商标分类 
商标转让 
您当前的位置： 改进的制备头孢菌素的方法
2021-02-01 16:02:44|
300|
起点商标网 专利名称：改进的制备头孢菌素的方法
技术领域：
本发明涉及一种具有工业优越性的改进的酶催方法，用相应的7-氨基头孢菌素核与α-氨基酸缩合制备头孢菌素。
在美国专利3，816，253中叙述了一种通过氨基酸衍生物和7-氨基头孢菌素核反应制备头孢菌素的酶催方法。在该专利的大多数实施例中，是将产生酶的微生物本身加到反应混合物中作为酶源。还举例说明了一种粗制的无细胞制剂和一种已经过两步层析的制剂。该专利提到反应进行的温度范围为5℃-50℃，以20℃-40℃最为合适。但是，在除了一个以外的所有实施例中，反应都是在37℃进行的。在唯一的一个例外中，反应是在25℃进行的，报导的产率为63%。
当在以上专利所列举的温度下操作时，由于竟争性反应形成了污染的副产物(主要是氨基酸衍生物的水解产物)，会使所要产物的产率降低。这些副产物不总是容易与反应混合物分离开来。但是，不管副产物多么容易分离，它们的存在增高了生产成本。
过去在采用酶催方法时，每次合成反应都消耗掉大量的酶。因此，酶的成本是此方法成本的相当大的一部分。
由于进行酶催方法的现行成本，它不象常规的有机化学方法那样具有工业吸引力。但是，酶催方法有许多胜过有机化学方法的优点，如果降低了酶催方法的成本，这在工业上将会更加重要。例如，酶催反应方法只需要一步反应，而有机化学方法需要几步反应。另外，有机化学反应费时间，需要诸如吡啶之类的大量溶剂，而且产生不需要的副产物。
基于以上考虑，工艺上需要一种能达到与先前的酶催方法同样高或者更高产率的酶催方法。
现已发现，利用在合适的反应介质/溶剂中在+20℃至0℃的温度范围内于固定化青霉素酰基转移酶存在下进行缩合反应(如下所述)，可以将所要的头孢菌素抗生素产物的产率增加到高于先有技术所公开的水平。
本发明方法的另一方面涉及进行缩合反应时令pH值保持为下面定义的环境值。
本发明方法的又一方面涉及采用α-氨基酸与头孢菌素核的高摩尔比进行缩合。
本发明的方法可以用来制备式(Ⅰ)的头孢菌素
其中R是一个可任选取代的五元或六元烃环，或者R是一个含有1到4个杂原子(N、O或S)的五元杂环，该杂环可以任选地被取代;R1是氢、卤素、甲基、甲氧基或与一个有机基团键合的亚甲基，该亚甲基可以任选地通过桥氧、硫或氮原子与基团键合;R2是氢或一个羧基保护基。
这一方法包括使式(Ⅲ)的α-取代的α-氨基酸的反应活性衍生物(通过取代羧基部分的羟基形成衍生物)与式(Ⅱ)的7-氨基头孢菌素底物化合物反应
式中的R、R1和R2是先前所述的基团，反应在青霉素酰基转移酶存在下进行，该酶最好是固定化的，反应的条件可独立地选择成在0℃至+20℃的温度范围内，最好是从0℃至5℃;或者在环境pH下;或者在α-氨基酸与头孢菌素底物高摩尔比条件下进行。
现有技术中头孢菌素的酶催生产的特点是生成污染性副产物和在生产过程中酶的损失。在本发明的第一个实施方案中，由于采用在固定化酶存在和从约0℃到约20℃的温度下式(Ⅲ)的α-取代α-氨基酸与式(Ⅱ)的7-氨基头孢菌素底物之间进行缩合反应，减少了在制造这些抗生素化合物期间生成的污染物的数量。
在低温下，酶的活性一般降低，经常是显著降低。为解决这一问题，本发明通常使用较大数量的酶。利用这一方法，在很低的温度下、例如在0℃至5℃下，达到了良好的产物产率。
在实施这种生物催化的缩合的方法中，一段时间之后达到最大产物浓度，这段时间随酶的数量、底物、温度和本领域普通技术人员会知道的其它变量而变。此后，产物的浓度在与为达到最大产物浓度所需时间大致成正比的一段时间内保持恒定。例如，如果在约2小时内达到最大产物浓度，则平坦浓度区持续约1小时。随后产物浓度经常减小。在实施本发明时，最好是青霉素酰基转移酶的用量使稳定的产物浓度(或平坦浓度)持续约1小时，以便有足够的时间从反应器中取出产物。但是，在实施本发明时适用的平时时间在约10分钟到约120分钟之间，最好是在约30分钟到约80分钟之间。
在本发明的另一实施方案中，令pH值保持为环境值，或者换句话说，不用诸如缓冲溶液之类的方法保持pH值恒定。环境pH条件是指pH值在反应期间可以不受干扰地漂移或变化。通常，pH值设定在约7-7.5，在反应期间可以下降到pH6-7。虽然不想作理论探讨，但是据信在环境pH值下，与最终产物的形成速度相比，D-苯基甘氨酸甲酯和最终产物的水解被减弱了。
一般来说，在本发明的所有实施方案中，酶的用量为每克7-氨基头孢菌素底物(Ⅱ)用50-3000国际单位的酶。当然，本领域的普通技术人员会认识到，在本发明方法中酶的合适用量将随底物的本质和数量、反应的规模、采用的温度和所用装置的类型而变。
关于以上的化学式，R可以是五元或六元脂族或芳族烃环(例如，苯基、环己二烯基、环己烯基或环己基)，任选地用一个或几个基团取代，这些基团包括但不限于羟基、卤素、烷基、烷氧基、羧基、硝基、氨基等;它也可以是一个含一个或几个杂原子(最好不多于四个)的五元杂环，杂原子选自O、N和S或是它们的组合(例如噻吩基、呋喃基等)，该杂环可以被一个或多个基团取代(最好不多于3个)，这些基团包括但不限于羟基、卤素、烷基、烷氧基、羧基、硝基、氨基等。特别优选的是产物化合物(Ⅰ)和相应的式(Ⅲ)化合物，其中R是一个未取代的苯基、对羟基苯基或1，4-环己二烯-1-基。
当R是一个杂环基团时，预期可以方便地采用4-噻唑基、呋喃基和噻吩基等基团。
R1本身又可以是氢原子、卤原子(Br、Cl、I、F)、甲氧基、甲基或与有机基团相键合的亚甲基，这些有机基团的实例有C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧-羰基或是一个含有1到4个杂原子的五元或六元杂环，杂原子选自O、S和N或它们的组合，该亚甲基可任选地通过O、S或N等桥原子与有机基团键合，杂环基团也可以任选地带有一个或几个取代基，包括但不限于羟基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羰基、羧基、氰基、氨基、硝基等。特别优选的R1是甲基、甲氧基、氯和乙酰氧基亚甲基。对于R1，优选的杂环基团(亚甲基和杂环可以藉以与内酰胺环体系连接的杂原子除外)是1H-1，2，3-三唑-4-基，1H-四唑-5-基和2-噻唑基基团。
可以用于本发明的α-取代的α-氨基酸活性衍生物是在羧基部分上的衍生物，其中羧基部分的羟基已用一个有机基团取代，它可以水解，通过暴露在要在缩合中使用的青霉素酰基转移酶之中而再生成羧酸。虽然不想作理论探讨，但是相信此实验确定了那些能与酶反应形成活性的酰基-酶中间体、接着与式(Ⅱ)的7-氨基头孢菌素核反应和形成酰胺键的衍生物。
可用的式(Ⅲ)α-氨基酸的活性衍生物的实例是烷基酯(例如甲酯、乙酯)、芳基烷基酯(例如苄基酯)、酰胺和二肽(即，与第二个氨基酸形成的酰胺)。D-苯基甘氨酸、D-对羟基苯基甘氨酸和D-1，4-环己二烯-1-基-甘氨酸的甲酯是优选的实施例。羧基保护基(R2)的其它实例可以在以下文献中找到美国专利号4，892，942，E.Haslam，ProtectiveGroupsinOrganicChemistry，J.G.W.McOmie，Ed.，PlenumPress，N.Y.，N.Y.，1973，Chapter5，和T.W.Greene，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，JohnWiley&Sons，N.Y.，N.Y.，1981，Chapter5，这些文献在本文中引用作为参考。
在式(Ⅱ)化合物之中，以下的酸特别重要7-氨基-头孢菌烷酸、7-氨基-3-去乙酸基头孢菌烷酸和7-氨基-3-氯-头孢菌烷酸。
在本发明方法中使用的青霉素酰基转移酶可以由任何已知的微生物源衍生得到。其中包括黄单胞菌属、假单胞菌属、气单胞菌属、大肠埃希氏菌属、节孢子杆菌属、棒状杆菌属和杆菌属的微生物。
最好是使用由大肠埃希氏菌ATCC9637衍生的青霉素酰基转移酶。
本发明的方法最好在固定化酶的存在下进行。固定化可以通过许多众所周知的固定化技术中的任何一种来完成，例如吸收，与聚合物基质的离子键合或共价键合，交联，捕集在凝胶或纤维中，微包囊化或截留在膜反应器中的微过滤膜之后(即，膜分配)。最好是使用渗入到三乙酸纤维素纤维结构之中的酶或是与聚丙烯酰胺树脂共价键合的酶。
固定化的青霉素酰基转移酶，或是纤维捕集的或是与聚合物基质共价键合的，都可以从Recordati，S.P.A.，BiochemicalUnitDe.Bi.(CassinadePecchiItaly)购得。
式(Ⅱ)化合物用约0.5%至约2%(wt/v)的浓度、最好是用1.4%至1.5%的浓度进行反应。在本发明的另一项实施方案中，式(Ⅲ)的活性衍生物以相对于式(Ⅱ)化合物数量的高摩尔比(在大约3至5之间)进行反应。
反应可以在从约0℃至约+20℃的温度范围内进行，但是温度以从0℃至2℃为宜。
一种优选的溶剂系统是仅用水。但是，可以在水溶液体系中使用合适的有机溶剂，包括乙二醇、低级醇(例如，甲醇、乙醇、异丙醇、2-丁醇)、丙酮等。
根据本发明的方法的反应进程中，反应的程度和产物质量可以用高效液体色谱(HPLC)和其它已知方法监测。
在一种最优选的方法中，控制两个方便的变量，温度和比例，以达到最大产率，pH则保持环境值。
以下实施例更好地解释了本发明的特点和适用性，但是不限制本发明的范围。
为了说明本发明，使用7-氨基-3-氯-头孢菌烷酸(“7-ACCA”)作为头孢菌素底物。7-ACCA可以按R.R.Chauvette等在J.Med.Chem.18403(1975)中所述制备。D-苯基甘氨酸甲酯(“PGME”)和D-对羟基苯基甘氨酸甲酯(“HPGME”)可以用标准的酯化步骤，例如用甲醇在HCl存在下处理，从市售的氨基酸(例如Sigma公司产品)制得。此法和其它经典的氨基酸衍生法在C.A.Buehler和D.E.Pearson的“SurveyofOrganicSynthesis”(Wiley-Interscience，NewYork，1970)第1卷801-830页和第2卷(1977)711-726页中有说明。
实施例17-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐
(1)将7-ACCA(1)(0.9388克，4.0007毫摩尔)和96.0毫升H2O合并到烧杯中。该pH为4.12。向烧杯中加入3M的氨水(1.78毫升)。该pH为7.57。向烧杯中加入D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2)(4.7594克，23.602毫摩尔)。该pH为5.68。将混合物冷却到5℃，加入3M的氨水(1.90毫升)将pH提高到7.00。加入酶(6.1442克，940国际单位/克核)。通过高效液体色谱，得到以下反应速度数据时间(分)pH温度(℃)化合物1保留%化合物2保留% 化合物3保留%07.006100100-856.2859.267.191.41206.1649.164.391.51805.974.58.963.791.82005.914.58.865.393.0在时间＝200分钟时，将该混合物过滤(除掉固定化酶)，标题产物的原位产率为93%。
实施例27-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐(1)将7-ACCA(1.0072克，4.000毫摩尔)和纯化水(550毫升)合并到烧杯中。该pH为3.39。向混合物中加入3M的氨水(4.10毫升)。该pH为6.73。向混合物中加入D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(4.8397克，24.000毫摩尔)。该pH为6.5。用水(13.77毫升)将该混合物稀释到75.09毫升。向此混合物中加入湿酶(3.0672克，-470国际单位/克核)。(在实验期间，每30分钟将该pH调节到6.5)。通过高压液体色谱得到以下数据时间(分)pH温度(℃)化合物1保留%化合物2保留%产物形成%06.48695.9100-306.345.553.087.032.5606.395.536.082.348.9906.41524.279.659.71206.415.517.673.266.32106.383.59.069.578.52406.3758.067.880.82706.384.56.966.382.33006.424.56.861.780.83306.424.06.261.080.13506.4257.147.788.2在350分钟之后，将该混合物过滤，标题产物的原位产率为88.2%。
实施例3-177-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐对于实施例3-17，采用以下的通用步骤(1)将7-ACCA(1.0072克，4.00毫摩尔)与水合并。用3M氨水调节该混合物的pH值，得到溶液。加入以下表中所示指定数量的D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐。将该混合物冷却到5℃。然后加入一定数量的3M的氨水，使pH达到以下表中所示的数值。用水将该混合物稀释到下表中指定的浓度。然后加入湿酶(3.07克，500国际单位/克核)。除起始pH为6.5外，不对pH进行调节，其中反应pH保持在6.2-6.5之间。
反应条件a)1.0当量D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐b)3.5当量D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐c)6.0当量D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐d)浓度0.5e)浓度1.25f)浓度2.0g)起始pH6.5(在加酶时)h)起始pH7.25(在加酶时)i)起始pH8.0(在加酶时)实施例反应条件时间(分)产物产率3C,F,H15086.94C,D,H15080.65A,F,H27546.66A,D,H18028.97C,E,I6083.48C,E,G33084.79A,E,I4534.310A,E,G54042.811B,F,I6079.812B,F,G36078.913B,D,I6056.214B,D,G63070.815B,E,H18080.416B,E,H19081.017B,E,H18080.8
实施例187-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐(1)将7-ACCA(4.8338G，20毫摩尔)与水(150毫升)合并。pH是3.67。向混合物中加入3M浓度的氨水(8.40毫升)。该pH为8.20。向混合物中加入D-苯基甘氨酸甲酯(23.0克，114毫摩尔)。该pH为5.29。该混合物经过助滤器过滤，用100毫升水稀释。溶液的体积为310毫升。加入5毫升水，将溶液冷却到1℃。pH为5.80。用浓度3M的氨水(16.6毫升)将pH调节到7.28。体积为332毫升。加入水洗酶(15.34克)。以下是通过高效液体色谱得到的分析结果时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物形成%(℃)07.28296.094.5-906.9418.161.587.71206.8316.656.084.81456.7617.158.589.8实施例197-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内酯(1)将7-ACCA(0.494克，2.000毫摩尔)和42.0毫升0.0033M K2HPO4pH6.5缓冲液置于烧杯中。pH为5.91。向此溶液中加入45%K3PO4(0.92毫升)以便溶解。该pH为7.24。加入D苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2.3797克，11.801毫摩尔)(2)。该pH为6.40。加入45%的K3PO4(1.10毫升)，以使pH约为7.0。加入酶(2.6120克，800国际单位/克核)。在T＝43分钟时，用1.34毫升的45%K3PO4将pH调节到7.00。标题产物的最大产率为66.1%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物形成%(℃)06.950.2593.695.10.056.7226.532.066.854.8106.6227.520.655.764.0156.502817.648.866.1206.3628.516.642.864.5256.2728.516.640.364.5306.182917.037.964.1356.102917.036.664.8406.0329.517.334.261.6456.9529.5-30.659.9506.8429.524.522.853.7556.753027.317.949.1606.686029.114.345.2实施例207-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐重复实施例19的实验，但是改用2.2707克的干酶(2660国际单位/克核)。反应期间不调节pH。最大产率为67.5%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物%(℃)07.0023.599.699.4-56.952462.780.8275106.882540.274.149.0156.852530.168.658.5206.7825.522.263.763.7256.712618.058.566.1306.6526.516.855.667.5356.592715.551.766.8406.542715.549.866.5456.492716.746.365.5506.4427.516.244.864.8556.3827.516.242.863.5606.342816.241.463.21805.752717.432.750.8实施例217-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐重复实施例19的实验，但有以下变化化合物1用量0.4698克，2.002毫摩尔化合物2用量2.381克，11.8074毫摩尔0.033M K2HPO4/pH6.5缓冲液用量44.0毫升45%K3PO4用量0.95毫升/1.06毫升湿酶用量8.1686克，2660国际单位/克核在T＝52分钟时用1.37毫升45%K3PO4将pH调节到7.00。
最大产率为65.6%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物形成%(℃)07.0023.595.795.6-56.722419.951.961.9106.452517.140.965.6156.262517.836.265.6206.1125.518.132.463.5255.992618.731.362.2305.882619.530.462.7355.8126.519.729.661.9405.7326.520.028.961.1455.662720.128.359.5505.612720.628.560.4556.902729.617.649.22826.162874.1-0.9实施例227-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐将7-ACCA(0.470克，2.0058毫摩尔)(1)和48.0毫升的0.033M K2HPO4(pH6.5缓冲液)置于烧杯中。pH为5.73。将烧杯置与20℃的浴中。加入45%K3PO4(1.06毫升)以便溶解。该pH为7.21。将D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2.3811克，11.8099毫摩尔)(2)加到溶液中。该pH为6.60。加入45%K3PO4(0.71毫升)，使pH为7.00。加入湿酶(3.0727克)。产物的最大原位产率为74.6%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物%(℃)07.0020.5100100-56.8920.543.476.148.7106.7820.525.462.062.1156.682121.859.571.0206.602120.156.074.0256.522118.952.273.5306.452118.649.172.0356.4020.519.147.874.6406.3520.519.046.973.4456.312118.744.271.2506.2720.519.346.072.9556.222119.544.572.5606.192119.843.772.4实施例237-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐将7-ACCA(0.4710克，2.0071毫摩尔)(1)和48.0毫升的0.033M K2HPO4(pH6.5)加到烧杯中。pH为6.02。加入45%K3PO4(0.98毫升)以便溶解。该pH为7.34。向溶液中加入D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2)(2.3801克，11.803毫摩尔)。该pH为6.58。将该烧杯置于20℃的浴中。加入45%K3PO4(0.63毫升)将溶液的pH值调节到7.00。加入湿酶(3.0738克)。标题产物的最大产率为70.1%。
〔表注对于从5分钟到50分钟的时间，在5分钟时间之前1分钟加入小份量的45%K3PO4，使溶液的pH突变至7.00左右〕时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物%(℃)06.9919.599.398.7-57.012052.280.636.3107.022033.969.457.7157.002024.460.463.1207.002020.655.167.1257.002020.151.969.6307.002019.747.470.1357.002020.343.568.7407.032021.339.967.9457.002022.236.766.2507.012023.833.565.71406.582037.214.450.22406.412038.011.144.1实施例247-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐将7-ACCA(0.4696克，2.0012毫摩尔)(1)和48.0毫升的水置于烧杯中。pH为3.5。将该溶液冷却到10℃。加入3M的氨水(2.47毫升)。该pH为7.10。加入D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2.3835克，11.8198毫摩尔)。该pH为5.65。加入3M的NH3(4.30毫升)。该pH为7.00。加入湿酶(3.0778克，1000国际单位/克核)。〔在T＝256分钟时，用2.60毫升3M的NH3将该pH值调节到7.00〕。最大产率为71.1%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物形成%(℃)06.981097.096.7-56.891055.981.833.6106.801036.376.052.0156.731027.371.058.3206.651022.369.561.8256.561019.369.368.3306.501017.367.970.5356.441015.765.471.1406.371014.262.562.5456.311014.164.064.0506.271013.665.765.7556.221013.063.463.4756.071012.162.862.82365.501010.961.461.42577.001010.959.559.52766.641011.551.151.13136.251011.145.645.6实施例257-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐将7-ACCA(0.4694克，2.0003毫摩尔)(1)和48.0毫升水置于烧杯中。pH为3.25。将该溶液冷却到10℃。加入3M的氨水(3.05毫升)。该pH为7.08。加入D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2)(2.3809克，11.8069毫摩尔)。该pH为5.40。加入3M的氨水(7.24毫升)。使pH为7.00。加入湿酶(8.1840克，2670国际单位/克核)。〔在T＝37分钟时，加入3M氨水(1.72毫升)将该pH调节到6.52。在T＝298分钟时，加入3M氨水(1.72毫升)将该pH调节到6.55〕。最大产率为71.2%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物形成%(℃)07.001098.697.0-56.751022.358.759.9106.461014.149.071.2156.201012.543.668.3205.981011.842.369.1255.801012.441.169.1305.701012.641.869.7355.581012.440.668.9406.521013.038.670.1456.141013.633.766.9505.961013.933.367.4555.801014.733.268.0605.691014.832.567.61215.111015.131.067.83006.551016.928.966.1实施例267-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐将7-ACCA(1)(0.4698克，2.0002毫摩尔)和48.0毫升水置于烧杯中。pH为3.46。加入3M的氨水(3.50毫升)。该pH为7.23。加入D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2)(2.3798克，11.8015毫升)。该pH为5.48。将此混合物冷却到5℃。加入3M氨水(4.33毫升)。将该pH调节至7.00。加入湿酶(3.0710克，1000国际单位/克核)。〔在T＝295分钟时加入2.87毫升3M氨水使pH为7.00〕。最大产率为79.5%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物形成%(℃)07.03595.394.8-56.82534.674.355.2306.63619.867.467.8456.49515.364.069.9806.20512.062.373.61056.065.511.462.074.61206.044.510.961.073.81505.92510.860.675.91805.81610.761.777.02155.735.510.259.974.32405.695.510.462.175.92705.63610.462.276.33006.96610.358.976.43306.615.510.552.879.权利要求
1.一种制备化学式(Ⅰ)的头孢菌素的方法，
式中R是一个可以被取代的五元或六元烃环，或R是一个可以被取代的五元杂环，杂环中含有选自氮、氧或硫的一个或几个杂原子；R1是一个氢原子、卤原子、甲氧基、甲基或是通过氧、硫或氮原子与一个有机基团直接键合的亚甲基，该有机基团为烷氧基、烷氧羰基或者五元或六元杂环基，它们可以被取代，杂环基中含有选自氧、硫和氮的1到4个杂原子；R2是氢或羧基保护基团；所述的方法包括使式(Ⅲ)的α-取代α-氨基酸的反应活性衍生物(其中羧基部分的羟基已被一个有机基团取代)与式(Ⅱ)的头孢菌素底物在有效数量的固定化青霉素酰基转移酶存在下反应，反应的温度范围从约0℃至约+20℃。
2.根据权利要求1的方法，其中R是苯基，R1是氯。
3.根据权利要求2的方法，其中式(Ⅲ)的α-取代α-氨基酸的活性衍生物选自D-苯基甘氨酸甲酯，D-对羟基苯基甘氨酸甲酸甲酯和D-1，4-环己二烯-1-基-甘氨酸甲酯，或是它们的可接受的盐。
4.根据权利要求1的方法，其中反应温度范围是从约0℃到约+5℃。
5.根据权利要求1的方法，其中令pH保持环境值。
6.一种制备化学式(Ⅰ)的头孢菌素的方法
式中R是一个可以被取代的五元或六元烃环，或R是一个含有一个或几个杂原子的五元杂环，杂原子选自氮、氧或硫，该杂环可以被取代;R1是一个氢原子、卤原子、甲氧基、甲基或是通过氧、硫或氮原子直接与一个有机基团键合的亚甲基，该有机基团为烷氧基、烷氧羰基或是一个五元或六元杂环基，它们可以被取代，杂环基团中含有选自O、S和N的1到4个杂原子;R2是氢或羧基保护基团;所述的方法包括使式(Ⅲ)的α-取代α-氨基酸的反应活性衍生物(其中羧基部分的羟基已被有机基团取代)与式(Ⅱ)的头孢菌素底物在有效数量的固定化青霉素酰基转移酶存在下反应，并且令反应的pH保持环境值。
7.根据权利要求6的方法，其中R是苯基，R1是氯。
8.根据权利要求6的方法，其中式(Ⅲ)的α-取代α-氨基酸的活性衍生物选自D-苯基甘氨酸甲酯，D-对羟基苯基甘氨酸甲酯和D-1，4-环己二烯-1-基-甘氨酸甲酯，以及它们的可接受的盐。
9.根据权利要求6的方法，其中的反应温度范围是从约0℃到约5℃。
10.根据权利要求6的方法，其中pH值范围是从约5到约8。
全文摘要
本发明涉及一种改进的制备头孢菌素的方法，该方法利用诸如7-氨基-头孢菌烷酸、7-氨基—3-去乙酸基-头孢菌烷酸等化合物或它们的衍生物与α-氨基酸的衍生物在适当的固定化青霉素酰基转移酶存在下反应，反应时采用以下的单独一个或组合的条件(1)在0℃至+20℃的温度下；或(2)在环境pH下；同时采用α-氨基酸与头孢菌烷酸核的高摩尔比。
文档编号C07D501/06GK1077749SQ93104639
公开日1993年10月27日 申请日期1993年4月23日 优先权日1992年4月24日
发明者J·P·加德纳 申请人:伊莱利利公司
技术领域：
本发明涉及一种具有工业优越性的改进的酶催方法，用相应的7-氨基头孢菌素核与α-氨基酸缩合制备头孢菌素。
在美国专利3，816，253中叙述了一种通过氨基酸衍生物和7-氨基头孢菌素核反应制备头孢菌素的酶催方法。在该专利的大多数实施例中，是将产生酶的微生物本身加到反应混合物中作为酶源。还举例说明了一种粗制的无细胞制剂和一种已经过两步层析的制剂。该专利提到反应进行的温度范围为5℃-50℃，以20℃-40℃最为合适。但是，在除了一个以外的所有实施例中，反应都是在37℃进行的。在唯一的一个例外中，反应是在25℃进行的，报导的产率为63%。
当在以上专利所列举的温度下操作时，由于竟争性反应形成了污染的副产物(主要是氨基酸衍生物的水解产物)，会使所要产物的产率降低。这些副产物不总是容易与反应混合物分离开来。但是，不管副产物多么容易分离，它们的存在增高了生产成本。
过去在采用酶催方法时，每次合成反应都消耗掉大量的酶。因此，酶的成本是此方法成本的相当大的一部分。
由于进行酶催方法的现行成本，它不象常规的有机化学方法那样具有工业吸引力。但是，酶催方法有许多胜过有机化学方法的优点，如果降低了酶催方法的成本，这在工业上将会更加重要。例如，酶催反应方法只需要一步反应，而有机化学方法需要几步反应。另外，有机化学反应费时间，需要诸如吡啶之类的大量溶剂，而且产生不需要的副产物。
基于以上考虑，工艺上需要一种能达到与先前的酶催方法同样高或者更高产率的酶催方法。
现已发现，利用在合适的反应介质/溶剂中在+20℃至0℃的温度范围内于固定化青霉素酰基转移酶存在下进行缩合反应(如下所述)，可以将所要的头孢菌素抗生素产物的产率增加到高于先有技术所公开的水平。
本发明方法的另一方面涉及进行缩合反应时令pH值保持为下面定义的环境值。
本发明方法的又一方面涉及采用α-氨基酸与头孢菌素核的高摩尔比进行缩合。
本发明的方法可以用来制备式(Ⅰ)的头孢菌素
其中R是一个可任选取代的五元或六元烃环，或者R是一个含有1到4个杂原子(N、O或S)的五元杂环，该杂环可以任选地被取代;R1是氢、卤素、甲基、甲氧基或与一个有机基团键合的亚甲基，该亚甲基可以任选地通过桥氧、硫或氮原子与基团键合;R2是氢或一个羧基保护基。
这一方法包括使式(Ⅲ)的α-取代的α-氨基酸的反应活性衍生物(通过取代羧基部分的羟基形成衍生物)与式(Ⅱ)的7-氨基头孢菌素底物化合物反应
式中的R、R1和R2是先前所述的基团，反应在青霉素酰基转移酶存在下进行，该酶最好是固定化的，反应的条件可独立地选择成在0℃至+20℃的温度范围内，最好是从0℃至5℃;或者在环境pH下;或者在α-氨基酸与头孢菌素底物高摩尔比条件下进行。
现有技术中头孢菌素的酶催生产的特点是生成污染性副产物和在生产过程中酶的损失。在本发明的第一个实施方案中，由于采用在固定化酶存在和从约0℃到约20℃的温度下式(Ⅲ)的α-取代α-氨基酸与式(Ⅱ)的7-氨基头孢菌素底物之间进行缩合反应，减少了在制造这些抗生素化合物期间生成的污染物的数量。
在低温下，酶的活性一般降低，经常是显著降低。为解决这一问题，本发明通常使用较大数量的酶。利用这一方法，在很低的温度下、例如在0℃至5℃下，达到了良好的产物产率。
在实施这种生物催化的缩合的方法中，一段时间之后达到最大产物浓度，这段时间随酶的数量、底物、温度和本领域普通技术人员会知道的其它变量而变。此后，产物的浓度在与为达到最大产物浓度所需时间大致成正比的一段时间内保持恒定。例如，如果在约2小时内达到最大产物浓度，则平坦浓度区持续约1小时。随后产物浓度经常减小。在实施本发明时，最好是青霉素酰基转移酶的用量使稳定的产物浓度(或平坦浓度)持续约1小时，以便有足够的时间从反应器中取出产物。但是，在实施本发明时适用的平时时间在约10分钟到约120分钟之间，最好是在约30分钟到约80分钟之间。
在本发明的另一实施方案中，令pH值保持为环境值，或者换句话说，不用诸如缓冲溶液之类的方法保持pH值恒定。环境pH条件是指pH值在反应期间可以不受干扰地漂移或变化。通常，pH值设定在约7-7.5，在反应期间可以下降到pH6-7。虽然不想作理论探讨，但是据信在环境pH值下，与最终产物的形成速度相比，D-苯基甘氨酸甲酯和最终产物的水解被减弱了。
一般来说，在本发明的所有实施方案中，酶的用量为每克7-氨基头孢菌素底物(Ⅱ)用50-3000国际单位的酶。当然，本领域的普通技术人员会认识到，在本发明方法中酶的合适用量将随底物的本质和数量、反应的规模、采用的温度和所用装置的类型而变。
关于以上的化学式，R可以是五元或六元脂族或芳族烃环(例如，苯基、环己二烯基、环己烯基或环己基)，任选地用一个或几个基团取代，这些基团包括但不限于羟基、卤素、烷基、烷氧基、羧基、硝基、氨基等;它也可以是一个含一个或几个杂原子(最好不多于四个)的五元杂环，杂原子选自O、N和S或是它们的组合(例如噻吩基、呋喃基等)，该杂环可以被一个或多个基团取代(最好不多于3个)，这些基团包括但不限于羟基、卤素、烷基、烷氧基、羧基、硝基、氨基等。特别优选的是产物化合物(Ⅰ)和相应的式(Ⅲ)化合物，其中R是一个未取代的苯基、对羟基苯基或1，4-环己二烯-1-基。
当R是一个杂环基团时，预期可以方便地采用4-噻唑基、呋喃基和噻吩基等基团。
R1本身又可以是氢原子、卤原子(Br、Cl、I、F)、甲氧基、甲基或与有机基团相键合的亚甲基，这些有机基团的实例有C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧-羰基或是一个含有1到4个杂原子的五元或六元杂环，杂原子选自O、S和N或它们的组合，该亚甲基可任选地通过O、S或N等桥原子与有机基团键合，杂环基团也可以任选地带有一个或几个取代基，包括但不限于羟基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羰基、羧基、氰基、氨基、硝基等。特别优选的R1是甲基、甲氧基、氯和乙酰氧基亚甲基。对于R1，优选的杂环基团(亚甲基和杂环可以藉以与内酰胺环体系连接的杂原子除外)是1H-1，2，3-三唑-4-基，1H-四唑-5-基和2-噻唑基基团。
可以用于本发明的α-取代的α-氨基酸活性衍生物是在羧基部分上的衍生物，其中羧基部分的羟基已用一个有机基团取代，它可以水解，通过暴露在要在缩合中使用的青霉素酰基转移酶之中而再生成羧酸。虽然不想作理论探讨，但是相信此实验确定了那些能与酶反应形成活性的酰基-酶中间体、接着与式(Ⅱ)的7-氨基头孢菌素核反应和形成酰胺键的衍生物。
可用的式(Ⅲ)α-氨基酸的活性衍生物的实例是烷基酯(例如甲酯、乙酯)、芳基烷基酯(例如苄基酯)、酰胺和二肽(即，与第二个氨基酸形成的酰胺)。D-苯基甘氨酸、D-对羟基苯基甘氨酸和D-1，4-环己二烯-1-基-甘氨酸的甲酯是优选的实施例。羧基保护基(R2)的其它实例可以在以下文献中找到美国专利号4，892，942，E.Haslam，ProtectiveGroupsinOrganicChemistry，J.G.W.McOmie，Ed.，PlenumPress，N.Y.，N.Y.，1973，Chapter5，和T.W.Greene，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，JohnWiley&Sons，N.Y.，N.Y.，1981，Chapter5，这些文献在本文中引用作为参考。
在式(Ⅱ)化合物之中，以下的酸特别重要7-氨基-头孢菌烷酸、7-氨基-3-去乙酸基头孢菌烷酸和7-氨基-3-氯-头孢菌烷酸。
在本发明方法中使用的青霉素酰基转移酶可以由任何已知的微生物源衍生得到。其中包括黄单胞菌属、假单胞菌属、气单胞菌属、大肠埃希氏菌属、节孢子杆菌属、棒状杆菌属和杆菌属的微生物。
最好是使用由大肠埃希氏菌ATCC9637衍生的青霉素酰基转移酶。
本发明的方法最好在固定化酶的存在下进行。固定化可以通过许多众所周知的固定化技术中的任何一种来完成，例如吸收，与聚合物基质的离子键合或共价键合，交联，捕集在凝胶或纤维中，微包囊化或截留在膜反应器中的微过滤膜之后(即，膜分配)。最好是使用渗入到三乙酸纤维素纤维结构之中的酶或是与聚丙烯酰胺树脂共价键合的酶。
固定化的青霉素酰基转移酶，或是纤维捕集的或是与聚合物基质共价键合的，都可以从Recordati，S.P.A.，BiochemicalUnitDe.Bi.(CassinadePecchiItaly)购得。
式(Ⅱ)化合物用约0.5%至约2%(wt/v)的浓度、最好是用1.4%至1.5%的浓度进行反应。在本发明的另一项实施方案中，式(Ⅲ)的活性衍生物以相对于式(Ⅱ)化合物数量的高摩尔比(在大约3至5之间)进行反应。
反应可以在从约0℃至约+20℃的温度范围内进行，但是温度以从0℃至2℃为宜。
一种优选的溶剂系统是仅用水。但是，可以在水溶液体系中使用合适的有机溶剂，包括乙二醇、低级醇(例如，甲醇、乙醇、异丙醇、2-丁醇)、丙酮等。
根据本发明的方法的反应进程中，反应的程度和产物质量可以用高效液体色谱(HPLC)和其它已知方法监测。
在一种最优选的方法中，控制两个方便的变量，温度和比例，以达到最大产率，pH则保持环境值。
以下实施例更好地解释了本发明的特点和适用性，但是不限制本发明的范围。
为了说明本发明，使用7-氨基-3-氯-头孢菌烷酸(“7-ACCA”)作为头孢菌素底物。7-ACCA可以按R.R.Chauvette等在J.Med.Chem.18403(1975)中所述制备。D-苯基甘氨酸甲酯(“PGME”)和D-对羟基苯基甘氨酸甲酯(“HPGME”)可以用标准的酯化步骤，例如用甲醇在HCl存在下处理，从市售的氨基酸(例如Sigma公司产品)制得。此法和其它经典的氨基酸衍生法在C.A.Buehler和D.E.Pearson的“SurveyofOrganicSynthesis”(Wiley-Interscience，NewYork，1970)第1卷801-830页和第2卷(1977)711-726页中有说明。
实施例17-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐
(1)将7-ACCA(1)(0.9388克，4.0007毫摩尔)和96.0毫升H2O合并到烧杯中。该pH为4.12。向烧杯中加入3M的氨水(1.78毫升)。该pH为7.57。向烧杯中加入D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2)(4.7594克，23.602毫摩尔)。该pH为5.68。将混合物冷却到5℃，加入3M的氨水(1.90毫升)将pH提高到7.00。加入酶(6.1442克，940国际单位/克核)。通过高效液体色谱，得到以下反应速度数据时间(分)pH温度(℃)化合物1保留%化合物2保留% 化合物3保留%07.006100100-856.2859.267.191.41206.1649.164.391.51805.974.58.963.791.82005.914.58.865.393.0在时间＝200分钟时，将该混合物过滤(除掉固定化酶)，标题产物的原位产率为93%。
实施例27-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐(1)将7-ACCA(1.0072克，4.000毫摩尔)和纯化水(550毫升)合并到烧杯中。该pH为3.39。向混合物中加入3M的氨水(4.10毫升)。该pH为6.73。向混合物中加入D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(4.8397克，24.000毫摩尔)。该pH为6.5。用水(13.77毫升)将该混合物稀释到75.09毫升。向此混合物中加入湿酶(3.0672克，-470国际单位/克核)。(在实验期间，每30分钟将该pH调节到6.5)。通过高压液体色谱得到以下数据时间(分)pH温度(℃)化合物1保留%化合物2保留%产物形成%06.48695.9100-306.345.553.087.032.5606.395.536.082.348.9906.41524.279.659.71206.415.517.673.266.32106.383.59.069.578.52406.3758.067.880.82706.384.56.966.382.33006.424.56.861.780.83306.424.06.261.080.13506.4257.147.788.2在350分钟之后，将该混合物过滤，标题产物的原位产率为88.2%。
实施例3-177-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐对于实施例3-17，采用以下的通用步骤(1)将7-ACCA(1.0072克，4.00毫摩尔)与水合并。用3M氨水调节该混合物的pH值，得到溶液。加入以下表中所示指定数量的D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐。将该混合物冷却到5℃。然后加入一定数量的3M的氨水，使pH达到以下表中所示的数值。用水将该混合物稀释到下表中指定的浓度。然后加入湿酶(3.07克，500国际单位/克核)。除起始pH为6.5外，不对pH进行调节，其中反应pH保持在6.2-6.5之间。
反应条件a)1.0当量D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐b)3.5当量D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐c)6.0当量D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐d)浓度0.5e)浓度1.25f)浓度2.0g)起始pH6.5(在加酶时)h)起始pH7.25(在加酶时)i)起始pH8.0(在加酶时)实施例反应条件时间(分)产物产率3C,F,H15086.94C,D,H15080.65A,F,H27546.66A,D,H18028.97C,E,I6083.48C,E,G33084.79A,E,I4534.310A,E,G54042.811B,F,I6079.812B,F,G36078.913B,D,I6056.214B,D,G63070.815B,E,H18080.416B,E,H19081.017B,E,H18080.8
实施例187-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐(1)将7-ACCA(4.8338G，20毫摩尔)与水(150毫升)合并。pH是3.67。向混合物中加入3M浓度的氨水(8.40毫升)。该pH为8.20。向混合物中加入D-苯基甘氨酸甲酯(23.0克，114毫摩尔)。该pH为5.29。该混合物经过助滤器过滤，用100毫升水稀释。溶液的体积为310毫升。加入5毫升水，将溶液冷却到1℃。pH为5.80。用浓度3M的氨水(16.6毫升)将pH调节到7.28。体积为332毫升。加入水洗酶(15.34克)。以下是通过高效液体色谱得到的分析结果时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物形成%(℃)07.28296.094.5-906.9418.161.587.71206.8316.656.084.81456.7617.158.589.8实施例197-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内酯(1)将7-ACCA(0.494克，2.000毫摩尔)和42.0毫升0.0033M K2HPO4pH6.5缓冲液置于烧杯中。pH为5.91。向此溶液中加入45%K3PO4(0.92毫升)以便溶解。该pH为7.24。加入D苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2.3797克，11.801毫摩尔)(2)。该pH为6.40。加入45%的K3PO4(1.10毫升)，以使pH约为7.0。加入酶(2.6120克，800国际单位/克核)。在T＝43分钟时，用1.34毫升的45%K3PO4将pH调节到7.00。标题产物的最大产率为66.1%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物形成%(℃)06.950.2593.695.10.056.7226.532.066.854.8106.6227.520.655.764.0156.502817.648.866.1206.3628.516.642.864.5256.2728.516.640.364.5306.182917.037.964.1356.102917.036.664.8406.0329.517.334.261.6456.9529.5-30.659.9506.8429.524.522.853.7556.753027.317.949.1606.686029.114.345.2实施例207-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐重复实施例19的实验，但是改用2.2707克的干酶(2660国际单位/克核)。反应期间不调节pH。最大产率为67.5%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物%(℃)07.0023.599.699.4-56.952462.780.8275106.882540.274.149.0156.852530.168.658.5206.7825.522.263.763.7256.712618.058.566.1306.6526.516.855.667.5356.592715.551.766.8406.542715.549.866.5456.492716.746.365.5506.4427.516.244.864.8556.3827.516.242.863.5606.342816.241.463.21805.752717.432.750.8实施例217-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐重复实施例19的实验，但有以下变化化合物1用量0.4698克，2.002毫摩尔化合物2用量2.381克，11.8074毫摩尔0.033M K2HPO4/pH6.5缓冲液用量44.0毫升45%K3PO4用量0.95毫升/1.06毫升湿酶用量8.1686克，2660国际单位/克核在T＝52分钟时用1.37毫升45%K3PO4将pH调节到7.00。
最大产率为65.6%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物形成%(℃)07.0023.595.795.6-56.722419.951.961.9106.452517.140.965.6156.262517.836.265.6206.1125.518.132.463.5255.992618.731.362.2305.882619.530.462.7355.8126.519.729.661.9405.7326.520.028.961.1455.662720.128.359.5505.612720.628.560.4556.902729.617.649.22826.162874.1-0.9实施例227-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐将7-ACCA(0.470克，2.0058毫摩尔)(1)和48.0毫升的0.033M K2HPO4(pH6.5缓冲液)置于烧杯中。pH为5.73。将烧杯置与20℃的浴中。加入45%K3PO4(1.06毫升)以便溶解。该pH为7.21。将D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2.3811克，11.8099毫摩尔)(2)加到溶液中。该pH为6.60。加入45%K3PO4(0.71毫升)，使pH为7.00。加入湿酶(3.0727克)。产物的最大原位产率为74.6%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物%(℃)07.0020.5100100-56.8920.543.476.148.7106.7820.525.462.062.1156.682121.859.571.0206.602120.156.074.0256.522118.952.273.5306.452118.649.172.0356.4020.519.147.874.6406.3520.519.046.973.4456.312118.744.271.2506.2720.519.346.072.9556.222119.544.572.5606.192119.843.772.4实施例237-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐将7-ACCA(0.4710克，2.0071毫摩尔)(1)和48.0毫升的0.033M K2HPO4(pH6.5)加到烧杯中。pH为6.02。加入45%K3PO4(0.98毫升)以便溶解。该pH为7.34。向溶液中加入D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2)(2.3801克，11.803毫摩尔)。该pH为6.58。将该烧杯置于20℃的浴中。加入45%K3PO4(0.63毫升)将溶液的pH值调节到7.00。加入湿酶(3.0738克)。标题产物的最大产率为70.1%。
〔表注对于从5分钟到50分钟的时间，在5分钟时间之前1分钟加入小份量的45%K3PO4，使溶液的pH突变至7.00左右〕时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物%(℃)06.9919.599.398.7-57.012052.280.636.3107.022033.969.457.7157.002024.460.463.1207.002020.655.167.1257.002020.151.969.6307.002019.747.470.1357.002020.343.568.7407.032021.339.967.9457.002022.236.766.2507.012023.833.565.71406.582037.214.450.22406.412038.011.144.1实施例247-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐将7-ACCA(0.4696克，2.0012毫摩尔)(1)和48.0毫升的水置于烧杯中。pH为3.5。将该溶液冷却到10℃。加入3M的氨水(2.47毫升)。该pH为7.10。加入D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2.3835克，11.8198毫摩尔)。该pH为5.65。加入3M的NH3(4.30毫升)。该pH为7.00。加入湿酶(3.0778克，1000国际单位/克核)。〔在T＝256分钟时，用2.60毫升3M的NH3将该pH值调节到7.00〕。最大产率为71.1%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物形成%(℃)06.981097.096.7-56.891055.981.833.6106.801036.376.052.0156.731027.371.058.3206.651022.369.561.8256.561019.369.368.3306.501017.367.970.5356.441015.765.471.1406.371014.262.562.5456.311014.164.064.0506.271013.665.765.7556.221013.063.463.4756.071012.162.862.82365.501010.961.461.42577.001010.959.559.52766.641011.551.151.13136.251011.145.645.6实施例257-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐将7-ACCA(0.4694克，2.0003毫摩尔)(1)和48.0毫升水置于烧杯中。pH为3.25。将该溶液冷却到10℃。加入3M的氨水(3.05毫升)。该pH为7.08。加入D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2)(2.3809克，11.8069毫摩尔)。该pH为5.40。加入3M的氨水(7.24毫升)。使pH为7.00。加入湿酶(8.1840克，2670国际单位/克核)。〔在T＝37分钟时，加入3M氨水(1.72毫升)将该pH调节到6.52。在T＝298分钟时，加入3M氨水(1.72毫升)将该pH调节到6.55〕。最大产率为71.2%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物形成%(℃)07.001098.697.0-56.751022.358.759.9106.461014.149.071.2156.201012.543.668.3205.981011.842.369.1255.801012.441.169.1305.701012.641.869.7355.581012.440.668.9406.521013.038.670.1456.141013.633.766.9505.961013.933.367.4555.801014.733.268.0605.691014.832.567.61215.111015.131.067.83006.551016.928.966.1实施例267-(D-2-铵-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢菌烷-4-羧酸酯，内盐将7-ACCA(1)(0.4698克，2.0002毫摩尔)和48.0毫升水置于烧杯中。pH为3.46。加入3M的氨水(3.50毫升)。该pH为7.23。加入D-苯基甘氨酸甲酯盐酸盐(2)(2.3798克，11.8015毫升)。该pH为5.48。将此混合物冷却到5℃。加入3M氨水(4.33毫升)。将该pH调节至7.00。加入湿酶(3.0710克，1000国际单位/克核)。〔在T＝295分钟时加入2.87毫升3M氨水使pH为7.00〕。最大产率为79.5%。
时间(分)pH温度化合物1保留%化合物2保留%产物形成%(℃)07.03595.394.8-56.82534.674.355.2306.63619.867.467.8456.49515.364.069.9806.20512.062.373.61056.065.511.462.074.61206.044.510.961.073.81505.92510.860.675.91805.81610.761.777.02155.735.510.259.974.32405.695.510.462.175.92705.63610.462.276.33006.96610.358.976.43306.615.510.552.879.权利要求
1.一种制备化学式(Ⅰ)的头孢菌素的方法，
式中R是一个可以被取代的五元或六元烃环，或R是一个可以被取代的五元杂环，杂环中含有选自氮、氧或硫的一个或几个杂原子；R1是一个氢原子、卤原子、甲氧基、甲基或是通过氧、硫或氮原子与一个有机基团直接键合的亚甲基，该有机基团为烷氧基、烷氧羰基或者五元或六元杂环基，它们可以被取代，杂环基中含有选自氧、硫和氮的1到4个杂原子；R2是氢或羧基保护基团；所述的方法包括使式(Ⅲ)的α-取代α-氨基酸的反应活性衍生物(其中羧基部分的羟基已被一个有机基团取代)与式(Ⅱ)的头孢菌素底物在有效数量的固定化青霉素酰基转移酶存在下反应，反应的温度范围从约0℃至约+20℃。
2.根据权利要求1的方法，其中R是苯基，R1是氯。
3.根据权利要求2的方法，其中式(Ⅲ)的α-取代α-氨基酸的活性衍生物选自D-苯基甘氨酸甲酯，D-对羟基苯基甘氨酸甲酸甲酯和D-1，4-环己二烯-1-基-甘氨酸甲酯，或是它们的可接受的盐。
4.根据权利要求1的方法，其中反应温度范围是从约0℃到约+5℃。
5.根据权利要求1的方法，其中令pH保持环境值。
6.一种制备化学式(Ⅰ)的头孢菌素的方法
式中R是一个可以被取代的五元或六元烃环，或R是一个含有一个或几个杂原子的五元杂环，杂原子选自氮、氧或硫，该杂环可以被取代;R1是一个氢原子、卤原子、甲氧基、甲基或是通过氧、硫或氮原子直接与一个有机基团键合的亚甲基，该有机基团为烷氧基、烷氧羰基或是一个五元或六元杂环基，它们可以被取代，杂环基团中含有选自O、S和N的1到4个杂原子;R2是氢或羧基保护基团;所述的方法包括使式(Ⅲ)的α-取代α-氨基酸的反应活性衍生物(其中羧基部分的羟基已被有机基团取代)与式(Ⅱ)的头孢菌素底物在有效数量的固定化青霉素酰基转移酶存在下反应，并且令反应的pH保持环境值。
7.根据权利要求6的方法，其中R是苯基，R1是氯。
8.根据权利要求6的方法，其中式(Ⅲ)的α-取代α-氨基酸的活性衍生物选自D-苯基甘氨酸甲酯，D-对羟基苯基甘氨酸甲酯和D-1，4-环己二烯-1-基-甘氨酸甲酯，以及它们的可接受的盐。
9.根据权利要求6的方法，其中的反应温度范围是从约0℃到约5℃。
10.根据权利要求6的方法，其中pH值范围是从约5到约8。
全文摘要
本发明涉及一种改进的制备头孢菌素的方法，该方法利用诸如7-氨基-头孢菌烷酸、7-氨基—3-去乙酸基-头孢菌烷酸等化合物或它们的衍生物与α-氨基酸的衍生物在适当的固定化青霉素酰基转移酶存在下反应，反应时采用以下的单独一个或组合的条件(1)在0℃至+20℃的温度下；或(2)在环境pH下；同时采用α-氨基酸与头孢菌烷酸核的高摩尔比。
文档编号C07D501/06GK1077749SQ93104639
公开日1993年10月27日 申请日期1993年4月23日 优先权日1992年4月24日
发明者J·P·加德纳 申请人:伊莱利利公司
起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】
与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。
此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除
热门咨询
tips