163，3422UV(EtOH)1max＝278，241，201(e＝6553，24711，元素分析C11H13N4OClC，52.28;H，5.18;N，2217.测定值C，52.55;H，5.18;N，22.09.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.20(s，9H)，6.50(d，J＝3.3Hz，1H)，7.51(d，J＝3.2Hz，1H)，10.02(s，1H)，12.31(s，1H)C.2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在盖在铝箔的100ml圆底烧瓶中，溶1.5%(5.94mmol)2-三甲乙酰氨基-4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶于30ml无水THF中，加1.47g(6.5mmol)N-碘琥珀酰亚胺。此深棕色溶液在氮气下室温搅拌1小时。真空去除溶剂，残余物溶入氯仿，用水洗涤，Na2SO4干燥，真空去除溶剂，残余物用硅胶闪层析，用100%CHCl3至2%MeOH/CHCl3梯度洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得1.86g(83%)2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，黄褐色固体。
Rf＝0.47(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝242-244℃(dec)质谱(FD)＝378IR(KBr，cm-1)＝759，780，803，916，936，965，1021，1161，1178，1227，1259，1287，1315，1368，1414，1453，1500，1565，1603，1708，2871，2967，3213，3425UV(EtOH)1max＝306，251，202(e＝4566，28829，16837)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.20(s，9H)，7.74(s，1H)，10.09(s，1H)，12.67(s，1H)D.N-[2-三甲乙酰氨基-4-氯-[(吡咯并(2，3-d)嘧啶-5-基]乙炔基]-苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
在有铝箔盖的100圆底烧瓶中，加入1.5g(3.96mmol)2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶、1.88g(4.16mmol)N-对-乙炔基苯甲酰基-L-谷氨酸二乙酯、0.16g(0.83mmol)碘化铜(Ⅰ)及溶于30ml无水DMF中的四(三苯膦)钯(o)，再加1.16ml(8.3mmol)三乙胺。在氮气下室温搅拌此深棕色溶液4小时。真空去除挥发物，残余物用硅胶闪层析，用100%CHCl3至1%MeOH/CHCl3梯度洗脱，收集所需部分，真空去除溶剂，将固体在40ml2∶1己烷/乙醚中研磨，得1.35g化合物1，黄褐色固体。
Rf＝0.22(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝212-214℃(dec)质谱(FD)＝582IR(KBr，cm-1)＝785，851，926，1020，1099，1162，1300，1426，1497，1568，1612，1639，1737，2219，2978，3214UV(EtOH)1max＝315，257，203(e＝19105，20190，24301)元素分析C29H32N5O6ClC，59.84;H，5.54;N，12.03.测定值C，59.54;H，5.52;N，11.83.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.00-1.19(m，6H)，1.21(s，9H)，1.97-2.13(m，2H)，2.40-2.47(m，2H)，4.43(m，1H)，7.60(d，J＝8.2Hz，2H)，7.90(d，J＝8.2Hz，2H)，8.80(d，7.3Hz，1H)，10.14(s，1H)，12.80(s，1H)
E.N-[2-三甲乙酰氨基-4-氯-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
在50ml圆底烧瓶中，溶解化合物1 0.050g(0.086mmol)于1ml无水乙醇和1ml二氯甲烷中，再加0.04g10%Pd/C催化剂。加上氢气球，搅拌4小时。滤去催化剂，充分洗涤催化剂，滤液真空去除溶剂，残余物用硅胶闪层析，用2%MeOH/CHCl3洗脱，收集所需部分，真空去除溶剂，得0.45g(95%)化合物2，黄色固体。
Rf＝0.47(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝86-88℃质谱(FAB)＝586IR(KBr，cm-1)＝759，922，1020，1098，1165，1374，1427，1469，1502，1540，1569，1613，1648，1737，2977，3244UV(EtOH)1max＝248，203(e＝40126，36298)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.11-1.19(m，6H)，1.20(s，9H)，1.95-2.09(m，2H)，2.41(t，J＝7.4Hz，2H)，2.97-3.15(m，4H)，3.98-4.11(m，4H)，4.38(m，1H)，7.23(s，1H)，7.32(d，J＝8.1Hz，2H)，7.78(d，J＝8.0Hz，2H)，8.63(d，J＝8.0Hz，1H)，9.98(s，1H)，12.02(s，1H)。
F.N-[2-氨基-4-氯-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基-L-谷氨酸的制备
在15ml圆底烧瓶中，将0.015g(0.026mmol)化合物1混悬于1ml2N NaOH中。室温搅拌七天，再在50℃搅拌4小时。所得浅黄色溶液用5N HCl酸化，置冰浴中冷却，滤出白色沉淀，用15ml水洗涤，70℃真空干燥，得0.005g(49%)化合物2，黄褐色固体。
Rf＝0.05(50%MeOH/CHCl3)m.p.＝＞300℃(dec)质谱(FAB)＝446IR(KBr，cm-1)＝599，928，1020，1225，1435，1501，1555，1617，1714，3337UV(EtOH)1max＝322，239，202(e＝4085，38829，34937)1H NMR(300MHz，DMSOd6)d1.87-2.09(m，2H)，2.32(t，J＝7.3Hz，2H)，2.95(s，4H)，4.36(m，1H)，6.42(s，2H)，6.78(s，1H)，7.30(d，J＝7.7Hz，2H)，7.81(d，J＝7.6Hz，2H)，8.49(d，J＝7.2Hz，1H)，11.13(s，1H)，12.40(br s，2H).
实施例2A.N-[2-三甲乙酰氨基-4-巯基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
在15ml圆底烧瓶中，溶解0.22g(0.37mmol)化合物1于4ml2-甲氧乙醇中，加0.20g(2.6mmol)硫脲。在氮气下100℃加热20分钟。冷到室温后真空去除溶剂，残余物溶于100ml氯仿中，用水洗涤，分出有机层，Na2SO4干燥，真空去除溶剂，在硅胶上闪层析，用2%MeOH/CHCl3洗脱，收集所需部分，真空去除溶剂，得0.11g(50%)化合物2，黄色固体。
Rf＝0.39(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝185-187℃(dec)质谱(FD)＝583IR(KBr，cm-1)＝766，842，935，1023，1163，1360，1439，1564，1640，1735，2975，3195UV(EtOH)1max＝339，279，238，202(e＝16995，10601，34456，43227)元素分析C29H37N5O6SC，59.67;H，6.39;N，12.00.测定值C，59.44;H，6.33;N，11.91.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.11-1.24(m，15H)，1.90-2.10(m，2H)，2.41(t，J＝7.4Hz，2H)，2.98-3.03(m，2H)，3.14-3.22(m，2H)，3.99-4.11(m，4H)，4.38-4.40(m，1H)，6.88(s，1H)，7.33(d，J＝8.1Hz，2H)，7.77(d，J＝8.1Hz，2H)，8.62(d，J＝7.4Hz，1H)，11.05(s，1H)，11.62(s，1H)，13.14(s，1H).
B.N-[2-氨基-4-巯基[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸的制备
在15ml园底烧瓶中溶解化合物1 0.083g(0.14mmol)于6ml0.5N NaOH中，盖上铝箔，室温搅拌5.5天，所得桔色溶液用1N HCl酸化，在冰浴中冷却，滤出沉淀，用水洗涤，60℃真空干燥，得0.037g(59%)化合物2，黄褐色固体。
Rf＝0.04(50% MeOH/CHCl3)m.p.＝240-242℃(dec)质谱(FAB)＝444IR(KBr，cm-1)＝767，817，968，1020，1098，1191，1343，1402，1446，1502，1568，1637，1710，2929，3333UV(EtOH)1max＝347，238，203(e＝9999，30880，40868)元素分析C20H21N5O5SC，54.17;H，4.77;N，15.79.测定值C，53.90;H，4.73;N，15.52.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d2.22-2.35(m，4H)，2.94-3.20(m，4H)，4.29-4.31(m，1H)，6.39(s，2H)，6.52(s，1H)，7.30(d，J＝7.9Hz，2H)，7.73(d，J＝7.9Hz，2H)，8.48(d，J＝7.5Hz，1H)，10.95(s，1H)实施例3A.N-[2-三甲乙酰氨基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸的制备
在-Parr氢化瓶中溶解0.01g(0.17mmol)化合物1于8ml无水乙醇和2ml二氯甲烷中，再加0.05ml(1.3mmol)浓氨水。加0.20g10%Pd/C催化剂，在50psi氢气压力下氢化20小时。滤去催化剂，充分洗涤，真空去涂溶剂，残余物在硅胶上闪层析，用100%CHCl3到2%MeOH/CHCl3梯度洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.055g(59%)化合物2，浅黄色固体。
Rf＝0.33(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝148-149℃质谱(FD)＝551IR(KBr，cm-1)＝766，850，923，1021，1097，1165，1433，1477，1500，1545，1582，1613，1636，1701，1742，2978，3225，3363，3441UV(EtOH)1max＝246，203(e＝38574，36571)元素分析C29H37N5O6C，63.14;H，6.76;N，12.69.测定值C，63.02;H，6.75;N，12.39.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.11-1.20(m，15H)，1.90-2.10(m，2H)，2.41(t，J＝7.4Hz，2H)，3.01(s，4H)，3.99-4.12(m，4H)，4.38-4.41(m，1H)，7.14(s，1H)，7.32(d，J＝8.0Hz，2H)，7.76(d，J＝7.9Hz，2H)，8.60(d，J＝7.3Hz，1H)，9.69(s，1H)，11.57(s，1H)。
B.N-[2-氨基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基-L-谷氨酸的制备
在15ml圆底烧瓶中混悬0.045g(0.082mmol)化合物1于2ml1N NaOH中。室温搅拌7天，所得黄色溶液用1N HCl酸化，在冰浴中冷却，滤出沉淀，用水洗涤，70℃真空干燥，得0.019g(57%)化合物2，浅黄色固体。
Rf＝0.05(50%MeOH/CHCl3)m.p.＝260-264℃(dec)质谱(FAB)＝412IR(KBr，cm-1)＝845，963，1020，1093，1209，1291，1333，1404，1451，1500，1538，1558，1614，1655，2813，2857，2947，3138，3353UV(EtOH)1max＝318，237，203(e＝2239，24103，25087)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.87-2.09(m，2H)，2.30-2.34(m，2H)，2.90-3.01(m，4H)，4.32-4.39(m，1H)，6.01(s，2H)，6.70(s，1H)，7.30(d，J＝8.1Hz，2H)，7.76(d，J＝8.1Hz，2H)，8.41(s，1H)，8.50(d，J＝7.6Hz，1H)，10.76(s，1H)，12.40(br s，1H)。
实施例4A.N-[2-三甲乙酰氨基[[二氢吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
在Parr氢化瓶中，溶解0.068g(0.17mmol)化合物1于6ml无水乙醇和1ml二氯甲烷中，再加0.2g 10%Pd/C催化剂。在50psi压力下氢化18小时。过滤并充分洗涤催化剂，滤液在真空中去除溶剂，残余物在硅胶上闪层析，用2%MeOH/CHCl3洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.022g(34%)化合物2，白色固体。
Rf＝0.23(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝90-92℃质谱(FD)＝554IR(KBr，cm-1)＝853，925，1022，1181，1398，1504，1591，1623，1735，2978，3308UV(EtOH)1max＝296，222，203(e＝7464，31504，35543)元素分析C29H39N5O6C，62.91;H，7.10;N，12.65.测定值C，62.61;H，7.40;N，12.53.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.04-1.20(m，15H)，1.75-1.85(m，1H)，1.93-2.09(m，4H)，2.41(t，J＝7.4Hz，2H)，2.69(t，J＝7.6Hz，3H)，3.65-3.69(m，1H)，4.00-4.11(m，4H)，4.39-4.42(m，1H)，7.34(d，J＝8.0Hz，2H)，7.40(s，1H)，7.78(d，J＝8.4Hz，2H)，7.81(s，1H)，8.62(d，J＝7.4Hz，1H)，9.29(br s，1H)。
B.N-[2-氨基-[[二氢吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸的制备
在15ml圆底烧瓶中，混悬0.075g(0.13mmol)化合物1于3ml1N NaOH中，盖上铝箔，室温搅拌7.5天。所得黄色溶液用5N HCl酸化，冰浴冷却，滤出黄色沉淀，用水洗涤，70℃真空干燥。滤液在真空中去除挥发物，残余物用C-18反相色谱纯化，用10%MeCN/89.5%H2O/0.5%AcOH洗脱。收集所需部分，在真空中浓缩至近干，冰冻干燥。所得沉淀和冰冻所得固体合并，共得0.027g(48%)化合物2，浅黄色固体。
Rf＝0.07(50%MeOH/CHCl3)m.p.＝＞300℃(dec)质谱(FAB)＝414IR(KBr，cm-1)＝660，1180，1295，1380，1500，1608，1630，1640，2920，3340UV(EtOH)1max＝238，203(e＝8086，15837)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.89-1.99(m，1H)，2.10-2.20(m，4H)，2.26(t，J＝6.8Hz，3H)，2.61-2.66(m，2H)，4.30-4.40(m，1H)，5.76(br s，2H)，6.77(s，1H)，7.29(d，J＝7.9Hz，2H)，7.51(br s，1H)，7.72(d，J＝7.7Hz，2H)，8.10(br s，1H)。
实施例5
A.2-氨基-4-甲氧基-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在250ml圆底烧瓶中，溶解0.92g(40mmol)金属钠于80ml无水乙醇中，搅拌，在氮气下加入20g(11.9mmol)2-氨基-4-氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶。所得黄色溶液加热回流24小时，冷到室温后用冰醋酸中和到pH6.0，真空去除挥发物。残余物用50ml水处理，滤去少量不溶物。滤液用100ml氯仿提取三次，合并有机层，Na2SO4干燥，真空去除溶剂，残余物在硅胶上闪层析，用5%MeOH/CHCl3洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得1.36g(70%)2-氨基-4-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，米色固体。
Rf＝0.17(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝202-204℃(dec)质谱(FD)＝164IR(KBr，cm-1)＝711，740，793，823，902，1056，1093，1165，1194，1228，1321，1334，1390，1406，1440，1473，1490，1579，1610，1632，2828，3110，3370，3484UV(EtOH)λmax＝287，257，223(ε＝7287，7375，24330)元素分析C7H8N4OC，51.22;H，4.91;N，34.13.测定值C，51.02;H，4.95;N，34.23.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)δ3.88(s，3H)，5.96(s，2H)，6.15(d，J＝2.3Hz，1H)，6.78(d，J＝2.9Hz，1H)，10.99(s，1H)。
B.2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在50ml圆底烧瓶中，溶解0.90g(5.48mmol)2-氨基-4-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶于12ml无水吡啶中，加2.4ml(19.2mmol)三甲乙酰氯。在氮气下加热回流1.5小时。真空去除挥发物。残渣溶于9ml甲醇中，冰浴冷却。搅拌，加9ml10%氢氧化铵，滤出生成的沉淀，用水及10%氢氧化铵洗涤，干燥，得11.09g(80%)2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，白色固体。
Rf＝0.26(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝235-236℃质谱(FD)＝248IR(KBr，cm-1)＝709，720，738，789，844，881，901，934，969，1017，1049，1058，1100，1167，1209，1309，1358，1395，1460，1516，1588，1618，1693，2958，3130，3185，3430UV(EtOH)1max＝278，231，202(e＝12328，19978，18292)元素分析C12H16N4O2C，58.05;H，6.50;N，22.57.测定值C，57.75;H，6.48;N，22.62.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.20(s，9H)，6.38(d，J＝3.2Hz，1H)，7.20(d，J＝3.1Hz，1H)，9.49(s，1H)，11.77(s，1H)。
C.2-三甲乙酰氨基-4-甲氧-5-碘-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在有铝箔盖的15ml园底烧瓶中，溶解0.266g(1.07mmol)2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶于6ml无水THF中，加入0.260gN-碘琥珀酰亚胺，在氮气下搅拌1.5小时。真空去除溶剂，残渣溶于100ml氯仿中。用水洗涤，分出有机层，Na2SO4干燥。经硅胶闪层析，用100%CHCl3到1%MeOH/CHCl3梯度洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.33g(82%)2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，米色固体。
Rf＝0.50(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝243-244℃(dec)质谱(FD)＝374IR(KBr，cm-1)＝652，723，785，806，843，965，1010，1096，1175，1212，1253，1279，1328，1390，1426，1461，1532，1579，1620，1705，2955，3200，3435UV(EtOH)1max＝283，242，202(e＝10018，30658，19457)1H NMR(300，DMSOd6)d1.20(s，9H)，4.01(s，3H)，7.40(d，J＝2.0Hz，1H)，9.55(s，1H)，12.11(s，1H)D.N-[2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙炔基]苯甲酰基]谷氨酸二乙酯的制备
在有铝箔盖的25ml圆底烧瓶中，加0.20g(0.53mmol)2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-5-碘-7H-吡啶并[2，3-d]嘧啶、0.19g(0.58mmol)N-对-乙炔基苯甲酰基-L-谷氨酸二乙酯、0.024g(0.13mmol)碘化铜(I)、及混悬于5ml无水DMF中的0.074g(0.06mmol)四(三苯膦)-钯(o)，再加0.18ml(1.28mmol)三乙胺。所得暗棕色混合物在氮气下于50℃搅拌0.5小时。真空去除挥发物，残余物在硅胶上闪层析，用100%CHCl3到1%MeOH/CHCl3梯度洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.085g(28%)化合物1，黄褐色固体。
Rf＝0.48(2%MeOH/CHCl3)m.p.＝215-216℃(dec)质谱(FD)＝577IR(KBr，cm-1)＝792，852，1097，1165，1346，1430，1527，1607，1737，2216，2978，3210UV(EtOH)1max＝321，263，254，201(e＝22757，22713，23239，39466)1H NMR(300MHz，DMSOd6)d1.06-1.21(m，15H)，1.97-2.11(m，2H)，2.41-2.51(m，2H)，3.99-4.13(m，7H)，4.38-4.45(m，1H)，7.56(d，J＝8.2Hz，2H)，7.61(s，1H)，7.90(d，J＝8.1Hz，2H)，8.79(d，J＝7.3Hz，1H)，9.61(s，1H)，12.28(s，1H)。
E.N-[2-三甲乙酰氨基-4-甲氧基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]谷氨酸二乙酯的制备
在50ml圆底烧瓶中，溶解0.075g(0.13mmol)化合物1于8ml无水乙醇和2ml二氯甲烷中，再加0.05gPd/C催化剂，充氢气下搅拌6小时。滤去催化剂，充分洗涤，滤液在真空中去除溶剂，残余物在硅胶上闪层析，用3%MeOH/CHCl3洗脱，收集所需部分，真空去除溶剂，得0.062g(82%)化合物2，黄色固体。
Rf＝0.35(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝71-74℃(dec)质谱(FAB)＝582IR(KBr，cm-1)＝793，844，970，1020，1095，1168，1338，1587，1615，1648，1737，2979，3259UV(EtOH)1max＝277，238，202(e＝13505，35834，45830)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.06-1.20(m，15H)，1.95-2.09(m，2H)，2.41-2.51(m，4H)，2.95(s，2H)，3.98-4.11(m，7H)，4.36-4.40(m，1H)，6.89(s，1H)，7.28(d，J＝8.1Hz，2H)，7.76(d，J＝8.0Hz，2H)，8.62(d，J＝7.4Hz，1H)，9.47(s，1H)，11.43(s，1H)。
F.N-[2-氨基-4-甲氧基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]谷氨酸的制备
在15ml圆底烧瓶中，混悬0.07g(0.12mmol)化合物1于4ml0.5N NaOH中，室温搅拌7天。所得浅黄色溶液用1N HCl酸化，冰浴中冷却，滤出黄褐色沉淀，用水洗涤，70℃真空干燥，得0.044g(83%)化合物2，黄褐色固体。
Rf＝0.08(50%MeOH/CHCl3)m.p.＝230℃(dec)质谱(FAB)＝442IR(KBr，cm-1)＝777，958，1020，1090，1153，1197，1250，1394，1441，1483，1538，1614，1660，2941，3336UV(EtOH)1max＝230，203(e＝35345，34328)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.90-2.07(m，2H)，2.32(t，J＝7.3Hz，2H)，2.84-2.95(m，4H)，3.96(s，3H)，4.33-4.40(m，1H)，6.56(s，1H)，7.26(d，J＝8.0Hz，2H)，7.78(d，J＝8.1Hz，2H)，8.50(d，J＝7.6Hz，1H)，11.04(s，1H)，12.40(br s，2H)。
实施例6A.2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-(三甲基甲硅烷基)乙炔基-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在盖有铝箔的100ml圆底烧瓶中，加入1.0g(2.6mmol)2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶、0.2g(1.04mmol)碘化铜(I)、1.8ml(13mmol)(三甲基甲硅烷基)乙炔及溶于15ml无水DMF中的0.30g(0.26mmol)四(三苯膦)钯(o)，再加0.72ml(5.1mmol)三乙胺。所得暗棕色溶液在氮气下室温搅拌18小时。真空去除挥发物，残余物溶于1L氯仿中，用水洗涤，分出有机层，Na2SO4干燥，真空去除溶剂。此粗制品在硅胶上闪层析，用100%CHCl3到1%MeOH/CHCl3梯度洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.49g(54%)2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-(三甲基甲硅烷基)乙炔基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，黄褐色固体。
Rf＝0.45(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝＞300℃质谱(FD)＝348IR(KBr，cm-1)＝626，758，785，860，926，1021，1166，1232，1260，1291，1432，1456，1498，1568，1610，1698，2161，2961，3154，3424UV(EtOH)1max＝261，256，201(e＝29006，29104，20753)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d0.21(s，9H)，1.20(s，9H)，7.89(s，1H)，10.12(s，1H)，12.67(s，1H)。
B.2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-5-(三甲基甲硅烷基)乙炔基-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在100ml圆底烧瓶中，于氮气下，混悬0.49g(1.4mmol)2-三甲乙酰氨基-4-氯-5-(三甲基甲硅烷基)乙炔基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶于15ml无水2-甲氧乙醇中，再加0.87ml(8.4mmol)二乙胺，100℃加热1小时，真空去除挥发物，残余物经闪层析，用3%MeOH/CHCl3洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂得0.43g(80%)2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-5-(三甲基甲硅烷基)乙炔基-7H-吡咯并(2，3-d]嘧啶，黄褐色固体。
Rf＝0.43(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝191-194℃(dec)质谱(FD)＝385IR(KBr，cm-1)＝695，711，759，786，838，862，1040，1064，1095，1176，1209，1250，1304，1357，1427，1532，1573，1690，2144，2962，3108，3428UV(EtOH)1max＝367，296，237，207，203(e＝966，18048，28781，22099，21727)1H NMR(300，DMSOd6)d0.19(s，9H)，1.13-1.18(m，15H)，3.86(q，J＝6.8Hz，4H)，7.52(s，1H)，9.08(s，1H)，11.88(s，1H)。
C.2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-5-乙炔基-吡咯并[2，3-d]嘧啶的制备
在15ml圆底烧瓶中，加入0.10g(0.26mmol)2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-5-(三甲基甲硅烷基)乙炔基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶、及溶于2ml无水THF的0.39ml(0.39mmol)氟化四丁铵。氮气下室温搅拌30分钟。立刻倒入50ml氯仿中，用水洗涤，分出有机层，Na2SO4干燥，真空去除溶剂。残余物闪层析，用2%MeOH/CHCl3洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.079g(97%)2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-5-乙炔基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，黄褐色固体。
Rf＝0.32(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝71-74℃(dec)质谱(FAB)＝314IR(KBr，cm-1)＝721，789，806，834，946，1033，1091，1162，1206，1279，1300，1358，1370，1428，1536，1571，1707，2102，2969，3195，3454UV(EtOH)1max＝295，237，206(e＝15267，26168，20274)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.11-1.22(m，15H)，3.80(q，J＝6.8Hz，4H)，4.01(s，1H)，7.47(s，1H)，9.02(s，1H)，11.81(s，1H)。
D.N-[2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙炔基]苯甲酰基]谷氨酸二乙酯的制备
在有铝箔盖的25ml圆底烧瓶中，加入0.21g(0.67mmol)2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-5-乙炔基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶、0.32g(0.74mmol)对-碘-N-苯甲酰基-L-谷氨酸二乙酯、0.51g(0.83mmol)碘化铜(I)、及溶于4ml无水DMF中的四(三苯膦)钯(o)。所得暗棕色溶液在氮气下室温搅拌1.5小时，真空除去挥发物，残渣在硅胶上闪层析，用100%CHCl3到2%MeOH/CHCl3梯度洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，固体在15ml乙醚中研磨，得0.18g(45%)化合物1，米色固体。
Rf＝0.32(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝171-174℃(dec)质谱(FAB)＝619IR(KBr，cm-1)＝1092，1174，1213，1261，1303，1392，1426，1494，1534，1571，1604，1650，1669，1738，2202，2933，2977UV(EtOH)1max＝340，291，272，245，202(e＝18314，21270，247273，34009，38018)1H NMR(300MHz，DMSOd6)d1.12-1.21(m，21H)，1.96-2.10(m，2H)，2.40-2.43(m，2H)，3.90(q，J＝6.4Hz，4H)，3.96-4.12(m，4H)，4.40-4.45(m，1H)，7.54(d，J＝8.0Hz，2H)，7.66(s，1H)，7.78(d，J＝8.1Hz，2H)，8.78(d，J＝7.3Hz，1H)，9.12(s，1H)，12.01(s，1H)。
E.N-[2-三甲乙酰氨基-4-二乙氨基-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
在Parr氢化瓶中，加入溶于10ml无水乙醇和2ml二氯甲烷中的0.17g(0.27mmol)化合物1，再加0.25g10%Pd/C催化剂，于50psi压力下氢化18小时。滤去催化剂，充分洗涤，滤液在真空中去除溶剂。残余物在硅胶上闪层析，用2%MeOH/CHCl3洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.13g(76%)化合物2，米色固体。
Rf＝0.25(5%MeOH/CHCl3)m.p.＝68-71℃质谱(FAB)＝623IR(KBr，cm-1)＝763，792，1020，1083，1167，1191，1260，1299，1377，1421，1468，1506，1537，1574，1612，1648，1704，1737，2872，2935，2975，3292，3455UV(EtOH)1max＝296，243，203(e＝11472，43662，43729)元素分析C33H46N6O6C，63.65;H，7.44;N，13.49.测定值C，63.45;H，7.52;N，13.46.
1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d1.07-1.19(m，21H)，1.90-2.10(m，2H)，2.40(t，J＝7.5Hz，2H)，3.30(s，4H)，3.52(q，J＝6.8Hz，4H)，3.98-4.11(m，4H)，6.91(s，1H)，7.26(d，J＝8.2Hz，2H)，7.74(d，J＝8.1Hz，2H)，8.60(d，J＝7.4Hz，1H)，9.15(s，1H)，11.26(s，1H)。
F.N-[2-氨基-4-二乙氨基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]谷氨酸的制备
在15ml圆底烧瓶中，混悬0.065g(0.10mmol)化合物1于3ml1N NaOH中，室温搅拌7.5天。所得黄色溶液用1N HCl酸化，冰浴中冷却，滤出沉淀，用水洗涤，70℃真空干燥，得0.021g(42%)化合物2，浅黄色固体。
Rf＝0.09(50%MeOH/CHCl3)m.p.＝160-163℃(dec)质谱(FAB)＝483IR(KBr，cm-1)＝724，766，851，930，990，1020，1079，1098，1206，1298，1354，1401，1436，1503，1533，1567，1612，1656，2873，2935，2975，3209，3331UV(EtOH)1max＝306，235，202(e＝5778，25046，26120)1H NMR(300 MHz，DMSOd6)d0.94-1.12(m，6H)，1.90-2.07(m，2H)，2.30-2.34(m，2H)，3.16-3.49(m，8H)，4.35-4.36(m，1H)，5.59(s，2H)，6.56(s，1H)，7.24(d，J＝7.8Hz，2H)，7.76(d，J＝7.8Hz，2H)，8.48(d，J＝7.6Hz，1H)，10.58(s，1H)，12.15(br s，1H)。
实施例7A.2-三甲乙酰氨基-4-乙硫基-6-乙炔基-吡啶并[2，3-d]嘧啶的制备
将1.0g2-三甲乙酰氨基-4-氧代-6-乙炔基-吡啶并[2，3-d]嘧啶在氮气下100℃与10ml三氯氧磷及1mlN，N-二乙基苯胺反应20分钟。真空除去挥发物，残渣溶于25ml二氯甲烷中，与1ml乙硫醇反应45分钟，真空去除挥发物。残余物溶于二氯甲烷中，用水洗涤两次，分出有机层，Na2SO4干燥，真空去除溶剂。残余物在硅胶上闪层析，用25%EtoAl/MeCl2洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，两步得0.262g(22%)黄色固体。
mp120-123℃UV(EtOH)-362，282，244，205质谱(FAB)＝314Rf＝0.48(11Etoac/MeCl2)1H NMR(300 MHz，CDCl3)d1.38(2，9H)，1.51(t，J＝7.4Hz，3H)，3.54(9，J＝7.4Hz，2H)8.28(s，1HO，8.44(d，J＝2.2Hz，1H)，9.09(d，J＝2.2H2，1H)IR(KBr，cm-1)＝666，763，812，847，893，923，978，1020，1137，1198，1224，1346，1376，1407，1551，1707，1743，2967，3236。
B.N-[2-三甲乙酰氨基-4-乙硫基[[吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基]乙炔基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
将0.009gPdCl2、0.028g三苯膦及3ml乙腈反应30分钟，然后加入0.30g化合物1、0.45g化合物2、0.005gCuI、7ml乙腈及0.31ml三乙胺，80℃加热20分钟。产物溶于过量的二氯甲烷中，用水洗涤，有机层用Na2SO4干燥，真空去除溶剂。残余物在硅胶上闪层析，用25%EtOAc/MeCl2洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.21g(36%)黄色固体。
Rf＝0.42(11EtOAc/MeCl2)UV(EtOH)＝373，326，306，252质谱(FAB)＝619mp＝97-100℃1H NMR(300，CDCl3)d1.26(t，J＝7.1Hz，3H)，1.34(t，J＝7.1Hz，3H)，1.50(s，9H)，1.57(t，J＝6.9Hz，3H)，2.16-2.20(m，1H)，2.23-2.36(M，1H)，2.48-2.59(m，2H)，3.70-3.77(m，2H)，4.14(9，J＝7.2Hz，2H)，4.28(9，J-8.2Hz，2H)，7.90(d，J＝8.2Hz，2HO，8.53(s，1H)，9.16(S，1H)
IR(KBr，Cm-1)＝662，769，792，856，905，979，1020，1132，1202，1261，1304，1332，1372，1400，1496，1552，1597，1660，1735，2976，3378。
C.N-[2-三甲乙酰氨基-[四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二乙酯的制备
溶解0.10g化合物1于3ml二氯乙烷中，用15ml乙醇稀释，所得溶液在60psi压力下用阮尼镍氢化，室温下反应2小时后于60℃三小时。真空去除溶剂。残余物闪层析，用5%MeOH/CHCl3洗脱。收集所需部分，真空去除溶剂，得0.025g(27%)黄色固体。
Rf＝0.27 15%MeOH/CHCl3)UV(EtOH)＝298，225，202质谱(FAB)＝619mp＝168-170℃1H NMR(300，CDCl3)d1.21(t，J＝3.4Hz，3H)，1.24-1.39(m，12H)，1.69-1.75(m，2H)，1.80-2.14(m，1H)，2.16-2.19(m，1H，2.30-2.50(m，4H)，2.74-2.82(m，2H)，3.10-3.25(m1H)，3.46-3.51(m，2H)，4.15(9，J＝6.9Hz，2H)，4.26(9，J＝7.0Hz，2HO，4.75-4.85(m，1HO，5.40(s，1H)，7.00(d，J＝7.1Hz，1HO，7.3old，J＝10.0H2，2HO，7.75(s，1HO，7.80(d，J+10.2Hz)IRCKBr，CM-1)＝542，613，785，857，927，1022，1097，1155，1207，1260，1300，1373，1421，1503，1542，1574，1613，1658，1736，2931，3338。
D.N-[2-氨基-[甲氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸的制备
将溶于1ml甲醇中的0.039g化合物1与1.5ml 1 N NaOH反应，搅拌3.5天。用5N HCl酸化到pH6。滤出生成的黄色沉淀，用水洗涤，60℃真空干燥。
Rf＝0.05(50%MeOH/CHCl3)mp＝250-253℃质谱(FAB)＝428UV(EtOH)＝230，2021H NMR(300，DMsOd6)d1.57(t，J＝7.3，3H)，1.62-1.67(m，2H)，1.92-2.01(m，2H)，2.18-2.21(m，2H)，2.30(t，J＝7.0 Hz，2H)2.48-2.71(m，2H)，2.90-3.10(m，2H)，4.31-4.34(m，1H)6.31(s，2H)，7.29(d，J＝8.0Hz，2H)，7.36(d，J＝1.2Hz，1H)，7.41(d，J＝2.5Hz，1H)，7.77(d，J＝8.0Hz，2H)，8.39(d，J＝7.2Hz，1H)IR(KBr，cm-1)＝583，768，1100，1379，1451，1502，1537，1585，1662，2929，3333。
权利要求
1.具下式的化合物及其药学上可接受的盐；
式中Ar是二氢吡咯并、吡咯并、吡啶并、或四氢吡啶并；R1是氢、氯、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷氨基、或二(C1-C4)烷氨基；及R2是C2-C3烷基。
2.按权利要求1的化合物其中Ar是二氢吡咯并、四氢吡啶并、或吡咯并;R1是氢或氯;和R2是乙基;及其药学上可接受的盐。
3.N-[2-氨基-[[二氢吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸及其药学上可接受的盐。
4.N-[2-氨基-[[吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸及其药学上可接受的盐。
5.N-[2-氨基-[[四氢吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸及其药学上可接受的盐。
6.一种药物制剂，它含有权利要求1至5中任一权项的化合物作为有效成份，并含有一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
7.制备权利要求1至5中任一权项的化合物的方法，该方法包括(a)水解下式的中间体
式中Ar是吡咯并或吡啶并，R1是氢、氯、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷氨基、或二(C1-C4)烷氨基，R2是C2-C3烷基，Y1是氨基保护基团，和Y2是相同或不相同的羰基保护基团;(b)将步骤(a)产物任选地催化氢化;和(c)将步骤(a)或步骤(b)的产物任意地转变成药学上可接受的盐。
8.按权利要求7的方法制备的具下式的化合物及其药学上可接受的盐
式中Ar是二氢吡咯并、吡咯并、吡啶并、或四氢吡啶并;R1是氢、氯、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷氨基、或二(C1-C4)烷氨基;和R2是C2-C3烷基。
9.具下式的化合物及其药学上可接受的盐
式中Y1是氢或氨基保护基团;Z是氢、溴、或碘。
10.具下式的化合物及其药学上可接受的盐
式中Ar是吡咯并或吡啶并;R2是C2-C3烷基;Y1是氨基保护基团;和Y2是相同或不相同的羧基保护基团。
全文摘要
本发明涉及N-[2-氨基-4-取代的-[[(吡咯并或吡啶并)[2，3-d]嘧啶基]烷基]苯甲酰基]-L-谷氨酸化合物、合成它们的中间体、含有这些化合物的药物制剂，及其作为抗肿瘤剂的应用。
文档编号C07D471/04GK1078235SQ9310320
公开日1993年11月10日 申请日期1993年3月23日 优先权日1992年3月24日
发明者L·S·戈塞特, 石全 申请人:伊莱利利公司
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