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2021-02-01 16:02:03|
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起点商标网 专利名称：具有免疫调节活性的新的亲油低聚肽的制作方法
本申请是1992年7月21日申请的顺序号为07/917464的申请的部分继续申请，顺序号为07/917464的申请是目前已放弃的1992年4月3日申请的顺序号为07/862694的申请的部分继续申请。
本发明涉及免疫调节低聚肽，其可调节机体的免疫系统对侵入的外来物质和微生物或恶性细胞的反应。
更确切地说，本发明是关于胞壁酰基二肽的亲油脱胞壁酰基型肽类似物和具有亲油烷基链的类似的低聚肽。
脊椎动物的免疫系统是用来保护机体免受寄生虫的侵袭。这些病原体包括非细胞病毒和细胞寄生虫，例如细菌、菌质、真菌、单细胞原生动物和多细胞原生动物。其免疫系统也使有机体防御癌细胞。
免疫系统的调节和细协调是医学治疗的目的，在医疗状态的治疗或预防中也经常被称作免疫系统的刺激或抑制。免疫系统的调节是用化学药品来实现，例如用由天然原料如糖蛋白合成的有机物、生物制剂或大分子化合物。
因此，免疫调节剂对防治传染性疾病提供了一种有效方法。这些化学药品以非特异性方式调节(刺激或抑制)免疫系统。免疫性的刺激在宿主防御癌的方面也是重要的，后一种情况是例如根据对免疫调节剂反应的肿瘤巨噬细胞的活化来进行的。免疫调节剂也可用来治疗免疫系统紊乱如关节炎引起的疾病，它们也可以用于治疗具有损伤的免疫系统的个体以提高它们的免疫反应。这类病人包括外科病人、烧伤受害者、经受放射治疗或化学治疗的病人和具有免疫紊乱如AIDS的病人。
通常，这些免疫损伤病人可能会受到病毒感染如细胞肥大病毒(CMV)、流行性感冒、带状疱疹、单纯性疱疹、呼吸合胞体病毒(RSV)和潜在肝炎的损害。免疫调节剂可用于刺激免疫系统并有助于阻止病毒的传染，免疫调节剂也可用作预防这种传染的预防剂。
免疫系统的非特异性刺激也发现可兽医应用，正如，例如，用粗的分枝杆菌细胞壁制剂来治疗马的呼吸疾病所证明的那样。
一些免疫调节剂在现有技术中是已知的。例如，弗罗因德完全辅药(Freund′sCompleteAdjuvant)(一种杀伤的结核杆菌的油包水乳状液)是一种公知的可提高体液和细胞免疫反应的免疫调节剂。其性质已有许多资料证明，例如，J.Freund，Adv.Tuberc.Res.，7，130，1956。然而，该制剂是有毒的，以致它目前在人体中应用是被禁止的，并且它在动物中的应用也受到限制。胞壁酰二肽(MDP;N-酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺)是最小的化学结构，其可以置换存在于弗罗因德辅药中的分枝杆菌细胞，而仍能保持免疫调节活性。MDP是细菌细胞壁的肽葡聚糖结构的部分，它是一种独特的刚性聚合物，该聚合物在细菌周围形成了一个网。MDP具有许多免疫活性，例如，它是巨噬细胞活化剂和B-细胞促细胞分裂剂。因此，MDP作为免疫调节剂具有显著的活性，MDP增加了对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、真菌寄生虫、病毒和肿瘤的免疫保护机理。MDP也在兔子中产生眼色素层炎(眼内的炎症)。通过皮下应用MDP在鼠中也可产生关节炎(一种自体免疫反应)，胞壁酰二肽也增加体液对许多菌苗的反应。然而，MDP象弗罗因德辅药一样是有毒的。E.lederer在JournalofMedicinalChemistry，23，819，1980中指出MDP的毒性效应包括致热性、暂时白细胞减少、血小板溶解和对内毒素致敏感作用。
多年来，为了制备高活性和低毒性的免疫调节剂已经合成和评价了许多MDP类似物。以前认为MDP分子的糖类部分对显著的免疫调节活性是必要的，然而，如果糖类部分通过加入更多的氨基酸而取代或者被可与受体分子相互作用的另一种分子本体取代，则该糖类部分可以除去。在生物系统中的这种受体将是结合小分子如MDP或这种小分子的一部分的任何大分子化合物。由于结合了小分子，大分子将经受结构变化，这将导致信号传递。
例如，一种已知的化合物十二烷酰四肽取代N-乙酰基胞壁酸糖类，在这个取代过程中除了12个碳原子链外2个附加的氨基酸被加到现有的两个碳原子上。FK156加上了两个附加氨基酸和乳酸，“TRIGLYMYC”加上了三个附加氨基酸、甘油和霉菌酸。MDP的金刚烷类似物是用抗病毒剂金刚烷胺取代糖类。
然而，当使用这些类似物时，遇到了一些问题。例如它们必须与油一起给药，以便有效的刺激免疫系统的细胞免疫组分。一些已知的MDP类似物引入了一个长烷基链以使其具有亲油性。重要的脱胞壁酰肽含有亲油部分。这些部分，例如在十二烷酰四肽、FK156和“TRIGLYMYC”中发现的那些部分是复杂的并具有不同程度的毒性。
近来，已经合成了几种不太复杂的MDP类似物。例如，L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺金刚烷基酰胺和D，L-(2-金刚烷基)甘氨酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺是由抗病毒化学品金刚烷得到的结构简单的化合物。然而，它们不适合作为免疫调节化学药品，因为金刚烷和由其得到的药引起中枢神经系统副作用和充血性心力衰竭。
因此，现在需要具有显著免疫调节活性的化合物，该化合物是容易使用的，并具有比MDP的已知类似物更低的毒性。
本发明涉及具有免疫调节活性的新的MDP的亲油脱胞壁酰型肽类似物和带有亲油烷基链的类似的低聚肽。因此，根据本发明的一个方面，提供了由共价连接到一个长烷基链上的低聚肽组成的小的结构简单的分子。
我们意外地发现，当长烷基链共价连接到MDP的二肽部分上或本发明分子的低聚肽部分上时，该长烷基链提高了免疫调节剂的活性。该连接可用酯或酰胺键来完成;酯键是指任何硫酯键和酯键;酰胺键是指任何硫代酰胺键和酰胺键。
本发明的类似物不用任何抗病毒剂取代N-乙酰基胞壁酸糖类，也不用在体内反应中可与受体特异性结合的任何小分子取代N-乙酰基胞壁酸糖类，因此，这些类似物在化学上是不复杂的，并容易合成。取代胞壁酸的结构简单的分子可用硬脂酸构成。硬脂酸、十八烷醇或其它合适的长烷基链衍生物对人类都是无毒的，例如，十八烷醇具有的口服LD50大于15g/Kg。
因此，本发明提供一种通式(Ⅰ)的低聚肽免疫调节剂
其中Z是C＝O或C＝S;
Y是适于将烷基链连接到Z部分上的连接基，优选-O-，-S-，或-NH-;和n是选自11至19的整数。
HA(如果存在)是与肽形成生理上可接受的盐的有机或无机酸，例如氢氯酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、柠檬酸、或甲磺酸。
P是由酰胺或硫代酰胺键独立地连接的含有2至5个氨基酸的低聚肽部分。P被称作低聚肽部分，是因为它不包括它的氨基和酸(羧酸或硫代羧酸)末端官能团。构成P的氨基酸独立地选自天然形成的L-构型或D-构型的氨基酸或合成的氨基酸。
天然形成的氨基酸是指以其L或D-构型的任何氨基酸，不管其是否用于蛋白质的形成。这些氨基酸可以，例如，选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异谷氨酰胺或鸟氨酸。
在不限制本发明范围的情况下，合成氨基酸的实例可以包括氰甲基丙氨酸和噻唑烷-4-羧酸。
本发明还设法提供通式(Ⅱ)的含有共价连接到低聚肽的羧基末端的长烷基链的MDP类似物，优选二肽免疫调节剂。
其中P是零至4;
每个Z独立地是C＝O或C＝S;
每个r独立地是零至2;
Y是适于将烷基链连接到Z部分上的连接基，优选-O-，-S-或-NH-;
n是选自11至19的整数;和X是NH2，OH或OCH3。
HA(如果存在)是将与肽形成生理上可接受的盐的有机或无机酸，例如氢氯酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、柠檬酸或甲磺酸。
Q是C1-C4支链或无支链的烷基、苯基、苄基、羟甲基或天然形成的氨基酸的侧链。
式(Ⅱ)的一具体的实例是通式(Ⅲ)的二肽免疫调节剂
其中HA、Q、P、Z、r、Y、n和X如上述定义。式(Ⅱ)的优选具体实例是十八烷基L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺盐酸盐(BCH-523)和十八烷基D-丙氨酰-L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-527)。
在式(Ⅱ)的另一个具体实例中，MDP的亲油脱胞壁酰二肽类似物可由通式(Ⅳ)表示
其中HA、n、X和Y如上所定义。式(Ⅳ)中的两个氨基酸残基是手性的。如在MDP中所看到的那样，优选的是采用L-构型的丙氨酸残基和采用D-构型的第二残基(例如，异谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸等)。这不排除该手性的转变，例如，丙氨酸残基采用D-构型，第二氨基酸采用L-构型。然而，这两个氨基酸在α碳上不应具有相同的手性。本专业熟练技术人员应知道，其中两个丙氨酸和异谷氨酰胺氨基酸都具有D-构型的MDP类似物不是免疫调节剂。
本发明优选的低聚肽免疫调节剂是十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰胺、γ-十八烷基L-丙氨酸D-谷氨酸、十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺、α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸、十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基L-苯基甘氨酰D-谷氨酰胺、十八烷基D-缬氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-丝氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-苯基甘氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-谷氨酸L-谷氨酰胺、十八烷基D-鸟氨酰L-谷氨酸、十八烷基L-酪氨酰甘氨酰甘氨酸及其任何药物上可接受的酸加成盐。
通常，本发明的类似物的合成是两步进行的。第一步是得到所需的低聚肽。肽常可从商业供应者得到，另外，所需的低聚肽可用任何常规方法合成，例如，如本专业所公知的，通过在偶合剂如2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)存在下使氨基酸反应而合成。
第二步是长烷基链前体，如十八烷醇或十八烷基胺，与制得的低聚肽反应，该方法用于合成实施例1中的BCH-523。
优选的是，本发明的类似物可通过长烷基链前体与单氨基酸或低聚肽偶合，然后与一个或多个其它的氨基酸偶合以生成所需的低聚肽免疫调节剂而合成。该方法用于合成实施例2中的BCH-525。
在这两种情况下，式(Ⅰ)的低聚肽免疫调节剂可制备如下a)式(Ⅴ)的化合物其中Z是C＝O或C＝S;
W是可接受的脱离基，如OH、卤素、O-琥珀酰亚胺、三唑、咪唑或S(E)，其中E是C1-6烷基;和P′含有由酰胺或硫代酰胺链独立地连接的1至5个氨基酸;该P′不包括氨基和酸末端官能团，该氨基酸独立地选自天然形成的、L-构型、D-构型或合成的氨基酸;
与下式化合物偶合，
其中n是选自11至19的整数，Y是将长烷基链前体与氨基酸或低聚肽连接的合适的连接基(Y优选为-O-、-S-、或-NH-);
生成式(Ⅵ)的亲油低聚肽其中P′、Z、Y和n如上定义;和b)如果需要，式(Ⅵ)的亲油低聚肽的氨基末端官能团(H2N-)与式(Ⅴ)的另一化合物的羧基或硫代羧基末端官能团(-Z-W)进一步偶合，得到式(Ⅰ)的所需低聚肽免疫调节剂。
优选的是，氨基酸或低聚肽与烷基链前体之间的偶合是在偶合剂存在下进行。烷基链连接的一种优选方法使用了羰基二咪唑。其它合适的偶合剂包括碳化二亚胺，如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。
在本发明的类似物的制备过程中，可以暂时地保护反应的官能团，例如，丙氨酰二肽(Ⅳ)的氨基末端可用氨基甲酸乙酯型基团保护，而羧基末端可用酯基团(例如，当X是-OH时的苄酯)保护。适合的保护-去保护条件和方法已在合成文献中叙述，并且对本专业熟练的化学工作者来说是公知的。
本发明的类似物在其合成期间和/或在其制备之后用熟练工人所公知的标准方法提纯。一种优选的提纯方法是硅胶色谱法，特别是可以使用快速色谱法。然而其它的色谱法，包括HPLC，也可用于产物类似物的提纯。由于可以用适合的有机溶剂洗涤的方法，所以也可用结晶法来提纯产物。
本发明的低聚肽在生理环境中通常具有有限的溶解性，例如在生理(0.9%)盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。因此，例如，通常观察到在式Ⅱ中(如在异谷氨酰胺，谷氨酰胺中)当X是-NH2时，溶解性是有限的，通常小于0.01mg/ml。如果类似物在含水介质中是不溶的，则它们应能够形成具有粒径在约150μm-1mm(18目-100目)的微粒，从而形成均匀稳定的悬浮液。一种优选的制剂使用60目微粒或直径约250μm的颗粒的含水悬浮液。
本发明也涉及治疗或预防哺乳动物中病毒感染的方法。哺乳动物是指包括人的任何一类高级脊椎动物。在不限制本发明范围的情况下，病毒感染可选自细胞肥大病毒(CMV)、流行性感冒、带状疱疹、单纯性疱疹、呼吸合胞体病毒(RSV)和肝炎。
上述结构式所述的本发明的类似物可用类似于配制其它药物肽组合物所用的那些方法来配制。因此，该类似物可以冷冻干燥的形式贮存，或作为干燥粉末，并在投药之前在生理上可接受的媒介物中再构成以形成悬浮液或溶液。另外，该类似物可贮存在治疗媒介物中。优选的媒介物是无菌溶液，特别是无菌缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。媒介物可含有保存剂或可用于改善该混合物的搁置稳定性或效力的其它已知添加剂，该保存剂包括，例如乙基汞硫代水杨酸钠或苯氧基乙醇。
为了用于治疗，虽然本发明的低聚肽可以以原化学药品的形式投药，但最好是以存在活性组分的药物制剂的形式投药。
因此，本发明还提供了一种含有结构式(Ⅰ)-(Ⅳ)的低聚肽或其药物可接受的酸加成盐以及一种或多种药物上可接受的媒介物和任意的其它治疗和/或预防组分的药物制剂。媒介物必须在可与制剂的其他组分配伍的意义上是“可接受的”，并对其接受者是无害的。
药物制剂包括适于口服、直肠投药、鼻内投药、局部(包括颊和舌下)投药、阴道或肠胃外(包括肌肉、皮下、静脉内和腹膜内)投药的那些制剂或者以适于用吸入法或吹入法投药的形式的那些制剂。该制剂可适当地以分散的剂量单位形式方便地提供，并且可以用药学专业公知的任何方法配制。所有的方法都包括步骤将活性化合物与液体媒介物或细分散的固体媒介物或这两种媒介物结合，然后，如果需要，将产物成形为所需的制剂。
当需要时，可以使用适于持续释放活性组分的上述制剂。
本发明的免疫调节剂可与其他药物活性治疗试剂结合使用。这样的结合可以是协同的，或者这些结合的试剂可同时影响许多问题。在没必要限制本发明的范围的情况下，设想几个实施例。
一个实例含有本发明的免疫调节剂和抗癌化合物，例如抗代谢物、插入剂(intercalatingagents)、有丝分裂抑制剂、烷基化剂或其他细胞毒素抑制剂如二氨二氯络铂。
本发明的免疫调节剂也可与抗毒素单克隆或多克隆抗体，或细胞毒素细胞如尤其是淋巴细胞活素活化的杀伤细胞或肿瘤浸润淋巴细胞一起使用。
本发明的免疫调节剂也可与抗病毒试剂一起投药。某些抗病毒化学药品可与本发明的免疫调节剂很好的作用，这些抗病毒化学药品可选自这样的试剂如无环鸟苷、ganciclovir、三氮唑核苷、金刚胺(amantidine)、叠氮胸苷、磷甲酸盐(foscarnet)、2′-去氧-3′-噻胞苷(2′-deoxy-3′-thiacytidine)(3TC)、2′3′-二去氧胞苷(ddC)、2′3′-二去氧肌苷(ddI)、2′3′-二去氧腺苷(ddA)、5′-碘去氧尿苷和carbovir。可以想象到，其他适合的抗病毒化学药品可与本发明的免疫调节剂结合使用。这些抗病毒化学药品对本专业熟练的化学工作者来说是已知的。可以想象到，这些抗病毒试剂可与本发明的免疫调节剂结合用于治疗AIDS、肝炎、CMV和其他病毒疾病。
另外，本发明的免疫调节剂也可与抗细菌抗生素、抗真菌药、抗原生动物药或其他抗微生物剂结合使用。
对哺乳动物优选的剂量为0.1-1000mg/Kg体重的本发明类似物化学药品，类似物的更优选的量为10-500mg/Kg体重。该剂量将取决于接受化合物的宿主以及宿主的大小、重量和年龄。
本发明的免疫调节剂是用4种不同方法测验。第一种方法例详细说明于实施例22和表1中。该方法包括使用鼠的脾细胞进行空斑形成测定，该鼠用绵羊红血细胞攻击并注射本发明的免疫调节剂。然后将获得的脾细胞在坎宁安(Cunningham)室中与新鲜绵羊红血细胞和豚鼠补体一起温育。当它们表现出空斑形成细胞时，计算血细胞溶解的面积。表Ⅰ显示了某些本发明的低聚肽的选择实例的免疫调节活性的结果。
已经发现本发明的下列低聚肽是免疫刺激剂十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰胺(BCH-523);十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺(BCH-525);十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527);十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰基甘氨酸(BCH-1315);L-丙氨酰D-异谷氨酰基十八烷胺(BCH-1316);和十八烷基L-酪氨酰甘氨酰甘氨酸(BCH-276)。
发现本发明的下列低聚肽的免疫抑制剂十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-524和BCH-526)和十八烷基D-鸟氨酰L-谷氨酸(BCH-1325)。
测验本发明的免疫调节剂的第二种方法详细叙述于实施例23和24中。将鼠投药50mg/Kg剂量的本发明的免疫调节剂，然后鼠死亡，取出脾并分离出脾细胞，对最终治疗后放置24小时的脾细胞进行免疫测定。使这些细胞进行巨噬细胞和自然杀伤细胞功能试验，也计算脾细胞B和T细胞。总的概括如下。
下列免疫调节剂引起巨噬细胞刺激十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰胺(BCH-523);γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-524);和十八烷基D-丙氨酰-L谷氨酰胺(BCH-527)。十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺(BCH-525)和α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-526)引起适度的巨噬细胞抑制。自然杀伤(NK)细胞活性受到十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)的刺激。γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-524)和十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺(BCH-525)产生边缘自然杀伤细胞的抑制。
γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-524)抑制B和T细胞。α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-526)和十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)增加B细胞数量并抑制T细胞数量。
第三种方法举例详细说明于实施例25和表5-6中。该方法非常类似于第二种方法。测定自然杀伤细胞(NK)的活性，并进行巨噬细胞机能测验，在这种情况下，在投药之前用流行性感冒A/NWS/33感染一部分鼠，投药的剂量为0-200mg/Kg的本发明的免疫调节剂。十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺(BCH-527)引起巨噬细胞刺激并刺激自然杀伤细胞活性。
第四种方法举例详细说明于实施例26和表7-8-9中。该方法包括用本发明的免疫调节剂对鼠预防治疗，后来用CMV攻击。观察死亡率并计算不同器官的病毒滴度。发现十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)由于可防止死亡和降低组织病毒滴度而具有预防活性。
实施例1十八烷基L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺盐酸盐(BCH-523)的合成
将1.1g，7mmole羰基二咪唑加入到溶于50ml无水四氢呋喃的BOCL-丙氨酰D-异谷氨酰胺(1.9g，6mmole游离酸)中，在氩气流下搅拌，在室温下将该溶液搅拌45分钟，然后继续在氩气流下加入十八烷醇(2.0g，7.2mmole)。在室温和氩气下搅拌反应物20小时。用旋转式蒸发法除去溶剂得到4.9g粗产物。将该固体溶于50ml氯仿中，并用0.5N盐酸(3×40ml)、5%碳酸氢钠(2×50ml)和水(50ml)萃取溶液。然后，有机相用无水硫酸钠干燥，除去溶剂得到2.7g固体。用快速硅胶色谱法从该固体提纯BOCL-丙氨酰D-异谷氨酰胺的十八烷基酯，色谱柱分别用1∶1己烷/二氯甲烷、二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇(1%，5%和最终10%V/V的后一种溶剂)洗脱。产物的收率1.2g。用300MHzNMR光谱测定法和TLC鉴定产物。通过将产物溶解于二氯甲烷中，然后在室温下吹入氯化氢气体通过该溶液10分钟来除去BOC保护基团。将该混浊溶液在4℃下放置2小时，然后过滤，真空干燥该固体化学药品。十八烷基D-丙氨酰L-异谷氨酰胺的白色盐酸盐的收率为1.0g，这样由BOC二肽反应物得到33%的收率。最终产物用300MHzNMR谱法和TLC(对碘和茚三酮呈阳性)证实。最终产物可用丙酮和/或乙醚洗涤。
实施例2十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-525)的合成
使用实施例1所述的合成方法，在有羰基二咪唑的存在下，通过十八醇(5.8g，22mmole)与BOCD-谷氨酰胺(4.4g，18mmole)酯化制备BOCD-谷胺酰氨的十八烷基酯(3.5g)。如实施例1所述，在室温下将产物在二氯甲烷中加溶，接着用氯化氢鼓泡通过该溶液10分钟从而脱除BOC保护基，得到2.7g十八烷基D-谷氨酰胺的盐酸盐。
向悬浮于75ml氯仿中的十八烷基D-谷氨酰胺的盐酸盐(2.2g，5mmole)中加入三乙胺(0.8ml，5.8mmole)，并在室温下将其搅拌几分钟，然后向该反应混合物中加入BOCL-丙氨酸(1.0g，5.5mmole)和2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ;1.6g，6.5mmole)。在室温下该反应物搅拌18小时，然后用冷的0.5N盐酸(3×75ml)，5%碳酸氢钠(2×75ml)和水(75ml)萃取。然后用无水硫酸钠干燥有机相。除去溶剂得到2.3g固体。用快速硅胶色谱法从该固体中提纯BOC-L丙氨酰D-谷氨酰胺的十八烷基酯。用1∶1己烷/乙酸乙酯，3∶1乙酸乙酯/己烷，乙酸乙酯，和乙酸乙酯/甲醇(10%V/V的后一种溶剂)洗脱该色谱柱。得到1.9g产物。该产物用300MHzNMR光谱和TLC鉴定。该产物另外也能用在二氯甲烷/乙醚中结晶来提纯。在室温下将产物在二氯甲烷中加溶(为除去少量的不溶物质过滤是必要的)接着用氯化氢鼓泡通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基。在4℃下将该混浊溶液存放2小时，过滤，在真空中干燥该固体。得到1.4g白色的十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺的盐酸盐。用300MHzNMR光谱法和TLC确定最终产物。
实施例3十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-527)的合成
用实施例2所述的方法，按同一比例合成十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺的盐酸盐(1.6g)。产物的NMR和TLC和实施例2的产物是一样的。
实施例4α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸盐酸盐(BCH-526)的合成
用实施例1所述的合成方法，在有羰基二咪唑的存在下通过十八烷醇(4.4g，16.2mmole)与γ-苄基BOCD-谷氨酸(4.6g，13.5mmole)酯化制备γ-苄基BOCD-谷氨酸的十八烷基酯(7.2g)。在室温下将产物在乙醚中加溶，接着将氯化氢大面积鼓泡通过该溶液3次每次10分钟，从而除去BOC保护基。在4℃下存放没有得到沉淀物，用旋转式蒸发法除去大部分溶剂，提浓物用己烷稀释，再次在4℃下存放2小时，过滤收集沉淀产物。得到5.2gγ-苄基D-谷氨酸的十八烷基酯的盐酸盐。
将三乙胺(1.2ml，8.7mmole)加入到溶于75ml氯仿中的γ-苄基D-谷氨酸的十八烷基酯的盐酸盐(3.9g，7.5mmole)中，在室温下搅拌该混合物几分钟。然后加入BOCL-谷氨酸(1.6g，8.3mmole)和EEDQ(2.4g，9.8mmole)到该反应物中。在室温下搅拌该反应物18小时，完成实施例2所述的步骤，从而得到不用硅胶色谱提纯就可使用的粗产物(4.9g)如上所述，将1.5g部分粗产物在二氯甲烷中加溶并用氯化氢气体大面积鼓泡，从而除去BOC保护基，得到1.3gL-丙氨酰D-谷氨酸的十八烷基γ-苄基酯的粘性固体。将该固体溶于75ml乙醇中并在氢气氛下，在有300mg10%钯/碳催化剂存在下，在室温下将其搅拌隔夜。过滤除去催化剂，用旋转式蒸发法除去溶剂，在乙醚中研制残余物，得到1.0g粗二肽。在乙腈中结晶得到630mg十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸的盐酸盐。用NMR光谱和TLC确定最终产物。
实施例5γ-十八烷基L丙氨酰D-谷氨酸盐酸盐(BCH-524)的合成
用实施例1所述的合成方法，在有羰基二咪唑的存在下，通过十八烷醇(1.5g，5.4mmole)与BOCL-丙氨酰D-谷氨酸的α-苄基酯(1.8g，4.5mmole)酯化，制备α-苄基BOCL-丙氨酰D-谷氨酸的十八烷基酯(875mg)。
用实施例4所述的方法，氢解除去苄基酯保护基，从而得到320mgBOCL-丙氨酰D-谷氨酸的γ-十八烷基酯。如实施例1所述在室温下将产物溶于二氯甲烷中，接着用氯化氢气鼓泡通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基，得到140mgγ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸的盐酸盐。用NMR光谱和TLC确定最终产物。
实施例6十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰基γ-甘氨酸盐酸盐(BCH-1315)的合成
将羰基二咪唑(583mg，3.6mmole)加入到溶于60ml无水四氢呋喃中的BOCL-丙氨酰D-异谷氨酰胺(955mg，3mmole的游离酸)中，并在氩气流下搅拌。将该溶液在室温下搅拌45分钟，然后在氩气流下将悬浮于无水四氢呋喃(40ml)和三乙胺(0.5ml)中的十八烷基甘氨酸盐酸盐(1.2g，3.3mmole)加入到反应物中。
用甲磺酸催化酯化甘氨酸与十八烷醇来制备十八烷基甘氨酸盐酸盐。在室温下在氩气下将该悬浮液搅拌20小时。如上述实施例1所述，用旋转式蒸发法除去溶剂，将粗产物收集在二氯甲烷中并萃取。通过在温的二氯甲烷中结晶来提纯BOCL-丙氨酰D-异谷氨酰基γ-甘氨酸的十八烷基酯得到690mg灰白色固体产物。如实施例1所述，通过与氯化氢气体反应除去BOC保护基。然而，在4℃下存放后没有沉淀物形成，因此，用旋转式蒸发法除去二氯甲烷，将乙醚加入到提浓物中。过滤接着用乙醚洗涤固体，得到450mg十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰基γ-甘氨酸的盐酸盐并用NMR光谱和TLC确定。
实施例7L-丙氨酰D-异谷氨酰基十八烷基胺盐酸盐(BCH-1316)的合成
除了用十八烷基胺的游离碱(890mg，3.3mmole)取代十八烷基甘氨酸盐酸盐和三乙胺外，用实施例6中所述的方法，并按同一比例合成L-丙氨酰D-异谷氨酰基十八烷基胺的盐酸盐。最终产物用NMR光谱和TLC确定。
实施例8十八烷基L-缬氨酰D-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1317)的合成
将三乙胺(0.4ml，2.9mmole)加入到悬浮在50ml氯仿中的十八烷基D-谷氨酰胺的盐酸盐(如上面实施例2所述的合成方法)(1.1g，2.5mmole)，将该混合物在室温下搅拌几分钟。然后加入BOCL-缬氨酸(0.6g，2.8mmole)和EEDQ(0.8g，3.3mmole)。在室温下搅拌反应物18小时并且其处理如实施例2所述。该反应得到1.6g粗的BOCL-缬氨酰D-谷氨酰胺的十八烷基酯，并用快速硅胶色谱法提纯。用2∶1己烷/乙酸乙酯，1∶1己烷/乙酸乙酯和乙酸乙酯洗脱该色谱柱。然而，用在二烷甲烷和乙醚中结晶的方法也可以提纯该产物。产生730mg产物。用NMR光谱和TLC鉴定该产物。在室温下将产物溶于二氯甲烷中接着鼓泡氯化氢气体通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基。然而，在4℃下存放该酸溶液没有得到沉淀物，因此用旋转式蒸发法除去二氯甲烷，在过滤后，用乙醚洗涤残余物得到510mg十八烷基L缬氨酰D-谷氨酰胺的盐酸盐。用300MHzNMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例9十八烷基L-丝氨酰D-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1318)的合成
除了用BOCL-丝氨酸(570mg，2.8mmole水合物)取代BOCL-缬氨酸外，用实施例8所述的方法，用同一比例合成420mg十八烷基L-丝氨酰D-谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例10十八烷基L-苏氨酰D-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1319)的合成
除了用BOCL-苏氨酸(600mg，2.8mmole)取代BOCL-缬氨酸外，用实施例8中所述的方法，用同一比例合成410mg十八烷基L-苏氨酰D-谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例11十八烷基L-苯基甘氨酰D-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1320)的合成
除了用BOCL-苯基甘氨酸(700mg，2.8mmole)取代BOCL-缬氨酸外，用实施例8所述的方法，用同一比例合成750mg十八烷基L-苯基甘氨酰D-谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例12十八烷基D-缬氨酰L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1321)的合成
除用BOCD-缬氨酸取代其L-对映体并使用谷氨酰胺的L-对映体外，用实施例8所述的方法，按相同比例合成580mg十八烷基D-缬氨酰L-谷氨酰胺。产物的NMR和TLC与实施例8所述的产生的产物相同。
实施例13十八烷基D-丝氨酰L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1322)的合成
除了用BOCD-丝氨酸(560mg，2.8mmole)取代BOCL-缬氨酸并使用谷氨酰胺的L-对映体外，用上述实施例8所述的方法，根据相同比例合成680mg十八烷基D丝氨酰L-谷氨酰胺的盐酸盐，用NMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例14十八烷基D-苯基甘氨酰L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1323)的合成
除用BOCD-苯基甘氨酸(700mg，2.8mmole)取代BOCL-缬氨酸并用谷氨酰胺的L-对映体外，用上述实施例8所述的方法，根据同一比例合成800mg十八烷基D-苯基甘氨酰L-谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例15十八烷基D-谷氨酸L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1326)的合成方法
除用BOCD-谷氨酸-γ-叔丁基酯(830mg，2.8mmole)取代BOCL-缬氨酸，并用谷氨酰胺的L-对映体外，用上述实施例8所述的方法，按同一比例合成800mg十八烷基D-谷氨酸L-谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例16十八烷基D-鸟氨酰L-谷氨酸盐酸盐(BCH-1325)的合成
在氩气流并搅拌下向溶于100ml无水四氢呋喃中的BOC-L-谷氨酸-γ-苄基酯(3.0g，12.2mmole)中加入羰基二咪唑(2.0g，12.3mmole)。在室温下搅拌20分钟后，加入十八烷醇(4.0g，14.6mmole)，然后将反应混合物在室温下搅拌18小时。
过滤除去不溶物，用旋转式蒸发法除去溶剂得到9.1g粗产物。将该固体溶于100ml二氯甲烷中并用5%盐酸(2×40ml)、5%碳酸氢钠(2×40ml)和盐水(40ml)萃取。用硫酸镁干燥有机相。除去溶剂得到5.8g固体。用快速硅胶色谱提纯粗产物。用二氯甲烷洗脱色谱柱得到4.8g产物。
用NMR光谱和TLC鉴定该产物。在室温下将产物在乙醚中加溶，接着使氯化氢气体鼓泡通过该溶液25分钟从而除去BOC保护基。在室温下将该反应物搅拌1小时，然后用旋转式蒸发法使其体积降低约一半。将该溶液在4℃下存放2小时然后过滤，在真空中干燥该固体。
得到2.3g白色γ-苄基L-谷氨酸的十八烷基酯的盐酸盐。用NMR光谱和TLC确定最终产物。将该产物(5.2mmole)加入到50ml氯仿和三乙胺(0.8ml，5.8mmole)中，并在室温下将该反应混合物搅拌20分钟。将BOC-N-&-CBZ-D-鸟氨酸(2.0g，5.7mmole)加入到反应混合物中，接着加入EEDQ(1.4g，5.7mmole)。在室温下将反应物搅拌18小时，用氯仿(25ml)稀释，并用5%盐酸(2×30ml)，5%碳酸氢钠(2×30ml)、盐水(30ml)萃取，然后在硫酸镁上干燥。结晶(3∶1乙醚/二氯甲烷)该产物得到3.4g纯产物，用NMR光谱和TLC测其特性。通过在室温下将产物溶于70ml乙醇中并在氢气氛及在有750mg10%钯/碳催化剂存在下搅拌隔夜除去苄酯保护基。过滤除去催化剂，旋转蒸发除去溶剂得到2.1gBOCD-鸟氨酰L-谷氨酸的十八烷基酯。用NMR光谱和TLC鉴定该产物。通过在室温下将产物溶于乙醚中，接着将氯化氢气鼓泡通过该溶液20分钟以除去BOC保护基。在室温下将该反应物保存1小时，然后旋转蒸发使其体积降低约1半。在4℃下将该混浊溶液搅拌2小时，过滤，用乙醚(2×30ml)洗涤固体并在真空中干燥。得到1.7g纯的十八烷基D-鸟氨酰L-谷氨酸盐酸盐，并用NMR光谱，高分辨质谱和TLC鉴定该产物。
实施例17十八烷基L-酪氨酰甘氨酰甘氨酸盐酸盐(BCH-276)的合成
将羰基二咪唑(535mg，3.3mmole)加入到在无水二氯甲烷(40ml)和无水二甲基甲酰胺(10ml)中的BOCL-酪氨酰甘氨酰甘氨酸(1.2g，3.0mmole)的溶液中。在室温下在氩气下将该溶液搅拌45分钟，然后向该溶液中加入十八烷醇(976mg，3.6mmole)。在氩气下将该反应物搅拌20小时。旋转式蒸发除去溶剂，用快速硅胶色谱法提纯粗产物(2.5g)。用4∶1己烷/乙酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸乙酯/甲醇(10%V/V的后一溶剂)洗脱该色谱柱。
得到1.3g产物。用NMR光谱和TLC鉴定产物。通过在室温下将产物在二氯甲烷中加溶，然后将氯化氢气体鼓泡通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基。在4℃下将该混浊的溶液存放2小时，过滤，在真空中干燥该固体。
得到950mg的十八烷基酪氨酰甘氨酰甘氨酸盐酸盐产物。
实施例18十八烷基-D-丙氨酰-α-氰基甲基L-丙氨酸盐酸盐(BCH-1365)的合成
将三乙胺(0.317ml，2.28mmole)逐滴加入到无水四氢呋喃(60ml)中的BOC-D-丙氨酰L-谷胺酰氨的十八烷基酯(1g，1.75mmole)溶液中。在氩气流下将混合物搅拌几分钟，然后在二十分钟内加入三氟乙酐(0.32ml，2.28mmole)，在室温下将反应物静置18小时。旋转蒸发除去溶剂并将粗产物溶解在二氯甲烷(30ml)中。用0.5N盐酸(2×50ml)，5%碳酸氢钠(2×50ml)，盐水(2×50ml)萃取该溶液。然后用无水硫酸钠干燥有机相。在用2∶3乙酸乙酯/己烷作洗脱液的情况用快速硅胶色谱法提纯粗的十八烷基酯。得到0.66g，1.19mmole，产率68%的产物。用300MHzNMR光谱和TLC(Rf＝0.4乙酸乙酯/己烷3∶7)鉴定产物。该产物另外也可用在二氯甲烷/己烷中结晶提纯。通过用在实施例1中所述的方法在室温下将产物(180mg，0.326mmole)溶于无水乙醚中，接着将氯化氢气体鼓泡通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基，得到123mg，0.25mmole，77%产率的十八烷基-D-丙氨酰-α-氰基甲基-L-丙氨酸的盐酸盐。用NMR光谱，高分辨质谱和TLC(Rf＝0.48，乙酸乙酯/己烷3∶7)鉴定最终产物。
实施例19十八烷基-D-丙氨酰-ψ[CSNH]-α-氰基甲基L-丙氨酸盐酸盐(BCH-1375)的合成
在氩气流下将Lawesson试剂(235mg;0.58mmole)加入到在无水四氢呋喃(45ml)中的十八烷基-BOC-D-丙氨酰-α-氰基甲基-L-丙氨酸(320mg，0.58mmole)的溶液中。在回流下将反应物加热4小时。旋转蒸发除去溶剂并将粗产物溶解在二氯甲烷(45ml)中。用5%碳酸氢钠(3×50ml)，0.5N盐酸(2×50ml)和盐水(2×50ml)萃取反应物。然后用无水硫酸钠干燥有机相。在用3∶7乙酸乙酯/己烷作为洗脱液情况下用快速硅胶色谱法提纯粗物质。得到200mg，0.352mmole，61%产率的产物。用300MHzNMR光谱和TLC(Rf＝0.52，乙酸乙酯/己烷3∶7)鉴定该产物。
用实施例1所述的方法，在室温下将产物溶于无水乙醚中，接着将氯化氢气体鼓泡通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基，得到63mg，0.125mmole，88%产率的十八烷基-D-丙氨酰ψ[CSNH]-α-氰基甲基-L-丙氨酸的盐酸盐。用NMR光谱，高分辨质谱和TLC(Rf＝0.5710%V/V甲醇/乙酸乙酯)确定最终产物。
实施例20十八烷基-D-丙氨酰ψ[CSNH]L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1376)的合成
在完成Lawesson试剂和十八烷基-BOC-D-丙氨酰-α-氰基甲基-L-丙氨酸之间的反应过程中析出(60mg，0.1mmole)十八烷基-BOC-D丙氨酰ψ[CSNH]-L-谷氨酰胺。用NMR光谱和TLC(Rf＝0.28乙酸乙酯/己烷3∶2)确定这个化合物。用实施例1所述的方法，在室温下通过将该产物溶于无水乙醚中，接着将氯化氢气体鼓泡通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基得到33mg，0.063mmole，63%产率的十八烷基-D-丙氨酰ψ[CSNH]-L-谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱，高分辨质谱和TLC(Rf＝0.5420%V/V甲醇/乙酸乙酯)确定最终产物。另外，也可通过十八烷基-BOC-D-丙氨酰-ψ[CSNH]-α-氰基甲基-L-丙氨酸的氰基官能团的水解，接着脱去BOC保护基来制备BCH1376。
实施例21十八烷基-D-丙氨酰L-硫代谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1373)的合成
在氩气流下将Lawesson试剂(370mg，0.91mmole)加入到溶于无水1，2-二氯乙烷(55ml)中的十八烷基-BOC-D-丙氨酰-L-谷氨酰胺(500mg，0.87mmole)的溶液中。在回流下加热反应物2小时。旋转蒸发除去溶剂，并将粗产物溶于二氯乙烷(50ml)中。用5%碳酸氢钠(3×50ml)，0.5N盐酸(2×50ml)和盐水(2×50ml)萃取该溶液。然后用无水硫酸钠干燥有机相。在用2∶3乙酸乙酯/己烷作洗脱剂下通过快速硅胶色谱法提纯该粗物质。得到378mg，0.64mmole，75%产率的产物。用NMR光谱和TLC(Rf＝0.34乙酸乙酯/己烷2∶3)鉴定该产物。用实施例1所述的方法，在室温下通过将该产物溶于无水乙醚中，接着将氯化氢气体鼓泡通过该溶液10分钟除去BOC保护基，得到264mg，0.50mmole，79%产率的十八烷基-D-丙氨酰-L-硫代谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱，高分辨质谱和TLC(Rf＝0.2620%V/V甲醇/乙酸乙酯)确定最终产物。
实施例22空斑形成试验选择本发明的低聚肽免疫调节剂进行形成抗体细胞的免疫调节活性试验。用下面方法进行下面试验。
用悬浮于盐水中的0.1%(体积/体积)绵羊血红细胞抗原免疫调节剂进行系繁殖的CD1鼠。用0.5ml约2×107细胞的悬浮液腹膜内注射给该鼠。
此后该鼠立刻用本发明免疫调节剂悬浮液注射。该免疫调节剂的剂量为0.23ml的1mg/ml磷酸盐缓冲盐水中的悬浮液。注射剂量为10mg/Kg。第二次注射也是腹膜内注射。
在注射后5天将该鼠杀死。取血样分析免疫蛋白。用抗μ-辣根过氧化酶轭合物的酶免疫测定法进行上述测定。取出脾，并放到含2mlHank平衡盐溶液和10mMHepes缓冲液(HBSS-HEPES)的培养皿中。用镊子缓慢地将该脾粉碎，用棉透明薄纱过滤该细胞悬浮液从而除去细胞碎片。通过加入 HBSS-HEPES使过滤后的悬浮液体积为5ml，计数细胞，稀释该悬浮液至5×106细胞/ml最终浓度。
将2ml绵羊血红细胞溶液移到15ml的离心管中，通过离心分离10分钟(低速)用HBSS-HEPES洗涤三次。用HBSS-HEPES稀释最终沉淀物至1至8根据制造者的说明书(Cedarlane，Hornby，Ontario)在使用前重新构成豚鼠补体并用HBSS-HEPES稀释至1∶20。
通过制备含550μl补体(1/20)，77μl绵羊红血细胞(1/8稀释)溶液和33μl脾细胞(5×106/ml)溶液形成660μl总体积的混合物来进行上述测定。将200μl这种混合物放入由两块显微镜玻璃片形成的Cunningham 室中。用熔化的蜡和石油胶密封该玻片，在37℃下将该室(两份试样)温育45分钟。计数溶血的面积。溶血作用表现出形成抗体的细胞，也将其称为空斑形成细胞(PFC)。结果用PFC/106脾细胞表示。其结果归纳在表1中。
实施例23自然杀伤细胞活性准备三周龄的C57BL/6鼠并在处理前24-48小时对其进行检疫。将表2、3和4中所述5种低聚肽与0.4%羧甲基纤维素水溶液掺合。该溶液在使用前一直在4℃下存放。在其后的每一实验中用Ribavarin(1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-羧酰胺)作为对比。
用50mg/Kg/天剂量的一种试验化合物处理动物，在最终处理后24小时将这些动物杀死，取出其脾，每一个脾悬浮在RPMI-1640介质中并用消化腔(stomacher)(Tekmar，Cincinnati，OH)搅匀。用溶血溶解除去血红细胞。剩下的脾细胞用RPMI1640洗涤3次，并再悬浮于含20%牛胎血清的介质中，在用于自然杀伤(NK)和巨噬细胞机能测定及T和B细胞计算研究之前用Coulter计数器(Hialeah，FL)计数。
通过试验脾细胞在通常4小时铬释放测定对YAC-1肿瘤细胞的溶解能力来测定鼠细胞的自然杀伤(NK)活性，作为NK指示物的铬释放测定表示为%铬释放＝(试验的每分钟计数(cpm)-本底物cpm)/(最大cpm-本底物cpm)结果见下面的表3。
动物一般对所有试验的本发明的免疫调节剂有很好的耐药力。
从用BCH化合物治疗的鼠中取出的脾细胞的NK细胞活性归纳于表3中。只有BCH-527对这种活性表现出明显的刺激;在两个效应物靶细胞比率上可看到相似的影响。在试验中BCH-524和525边缘抑制了NK细胞活性。从BCH-527得到的刺激可与从两个其它免疫调节剂，即7-硫-8-氧代鸟苷和Aviron(ImuVert)得到的刺激相比。
实施例24巨噬细胞活性和T/B细胞测定用实施例22所述的方法得到有意义的鼠细胞。
利用鼠的胸腺细胞对植物凝血素(PHA)的响应进行白细胞介素-1(IL-1)测定来测出巨噬细胞机能，所说的响应取决于IL-1对其的反应性。
将以107细胞/ml浓度的鼠胸腺细胞悬浮在含有2%PHA，5%牛胎血清，0.05mM2-巯基乙醇/青霉素-链霉素的RPMI1640介质中。将总计100μl的这种悬浮液加入到含一系列用于测定IL-1的上清液稀释液的96井平底微量板的每一井中。在37℃下将这些细胞温育72小时。在温育的最后4小时内，这些细胞用[3H]胸苷(1μci/井)脉动。然后将这些细胞收获，并用直接计数器测定[H3]胸苷掺入量。
本发明免疫调节剂对巨噬细胞机能的影响参见表2。可用在治疗的鼠的脾细胞中的IL-1活性表示。在许多治疗组中出现了很大的变化。化合物BCH-523，524和527都有点刺激作用，而BCH-525和526具有适当的抑制作用。
用下面的方法计数脾细胞。对于B细胞计数，将分散的脾细胞与异硫氰酸荧光素标记的鼠单克隆抗体抗-Ly5反应，对于T细胞计数，将分散的脾细胞与藻红蛋白标记的单克隆抗体抗-Thy1.2反应。然后将标记的细胞用荧光激活细胞分类术(FACS)(EPICS-C，coultercorp.，Hialeah，FL)来计数。
用这些BCH化合物得到的脾T和B细胞计数数据表示于表4中。BCH-526和527显示出增加的%B细胞而抑制T细胞。BCH-524显示出对T和B细胞的抑制。
实施例25自然杀伤细胞和巨噬细胞活性从Simonsen试验室(GilroyCA)得到14-16g雌性和雄性Balb/c鼠。在使用前24小时对它们进行检疫，并保持在WayneLabBlox和自来水中。通过鼻内感染将流感病毒感染给被感染的鼠。从 Michigan 大学(Ann Arbor.MI)的Dr.K.W.Cochran得到流感A/NWS/33(H1N1)病毒。通过感染Madin Darby 犬肾(MDCK)细胞的会合单细胞层，并在37℃下在5%CO2中温育，当该病毒细胞致病作用是90-100%时的3-5天时收取这些细胞从而制备病毒库。将病毒原种装入安瓿并在-80℃下存放直到使用。感染后给这些鼠喝含0.006%羟四环素(Pfizer，New York，NY)的水从而控制可能的次级细菌感染。
将十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)悬浮在无菌0.4%羧甲基纤维素(CMC)溶液中，用于腹膜内(i.p.)注射给鼠。将十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)以200，100，和50mg/Kg/天剂量使用，在相应于病毒处理(分别注射＃1，＃2，＃3，＃4和＃5)的-1，+1，+3，+5和+7的这些天每天投药一次。
在每一药物剂量和正常对照下在第一次处理后的24小时测定5只鼠的脾内的自然杀伤细胞活性和巨噬细胞机能。用每一剂量治疗和用相似的病毒和正常对照数，在对5只感染过的和5只未感染过的鼠5种治疗后那天也可进行相似的测定。
按实施例23的描述，测定自然杀伤细胞活性。所用的脾细胞对肿瘤细胞的比是5∶1，25∶1，50∶1和100∶1。利用一种ELISA药盒(GenzymeCorp.，Cambridge，MA)对鼠的IL-1进行白细胞介素-1(IL-1)检测从而测出巨噬细胞机能。在20μg/ml的脂多糖中温育脾单核细胞24小时。除去上清液并用ELISA分析。
结果归纳在表5-6中可以观察到在感染的和未感染的鼠中的十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)的重要的免疫调节作用。如表5所示，在以100和50mg/Kg/天剂量用十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)4次注射后，一种很强的NK细胞活性尤其可在感染过的鼠中看到。
从表6可以看出，十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)也是一种有效的巨噬细胞活化剂。这尤其表现在4次治疗后。并在流感病毒感染过的动物中表现得更强。
实施例26抗病毒活性用鼠细胞肥大病毒(MCMV)(Smith品种)腹膜内感染SwissWebster雌性鼠(SimonsonLabs，Gilroy，CA)，该鼠在试验开始时重12克/只。将病毒预先滴定在鼠中并杀死80-90%的动物，尽管从一个试验到另一个试验死亡数有变化，但该病毒仅杀死55%的安慰剂的对照动物。相应于病毒治疗在-1，+1，+3，+5和+7天每天投药十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)一次。将BCH-527悬浮在无菌的0.4%羧甲基纤维素溶液中。以50mg/Kg到200mg/Kg的变化剂量腹膜内注射给动物。并在同时将0.4%的羧甲基纤维素投药给安慰剂的对比动物。
在病毒接种后24小时开始每天一次给予ganciclovir共给予5天。用腹膜内注射方法注射剂量为25mg/Kg的溶于生理盐水溶液的无菌溶液。
每天记录死亡情况共计21天，计算的平均天数考虑到死亡的鼠。通过从10%组织匀浆得到的病毒的滴定来得到组织病毒滴度。在96＃板中在C1271细胞中进行这些滴定(Smee，D.F.，A，CollettiH.A.Alaghamandan，和L.BAllen.1989。在用鼠细胞肥大病毒的抗病毒研究中进行连续的细胞株评价，Arch，Virol，107∶253-260)。用50%终点稀释方法进行病毒滴度计算(Reed，L.J.和M.Muench.1938。一种评估50%终点的简单方法。Am.J.Hyg.27∶493-498)。这些结果列在表7和8中。这些结果表明在三种剂量下的免疫调节剂十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)可避免死亡并降低在鼠中的MCMV组织病毒滴度。
毒性对照用上述相同方法相同时间处理由5只未感染鼠所组成的组。每天检查这些动物的存活情况。在最初处理之前和在最后处理后24小时测出它们的重量从而测出对重量增加的药剂影响。结果列于表9中。
统计分析用两种尾数分析法(tailed analyses)分析存活率(X2测定法用Yate校正)，死亡的平均天数(学生试验)和病毒滴度(学生试验)。
表1选择的免疫调节剂对抗SRBC抗原的抗体产生的影响，用空斑测定法和酶免疫测定法来测定试验选择的酶编号A免疫调节剂B空斑测定C免疫测定D1盐水(对比)467±93100%(100%)1BCH-5231186±323171%(254%)2盐水(对比)358±298100%(100%)2BCH-523877±220138%(245%)3盐水(对比)410±382100%(100%)3BCH-523826±291261%(201%)4盐水(对比)363±396100%(100%)4BCH-523682±246160%(188%)5盐水(对比)423±365100%(100%)5BCH-524245±9080%(58%)5BCH-526325±30082%(77%)6盐水(对比)565±280100%(100%)6BCH-5251073±234161%(190%)7盐水(对比)7±5100%(100%)7BCH-527479±322523%(6843%)
试验选择的酶编号A免疫调节剂B空斑测定C免疫测定D7BCH-523385±33465%(5500%)8盐水(对比)496±272100%(100%)8BCH-13151012±207202%(204%)8BCH-1316759±252186%(153%)9盐水504±407100%(100%)9BCH1317750±191189%(149%)9BCH1318613±166121%(122%)9BCH1325150±11060%(30%)10盐水794±394100%(100%)10BCH1325456±26167%(57%)11盐水187±139100%(100%)11BCH-276439±305160%(235%)
A试验表明了在不同鼠中观察到的BCH523的免疫调节剂的作用试验1和2，近亲交配C3H鼠试验3和4，远亲交配CD1和CF1鼠BBCH编号指的是选择的免疫调节剂，523;十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰胺524;γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸526;α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸525;十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺527;十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺1315;十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰氨基甘氨酸1316;L-丙氨酰D-异谷氨酰氨基十八烷基胺C PFC/106脾细胞。百分数指的是PFC相对于对比例(100%)的增加(降低)。
D百分分数指的是用吸光率测量时1gM抗体相对于对比例(100%)的增加(降低)。
用于评价免疫调节剂的每组小鼠的数量对于对比组是7只，对于治疗组是6只。
表5在正常的和流感病毒感染过的BALB/C鼠中腹膜内投药BCH-527的治疗对自然杀伤活性的影响
a在给出的效应物靶细胞比值下铬释放平均百分数(2标准误差)n＝5＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
表6在正常的和流感病毒感染过的BALB/C鼠中BCH-527对巨噬细胞活性a的影响
a以IL-1浓度表示，n＝5＊P＜0.05，＊＊P＜0.01.
表7BCH-527和ganciclovir在MCMV-感染的鼠中对死亡的影响
a在感染21天时或之前死亡的鼠＊P＜0.05，＊＊P＜0.01.
表8在3和6天后BCH-527和ganciclovir对组织中MCMV滴度的影响
1细胞培养感染剂量＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
表9BCH-527和ganciclovir对未感染鼠的死亡率和重量增加的影响
b在开始治疗时的初始重量和最终治疗后24小时的重量之间的差值。
权利要求
1.一种式(Ⅰ)的低聚肽免疫调节剂其中Z是C=O或C=S；Y是适于将烷基链连接到Z部分上的连接基；n是选自11至19的整数；HA(如果存在)是将与所述低聚肽形成生理上可接受的盐的有机或无机酸；和P是含有2至5个由酰胺或硫代酰胺键独立地连接的氨基酸的低聚肽部分，每个氨基酸独立地选自天然形成的、L-构型、D-构型或合成的氨基酸，其中所述的低聚肽部分不包括氨基和酸末端官能团。
2.根据权利要求1的免疫调节剂，其中Y选自-O-、-S-和-NH-。
3.根据权利要求1的免疫调节剂，其中每个氨基酸独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰氨、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、异谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、缬氨酸、氰甲基丙氨酸、噻唑烷-4-羧酸、硫代谷氨酰胺、硫代-α-谷氨酰胺和硫代-α-丙氨酸。
4.根据权利要求1的免疫调节剂，其中每个氨基酸独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、异谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、鸟氨酸和缬氨酸。
5.根据权利要求1的免疫调节剂，其中每个氨基酸独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、异谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和酪氨酸。
6.根据权利要求1至5之任一项的免疫调节剂，其中低聚肽部分P含有2至4个氨基酸。
7.根据权利要求1至5之任一项的免疫调节剂，其中低聚肽部分P含有2个氨基酸。
8.根据权利要求1至5之任一项的免疫调节剂，其中所述氨基酸由酰胺键连接。
9.一种式(Ⅱ)的低聚肽
其中p是选自零至4的整数;每个Z独立地是C＝O或C＝S;每个r独立地是选自零至2的整数;Y选自-O-、-S-或-NH-;n是选自11至19的整数;X是NH2、OH或OCH3;HA(如果存在)是将与所述的低聚肽形成生理上可接受的盐的有机或无机酸;和Q是支链或无支链的烷基、苯基、苄基、羟甲基或任何天然形成的氨基酸的侧链。
10.根据权利要求9的低聚肽免疫调节剂，其中Z是C＝O，Y是-O-或-NH-，n是17，X是NH2或OH。
11.根据权利要求9的一种结构式(Ⅲ)的低聚肽免疫调节剂
其中p是选自零至4的整数;每个Z独立地是C＝O或C＝S;r是选自零至2的整数;Y选自-O-、-S-或-NH-;n是选自11至19的整数;X是NH2、OH或OCH3;HA(如果存在)是将与所述的低聚肽形成生理上可接受的盐的有机或无机酸;和Q是C1-C4支链或无支链的烷基、苯基、苄基、羟甲基或任何天然形成的氨基酸的侧链。
12.根据权利要求11的低聚肽免疫调节剂，其中Z是C＝O，Y是-O-或-NH-，X是NH2或OH，n是17。
13.根据权利要求9的一种结构式(Ⅳ)的低聚肽免疫调节剂
其中Y选自-O-、-S-或-NH-;n是选自11至19的整数;X是NH2、OH或OCH3;HA(如果存在)是将与所述的低聚肽形成生理上可接受的盐的有机或无机酸;和Q是C1-C4支链或无支链的烷基、苯基、苄基、羟甲基或任何天然形成的氨基酸的侧链。
14.根据权利要求13的低聚肽免疫调节剂，其中n是17，X是NH2，Y是-O-。
15.根据权利要求11的免疫调节剂，其中r是1。
16.根据权利要求11的免疫调节剂，其中所述的免疫调节剂选自十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰胺、γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸、十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺、α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸、十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基L-苯基甘氨酰D-谷氨酰胺、十八烷基D-缬氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-丝氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-苯基甘氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-谷氨酸L-谷氨酰胺、十八烷基D-鸟氨酰L-谷氨酸、十八烷基L-酪氨酰甘氨酰甘氨酸、十八烷基-D-丙氨酰-α-氰甲基L-丙氨酸、十八烷基-D-丙氨酰-ψ[CSNH]-α氰甲基L-丙氨酸、十八烷基-D-丙氨酰-ψ[CSNH]L-谷氨酰胺、十八烷基-D-丙氨酰L-硫代谷氨酰胺，及其任何药物上可接受的酸加成盐。
17.一种药物组合物含有产生免疫调节活性的有效量的至少一种根据权利要求1至5之任一项的化合物和药物上可接受的媒介物。
18.一种药物组合物含有产生免疫调节活性的有效量的至少一种根据权利要求6的化合物和药物上可接受的媒介物。
19.一种药物组合物含有产生免疫调节活性的有效量的至少一种根据权利要求8的化合物和药物上可接受的媒介物。
20.一种药物组合物含有产生免疫调节活性的有效量的至少一种根据权利要求9至16之任一项的化合物和药物上可接受的媒介物。
21.根据权利要求17的药物组合物还含有抗病毒、抗微生物或抗癌化合物。
22.根据权利要求18的药物组合物还含有抗病毒、抗微生物或抗癌化合物。
23.根据权利要求19的药物组合物还含有抗病毒、抗微生物或抗癌化合物。
24.根据权利要求20的药物组合物还含有抗病毒、抗微生物或抗癌化合物。
25.根据权利要求21至24之任一项的药物组合物，其中所述的抗病毒化合物选自无环鸟苷、gancyclovir、三氮唑核苷、金刚胺(amantidine)、叠氮胸苷、磷甲酸盐(foscarnet)、2′-去氧-3′-噻胞苷(2′-deoxy-3′-thiacytidine)(3TC)、2′3′-二去氧胞苷(ddC)、2′3′-二去氧肌苷(ddI)、2′3′-二去氧腺苷(ddA)、5′-碘去氧尿苷和Carbovir。
26.一种治疗或预防哺乳动物的病毒感染的方法，包括投药抗病毒剂量的根据权利要求18、19、21、22、23和24之任何一项的药物组合物的步骤。
27.一种治疗或预防哺乳动物的病毒感染的方法，包括投药抗病毒剂量的根据权利要求25的药物组合物的步骤。
28.一种治疗或预防哺乳动物的病毒感染的方法，包括投药抗病毒剂量的根据权利要求17的药物组合物的步骤。
29.一种治疗或预防哺乳动物的病毒感染的方法，包括投药抗病毒剂量的根据权利要求20的药物组合物的步骤。
30.根据权利要求26的方法，其中所述的病毒感染选自CMV和流行性感冒感染。
31.根据权利要求27至29之任一项的方法，其中所述的病毒感染选自CMV和流行性感冒感染。
32.根据权利要求26的方法，其中所述的免疫调节剂是十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH 527)。
33.根据权利要求27至29之任一项的方法，其中所述的免疫调节剂是十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH 527)。
34.一种制备式(Ⅰ)的低聚肽免疫调节剂的方法其中Z是C＝O或C＝S;Y是适于将烷基链连接到Z部分上的连接基;n是选自11至19的整数;HA(如果存在)是将与所述低聚肽形成可接受的盐的有机或无机酸;和P是含有2至5个由酰胺或硫代酰胺键独立地连接的氨基酸的低聚肽部分;所述的氨基酸独立地选自天然形成的、L-构型、D-构型或合成的氨基酸;其中所述的低聚肽部分隔断氨基和羧酸末端官能团;该方法包括步骤a)式(Ⅴ)化合物其中W是可接受的脱离基团;和P′含有1至5个由酰胺或硫代酰胺键独立地连接的氨基酸，所述的氨基酸独立地选自天然形成的、L-构型、D-构型或合成的氨基酸，其中P′隔断氨基和酸末端官能团;与下式化合物偶合其中，n是选自11至19的整数;生成式(Ⅵ)的亲油低聚肽其中P′、Z、Y或n如上定义;和b)如果需要，通过它们各自的H2N-氨基和Z-W末端官能团使式(Ⅵ)与式(Ⅴ)的另一种化合物进一步偶合，得到式(Ⅰ)的低聚肽免疫调节剂。
35.根据权利要求34的方法，其中W独立地选自OH、卤素、O-琥珀酰胺、三唑、咪唑和S(E)，其中E是C1-6烷基。
36.根据权利要求35的方法，其中W是OH。
37.根据权利要求34至36之任一项的方法，其中Y选自-O-、-S-和-NH-。
38.根据权利要求34至36之任一项的方法，其中所述方法在偶合剂存在下进行。
39.根据权利要求37的方法，其中所述方法在偶合剂存在下进行。
40.根据权利要求38的方法，其中式(Ⅴ)或(Ⅵ)化合物的活性官能基团在加入所述的偶合剂之前先化学保护。
41.根据权利要求39的方法，其中式(Ⅴ)或(Ⅵ)化合物的活性官能基团在加入所述的偶合剂之前先化学保护。
42.根据权利要求34的方法，其中所述的低聚肽部分P含有2至4个氨基酸。
43.根据权利要求34的方法，其中P′的每个氨基酸独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰氨、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、异谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、缬氨酸、氰甲基丙氨酸、硫代谷氨酰胺、硫代-α-谷氨酰胺和硫代-α-丙氨酸。
44.根据权利要求30的方法，其中所述的免疫调节剂是十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH 527)。
45.根据权利要求31的方法，其中所述的免疫调节剂是十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH 527)。
全文摘要
本发明公开了新的、小的和结构简单的免疫调节低聚肽。本发明的低聚肽具有一个长的亲油烷基链。这些免疫调节低聚肽在治疗人和动物的疾病中可与抗病毒或抗癌试剂结合使用。还公开了免疫调节化学药品的合成方法。
文档编号C07K5/06GK1083073SQ9310573
公开日1994年3月2日 申请日期1993年4月3日 优先权日1992年4月3日
发明者C·彭尼, B·泽卡里尔 申请人:生物化学药物有限公司
本申请是1992年7月21日申请的顺序号为07/917464的申请的部分继续申请，顺序号为07/917464的申请是目前已放弃的1992年4月3日申请的顺序号为07/862694的申请的部分继续申请。
本发明涉及免疫调节低聚肽，其可调节机体的免疫系统对侵入的外来物质和微生物或恶性细胞的反应。
更确切地说，本发明是关于胞壁酰基二肽的亲油脱胞壁酰基型肽类似物和具有亲油烷基链的类似的低聚肽。
脊椎动物的免疫系统是用来保护机体免受寄生虫的侵袭。这些病原体包括非细胞病毒和细胞寄生虫，例如细菌、菌质、真菌、单细胞原生动物和多细胞原生动物。其免疫系统也使有机体防御癌细胞。
免疫系统的调节和细协调是医学治疗的目的，在医疗状态的治疗或预防中也经常被称作免疫系统的刺激或抑制。免疫系统的调节是用化学药品来实现，例如用由天然原料如糖蛋白合成的有机物、生物制剂或大分子化合物。
因此，免疫调节剂对防治传染性疾病提供了一种有效方法。这些化学药品以非特异性方式调节(刺激或抑制)免疫系统。免疫性的刺激在宿主防御癌的方面也是重要的，后一种情况是例如根据对免疫调节剂反应的肿瘤巨噬细胞的活化来进行的。免疫调节剂也可用来治疗免疫系统紊乱如关节炎引起的疾病，它们也可以用于治疗具有损伤的免疫系统的个体以提高它们的免疫反应。这类病人包括外科病人、烧伤受害者、经受放射治疗或化学治疗的病人和具有免疫紊乱如AIDS的病人。
通常，这些免疫损伤病人可能会受到病毒感染如细胞肥大病毒(CMV)、流行性感冒、带状疱疹、单纯性疱疹、呼吸合胞体病毒(RSV)和潜在肝炎的损害。免疫调节剂可用于刺激免疫系统并有助于阻止病毒的传染，免疫调节剂也可用作预防这种传染的预防剂。
免疫系统的非特异性刺激也发现可兽医应用，正如，例如，用粗的分枝杆菌细胞壁制剂来治疗马的呼吸疾病所证明的那样。
一些免疫调节剂在现有技术中是已知的。例如，弗罗因德完全辅药(Freund′sCompleteAdjuvant)(一种杀伤的结核杆菌的油包水乳状液)是一种公知的可提高体液和细胞免疫反应的免疫调节剂。其性质已有许多资料证明，例如，J.Freund，Adv.Tuberc.Res.，7，130，1956。然而，该制剂是有毒的，以致它目前在人体中应用是被禁止的，并且它在动物中的应用也受到限制。胞壁酰二肽(MDP;N-酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺)是最小的化学结构，其可以置换存在于弗罗因德辅药中的分枝杆菌细胞，而仍能保持免疫调节活性。MDP是细菌细胞壁的肽葡聚糖结构的部分，它是一种独特的刚性聚合物，该聚合物在细菌周围形成了一个网。MDP具有许多免疫活性，例如，它是巨噬细胞活化剂和B-细胞促细胞分裂剂。因此，MDP作为免疫调节剂具有显著的活性，MDP增加了对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、真菌寄生虫、病毒和肿瘤的免疫保护机理。MDP也在兔子中产生眼色素层炎(眼内的炎症)。通过皮下应用MDP在鼠中也可产生关节炎(一种自体免疫反应)，胞壁酰二肽也增加体液对许多菌苗的反应。然而，MDP象弗罗因德辅药一样是有毒的。E.lederer在JournalofMedicinalChemistry，23，819，1980中指出MDP的毒性效应包括致热性、暂时白细胞减少、血小板溶解和对内毒素致敏感作用。
多年来，为了制备高活性和低毒性的免疫调节剂已经合成和评价了许多MDP类似物。以前认为MDP分子的糖类部分对显著的免疫调节活性是必要的，然而，如果糖类部分通过加入更多的氨基酸而取代或者被可与受体分子相互作用的另一种分子本体取代，则该糖类部分可以除去。在生物系统中的这种受体将是结合小分子如MDP或这种小分子的一部分的任何大分子化合物。由于结合了小分子，大分子将经受结构变化，这将导致信号传递。
例如，一种已知的化合物十二烷酰四肽取代N-乙酰基胞壁酸糖类，在这个取代过程中除了12个碳原子链外2个附加的氨基酸被加到现有的两个碳原子上。FK156加上了两个附加氨基酸和乳酸，“TRIGLYMYC”加上了三个附加氨基酸、甘油和霉菌酸。MDP的金刚烷类似物是用抗病毒剂金刚烷胺取代糖类。
然而，当使用这些类似物时，遇到了一些问题。例如它们必须与油一起给药，以便有效的刺激免疫系统的细胞免疫组分。一些已知的MDP类似物引入了一个长烷基链以使其具有亲油性。重要的脱胞壁酰肽含有亲油部分。这些部分，例如在十二烷酰四肽、FK156和“TRIGLYMYC”中发现的那些部分是复杂的并具有不同程度的毒性。
近来，已经合成了几种不太复杂的MDP类似物。例如，L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺金刚烷基酰胺和D，L-(2-金刚烷基)甘氨酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺是由抗病毒化学品金刚烷得到的结构简单的化合物。然而，它们不适合作为免疫调节化学药品，因为金刚烷和由其得到的药引起中枢神经系统副作用和充血性心力衰竭。
因此，现在需要具有显著免疫调节活性的化合物，该化合物是容易使用的，并具有比MDP的已知类似物更低的毒性。
本发明涉及具有免疫调节活性的新的MDP的亲油脱胞壁酰型肽类似物和带有亲油烷基链的类似的低聚肽。因此，根据本发明的一个方面，提供了由共价连接到一个长烷基链上的低聚肽组成的小的结构简单的分子。
我们意外地发现，当长烷基链共价连接到MDP的二肽部分上或本发明分子的低聚肽部分上时，该长烷基链提高了免疫调节剂的活性。该连接可用酯或酰胺键来完成;酯键是指任何硫酯键和酯键;酰胺键是指任何硫代酰胺键和酰胺键。
本发明的类似物不用任何抗病毒剂取代N-乙酰基胞壁酸糖类，也不用在体内反应中可与受体特异性结合的任何小分子取代N-乙酰基胞壁酸糖类，因此，这些类似物在化学上是不复杂的，并容易合成。取代胞壁酸的结构简单的分子可用硬脂酸构成。硬脂酸、十八烷醇或其它合适的长烷基链衍生物对人类都是无毒的，例如，十八烷醇具有的口服LD50大于15g/Kg。
因此，本发明提供一种通式(Ⅰ)的低聚肽免疫调节剂
其中Z是C＝O或C＝S;
Y是适于将烷基链连接到Z部分上的连接基，优选-O-，-S-，或-NH-;和n是选自11至19的整数。
HA(如果存在)是与肽形成生理上可接受的盐的有机或无机酸，例如氢氯酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、柠檬酸、或甲磺酸。
P是由酰胺或硫代酰胺键独立地连接的含有2至5个氨基酸的低聚肽部分。P被称作低聚肽部分，是因为它不包括它的氨基和酸(羧酸或硫代羧酸)末端官能团。构成P的氨基酸独立地选自天然形成的L-构型或D-构型的氨基酸或合成的氨基酸。
天然形成的氨基酸是指以其L或D-构型的任何氨基酸，不管其是否用于蛋白质的形成。这些氨基酸可以，例如，选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异谷氨酰胺或鸟氨酸。
在不限制本发明范围的情况下，合成氨基酸的实例可以包括氰甲基丙氨酸和噻唑烷-4-羧酸。
本发明还设法提供通式(Ⅱ)的含有共价连接到低聚肽的羧基末端的长烷基链的MDP类似物，优选二肽免疫调节剂。
其中P是零至4;
每个Z独立地是C＝O或C＝S;
每个r独立地是零至2;
Y是适于将烷基链连接到Z部分上的连接基，优选-O-，-S-或-NH-;
n是选自11至19的整数;和X是NH2，OH或OCH3。
HA(如果存在)是将与肽形成生理上可接受的盐的有机或无机酸，例如氢氯酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、柠檬酸或甲磺酸。
Q是C1-C4支链或无支链的烷基、苯基、苄基、羟甲基或天然形成的氨基酸的侧链。
式(Ⅱ)的一具体的实例是通式(Ⅲ)的二肽免疫调节剂
其中HA、Q、P、Z、r、Y、n和X如上述定义。式(Ⅱ)的优选具体实例是十八烷基L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺盐酸盐(BCH-523)和十八烷基D-丙氨酰-L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-527)。
在式(Ⅱ)的另一个具体实例中，MDP的亲油脱胞壁酰二肽类似物可由通式(Ⅳ)表示
其中HA、n、X和Y如上所定义。式(Ⅳ)中的两个氨基酸残基是手性的。如在MDP中所看到的那样，优选的是采用L-构型的丙氨酸残基和采用D-构型的第二残基(例如，异谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸等)。这不排除该手性的转变，例如，丙氨酸残基采用D-构型，第二氨基酸采用L-构型。然而，这两个氨基酸在α碳上不应具有相同的手性。本专业熟练技术人员应知道，其中两个丙氨酸和异谷氨酰胺氨基酸都具有D-构型的MDP类似物不是免疫调节剂。
本发明优选的低聚肽免疫调节剂是十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰胺、γ-十八烷基L-丙氨酸D-谷氨酸、十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺、α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸、十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基L-苯基甘氨酰D-谷氨酰胺、十八烷基D-缬氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-丝氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-苯基甘氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-谷氨酸L-谷氨酰胺、十八烷基D-鸟氨酰L-谷氨酸、十八烷基L-酪氨酰甘氨酰甘氨酸及其任何药物上可接受的酸加成盐。
通常，本发明的类似物的合成是两步进行的。第一步是得到所需的低聚肽。肽常可从商业供应者得到，另外，所需的低聚肽可用任何常规方法合成，例如，如本专业所公知的，通过在偶合剂如2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)存在下使氨基酸反应而合成。
第二步是长烷基链前体，如十八烷醇或十八烷基胺，与制得的低聚肽反应，该方法用于合成实施例1中的BCH-523。
优选的是，本发明的类似物可通过长烷基链前体与单氨基酸或低聚肽偶合，然后与一个或多个其它的氨基酸偶合以生成所需的低聚肽免疫调节剂而合成。该方法用于合成实施例2中的BCH-525。
在这两种情况下，式(Ⅰ)的低聚肽免疫调节剂可制备如下a)式(Ⅴ)的化合物其中Z是C＝O或C＝S;
W是可接受的脱离基，如OH、卤素、O-琥珀酰亚胺、三唑、咪唑或S(E)，其中E是C1-6烷基;和P′含有由酰胺或硫代酰胺链独立地连接的1至5个氨基酸;该P′不包括氨基和酸末端官能团，该氨基酸独立地选自天然形成的、L-构型、D-构型或合成的氨基酸;
与下式化合物偶合，
其中n是选自11至19的整数，Y是将长烷基链前体与氨基酸或低聚肽连接的合适的连接基(Y优选为-O-、-S-、或-NH-);
生成式(Ⅵ)的亲油低聚肽其中P′、Z、Y和n如上定义;和b)如果需要，式(Ⅵ)的亲油低聚肽的氨基末端官能团(H2N-)与式(Ⅴ)的另一化合物的羧基或硫代羧基末端官能团(-Z-W)进一步偶合，得到式(Ⅰ)的所需低聚肽免疫调节剂。
优选的是，氨基酸或低聚肽与烷基链前体之间的偶合是在偶合剂存在下进行。烷基链连接的一种优选方法使用了羰基二咪唑。其它合适的偶合剂包括碳化二亚胺，如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。
在本发明的类似物的制备过程中，可以暂时地保护反应的官能团，例如，丙氨酰二肽(Ⅳ)的氨基末端可用氨基甲酸乙酯型基团保护，而羧基末端可用酯基团(例如，当X是-OH时的苄酯)保护。适合的保护-去保护条件和方法已在合成文献中叙述，并且对本专业熟练的化学工作者来说是公知的。
本发明的类似物在其合成期间和/或在其制备之后用熟练工人所公知的标准方法提纯。一种优选的提纯方法是硅胶色谱法，特别是可以使用快速色谱法。然而其它的色谱法，包括HPLC，也可用于产物类似物的提纯。由于可以用适合的有机溶剂洗涤的方法，所以也可用结晶法来提纯产物。
本发明的低聚肽在生理环境中通常具有有限的溶解性，例如在生理(0.9%)盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。因此，例如，通常观察到在式Ⅱ中(如在异谷氨酰胺，谷氨酰胺中)当X是-NH2时，溶解性是有限的，通常小于0.01mg/ml。如果类似物在含水介质中是不溶的，则它们应能够形成具有粒径在约150μm-1mm(18目-100目)的微粒，从而形成均匀稳定的悬浮液。一种优选的制剂使用60目微粒或直径约250μm的颗粒的含水悬浮液。
本发明也涉及治疗或预防哺乳动物中病毒感染的方法。哺乳动物是指包括人的任何一类高级脊椎动物。在不限制本发明范围的情况下，病毒感染可选自细胞肥大病毒(CMV)、流行性感冒、带状疱疹、单纯性疱疹、呼吸合胞体病毒(RSV)和肝炎。
上述结构式所述的本发明的类似物可用类似于配制其它药物肽组合物所用的那些方法来配制。因此，该类似物可以冷冻干燥的形式贮存，或作为干燥粉末，并在投药之前在生理上可接受的媒介物中再构成以形成悬浮液或溶液。另外，该类似物可贮存在治疗媒介物中。优选的媒介物是无菌溶液，特别是无菌缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。媒介物可含有保存剂或可用于改善该混合物的搁置稳定性或效力的其它已知添加剂，该保存剂包括，例如乙基汞硫代水杨酸钠或苯氧基乙醇。
为了用于治疗，虽然本发明的低聚肽可以以原化学药品的形式投药，但最好是以存在活性组分的药物制剂的形式投药。
因此，本发明还提供了一种含有结构式(Ⅰ)-(Ⅳ)的低聚肽或其药物可接受的酸加成盐以及一种或多种药物上可接受的媒介物和任意的其它治疗和/或预防组分的药物制剂。媒介物必须在可与制剂的其他组分配伍的意义上是“可接受的”，并对其接受者是无害的。
药物制剂包括适于口服、直肠投药、鼻内投药、局部(包括颊和舌下)投药、阴道或肠胃外(包括肌肉、皮下、静脉内和腹膜内)投药的那些制剂或者以适于用吸入法或吹入法投药的形式的那些制剂。该制剂可适当地以分散的剂量单位形式方便地提供，并且可以用药学专业公知的任何方法配制。所有的方法都包括步骤将活性化合物与液体媒介物或细分散的固体媒介物或这两种媒介物结合，然后，如果需要，将产物成形为所需的制剂。
当需要时，可以使用适于持续释放活性组分的上述制剂。
本发明的免疫调节剂可与其他药物活性治疗试剂结合使用。这样的结合可以是协同的，或者这些结合的试剂可同时影响许多问题。在没必要限制本发明的范围的情况下，设想几个实施例。
一个实例含有本发明的免疫调节剂和抗癌化合物，例如抗代谢物、插入剂(intercalatingagents)、有丝分裂抑制剂、烷基化剂或其他细胞毒素抑制剂如二氨二氯络铂。
本发明的免疫调节剂也可与抗毒素单克隆或多克隆抗体，或细胞毒素细胞如尤其是淋巴细胞活素活化的杀伤细胞或肿瘤浸润淋巴细胞一起使用。
本发明的免疫调节剂也可与抗病毒试剂一起投药。某些抗病毒化学药品可与本发明的免疫调节剂很好的作用，这些抗病毒化学药品可选自这样的试剂如无环鸟苷、ganciclovir、三氮唑核苷、金刚胺(amantidine)、叠氮胸苷、磷甲酸盐(foscarnet)、2′-去氧-3′-噻胞苷(2′-deoxy-3′-thiacytidine)(3TC)、2′3′-二去氧胞苷(ddC)、2′3′-二去氧肌苷(ddI)、2′3′-二去氧腺苷(ddA)、5′-碘去氧尿苷和carbovir。可以想象到，其他适合的抗病毒化学药品可与本发明的免疫调节剂结合使用。这些抗病毒化学药品对本专业熟练的化学工作者来说是已知的。可以想象到，这些抗病毒试剂可与本发明的免疫调节剂结合用于治疗AIDS、肝炎、CMV和其他病毒疾病。
另外，本发明的免疫调节剂也可与抗细菌抗生素、抗真菌药、抗原生动物药或其他抗微生物剂结合使用。
对哺乳动物优选的剂量为0.1-1000mg/Kg体重的本发明类似物化学药品，类似物的更优选的量为10-500mg/Kg体重。该剂量将取决于接受化合物的宿主以及宿主的大小、重量和年龄。
本发明的免疫调节剂是用4种不同方法测验。第一种方法例详细说明于实施例22和表1中。该方法包括使用鼠的脾细胞进行空斑形成测定，该鼠用绵羊红血细胞攻击并注射本发明的免疫调节剂。然后将获得的脾细胞在坎宁安(Cunningham)室中与新鲜绵羊红血细胞和豚鼠补体一起温育。当它们表现出空斑形成细胞时，计算血细胞溶解的面积。表Ⅰ显示了某些本发明的低聚肽的选择实例的免疫调节活性的结果。
已经发现本发明的下列低聚肽是免疫刺激剂十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰胺(BCH-523);十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺(BCH-525);十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527);十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰基甘氨酸(BCH-1315);L-丙氨酰D-异谷氨酰基十八烷胺(BCH-1316);和十八烷基L-酪氨酰甘氨酰甘氨酸(BCH-276)。
发现本发明的下列低聚肽的免疫抑制剂十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-524和BCH-526)和十八烷基D-鸟氨酰L-谷氨酸(BCH-1325)。
测验本发明的免疫调节剂的第二种方法详细叙述于实施例23和24中。将鼠投药50mg/Kg剂量的本发明的免疫调节剂，然后鼠死亡，取出脾并分离出脾细胞，对最终治疗后放置24小时的脾细胞进行免疫测定。使这些细胞进行巨噬细胞和自然杀伤细胞功能试验，也计算脾细胞B和T细胞。总的概括如下。
下列免疫调节剂引起巨噬细胞刺激十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰胺(BCH-523);γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-524);和十八烷基D-丙氨酰-L谷氨酰胺(BCH-527)。十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺(BCH-525)和α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-526)引起适度的巨噬细胞抑制。自然杀伤(NK)细胞活性受到十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)的刺激。γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-524)和十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺(BCH-525)产生边缘自然杀伤细胞的抑制。
γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-524)抑制B和T细胞。α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸(BCH-526)和十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)增加B细胞数量并抑制T细胞数量。
第三种方法举例详细说明于实施例25和表5-6中。该方法非常类似于第二种方法。测定自然杀伤细胞(NK)的活性，并进行巨噬细胞机能测验，在这种情况下，在投药之前用流行性感冒A/NWS/33感染一部分鼠，投药的剂量为0-200mg/Kg的本发明的免疫调节剂。十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺(BCH-527)引起巨噬细胞刺激并刺激自然杀伤细胞活性。
第四种方法举例详细说明于实施例26和表7-8-9中。该方法包括用本发明的免疫调节剂对鼠预防治疗，后来用CMV攻击。观察死亡率并计算不同器官的病毒滴度。发现十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)由于可防止死亡和降低组织病毒滴度而具有预防活性。
实施例1十八烷基L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺盐酸盐(BCH-523)的合成
将1.1g，7mmole羰基二咪唑加入到溶于50ml无水四氢呋喃的BOCL-丙氨酰D-异谷氨酰胺(1.9g，6mmole游离酸)中，在氩气流下搅拌，在室温下将该溶液搅拌45分钟，然后继续在氩气流下加入十八烷醇(2.0g，7.2mmole)。在室温和氩气下搅拌反应物20小时。用旋转式蒸发法除去溶剂得到4.9g粗产物。将该固体溶于50ml氯仿中，并用0.5N盐酸(3×40ml)、5%碳酸氢钠(2×50ml)和水(50ml)萃取溶液。然后，有机相用无水硫酸钠干燥，除去溶剂得到2.7g固体。用快速硅胶色谱法从该固体提纯BOCL-丙氨酰D-异谷氨酰胺的十八烷基酯，色谱柱分别用1∶1己烷/二氯甲烷、二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇(1%，5%和最终10%V/V的后一种溶剂)洗脱。产物的收率1.2g。用300MHzNMR光谱测定法和TLC鉴定产物。通过将产物溶解于二氯甲烷中，然后在室温下吹入氯化氢气体通过该溶液10分钟来除去BOC保护基团。将该混浊溶液在4℃下放置2小时，然后过滤，真空干燥该固体化学药品。十八烷基D-丙氨酰L-异谷氨酰胺的白色盐酸盐的收率为1.0g，这样由BOC二肽反应物得到33%的收率。最终产物用300MHzNMR谱法和TLC(对碘和茚三酮呈阳性)证实。最终产物可用丙酮和/或乙醚洗涤。
实施例2十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-525)的合成
使用实施例1所述的合成方法，在有羰基二咪唑的存在下，通过十八醇(5.8g，22mmole)与BOCD-谷氨酰胺(4.4g，18mmole)酯化制备BOCD-谷胺酰氨的十八烷基酯(3.5g)。如实施例1所述，在室温下将产物在二氯甲烷中加溶，接着用氯化氢鼓泡通过该溶液10分钟从而脱除BOC保护基，得到2.7g十八烷基D-谷氨酰胺的盐酸盐。
向悬浮于75ml氯仿中的十八烷基D-谷氨酰胺的盐酸盐(2.2g，5mmole)中加入三乙胺(0.8ml，5.8mmole)，并在室温下将其搅拌几分钟，然后向该反应混合物中加入BOCL-丙氨酸(1.0g，5.5mmole)和2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ;1.6g，6.5mmole)。在室温下该反应物搅拌18小时，然后用冷的0.5N盐酸(3×75ml)，5%碳酸氢钠(2×75ml)和水(75ml)萃取。然后用无水硫酸钠干燥有机相。除去溶剂得到2.3g固体。用快速硅胶色谱法从该固体中提纯BOC-L丙氨酰D-谷氨酰胺的十八烷基酯。用1∶1己烷/乙酸乙酯，3∶1乙酸乙酯/己烷，乙酸乙酯，和乙酸乙酯/甲醇(10%V/V的后一种溶剂)洗脱该色谱柱。得到1.9g产物。该产物用300MHzNMR光谱和TLC鉴定。该产物另外也能用在二氯甲烷/乙醚中结晶来提纯。在室温下将产物在二氯甲烷中加溶(为除去少量的不溶物质过滤是必要的)接着用氯化氢鼓泡通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基。在4℃下将该混浊溶液存放2小时，过滤，在真空中干燥该固体。得到1.4g白色的十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺的盐酸盐。用300MHzNMR光谱法和TLC确定最终产物。
实施例3十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-527)的合成
用实施例2所述的方法，按同一比例合成十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺的盐酸盐(1.6g)。产物的NMR和TLC和实施例2的产物是一样的。
实施例4α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸盐酸盐(BCH-526)的合成
用实施例1所述的合成方法，在有羰基二咪唑的存在下通过十八烷醇(4.4g，16.2mmole)与γ-苄基BOCD-谷氨酸(4.6g，13.5mmole)酯化制备γ-苄基BOCD-谷氨酸的十八烷基酯(7.2g)。在室温下将产物在乙醚中加溶，接着将氯化氢大面积鼓泡通过该溶液3次每次10分钟，从而除去BOC保护基。在4℃下存放没有得到沉淀物，用旋转式蒸发法除去大部分溶剂，提浓物用己烷稀释，再次在4℃下存放2小时，过滤收集沉淀产物。得到5.2gγ-苄基D-谷氨酸的十八烷基酯的盐酸盐。
将三乙胺(1.2ml，8.7mmole)加入到溶于75ml氯仿中的γ-苄基D-谷氨酸的十八烷基酯的盐酸盐(3.9g，7.5mmole)中，在室温下搅拌该混合物几分钟。然后加入BOCL-谷氨酸(1.6g，8.3mmole)和EEDQ(2.4g，9.8mmole)到该反应物中。在室温下搅拌该反应物18小时，完成实施例2所述的步骤，从而得到不用硅胶色谱提纯就可使用的粗产物(4.9g)如上所述，将1.5g部分粗产物在二氯甲烷中加溶并用氯化氢气体大面积鼓泡，从而除去BOC保护基，得到1.3gL-丙氨酰D-谷氨酸的十八烷基γ-苄基酯的粘性固体。将该固体溶于75ml乙醇中并在氢气氛下，在有300mg10%钯/碳催化剂存在下，在室温下将其搅拌隔夜。过滤除去催化剂，用旋转式蒸发法除去溶剂，在乙醚中研制残余物，得到1.0g粗二肽。在乙腈中结晶得到630mg十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸的盐酸盐。用NMR光谱和TLC确定最终产物。
实施例5γ-十八烷基L丙氨酰D-谷氨酸盐酸盐(BCH-524)的合成
用实施例1所述的合成方法，在有羰基二咪唑的存在下，通过十八烷醇(1.5g，5.4mmole)与BOCL-丙氨酰D-谷氨酸的α-苄基酯(1.8g，4.5mmole)酯化，制备α-苄基BOCL-丙氨酰D-谷氨酸的十八烷基酯(875mg)。
用实施例4所述的方法，氢解除去苄基酯保护基，从而得到320mgBOCL-丙氨酰D-谷氨酸的γ-十八烷基酯。如实施例1所述在室温下将产物溶于二氯甲烷中，接着用氯化氢气鼓泡通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基，得到140mgγ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸的盐酸盐。用NMR光谱和TLC确定最终产物。
实施例6十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰基γ-甘氨酸盐酸盐(BCH-1315)的合成
将羰基二咪唑(583mg，3.6mmole)加入到溶于60ml无水四氢呋喃中的BOCL-丙氨酰D-异谷氨酰胺(955mg，3mmole的游离酸)中，并在氩气流下搅拌。将该溶液在室温下搅拌45分钟，然后在氩气流下将悬浮于无水四氢呋喃(40ml)和三乙胺(0.5ml)中的十八烷基甘氨酸盐酸盐(1.2g，3.3mmole)加入到反应物中。
用甲磺酸催化酯化甘氨酸与十八烷醇来制备十八烷基甘氨酸盐酸盐。在室温下在氩气下将该悬浮液搅拌20小时。如上述实施例1所述，用旋转式蒸发法除去溶剂，将粗产物收集在二氯甲烷中并萃取。通过在温的二氯甲烷中结晶来提纯BOCL-丙氨酰D-异谷氨酰基γ-甘氨酸的十八烷基酯得到690mg灰白色固体产物。如实施例1所述，通过与氯化氢气体反应除去BOC保护基。然而，在4℃下存放后没有沉淀物形成，因此，用旋转式蒸发法除去二氯甲烷，将乙醚加入到提浓物中。过滤接着用乙醚洗涤固体，得到450mg十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰基γ-甘氨酸的盐酸盐并用NMR光谱和TLC确定。
实施例7L-丙氨酰D-异谷氨酰基十八烷基胺盐酸盐(BCH-1316)的合成
除了用十八烷基胺的游离碱(890mg，3.3mmole)取代十八烷基甘氨酸盐酸盐和三乙胺外，用实施例6中所述的方法，并按同一比例合成L-丙氨酰D-异谷氨酰基十八烷基胺的盐酸盐。最终产物用NMR光谱和TLC确定。
实施例8十八烷基L-缬氨酰D-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1317)的合成
将三乙胺(0.4ml，2.9mmole)加入到悬浮在50ml氯仿中的十八烷基D-谷氨酰胺的盐酸盐(如上面实施例2所述的合成方法)(1.1g，2.5mmole)，将该混合物在室温下搅拌几分钟。然后加入BOCL-缬氨酸(0.6g，2.8mmole)和EEDQ(0.8g，3.3mmole)。在室温下搅拌反应物18小时并且其处理如实施例2所述。该反应得到1.6g粗的BOCL-缬氨酰D-谷氨酰胺的十八烷基酯，并用快速硅胶色谱法提纯。用2∶1己烷/乙酸乙酯，1∶1己烷/乙酸乙酯和乙酸乙酯洗脱该色谱柱。然而，用在二烷甲烷和乙醚中结晶的方法也可以提纯该产物。产生730mg产物。用NMR光谱和TLC鉴定该产物。在室温下将产物溶于二氯甲烷中接着鼓泡氯化氢气体通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基。然而，在4℃下存放该酸溶液没有得到沉淀物，因此用旋转式蒸发法除去二氯甲烷，在过滤后，用乙醚洗涤残余物得到510mg十八烷基L缬氨酰D-谷氨酰胺的盐酸盐。用300MHzNMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例9十八烷基L-丝氨酰D-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1318)的合成
除了用BOCL-丝氨酸(570mg，2.8mmole水合物)取代BOCL-缬氨酸外，用实施例8所述的方法，用同一比例合成420mg十八烷基L-丝氨酰D-谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例10十八烷基L-苏氨酰D-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1319)的合成
除了用BOCL-苏氨酸(600mg，2.8mmole)取代BOCL-缬氨酸外，用实施例8中所述的方法，用同一比例合成410mg十八烷基L-苏氨酰D-谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例11十八烷基L-苯基甘氨酰D-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1320)的合成
除了用BOCL-苯基甘氨酸(700mg，2.8mmole)取代BOCL-缬氨酸外，用实施例8所述的方法，用同一比例合成750mg十八烷基L-苯基甘氨酰D-谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例12十八烷基D-缬氨酰L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1321)的合成
除用BOCD-缬氨酸取代其L-对映体并使用谷氨酰胺的L-对映体外，用实施例8所述的方法，按相同比例合成580mg十八烷基D-缬氨酰L-谷氨酰胺。产物的NMR和TLC与实施例8所述的产生的产物相同。
实施例13十八烷基D-丝氨酰L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1322)的合成
除了用BOCD-丝氨酸(560mg，2.8mmole)取代BOCL-缬氨酸并使用谷氨酰胺的L-对映体外，用上述实施例8所述的方法，根据相同比例合成680mg十八烷基D丝氨酰L-谷氨酰胺的盐酸盐，用NMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例14十八烷基D-苯基甘氨酰L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1323)的合成
除用BOCD-苯基甘氨酸(700mg，2.8mmole)取代BOCL-缬氨酸并用谷氨酰胺的L-对映体外，用上述实施例8所述的方法，根据同一比例合成800mg十八烷基D-苯基甘氨酰L-谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例15十八烷基D-谷氨酸L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1326)的合成方法
除用BOCD-谷氨酸-γ-叔丁基酯(830mg，2.8mmole)取代BOCL-缬氨酸，并用谷氨酰胺的L-对映体外，用上述实施例8所述的方法，按同一比例合成800mg十八烷基D-谷氨酸L-谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱和TLC鉴定最终产物。
实施例16十八烷基D-鸟氨酰L-谷氨酸盐酸盐(BCH-1325)的合成
在氩气流并搅拌下向溶于100ml无水四氢呋喃中的BOC-L-谷氨酸-γ-苄基酯(3.0g，12.2mmole)中加入羰基二咪唑(2.0g，12.3mmole)。在室温下搅拌20分钟后，加入十八烷醇(4.0g，14.6mmole)，然后将反应混合物在室温下搅拌18小时。
过滤除去不溶物，用旋转式蒸发法除去溶剂得到9.1g粗产物。将该固体溶于100ml二氯甲烷中并用5%盐酸(2×40ml)、5%碳酸氢钠(2×40ml)和盐水(40ml)萃取。用硫酸镁干燥有机相。除去溶剂得到5.8g固体。用快速硅胶色谱提纯粗产物。用二氯甲烷洗脱色谱柱得到4.8g产物。
用NMR光谱和TLC鉴定该产物。在室温下将产物在乙醚中加溶，接着使氯化氢气体鼓泡通过该溶液25分钟从而除去BOC保护基。在室温下将该反应物搅拌1小时，然后用旋转式蒸发法使其体积降低约一半。将该溶液在4℃下存放2小时然后过滤，在真空中干燥该固体。
得到2.3g白色γ-苄基L-谷氨酸的十八烷基酯的盐酸盐。用NMR光谱和TLC确定最终产物。将该产物(5.2mmole)加入到50ml氯仿和三乙胺(0.8ml，5.8mmole)中，并在室温下将该反应混合物搅拌20分钟。将BOC-N-&-CBZ-D-鸟氨酸(2.0g，5.7mmole)加入到反应混合物中，接着加入EEDQ(1.4g，5.7mmole)。在室温下将反应物搅拌18小时，用氯仿(25ml)稀释，并用5%盐酸(2×30ml)，5%碳酸氢钠(2×30ml)、盐水(30ml)萃取，然后在硫酸镁上干燥。结晶(3∶1乙醚/二氯甲烷)该产物得到3.4g纯产物，用NMR光谱和TLC测其特性。通过在室温下将产物溶于70ml乙醇中并在氢气氛及在有750mg10%钯/碳催化剂存在下搅拌隔夜除去苄酯保护基。过滤除去催化剂，旋转蒸发除去溶剂得到2.1gBOCD-鸟氨酰L-谷氨酸的十八烷基酯。用NMR光谱和TLC鉴定该产物。通过在室温下将产物溶于乙醚中，接着将氯化氢气鼓泡通过该溶液20分钟以除去BOC保护基。在室温下将该反应物保存1小时，然后旋转蒸发使其体积降低约1半。在4℃下将该混浊溶液搅拌2小时，过滤，用乙醚(2×30ml)洗涤固体并在真空中干燥。得到1.7g纯的十八烷基D-鸟氨酰L-谷氨酸盐酸盐，并用NMR光谱，高分辨质谱和TLC鉴定该产物。
实施例17十八烷基L-酪氨酰甘氨酰甘氨酸盐酸盐(BCH-276)的合成
将羰基二咪唑(535mg，3.3mmole)加入到在无水二氯甲烷(40ml)和无水二甲基甲酰胺(10ml)中的BOCL-酪氨酰甘氨酰甘氨酸(1.2g，3.0mmole)的溶液中。在室温下在氩气下将该溶液搅拌45分钟，然后向该溶液中加入十八烷醇(976mg，3.6mmole)。在氩气下将该反应物搅拌20小时。旋转式蒸发除去溶剂，用快速硅胶色谱法提纯粗产物(2.5g)。用4∶1己烷/乙酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸乙酯/甲醇(10%V/V的后一溶剂)洗脱该色谱柱。
得到1.3g产物。用NMR光谱和TLC鉴定产物。通过在室温下将产物在二氯甲烷中加溶，然后将氯化氢气体鼓泡通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基。在4℃下将该混浊的溶液存放2小时，过滤，在真空中干燥该固体。
得到950mg的十八烷基酪氨酰甘氨酰甘氨酸盐酸盐产物。
实施例18十八烷基-D-丙氨酰-α-氰基甲基L-丙氨酸盐酸盐(BCH-1365)的合成
将三乙胺(0.317ml，2.28mmole)逐滴加入到无水四氢呋喃(60ml)中的BOC-D-丙氨酰L-谷胺酰氨的十八烷基酯(1g，1.75mmole)溶液中。在氩气流下将混合物搅拌几分钟，然后在二十分钟内加入三氟乙酐(0.32ml，2.28mmole)，在室温下将反应物静置18小时。旋转蒸发除去溶剂并将粗产物溶解在二氯甲烷(30ml)中。用0.5N盐酸(2×50ml)，5%碳酸氢钠(2×50ml)，盐水(2×50ml)萃取该溶液。然后用无水硫酸钠干燥有机相。在用2∶3乙酸乙酯/己烷作洗脱液的情况用快速硅胶色谱法提纯粗的十八烷基酯。得到0.66g，1.19mmole，产率68%的产物。用300MHzNMR光谱和TLC(Rf＝0.4乙酸乙酯/己烷3∶7)鉴定产物。该产物另外也可用在二氯甲烷/己烷中结晶提纯。通过用在实施例1中所述的方法在室温下将产物(180mg，0.326mmole)溶于无水乙醚中，接着将氯化氢气体鼓泡通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基，得到123mg，0.25mmole，77%产率的十八烷基-D-丙氨酰-α-氰基甲基-L-丙氨酸的盐酸盐。用NMR光谱，高分辨质谱和TLC(Rf＝0.48，乙酸乙酯/己烷3∶7)鉴定最终产物。
实施例19十八烷基-D-丙氨酰-ψ[CSNH]-α-氰基甲基L-丙氨酸盐酸盐(BCH-1375)的合成
在氩气流下将Lawesson试剂(235mg;0.58mmole)加入到在无水四氢呋喃(45ml)中的十八烷基-BOC-D-丙氨酰-α-氰基甲基-L-丙氨酸(320mg，0.58mmole)的溶液中。在回流下将反应物加热4小时。旋转蒸发除去溶剂并将粗产物溶解在二氯甲烷(45ml)中。用5%碳酸氢钠(3×50ml)，0.5N盐酸(2×50ml)和盐水(2×50ml)萃取反应物。然后用无水硫酸钠干燥有机相。在用3∶7乙酸乙酯/己烷作为洗脱液情况下用快速硅胶色谱法提纯粗物质。得到200mg，0.352mmole，61%产率的产物。用300MHzNMR光谱和TLC(Rf＝0.52，乙酸乙酯/己烷3∶7)鉴定该产物。
用实施例1所述的方法，在室温下将产物溶于无水乙醚中，接着将氯化氢气体鼓泡通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基，得到63mg，0.125mmole，88%产率的十八烷基-D-丙氨酰ψ[CSNH]-α-氰基甲基-L-丙氨酸的盐酸盐。用NMR光谱，高分辨质谱和TLC(Rf＝0.5710%V/V甲醇/乙酸乙酯)确定最终产物。
实施例20十八烷基-D-丙氨酰ψ[CSNH]L-谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1376)的合成
在完成Lawesson试剂和十八烷基-BOC-D-丙氨酰-α-氰基甲基-L-丙氨酸之间的反应过程中析出(60mg，0.1mmole)十八烷基-BOC-D丙氨酰ψ[CSNH]-L-谷氨酰胺。用NMR光谱和TLC(Rf＝0.28乙酸乙酯/己烷3∶2)确定这个化合物。用实施例1所述的方法，在室温下通过将该产物溶于无水乙醚中，接着将氯化氢气体鼓泡通过该溶液10分钟从而除去BOC保护基得到33mg，0.063mmole，63%产率的十八烷基-D-丙氨酰ψ[CSNH]-L-谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱，高分辨质谱和TLC(Rf＝0.5420%V/V甲醇/乙酸乙酯)确定最终产物。另外，也可通过十八烷基-BOC-D-丙氨酰-ψ[CSNH]-α-氰基甲基-L-丙氨酸的氰基官能团的水解，接着脱去BOC保护基来制备BCH1376。
实施例21十八烷基-D-丙氨酰L-硫代谷氨酰胺盐酸盐(BCH-1373)的合成
在氩气流下将Lawesson试剂(370mg，0.91mmole)加入到溶于无水1，2-二氯乙烷(55ml)中的十八烷基-BOC-D-丙氨酰-L-谷氨酰胺(500mg，0.87mmole)的溶液中。在回流下加热反应物2小时。旋转蒸发除去溶剂，并将粗产物溶于二氯乙烷(50ml)中。用5%碳酸氢钠(3×50ml)，0.5N盐酸(2×50ml)和盐水(2×50ml)萃取该溶液。然后用无水硫酸钠干燥有机相。在用2∶3乙酸乙酯/己烷作洗脱剂下通过快速硅胶色谱法提纯该粗物质。得到378mg，0.64mmole，75%产率的产物。用NMR光谱和TLC(Rf＝0.34乙酸乙酯/己烷2∶3)鉴定该产物。用实施例1所述的方法，在室温下通过将该产物溶于无水乙醚中，接着将氯化氢气体鼓泡通过该溶液10分钟除去BOC保护基，得到264mg，0.50mmole，79%产率的十八烷基-D-丙氨酰-L-硫代谷氨酰胺的盐酸盐。用NMR光谱，高分辨质谱和TLC(Rf＝0.2620%V/V甲醇/乙酸乙酯)确定最终产物。
实施例22空斑形成试验选择本发明的低聚肽免疫调节剂进行形成抗体细胞的免疫调节活性试验。用下面方法进行下面试验。
用悬浮于盐水中的0.1%(体积/体积)绵羊血红细胞抗原免疫调节剂进行系繁殖的CD1鼠。用0.5ml约2×107细胞的悬浮液腹膜内注射给该鼠。
此后该鼠立刻用本发明免疫调节剂悬浮液注射。该免疫调节剂的剂量为0.23ml的1mg/ml磷酸盐缓冲盐水中的悬浮液。注射剂量为10mg/Kg。第二次注射也是腹膜内注射。
在注射后5天将该鼠杀死。取血样分析免疫蛋白。用抗μ-辣根过氧化酶轭合物的酶免疫测定法进行上述测定。取出脾，并放到含2mlHank平衡盐溶液和10mMHepes缓冲液(HBSS-HEPES)的培养皿中。用镊子缓慢地将该脾粉碎，用棉透明薄纱过滤该细胞悬浮液从而除去细胞碎片。通过加入 HBSS-HEPES使过滤后的悬浮液体积为5ml，计数细胞，稀释该悬浮液至5×106细胞/ml最终浓度。
将2ml绵羊血红细胞溶液移到15ml的离心管中，通过离心分离10分钟(低速)用HBSS-HEPES洗涤三次。用HBSS-HEPES稀释最终沉淀物至1至8根据制造者的说明书(Cedarlane，Hornby，Ontario)在使用前重新构成豚鼠补体并用HBSS-HEPES稀释至1∶20。
通过制备含550μl补体(1/20)，77μl绵羊红血细胞(1/8稀释)溶液和33μl脾细胞(5×106/ml)溶液形成660μl总体积的混合物来进行上述测定。将200μl这种混合物放入由两块显微镜玻璃片形成的Cunningham 室中。用熔化的蜡和石油胶密封该玻片，在37℃下将该室(两份试样)温育45分钟。计数溶血的面积。溶血作用表现出形成抗体的细胞，也将其称为空斑形成细胞(PFC)。结果用PFC/106脾细胞表示。其结果归纳在表1中。
实施例23自然杀伤细胞活性准备三周龄的C57BL/6鼠并在处理前24-48小时对其进行检疫。将表2、3和4中所述5种低聚肽与0.4%羧甲基纤维素水溶液掺合。该溶液在使用前一直在4℃下存放。在其后的每一实验中用Ribavarin(1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-羧酰胺)作为对比。
用50mg/Kg/天剂量的一种试验化合物处理动物，在最终处理后24小时将这些动物杀死，取出其脾，每一个脾悬浮在RPMI-1640介质中并用消化腔(stomacher)(Tekmar，Cincinnati，OH)搅匀。用溶血溶解除去血红细胞。剩下的脾细胞用RPMI1640洗涤3次，并再悬浮于含20%牛胎血清的介质中，在用于自然杀伤(NK)和巨噬细胞机能测定及T和B细胞计算研究之前用Coulter计数器(Hialeah，FL)计数。
通过试验脾细胞在通常4小时铬释放测定对YAC-1肿瘤细胞的溶解能力来测定鼠细胞的自然杀伤(NK)活性，作为NK指示物的铬释放测定表示为%铬释放＝(试验的每分钟计数(cpm)-本底物cpm)/(最大cpm-本底物cpm)结果见下面的表3。
动物一般对所有试验的本发明的免疫调节剂有很好的耐药力。
从用BCH化合物治疗的鼠中取出的脾细胞的NK细胞活性归纳于表3中。只有BCH-527对这种活性表现出明显的刺激;在两个效应物靶细胞比率上可看到相似的影响。在试验中BCH-524和525边缘抑制了NK细胞活性。从BCH-527得到的刺激可与从两个其它免疫调节剂，即7-硫-8-氧代鸟苷和Aviron(ImuVert)得到的刺激相比。
实施例24巨噬细胞活性和T/B细胞测定用实施例22所述的方法得到有意义的鼠细胞。
利用鼠的胸腺细胞对植物凝血素(PHA)的响应进行白细胞介素-1(IL-1)测定来测出巨噬细胞机能，所说的响应取决于IL-1对其的反应性。
将以107细胞/ml浓度的鼠胸腺细胞悬浮在含有2%PHA，5%牛胎血清，0.05mM2-巯基乙醇/青霉素-链霉素的RPMI1640介质中。将总计100μl的这种悬浮液加入到含一系列用于测定IL-1的上清液稀释液的96井平底微量板的每一井中。在37℃下将这些细胞温育72小时。在温育的最后4小时内，这些细胞用[3H]胸苷(1μci/井)脉动。然后将这些细胞收获，并用直接计数器测定[H3]胸苷掺入量。
本发明免疫调节剂对巨噬细胞机能的影响参见表2。可用在治疗的鼠的脾细胞中的IL-1活性表示。在许多治疗组中出现了很大的变化。化合物BCH-523，524和527都有点刺激作用，而BCH-525和526具有适当的抑制作用。
用下面的方法计数脾细胞。对于B细胞计数，将分散的脾细胞与异硫氰酸荧光素标记的鼠单克隆抗体抗-Ly5反应，对于T细胞计数，将分散的脾细胞与藻红蛋白标记的单克隆抗体抗-Thy1.2反应。然后将标记的细胞用荧光激活细胞分类术(FACS)(EPICS-C，coultercorp.，Hialeah，FL)来计数。
用这些BCH化合物得到的脾T和B细胞计数数据表示于表4中。BCH-526和527显示出增加的%B细胞而抑制T细胞。BCH-524显示出对T和B细胞的抑制。
实施例25自然杀伤细胞和巨噬细胞活性从Simonsen试验室(GilroyCA)得到14-16g雌性和雄性Balb/c鼠。在使用前24小时对它们进行检疫，并保持在WayneLabBlox和自来水中。通过鼻内感染将流感病毒感染给被感染的鼠。从 Michigan 大学(Ann Arbor.MI)的Dr.K.W.Cochran得到流感A/NWS/33(H1N1)病毒。通过感染Madin Darby 犬肾(MDCK)细胞的会合单细胞层，并在37℃下在5%CO2中温育，当该病毒细胞致病作用是90-100%时的3-5天时收取这些细胞从而制备病毒库。将病毒原种装入安瓿并在-80℃下存放直到使用。感染后给这些鼠喝含0.006%羟四环素(Pfizer，New York，NY)的水从而控制可能的次级细菌感染。
将十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)悬浮在无菌0.4%羧甲基纤维素(CMC)溶液中，用于腹膜内(i.p.)注射给鼠。将十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)以200，100，和50mg/Kg/天剂量使用，在相应于病毒处理(分别注射＃1，＃2，＃3，＃4和＃5)的-1，+1，+3，+5和+7的这些天每天投药一次。
在每一药物剂量和正常对照下在第一次处理后的24小时测定5只鼠的脾内的自然杀伤细胞活性和巨噬细胞机能。用每一剂量治疗和用相似的病毒和正常对照数，在对5只感染过的和5只未感染过的鼠5种治疗后那天也可进行相似的测定。
按实施例23的描述，测定自然杀伤细胞活性。所用的脾细胞对肿瘤细胞的比是5∶1，25∶1，50∶1和100∶1。利用一种ELISA药盒(GenzymeCorp.，Cambridge，MA)对鼠的IL-1进行白细胞介素-1(IL-1)检测从而测出巨噬细胞机能。在20μg/ml的脂多糖中温育脾单核细胞24小时。除去上清液并用ELISA分析。
结果归纳在表5-6中可以观察到在感染的和未感染的鼠中的十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)的重要的免疫调节作用。如表5所示，在以100和50mg/Kg/天剂量用十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)4次注射后，一种很强的NK细胞活性尤其可在感染过的鼠中看到。
从表6可以看出，十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)也是一种有效的巨噬细胞活化剂。这尤其表现在4次治疗后。并在流感病毒感染过的动物中表现得更强。
实施例26抗病毒活性用鼠细胞肥大病毒(MCMV)(Smith品种)腹膜内感染SwissWebster雌性鼠(SimonsonLabs，Gilroy，CA)，该鼠在试验开始时重12克/只。将病毒预先滴定在鼠中并杀死80-90%的动物，尽管从一个试验到另一个试验死亡数有变化，但该病毒仅杀死55%的安慰剂的对照动物。相应于病毒治疗在-1，+1，+3，+5和+7天每天投药十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)一次。将BCH-527悬浮在无菌的0.4%羧甲基纤维素溶液中。以50mg/Kg到200mg/Kg的变化剂量腹膜内注射给动物。并在同时将0.4%的羧甲基纤维素投药给安慰剂的对比动物。
在病毒接种后24小时开始每天一次给予ganciclovir共给予5天。用腹膜内注射方法注射剂量为25mg/Kg的溶于生理盐水溶液的无菌溶液。
每天记录死亡情况共计21天，计算的平均天数考虑到死亡的鼠。通过从10%组织匀浆得到的病毒的滴定来得到组织病毒滴度。在96＃板中在C1271细胞中进行这些滴定(Smee，D.F.，A，CollettiH.A.Alaghamandan，和L.BAllen.1989。在用鼠细胞肥大病毒的抗病毒研究中进行连续的细胞株评价，Arch，Virol，107∶253-260)。用50%终点稀释方法进行病毒滴度计算(Reed，L.J.和M.Muench.1938。一种评估50%终点的简单方法。Am.J.Hyg.27∶493-498)。这些结果列在表7和8中。这些结果表明在三种剂量下的免疫调节剂十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH-527)可避免死亡并降低在鼠中的MCMV组织病毒滴度。
毒性对照用上述相同方法相同时间处理由5只未感染鼠所组成的组。每天检查这些动物的存活情况。在最初处理之前和在最后处理后24小时测出它们的重量从而测出对重量增加的药剂影响。结果列于表9中。
统计分析用两种尾数分析法(tailed analyses)分析存活率(X2测定法用Yate校正)，死亡的平均天数(学生试验)和病毒滴度(学生试验)。
表1选择的免疫调节剂对抗SRBC抗原的抗体产生的影响，用空斑测定法和酶免疫测定法来测定试验选择的酶编号A免疫调节剂B空斑测定C免疫测定D1盐水(对比)467±93100%(100%)1BCH-5231186±323171%(254%)2盐水(对比)358±298100%(100%)2BCH-523877±220138%(245%)3盐水(对比)410±382100%(100%)3BCH-523826±291261%(201%)4盐水(对比)363±396100%(100%)4BCH-523682±246160%(188%)5盐水(对比)423±365100%(100%)5BCH-524245±9080%(58%)5BCH-526325±30082%(77%)6盐水(对比)565±280100%(100%)6BCH-5251073±234161%(190%)7盐水(对比)7±5100%(100%)7BCH-527479±322523%(6843%)
试验选择的酶编号A免疫调节剂B空斑测定C免疫测定D7BCH-523385±33465%(5500%)8盐水(对比)496±272100%(100%)8BCH-13151012±207202%(204%)8BCH-1316759±252186%(153%)9盐水504±407100%(100%)9BCH1317750±191189%(149%)9BCH1318613±166121%(122%)9BCH1325150±11060%(30%)10盐水794±394100%(100%)10BCH1325456±26167%(57%)11盐水187±139100%(100%)11BCH-276439±305160%(235%)
A试验表明了在不同鼠中观察到的BCH523的免疫调节剂的作用试验1和2，近亲交配C3H鼠试验3和4，远亲交配CD1和CF1鼠BBCH编号指的是选择的免疫调节剂，523;十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰胺524;γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸526;α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸525;十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺527;十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺1315;十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰氨基甘氨酸1316;L-丙氨酰D-异谷氨酰氨基十八烷基胺C PFC/106脾细胞。百分数指的是PFC相对于对比例(100%)的增加(降低)。
D百分分数指的是用吸光率测量时1gM抗体相对于对比例(100%)的增加(降低)。
用于评价免疫调节剂的每组小鼠的数量对于对比组是7只，对于治疗组是6只。
表5在正常的和流感病毒感染过的BALB/C鼠中腹膜内投药BCH-527的治疗对自然杀伤活性的影响
a在给出的效应物靶细胞比值下铬释放平均百分数(2标准误差)n＝5＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
表6在正常的和流感病毒感染过的BALB/C鼠中BCH-527对巨噬细胞活性a的影响
a以IL-1浓度表示，n＝5＊P＜0.05，＊＊P＜0.01.
表7BCH-527和ganciclovir在MCMV-感染的鼠中对死亡的影响
a在感染21天时或之前死亡的鼠＊P＜0.05，＊＊P＜0.01.
表8在3和6天后BCH-527和ganciclovir对组织中MCMV滴度的影响
1细胞培养感染剂量＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
表9BCH-527和ganciclovir对未感染鼠的死亡率和重量增加的影响
b在开始治疗时的初始重量和最终治疗后24小时的重量之间的差值。
权利要求
1.一种式(Ⅰ)的低聚肽免疫调节剂其中Z是C=O或C=S；Y是适于将烷基链连接到Z部分上的连接基；n是选自11至19的整数；HA(如果存在)是将与所述低聚肽形成生理上可接受的盐的有机或无机酸；和P是含有2至5个由酰胺或硫代酰胺键独立地连接的氨基酸的低聚肽部分，每个氨基酸独立地选自天然形成的、L-构型、D-构型或合成的氨基酸，其中所述的低聚肽部分不包括氨基和酸末端官能团。
2.根据权利要求1的免疫调节剂，其中Y选自-O-、-S-和-NH-。
3.根据权利要求1的免疫调节剂，其中每个氨基酸独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰氨、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、异谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、缬氨酸、氰甲基丙氨酸、噻唑烷-4-羧酸、硫代谷氨酰胺、硫代-α-谷氨酰胺和硫代-α-丙氨酸。
4.根据权利要求1的免疫调节剂，其中每个氨基酸独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、异谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、鸟氨酸和缬氨酸。
5.根据权利要求1的免疫调节剂，其中每个氨基酸独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、异谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和酪氨酸。
6.根据权利要求1至5之任一项的免疫调节剂，其中低聚肽部分P含有2至4个氨基酸。
7.根据权利要求1至5之任一项的免疫调节剂，其中低聚肽部分P含有2个氨基酸。
8.根据权利要求1至5之任一项的免疫调节剂，其中所述氨基酸由酰胺键连接。
9.一种式(Ⅱ)的低聚肽
其中p是选自零至4的整数;每个Z独立地是C＝O或C＝S;每个r独立地是选自零至2的整数;Y选自-O-、-S-或-NH-;n是选自11至19的整数;X是NH2、OH或OCH3;HA(如果存在)是将与所述的低聚肽形成生理上可接受的盐的有机或无机酸;和Q是支链或无支链的烷基、苯基、苄基、羟甲基或任何天然形成的氨基酸的侧链。
10.根据权利要求9的低聚肽免疫调节剂，其中Z是C＝O，Y是-O-或-NH-，n是17，X是NH2或OH。
11.根据权利要求9的一种结构式(Ⅲ)的低聚肽免疫调节剂
其中p是选自零至4的整数;每个Z独立地是C＝O或C＝S;r是选自零至2的整数;Y选自-O-、-S-或-NH-;n是选自11至19的整数;X是NH2、OH或OCH3;HA(如果存在)是将与所述的低聚肽形成生理上可接受的盐的有机或无机酸;和Q是C1-C4支链或无支链的烷基、苯基、苄基、羟甲基或任何天然形成的氨基酸的侧链。
12.根据权利要求11的低聚肽免疫调节剂，其中Z是C＝O，Y是-O-或-NH-，X是NH2或OH，n是17。
13.根据权利要求9的一种结构式(Ⅳ)的低聚肽免疫调节剂
其中Y选自-O-、-S-或-NH-;n是选自11至19的整数;X是NH2、OH或OCH3;HA(如果存在)是将与所述的低聚肽形成生理上可接受的盐的有机或无机酸;和Q是C1-C4支链或无支链的烷基、苯基、苄基、羟甲基或任何天然形成的氨基酸的侧链。
14.根据权利要求13的低聚肽免疫调节剂，其中n是17，X是NH2，Y是-O-。
15.根据权利要求11的免疫调节剂，其中r是1。
16.根据权利要求11的免疫调节剂，其中所述的免疫调节剂选自十八烷基L-丙氨酰D-异谷氨酰胺、γ-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸、十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酰胺、α-十八烷基L-丙氨酰D-谷氨酸、十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基L-苯基甘氨酰D-谷氨酰胺、十八烷基D-缬氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-丝氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-苯基甘氨酰L-谷氨酰胺、十八烷基D-谷氨酸L-谷氨酰胺、十八烷基D-鸟氨酰L-谷氨酸、十八烷基L-酪氨酰甘氨酰甘氨酸、十八烷基-D-丙氨酰-α-氰甲基L-丙氨酸、十八烷基-D-丙氨酰-ψ[CSNH]-α氰甲基L-丙氨酸、十八烷基-D-丙氨酰-ψ[CSNH]L-谷氨酰胺、十八烷基-D-丙氨酰L-硫代谷氨酰胺，及其任何药物上可接受的酸加成盐。
17.一种药物组合物含有产生免疫调节活性的有效量的至少一种根据权利要求1至5之任一项的化合物和药物上可接受的媒介物。
18.一种药物组合物含有产生免疫调节活性的有效量的至少一种根据权利要求6的化合物和药物上可接受的媒介物。
19.一种药物组合物含有产生免疫调节活性的有效量的至少一种根据权利要求8的化合物和药物上可接受的媒介物。
20.一种药物组合物含有产生免疫调节活性的有效量的至少一种根据权利要求9至16之任一项的化合物和药物上可接受的媒介物。
21.根据权利要求17的药物组合物还含有抗病毒、抗微生物或抗癌化合物。
22.根据权利要求18的药物组合物还含有抗病毒、抗微生物或抗癌化合物。
23.根据权利要求19的药物组合物还含有抗病毒、抗微生物或抗癌化合物。
24.根据权利要求20的药物组合物还含有抗病毒、抗微生物或抗癌化合物。
25.根据权利要求21至24之任一项的药物组合物，其中所述的抗病毒化合物选自无环鸟苷、gancyclovir、三氮唑核苷、金刚胺(amantidine)、叠氮胸苷、磷甲酸盐(foscarnet)、2′-去氧-3′-噻胞苷(2′-deoxy-3′-thiacytidine)(3TC)、2′3′-二去氧胞苷(ddC)、2′3′-二去氧肌苷(ddI)、2′3′-二去氧腺苷(ddA)、5′-碘去氧尿苷和Carbovir。
26.一种治疗或预防哺乳动物的病毒感染的方法，包括投药抗病毒剂量的根据权利要求18、19、21、22、23和24之任何一项的药物组合物的步骤。
27.一种治疗或预防哺乳动物的病毒感染的方法，包括投药抗病毒剂量的根据权利要求25的药物组合物的步骤。
28.一种治疗或预防哺乳动物的病毒感染的方法，包括投药抗病毒剂量的根据权利要求17的药物组合物的步骤。
29.一种治疗或预防哺乳动物的病毒感染的方法，包括投药抗病毒剂量的根据权利要求20的药物组合物的步骤。
30.根据权利要求26的方法，其中所述的病毒感染选自CMV和流行性感冒感染。
31.根据权利要求27至29之任一项的方法，其中所述的病毒感染选自CMV和流行性感冒感染。
32.根据权利要求26的方法，其中所述的免疫调节剂是十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH 527)。
33.根据权利要求27至29之任一项的方法，其中所述的免疫调节剂是十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH 527)。
34.一种制备式(Ⅰ)的低聚肽免疫调节剂的方法其中Z是C＝O或C＝S;Y是适于将烷基链连接到Z部分上的连接基;n是选自11至19的整数;HA(如果存在)是将与所述低聚肽形成可接受的盐的有机或无机酸;和P是含有2至5个由酰胺或硫代酰胺键独立地连接的氨基酸的低聚肽部分;所述的氨基酸独立地选自天然形成的、L-构型、D-构型或合成的氨基酸;其中所述的低聚肽部分隔断氨基和羧酸末端官能团;该方法包括步骤a)式(Ⅴ)化合物其中W是可接受的脱离基团;和P′含有1至5个由酰胺或硫代酰胺键独立地连接的氨基酸，所述的氨基酸独立地选自天然形成的、L-构型、D-构型或合成的氨基酸，其中P′隔断氨基和酸末端官能团;与下式化合物偶合其中，n是选自11至19的整数;生成式(Ⅵ)的亲油低聚肽其中P′、Z、Y或n如上定义;和b)如果需要，通过它们各自的H2N-氨基和Z-W末端官能团使式(Ⅵ)与式(Ⅴ)的另一种化合物进一步偶合，得到式(Ⅰ)的低聚肽免疫调节剂。
35.根据权利要求34的方法，其中W独立地选自OH、卤素、O-琥珀酰胺、三唑、咪唑和S(E)，其中E是C1-6烷基。
36.根据权利要求35的方法，其中W是OH。
37.根据权利要求34至36之任一项的方法，其中Y选自-O-、-S-和-NH-。
38.根据权利要求34至36之任一项的方法，其中所述方法在偶合剂存在下进行。
39.根据权利要求37的方法，其中所述方法在偶合剂存在下进行。
40.根据权利要求38的方法，其中式(Ⅴ)或(Ⅵ)化合物的活性官能基团在加入所述的偶合剂之前先化学保护。
41.根据权利要求39的方法，其中式(Ⅴ)或(Ⅵ)化合物的活性官能基团在加入所述的偶合剂之前先化学保护。
42.根据权利要求34的方法，其中所述的低聚肽部分P含有2至4个氨基酸。
43.根据权利要求34的方法，其中P′的每个氨基酸独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰氨、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、异谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、缬氨酸、氰甲基丙氨酸、硫代谷氨酰胺、硫代-α-谷氨酰胺和硫代-α-丙氨酸。
44.根据权利要求30的方法，其中所述的免疫调节剂是十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH 527)。
45.根据权利要求31的方法，其中所述的免疫调节剂是十八烷基D-丙氨酰L-谷氨酰胺(BCH 527)。
全文摘要
本发明公开了新的、小的和结构简单的免疫调节低聚肽。本发明的低聚肽具有一个长的亲油烷基链。这些免疫调节低聚肽在治疗人和动物的疾病中可与抗病毒或抗癌试剂结合使用。还公开了免疫调节化学药品的合成方法。
文档编号C07K5/06GK1083073SQ9310573
公开日1994年3月2日 申请日期1993年4月3日 优先权日1992年4月3日
发明者C·彭尼, B·泽卡里尔 申请人:生物化学药物有限公司
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