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2021-02-01 15:02:43|
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起点商标网 专利名称：黑素生成抑制剂及其制备和使用方法
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本发明涉及一种黑素生成抑制剂，及其制备和使用的方法。更为具体地，该黑素生成抑制剂包含一种天然的蛋白质或其有效片段。它能降低酪氨酸酶活性、抑制色素细胞增殖，并对黑素瘤细胞有细胞毒性。
色素沉着过多症影响全世界许多人，常常使人极其窘迫或产生更坏后果。这类疾病包括诸如雀斑、日照着色斑(褐黄斑)、烧伤病人移植皮肤常见的颜色明显变深，以及最为严重的黑素瘤。此外，许多人仅仅从美容角度也希望减轻他们的皮肤底色。
过去采用了不同的方法来降低色素沉着过多区域的色素沉着或减轻皮肤底色。虽然这些治疗取得了种种结果，然而大部分会产生不希望得到的副作用。用于漂白皮肤或脱去色素的化合物包括氢醌及其衍生物。氯化氨基汞、抗坏血酸、巯基胺类、4-异丙基儿茶酚、以及过氧化物。然而没有一种业已证明是完全可靠，没有副作用的。
欧洲专利申请389，950揭示了一种促黑素细胞激素(MSH)抑制剂，据报道其对诸如预防或减轻褐黄斑或雀斑等症状是有用的。该抑制剂包含由下列式子代表的氨基酸顺序-His-Ser-Arg-Trp-;-Trp-Arg-Ser-His;或-Leu-Ala-Cys-Ala-Arg-。前面二种顺序代表的肽类对黑素细胞表面包含的MSH受体具有亲和力，由此拮抗MSH。第三种顺序代表的肽类对MSH本身具有亲和力，由此抑制MSH的作用。
在他们发明之后，申请人得知一篇新近的出版论文，其中揭示了一种蛋白质，可能与他们已经制备的有关，事实上可能是一样的(Madsen，P.etal.，I.InvestDermatol99∶299-305(1992)。这种蛋白质据报道在牛皮癣角质细胞中受到高度的正调节，但是报道没有提到与黑素生成的关系。
一种更为严重的皮肤色素沉着过多症是黑素瘤。它影响世界上数百万人。虽然早期诊断的活，有时可以得到治疗，但黑素瘤常常是致命的。目前已有的治疗方法，如化学疗法，常会引起严重的副作用，并且从不会对所有病人完全有效。
然而，迄今为止，没有一种天然来源的组合物能够可靠的抑制黑素生成，由此减少皮肤色素沉着，并对黑素瘤细胞有选择性细胞毒性，而且没有任何副作用。
下面描述本发明的一些重要特征和目的，但不是全部的。
本发明的一个目的是提供一种天然来源的黑素生成抑制剂，用于减少皮肤色素沉着，有选择地破坏黑素瘤细胞。
本发明的另一个目的是提供一种天然来源的黑素生成抑制剂，包含一种天然来源的黑素生成抑制因子蛋白质或其有效片段。
本发明的另一个目的是提供一种制备黑素生成抑制因子蛋白质的方法。
本发明的另一个目的是提供一种利用天然来源的黑素生成抑制因子蛋白质或其有效片段来控制皮肤和/或毛发色素沉着。
本发明的另一个目的是提供一种利用天然来源的黑素生成抑制因子蛋白质或其有效片段来破坏黑素瘤细胞，而不影响正常的非色素细胞。
如本文所用，“黑素生成”是指由活细胞生成黑素;“抑制黑素生成”包括抑制各个细胞产生黑素的能力和/或减小能产生黑素的细胞群体。
按照本发明的一个方面，提供了一种在此之前未知的天然来源的蛋白质，它能够抑制色素细胞的黑素生成，选择性破坏黑素瘤细胞，而不伤害其他细胞。该黑素生成抑制因子(MI)蛋白质具有下列氨基酸顺序(与其相应的密码子一起列出，每个氨基酸下面的数字指MI顺序中氨基酸的位置)SEQIDNO3ATGGCCACAGTTCAGCAGCTGGAAGGAAGATGGCGCCTGGTGMetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510GACAGCAAAGGCTTTGATGAATACATGAAGGAGCTAGGAGTGAspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025GGAATAGCTTTGCGAAAAATGGGCGCAATGGCCAAGCCAGATGlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540TGTATCATCACTTGTGATGGTAAAAACCTCACCATAAAAACTCysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055GAGAGCACTTTGAAAACAACACAGTTTTCTTGTACCCTGGGAGluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GAGAAGTTTGAAGAAACCACAGCTGATGGCAGAAAAACTCAGGluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ACTGTCTGCAACTTTACAGATGGTGCATTGGTTCAGCATCAGThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GAGTGGGATGGGAAGGAAAGCACAATAACAAGAAAATTGAAAGluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110
GATGGGAAATTAGTGGTGGAGTGTGTCATGAACAATGTCACCAspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125TGTACTCGGATCTATGAAAAAGTAGAATAACysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135为了简明起见,整个MI蛋白质的顺序如下所示:
SEQIDNO.4:
MetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510AspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025GlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540CysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055GluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110
AspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125CysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135按照本发明的另一个方面，提供了一种制备MI蛋白质的方法，包括下列步骤(a)将哺乳动物皮肤，较好是人皮肤，移植到活的裸鼠上;(b)让此哺乳动物皮肤在裸鼠上保持预定的一段时间;(c)从裸鼠上移走此哺乳动物皮肤;以及(d)从此哺乳动物皮肤提取包含MI蛋白质的蛋白质部分。较好是让哺乳动物植皮在裸鼠上保持至少6个星期。同样，较好是提取步骤包括用生理盐水从哺乳动物皮肤提取蛋白质，用离子交换色谱法分级分离皮肤蛋白质提取物，用双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离色谱法得到的适当的级分中的皮肤蛋白质提取物，以及用电洗脱法从电泳凝胶中分离MI蛋白质。
按照本发明的另一个方面，还提供了一种控制色素细胞(特别是皮肤和毛发中的色素细胞)黑素生成的方法，其步骤包括形成一种有效量MI蛋白质和合适载体的混合物，然后将此混合物施用于欲控制的色素细胞。MI蛋白质或其活性片段可施用于例如皮肤，来治疗某些色素沉着过多症或仅仅为了美容目的。MI蛋白质也可施用于美容方面的毛发脱色或减色，例如使体毛(如阴毛，腋毛，胸毛，腿毛，臂毛，背毛)变得不那么清晰可见。使用这种组合物可使刮顺，脱毛或电针除毛不便之处较少见，比较好的是将混合物局部施用于色素细胞，并且最好是用MI蛋白质活性片段。或者M白质或其活性片段可以与适当的载体一起注射，以便将组合物施用于色素细胞。合适的载体可有无数种，其选择依赖于施用的最终目的。这样，MI蛋白质或最好是其活性片段，可以与皮肤修补剂结合使用，以减轻老年斑，同时也改善皮肤皱纹状态。
按照本发明的另一个方面，提供了一种通过将有效剂量的MI蛋白质或其活性片段与合适载体混合，应用于黑素瘤细胞，从而选择性破坏黑素瘤细胞的方法。同样先多种载体可以使用，其选择依赖于该组合物的应用方法。比较好的是将该组合物局部使用，并且利用MI蛋白质的活性片段。
A.MI蛋白质的开发研究移植到烧伤病人的皮肤色素过多沉着以前已有记载，并被认为是一种炎症后机制起作用的结果。也观察到皮肤色素沉着增加与日照灼伤和其他皮炎过程的关系，并把这种增加归结于功能性黑素细胞(“多巴阳性”黑素细胞)数量的增加和黑素细胞实际黑素合成的增加。
为了检查移植皮肤的色素反应，将小块人皮肤样本植到先天性无胸腺小鼠(裸鼠)上。裸鼠经证明是一种用于研究正常和病理异种移植组织体内行为的优异宿主，因为它们不会排斥不同系统发生来源的移植物。裸鼠已经广泛地用于人类皮肤的研究。移植到裸鼠上的人类皮肤仍保持其结构和免疫特性，以及一些主要的功能性质。
在这一讨论和接下来的所有实施例中，存活的供体皮肤来自于高加索人种成人尸体。用植皮刀取皮肤，厚度为一吋的12-14/1000，并贮存于F-12组织培养基(自GibcoLaboratories，GrandIsland，NY)，4℃。将裸鼠先用Nembutol麻醉，从躯体合适部位除去皮肤，准备移植部位。将裂口厚度(12-14/1000吋)的供体皮肤置于小鼠合适部位并缝合得当。移植皮肤是在供体死亡48小时之内移植到小鼠上的。需要时，将小鼠用过量的Nembutol处死，通过消毒外科技术，取下异种移植物。
如所期望，这种异种移植物表现出与报道的烧伤病人中相同的色素过多沉着。在移植之前以及移植后不同时间，对异种移植物进行了各种组织学试验和检查，以研究这种观察到的色素过多沉着。明显的异种移植物颜色变深早在移植两周后就出现了。而且，尽管存在观察关异，所有的异种移植物都表现出色素过多沉着。然而，观察到的色素过多沉着只局限于异种移植物，并不延伸到宿主皮肤。
异种移植物样本的显微镜分析揭示出与移植前相比，异种移植物中多巴阳性黑素细数量有显著的增加。多巴阳性细胞是指存在功能性酪氨酸酶的细胞，因而能产生色素。虽然增加的程度有些不同，但是多巴阳性黑素细胞数目的增加至少有3倍，而且所有的样本在移植后6周左右都出现一个峰值。从这点开始，多巴阳性黑素的细胞数目逐步下降，但在某些异种移植物中，迟至移植30周，仍会维持在略有增加的程度。
作为黑素生成活性的一种指示，也测定了黑素细胞体的大小。在所有的情形中，黑素细胞的大小比移植前样品中观察的要大一倍以上，同时细胞大小变化也显示出一个峰值，随之逐步减小。此外，异种移植物中黑素细胞树突也显著增加。树突的增加一般会导致皮肤色素沉着的增加，因为树突负责运输黑素至表皮。虽然色素过多沉着的程度并不总是与多巴阳性黑素细胞的数目相关，但的确倾向于与黑素细胞树突相关。这似乎表明，观察到的色素过多沉着与其说是黑素细胞实际数目增加的结果，不如说是黑素生成活性增加的结果。
为了确定低分子量和高分子量蛋白质区是否存在任何差别，对移植前和移植后的人皮肤提取液进行了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。虽然在移植后不同时间取样的样品间，蛋白质电泳带型没有任何明显的差异，但是，在移植后异种移植物样品中，独特地显示出一条表观分子量大约为13到14千道尔顿(KDa)的蛋白质带，而在移植前皮肤中没有发现此带。在趣的是，在裸鼠皮肤提取物中也发现了一种具有类似分子量的蛋白质。该13到14KDa蛋白质带早至移植后二周就出现，并持续出现到移植14周以后。
在下面的实施例中，不同的蛋白质级分和纯化的蛋白质被用于几种不同类型的细胞，以确定提取自移植前和移植后的皮肤中的蛋白质对色素作用的影响，如果有的话。移植前皮肤仅指正常人皮肤，而移植后皮肤指由裸鼠支持的活的异种移植物。这种试验的最终结果就是从上面提到的13到14KDa带中分离出单一的黑素生成抑制因子(MI)蛋白质。虽然申请人并不能确定MI蛋白质如何影响黑素生成和选择性地杀灭黑素瘤细胞，但是没有任何理由相信这些作用是通过MSH和/或其受体引起的。
实施例1采用的第一种细胞类型是克劳德曼(Cloudman)S91黑素瘤。这是一种中等程度鼠黑素沉着病细胞，已广泛用于研究黑素生成和色素细胞生长。黑素瘤细胞以单层培养物形式保存于Ham F-10培养基(购自Gibco Laboratories，Grand Insland，NY)，其中补充有10%热激活小鼠血清，2.5%热激活胎牛血清，100单位/毫升青霉素，及100微克/毫升链霉素，置于37℃含5%CO2的湿润温育器中。细胞每周传代培养，并保存在培养物中仅10代，以避免表型漂移。从液氮中冷冻保藏的细胞重新获取单层备用培养物(参见Zalfa Abdel-Malek et al.，Cancer Research 47∶3141-6(1987))。
通过除去皮下脂肪，然后将皮肤样品切成小片，从移植前和移植后(移植12至15周之后)的皮肤样品中制备蛋白质提取物。用polytron匀浆器制皮肤匀浆，制备20-30%含1mM甲苯磺酰氟(PMSF)的磷酸盐缓冲液(PBS)匀浆。2000×g离心20分钟，取出粗抽提液，再于100，000×g离心1小时，获得澄清可溶的上清部分。将上清液过滤灭菌，用Bio-Rad方法测定蛋白质含量。
然后，用含EDTA的Tyrodes溶液取代培养基，收获Cloudman S91黑素瘤细胞。将细胞按大约0.2×106/25cm2密度接种于每个瓶中。对于每个实验组，接种三瓶，并做对照瓶。24小时后，用含不同浓度的按上法制备的移植前或移植后上清液的新鲜培养基替换老的培养基，温育24小时。最后，加入含3H-酪氨酸(1微居里/毫升)和上清液(与前面所用浓度相同)的新鲜培养基，再温育24小时。按照修改的Pomerantz活性炭吸附法(如Fuller，B.B.&Viskochil，B.H.，Life Sci.24∶2405-2416(1979)所述)，原位测定酪氨酸酶的酪氨酸羟化酶活性。此检测是通过测定由酪氨酸酶将3H-酪氨酸转变为L-多巴后3H2O的释放量来测定酪氨酸酶的活性，也是对黑素生成活性的一种显著的指示，因为酪氨酸酶活性的降低将会导致相应的黑素生成活性的降低(例如皮肤色素沉着的减轻)。
与对照相比，用25微克/毫升移植后蛋白质提取物处理的黑素瘤细胞，其酪氨酸酶活性大约增加20%。浓度低于25微克/毫升不再会增加酪氨酸酶活性。然而，在较高浓度的移植后蛋白质提取物时，黑素瘤细胞的酪氨酸酶活性以剂量依赖性方式降低。浓度为50微克/毫升时，酪氨酸酶活性大约降低20%，75微克/毫升降低30%，100微克/毫升降低50%。与此对照，用移植前皮肤蛋白质提取物处理的黑素瘤细胞培养物，不显示任何有统计学意义的酪氨酸酶活性的变化。因此，显然当人皮肤移植到活的宿主上时会诱导产生出一种强有力的黑素生成抑制因子，这种抑制因子存在于移植后皮肤的蛋白质提取物中。
实施例2同样，检查了实施例1中的蛋白质提取物对正常人黑素细胞的影响。先除去新生儿背侧包皮皮下组织，而获得正常黑素细胞。然后将组织培养在0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。接着用后工将表皮从真皮撕开，两者均置于培养基中剧烈旋转。然后取出上清液，转移到一25平方厘米的组织培养瓶(步骤详见Zalfa Abdel-Malek et al.，Journal of Cellular Physiology，150∶416-25(1992))。用于上述两种提取物和保存细胞的培养基包含Ham F-10培养基，10-4M3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，5%热失活胎牛血清，5%新生牛血清，5微克/毫升胰岛素，2微克/毫升α-生育酚，2微克/毫升转铁蛋白，5纳克/毫升TPA，20纳克/毫升霍乱毒素，10，000单位/毫升青霉素，以及10，000微克/毫升链霉素。细胞仍于37℃保存在含5%CO2的湿润的温育器中。然后按0.15×106细胞/孔的密度将黑素细胞种于一起的6个孔中(表面积9.6平方厘米)。其余步骤，包括移植前和移植后(12至15周)皮肤蛋白质抽提物的提取，同实施例1。
测定了不同浓度(25-100微克/毫升)蛋白质抽提物处理的正常黑素细胞中的酪氨酸酶活性。依然观察到了移植后蛋白抽提物低浓度处理酪氨酸酶活性的增加和随后的较高浓度处理酪氨酸酶活性剂量依赖性的下降。观察到的每种浓度下酪氨酸酶活性的变化与实施例1中记录的黑素瘤细胞的结果大致相同，培养在100微克/毫升移植后蛋白质抽提物中的细胞中酪氨酸酶活性下降50%。用移植前皮肤蛋白质抽提物处理的细胞不表现任何统计上有意义的酪氨酸酶活性的变化。由此，存在于移植后皮肤蛋白质抽提物中的黑素生成抑制因子对正常黑素细胞和黑素瘤细胞两者具有同等的抑制作用。
实施例3为了检测移植前和移植后皮肤蛋白质抽提物中所含的不同蛋白质，进行了单向0.1%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。电泳使用15%丙烯酰胺凝胶，采用Laemmli所述的不连续缓冲系统(报道于Nature227∶680-5(1970))。用考马斯亮兰R-250染色显示蛋白质带。对移植前和移植后粗抽提物(2000×g)和上清液(100，000×g)(按实施例1所述方法制备)都进行了分析。此外，用TritonX-100抽提100，000×g离心后的沉淀物，以溶解任何颗粒部分，并同样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
在移植前粗抽提物和上清液蛋白质电泳结果之间没有观察到明显的差异。同样，在移植后粗抽提物和上清液之间，也没有明显的差异。然而，在移植前和移植后蛋白质电泳结果之间，存在显著的差异。最显著地是在移植后皮肤样品中独有地出现一条13至14KDa的双带。而且，用TritonX-100抽提沉淀所得部分不包含这条蛋白质带，表明这条带含有可溶性蛋白质。同时，将移植后皮肤真皮和表皮撕开，重复上述步骤。两种样品中都存在13至14KDa蛋白质带，但在表皮中显示程度更强。
同样，对在宿主上存在不同长短时间的移植后皮肤也进行了上述分析。该13至14KDa蛋白质带早在移植后两周就出现了，并且持续显现超过移植后14周。在移植后2周和14周样品之间，未记录到蛋白质带型的任何明显的差异。
实施例4为了确定该13至14KDa蛋白质带是否含多种蛋白质，对移植前后两者皮肤上清液进行了双向聚丙烯酰胺凝胶电泳。不过先用DEAE-纤维素柱(15厘米×1.5厘米)对移植后皮肤上清抽提物(如实施例1所述方法得到)进行离子交换色谱分析。将上清液(15毫升)加到色谱柱上，用磷酸盐缓冲洗柱以洗脱未结合的蛋白质。每5分钟收集5毫升级分，并对每一收集的级分测定280纳米光吸收。用磷酸盐缓冲液洗柱直至洗脱级分光吸收近于可忽略不计。此后，用0至1.0M的盐梯度(Nacl于磷酸盐缓冲液中)洗脱柱中结合的蛋白质。各级分光谱分析结果表明存在两个分立的吸收峰(280纳米处)。
接着，收集与两吸收峰有关的级分，并对含0.02%叠氮钠的重蒸馏水充分透析至少36小时。然后将透析峰样品冻干过夜以获取干粉。再将干粉溶于蒸馏水。并测定蛋白质含量。然后将此两峰级分分别进行双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
为了进行双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，将含700-800微克蛋白质的两峰级分小份样品冻干。然后将两份样品溶于9M尿素，其中含2%CHAPS去垢剂(购自SigmaChemicalCo.)、2%两性电解质(pH3-10)和2%β-巯基乙醇，室温下保温2小时。14，000rpm离心15分钟后，将样品加样于等电聚焦凝胶。用两性电解质(pH3-10)进行等电聚焦电泳，700伏过夜(如Farrell，J.Biol.Chem.250∶4007-21，(1975)所述)。然后将凝胶用SDS-平衡缓冲液平衡至少15分钟，再上样至平板凝胶，用15%凝胶进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶用考马斯亮兰染色，以显示不同的蛋白质斑点。
在移植后皮肤上清液样品中，第一吸收峰级分中的13至14KDa蛋白质带可分辨出四个蛋白质斑点，其等电点pI值在6.5至7.5之间。然而，第二个吸收峰级分在此分子量范围内，没有显示任何蛋白质。同样，当对移植前皮肤样品重复上述步骤时，没有显现这些蛋白质。由此可看出，在移植后皮肤中发现的13至14KDa蛋白质带实际上包含四种不同的蛋白质。
实施例5为了分离和试验13至14KDa蛋白质带中包含的四种蛋白质，采用了电洗胶。移植后皮肤上清液经实施例3步骤进行单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将未染色凝胶与染色凝胶(作为标记)并排放置，从未染色凝胶中切下该13至14KDa蛋白质带。然后将凝胶切碎，转移到SchleicherandSchuell电洗脱装置的电洗脱槽中(购自S.S.Inc.，Keene，NH)。加入含20mMTris、150mM甘氨酸和.05%SDS的缓冲系统，150伏电洗脱过夜。然后收集电洗脱级分，用Centricon-3浓缩器浓缩、透析(得自AmiconCorp.，divisionofW.R.Grace&Co.，Beverly，MA)，至体积约0.5毫升。最后，将此浓缩的13至14KDa蛋白质混合物过滤灭菌，并测定蛋白质含量。
按照实施例1的步骤，来检测电洗脱蛋白质对黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性的影响。将从移植后皮肤上清液中获得的13-14KDa蛋白质混合物加到细胞培养物中，浓度范围从0.25到1.0微克/毫升。为了保证观察到的效应的确是由于来自移植后皮肤的13-14Da带中的蛋白质混合物所致，也用移植前皮肤上清液进行了同样的步骤。
得自移植后皮肤的13-14KDa蛋白质混合物引起了黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性相当显著的剂量依赖性下降。事实上，在蛋白质浓度为1.0微克/毫升时，几乎下降90%。作为对照，用相应量的得自移植前皮肤上清液的溶液进行试验，结果只引起酪氨酸酶活性轻微的，不显著的下降。
当用正常人黑素细胞(按实施例2方法所得)重复同样的试验时，该13-14KDa蛋白质混合物同样引起酪氨酸酶活性下降。浓度为0.25微克/毫升时，观察到酪氨酸酶活性大约下降37%;0.5微克/毫升时，观察到下降约为53%。当使用移植前皮肤抽提物时，观察到酪氨酸酶活性下降非常小。这些结果表明，存在于移植后皮肤抽提取物中的黑素生成抑制因子包含在该13-14KDa蛋白质混合物中。
实施例6通过检测3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入(此为细胞中DNA合成速率的量度)，测定了移植前和后皮肤抽提物对细胞增殖的影响。很明显，黑素细胞增殖的降低将会引起受观察皮肤色素沉着的相应降低，因为黑素细胞直接负责色素产生。将Cloudman黑素瘤细胞接种于一96孔平底培养板上，200微升/孔。使F-10生长培养基中的细胞附着，第二天用100微升新鲜培养基和选定量的皮肤蛋白质抽提物替换一半体积的培养基。每一实验组包含6孔。经24小时处理后，再用新鲜培养基和皮肤蛋白质抽提物替一半培养基。在后一处理期间，将细胞用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(1微居里/孔)脉冲标记。
培育24小时后，用半自动PHD细胞收获器(购自CambridgeTechnology)将细胞收集到玻璃纤维滤膜上。滤膜于空气中过夜干燥，分别转移到闪烁小瓶中，用450微升Protosol组织和凝胶溶解液处理。然后将小瓶置于烘箱中，66℃保温75分钟，再冷却。接着，第一小瓶中加入100微升冰醋酸和9.5毫升EconoFluor-2(一种非水性闪烁液)。小瓶置于冷冻闪烁计数器中冷却24小时，然后测定每分钟计数。
在使用13-14KDa蛋白质混合物(如实施例5电洗脱)的样品中，观察到对黑素瘤细胞增殖剂量依赖性的抑制(与对照样品比较)。蛋白质混合物浓度为0.25微克/毫升时，这种抑制超过30%;浓度为0.50微克/毫升时抑制几乎为50%。作为对照，用移植前皮肤抽提物处理的黑素瘤细胞只表现出轻微的不显著的抑制细胞增殖。当用正常人黑素细胞重复这些试验时，13-14KDa蛋白质混合物对正常黑素细胞增殖抑制程度相同。同样，移植前皮肤抽提物并不抑制正常黑素细胞的增殖。
为了研究其形态学，也用相差显微镜观察了培养后的黑素瘤细胞。在没有处理的细胞(对照)和用移植前皮肤抽提物处理的细胞样品中，细胞看来是正常健康的，具有显著延伸到细胞间并形成特征网络的树突。作为对照，用13-14KDa蛋白质混合物处理的细胞是不健康的，有很多不附着的、漂浮的死细胞。事实上，仅有大约40%细胞存活，细胞密度下降很多。此外，从余下的细胞中，很少有树突延伸出来，实际上所有细胞形状都是圆的。这清楚地表明，黑素生成抑制因子不但抑制色素细胞增殖，而且对黑素瘤细胞具有细胞毒性。
实施例7为了确定从移植后的皮肤中分离的13-14KDa蛋白质混合物是否只是一种一般代谢抑制剂，用正常人成纤维细胞重复了3H-胸腺嘧啶脱氧核苷细胞增殖试验。正常人二倍体所生儿包皮成纤维细胞购自Clonetics Corporation，并在到货后，在T-25瓶中，用加有10%胎牛血清的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)培养。37℃培育三天后，将成纤维细胞用胰蛋白酶处理，以每平方厘米3，000个细胞的密度接种到48孔微量滴定板上。然后37℃培育三天。接着，将培养基换成含0.2%血清的DMEM，细胞在这种环境保持四到五天，不加任何其他添加物。
进行了两种类型的试验激动剂和拮抗剂。在激动剂试验中，将不同浓度的移植后皮肤蛋白质抽提液加入随机选择的孔中。用成纤难细胞生长因子(FGF)作为阳性对照。同时加入3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(以研究增殖)或3H-脯氨酸(以研究胶原产生)。细胞在此培养基中分别培养二天(增殖)和四天(胶原产生)。然后移去培养基，洗涤细胞，然后用SDS溶解细胞。将1毫升溶解物加到9毫升闪烁液中并计数。拮抗剂试验采用同样的步骤，只是还将FGF加到含蛋白质混合物的每个孔中，以确定是否混合物中的活性组分与FGF竞争并表现出3H-胸腺嘧啶脱氧核苷或3H-脯氨酸掺入的相应降低。在激动剂或拮抗剂试验中，蛋白质抽提物对细胞增殖和胶原产生没有显示出任何效应，无论其浓度如何。因此，明显地，13-14KDa蛋白质混合物的作用是对色素细胞特异的，而且该混合物中的黑素生成抑制剂也不仅仅是一种一般代谢抑制剂。
实施例8
实施例4所述的研究表明，起黑素生成抑制作用的13-14KDa蛋白质混合物实际上包含四种不同的蛋白质，因此，进行了试验以确定其中哪种蛋白质与观察到的效应有关。用如实施例4的DEAE-纤维素离子交换柱将移植后皮肤上清液分级分离。收集合并与第一个峰相应的级分(见实施例4)，再将此混合物透析、冻干。然后进行双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(如实施例4所述)，以将此蛋白质混合物分成前面发现的四种不同的蛋白质。用考马斯亮兰将凝胶染色，分别从凝胶中切下四种蛋白质“斑点”。然后将四种蛋白质的每一种从凝胶中电洗脱下来(如前所述)并浓缩。再测定所得溶液的蛋白质含量。这样，获得四种纯化的蛋白质(相互分离的)。
用前述的步骤研究Cloudman黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性和3-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入。这些试验中采用蛋白质浓度大约1.0微克/毫升的每一种纯化蛋白质，作为对照，实验中包含了未处理的和α-MSH(10-7M)处理的细胞培养物。用与第三种蛋白质“斑点”对应的纯化蛋白质处理的培养物，其酪氨酸酶活性大约下降40%。但是，用其余三种蛋白质处理的培养物，未显示酪氨酸酶活性的明显下降。类似地，当对应于第三“斑点”的纯化蛋白质存在时，细胞增殖受到显著的抑制(约45%)，但其他蛋白质对细胞增殖没有明显影响。
根据这些试验，显然从第三种凝胶“斑点”电洗脱下来的蛋白质是与前面观察到的黑素生成抑制作用和细胞增殖抑制作用有关的。前面的双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，这种对应于第三“斑点”的黑素生成抑制因子(“MI”)蛋白质，其分子量约为14，000，等电点大约在7.2至7.5之间。
实施例9为了测定该13-14KDa蛋白质混合物中所含四种蛋白质的氨基酸顺序，再对按前述方法分级分离的移植后皮肤抽提物进行双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。将蛋白质印迹到ImmobilonPSQ(一种聚二氟乙烯膜)，用酰胺黑染色显示。然后从印迹处切下四种“斑点”，与碘乙酰胺反应，再进行顺序测定。蛋白质顺序测定在AppliedBiosystems475A蛋白测序仪上按脉冲液相化学法进行(Speicher，D.W.，(1989)，TechniquesinProteinChemistry，(T.E.HugliEd.)，AcademicPress，SanDiego，CA，pp.24-35)。
第一“斑点”部分N-端氨基酸顺序分析表明，该蛋白质与小鼠transthyretin或前清蛋白相同。Transthyretin是一种血清蛋白质，分子量55KDa，但是它是由四种相同的亚基组成，亚基分子量约为14KDa。第二“斑点”顺序分析表明，该蛋白质与血红蛋白一条链有很高的同源性。第四“斑点”的顺序与已知蛋白质只有很低或没有同源性。
由于完整的MI蛋白质(第三“斑点”)的N-端氨基酸顺序分析表明，该蛋白质N-端是封闭的，因此决定用蛋白酶将其消化成片段，然后对产生的肽段测序。将四个ImmobilonPSQ印迹点MI蛋白质切下，还原，用碘乙酰胺烷化，再用内切蛋白酶LysC消化(Stone，K.L.，M.B.LoPresti，J.M.Crawfrod，R.DeAngelisandK.R.Willims，(1989)，APracticalGuidetoProteinandPeptidePurificationforMicrosequencing，，(P.T.Matsudaira，Ed.)，AcademicPress，SanDiego，CA，pp.31047)。
MI蛋白质蛋白酶解后，对其中第二峰的顺序测定更为成功，并得到下列氨基酸顺序
SEQIDNO1ThrGlnThrValXaaAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHis151015GlnGluXaaXaaGlyLys20“Xaa”表示的位点是指尚未确证或根本就没能测定的位点。将第5位暂定为Cys，第19位暂定为Asp。有趣的是，该蛋白质片段C-端12个氨基酸中有(个与小鼠脂肪酸结合蛋白(mFABP)的一个区域相对应，但是该片段N-端没有发现任何明显的同源性。
得自MI蛋白质的第三峰的顺序测定如下SEQIDNO2LeuValValGluCysValMetAsnAsnValThrCysThrArgXaa151015TyrGluLys此外，将第15位暂定为Ile。此例中，该片段18个氨基酸的13个与mFABP一区域对应，在第12，15和18位氨基酸处仅有保守的改变。
在此序列测定的基础上，显然MI蛋白质与mFABP高度相关，虽然肯定不是相同的。小鼠脂肪酸结合蛋白属于一个蛋白质家族，其中包括脂肪酸结合蛋白、视黄酸结合蛋白、脂肪细胞分化蛋白质和髓磷脂P2蛋白，而且，根据两段已测定的顺序，预计MI蛋白质也是该家族的一员。这样，由于该家族中大部分蛋白质包含大约131个氨基酸，进一步可以预计MI蛋白质包含大约131个氨基酸。MI蛋白质与已知的蛋白质如mFABP有密切的同源性，这一事实也强有力地表明，如申请人的研究所示，它是一种生物学有关的分子。
实施例10为了测定MI蛋白质的全顺序，制备了针对MI蛋白质的合适的寡核苷酸探针，如下所列5′-CAGCCCGCCCGCACC-3′5′-AAAAAAGAAAGAAACAGTATG-3′利用这些寡核苷酸对人皮肤RNA进行多聚酶链反应(PCR)，其中人皮肤是按前述方法移植到裸鼠后所得。PCR反应导致产生相当数量的编码MI蛋白质的单一大小的DNA。然后将分离的DNA克隆到顺序测定载体并按已知方法测定其顺序。核酸序列如下所示(相应的MI蛋白质氨基酸顺序与列于对应的密码子之下，数目表示MI蛋白质中氨基酸的位置)SEQIDNO3ATGGCCACAGTTCAGCAGCTGGAAGGAAGATGGCGCCTGGTGMetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510GACAGCAAAGGCTTTGATGAATACATGAAGGAGCTAGGAGTGAspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025GGAATAGCTTTGCGAAAAATGGGCGCAATGGCCAAGCCAGATGlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540TGTATCATCACTTGTGATGGTAAAAACCTCACCATAAAAACTCysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055
GAGAGCACTTTGAAAACAACACAGTTTTCTTGTACCCTGGGAGluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GAGAAGTTTGAAGAAACCACAGCTGATGGCAGAAAAACTCAGGluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ACTGTCTGCAACTTTACAGATGGTGCATTGGTTCAGCATCAGThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GAGTGGGATGGGAAGGAAAGCACAATAACAAGAAAATTGAAAGluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110GATGGGAAATTAGTGGTGGAGTGTGTCATGAACAATGTCACCAspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125TGTACTCGGATCTATGAAAAAGTAGAATAACysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135为简明起见,整个MI蛋白质顺序如下所示:
SEQIDNO:4:
MetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510AspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025
GlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540CysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055GluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110AspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125CysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135为了证明SEQ ID NO4确实是MI蛋白质，按熟知的方法从SEQ ID NO4重组表达出一种蛋白质。然后通过检测3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入速率(与实施列6方式类似)，测定该重组表达蛋白质对黑素细胞增殖的效应。结果观察到显著的对黑素细胞增殖的剂量依赖性抑制，这清楚表明，从SEQ ID NO4重组表达的蛋白质的确是MI蛋白质。因此，MI蛋白质的结构便如SEQ ID NO4所示。如熟悉本领域人员所能认识的，SEQ ID NO3也可用于熟知的方法，来证明根据申请人的的合成方法制备的任何产物的确是MI蛋白质。
实施例11为了检测MI蛋白质对色素过多沉着的移植皮肤的体内影响，将包含MI的完整13-14KDa蛋白质混合物注射到按前述方法预先移植到裸鼠上的人皮肤中。在这些试验中用了七只小鼠，而且试验前这些小鼠已经支持人皮肤移植物10至12个月。这些试验的异种移植物中存在不同程度的色素过多沉着。
将用于试验的小鼠进一步分成一个实验组(5只小鼠)和一个对照组(其余2只小鼠)。对照组小鼠不给予任何注射。实验组中，按每周间隔，在人皮肤移植物左侧进行皮下注射，共注射5周。每次注射剂量为50微升溶液，其中包含2微克蛋白质混合物，其余为生理盐水。作为一种内部对照，按同样时间间隔在移植物右侧注射50微升生理盐水。在第一轮5次注射一周之后，重复进行整个试验方案。但是，第二轮5次注射时，注射部位改变了。在此期间，蛋白质混合物注射到移植物背部区域，而生理盐水(对照)注射到移植物腹部区域。
在一系列注射之前，第一轮5次注射之后一周(但在第二轮注射之前)以及最后注射之后分别对皮肤移植物进行了活组织检查。活检部位取自注射蛋白质级分和生理盐水的位点附近。也对对照组进行了活组织检查。
对每一活检中多巴阳性黑素细胞进行了计数，试验的总结果如下列于表1。多巴阳性黑素细胞数目是黑素细胞中酪氨酸酶活性的一种直接量度。示于表1的结果表明，含MI蛋白质的蛋白质混合物能降低酪氨酸酶活性。多巴阳性黑素细胞数目的减少从9.0%到32.3%。对照组或实验组注射生理盐水部位的活检结果，表明没有任何明显的减少。
表1多巴阳性黑素细胞数目的减少(%)小鼠蛋白质混合物注射部位盐水注射部位A32.32.5B29.01.3C24.60D9.00E10.12.0F-对照00G-对照00目视检查小鼠表明，经过仅两次蛋白质混合物注射之后，色素过多沉着明显减少，特别是注射部位。在对照组或实验组注射生理盐水部位，没有观察到这种减少。
将几个活检切片还用苏木精和曙红染色，进行显微镜观察，以检查由于蛋白质混合物的注射引起的任何形态学变化。实验组和对照组之间没有什么差别，两组都没有表现出任何表皮或真皮损伤或毒性的迹象。由此，MI蛋白质能够减少色素过多沉着而不引起不希望产生的副作用。
实施例12为了检测MI蛋白质在预防或延缓移植后通常立刻发生的皮肤移植物色素过多沉着中的作用，将实施例11中使用的蛋白质混合物也注射到刚刚支持人皮肤移植物2周的裸鼠上。采用实施例11中的方法，不过只进行第一轮5次注射。将蛋白质混合物注射到皮肤移植物背部，生理盐水注射到腹部。在将要进行第一次注射前，对多巴阳性黑素细胞进行起始计数。
目视检查小鼠揭示出在蛋白质混合物注射部位色素过多沉着有些减少。更为重要的是，如表2所示，从蛋白质混合物注射部位取样活检表明，多巴阳性黑素细胞数目又一次显著减少。如所预料，作为对照，从对照组和实验组生理盐水注射部位取样活检，表明多巴阳性黑素细胞数目增加。增加范围从190%到300%，而含MI的蛋白质混合物引起的减少范围从8.3%到31.6%。注射蛋白质混合物的小鼠也无任何毒性迹象。这一结果证实，MI蛋白质能防止或逆转色素过多沉着，很可能是通过改变酪氨酸酶活性，而不是通过影响细胞生活能力。
表2多巴阳性黑素细胞数目的减少(%)小鼠蛋白质混合物注射部位盐水注射部位H-31.6+230I-17.5+300J-11.2+210K-27.5+190L-8.3+200M-对照>+200+240N-对照>+200+228实施例13另外也检查了MI蛋白质对色素正常的小鼠(C57BL/6)的体内效应。这种特殊类型的小经证明对于研究色素沉着和毛发生长是有用的，因为这种小鼠躯干皮肤色素沉着起源于毛囊中而不是表皮中的黑素细胞。一旦将这些毛囊除去，下面的皮肤就由于黑素细胞的减少而变得色素减少。虽然毛囊除去后马上又会长出来，但皮肤的色素沉着再发生要5到6天之后。这样，这种小鼠是一种良好模型，用于检查MI蛋白质在延缓色素重新沉着中的作用。
使用5只C57BL/6小鼠，从背部左右两边小块区域除去毛囊。将实施例11中所用的蛋白质混合物(体积50微升，含2微克蛋白质混合物)皮下注射到每只小鼠左背部除去毛囊区域。作为对照，将获自正常人皮肤(在任何移植之前)的电洗脱13至14KDa蛋白质级分注射到每只小鼠右背部区域。该正常人皮肤蛋白质级分按前述相同方法获得。每天注射1次，共5天。每天照相以监测皮肤颜色变化，并从每只小鼠左右背部区域取样活检。
注射含MI蛋白质的蛋白质混合物的左背部区域，在仅注射2次之后，就表现出皮肤颜色减淡，而右背部区域未观察到皮肤颜色明显减淡。此外，与右边(对照)相比，左背部区域新毛囊的出现也延迟了。
对左右背部区域两边取样进行活检，其苏木精和曙红染色图象看来是正常的，两者间也没观察到任何形态学差异。另外也没有任何毒性迹象，但是注射了含MI蛋白质的蛋白质混合物的左背部区域的活检结果显示出毛囊中黑色素染色减少(如多巴染色所示)。B.药用和化妆品组合物及方法如本文中所用，“局部施用”指直接敷于或涂布于皮肤外部;“皮肤注射”指通过皮下注射针将物质引入皮下或皮肤中;“包含”、“包括”(comprising)指可以加入不影响最终结果的其它步骤和其它成分。这最后一个术语就包含了“由…组成”和“基本由…组成”。
本发明还涉及到一种组合物，包含a)一种抑制色素细胞中黑素生成的足够纯的蛋白质，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或类似物，所述蛋白质分子量约为14，000，等电点大约在7.2到7.5之间，以及具有SEQIDNO4的氨基酸顺序;和b)一种化妆用或药用可接受的载体。在本发明的一项实施方案中，该载体是一种可注射的载体。在本发明的另一项实施方案中，该载体是一种局部应用的载体。
本发明的组合物包括固体的，半固体的，或液体的在化妆品方面和/或生理学上可接受的载体，以使MI蛋白质，或其活性片段、衍生物或类似物能够以合适的浓度释放到所需靶部位。载体本身可以是惰性的或者可以具有生理的或药用的价值。载体的性质将由所选择的该组合物的用法所决定。安全有效的载体的量比较好的是占组合物的约50%到约99.9999%，更好是约90%到约99.9%。这些载体配方的变化将会导致产生大量不同的产品，它们都在本发明的范围之内。MI蛋白质或其活性片段、组合物的用法可以从体内给药法如注射到局部外用法。
MI蛋白质或其活性片段较好的给药法是通过皮肤注射。这种给药法的辅助载体较好的是包括水或盐溶液，理想的是等渗盐溶液。
MI蛋白质或其活性片段更好的用法是局部施用。本发明的局部药用组合物可以制成大量不同类型的产品。包括(但不局部于)洗剂、冷霜类、防晒油类、凝胶、粘剂、喷雾剂、软膏、糊剂、摩丝和化妆品。这些产品种类可以包括几种类型的载体系统，包括(但不局限于)溶液、乳剂、凝胶和固体。
本发明的局部药用组合物还包含一种局部药用可接受的润肤剂，含量从约2%到约50%。如本文中所用，“润肤剂”指用于预防或减轻皮肤干燥及保护皮肤的物质。已知大量合适的润肤剂可以用于此处。Sagarin，Cosmetics，ScienceandTechnology，2ndEdition，Vol.1，pp32-43(1972)(结合于此作为参考)包含大量合适物质的例子。特别有用的具有护肤作用的润肤剂为甘油、己三醇、丁三醇、乳酸及其盐、尿素、吡咯烷酮羧酸及其盐、氨基酸类、胍、双甘油和三甘油。
本发明进一步涉及一种抑制哺乳动物皮肤和/或毛发中黑素生成的方法。该方法包括用安全有效量的MI蛋白质或其活性片段、衍生物或类似物处理皮肤和/或毛发。根据受试者已经存在的色素沉着和/或黑素生成水平以及所希望的黑素生成抑制程度，所用的MI蛋白质或其活性片段的剂量和处理频度将有广泛变动。
较好的处理皮肤和/或毛发的方法是经皮注射安全有效剂量的MI蛋白质或其活性片段来抑制哺乳动物皮肤和/或毛发中的黑素生成。MI蛋白质或其活性片段注射所用的载体较好的是包括水或盐溶液。根据个人需要，皮肤注射的MI蛋白质或其活性片段的量及注射频度可有很大变动。作为皮肤注射处理的一个例子，建议将包含MI蛋白质或其活性片段的适于皮肤注射的组合物按每天一次到每六个月一次进行皮肤注射，较好的是从每周三次到第月一次，更好是每周一次到每月两次。用于皮肤注射的组合物可包含约0.0001%到约10%，较好的是约0.001%到约5%，更好的是0.01%到1%的MI蛋白质。注射期可以为约一个月到约十年，较好的是约三个月到约两年，更好是的约六个月到约一年，从而对哺乳动物皮肤和/或毛发黑素生成产生抑制作用。
更好的一种处理皮肤和/或毛发的方法是通过局部施用安全有效量的MI蛋白质或其活性片段来抑制哺乳动物皮肤和/或毛发中的黑素生成。根据个人需要，MI蛋白质或其活性片段的量以及局部施用于皮肤和/或毛发的频度可变化很大，但作为一个例子，建议局部施用可从约每周一次到约每天十次，较好是约每周两次到约每天四次，更好是每周三次到每天两次，最好是约每天一次。局部施用组合物可包括约0.001到约20%、较好为约0.01%到约10%、更好为约0.1%到约5%的MI蛋白质或其活性片段、衍生物或类似物。局部施用期较好是从约一个月到约十年，更好为约三个月到约两年、再好些为约六个月到约一年，从而对哺乳动物皮肤和/或毛发中的黑素生成产生抑制作用。
下面的实施例进一步描述和论证本发明范围内某些较好的具体实施方案。给予实施例仅为了说明起见，而不能认为是对本发明的限制，因为它们的很多变化是可能的，而不会违背本发明的精神实质和范围。这些实施例仅仅用来证实可以怎样使用本发明的黑素生成抑制剂。
实施例14利用常规混合技术，将下列组分合并制成一种水包油乳剂。
组分占组合物的重量百分比去离子水足够量甘油3羟苯甲酸甲酯0.2MI蛋白质0.1Steareth20(Brij78R)1单硬脂酸甘油酯和PEG1000.5(Arlacel165R)Carbopol940(B.F.Goodrich，0.2Cleveland，OH)99%三乙醇胺0.2十六烷醇1.0十八烷醇1.0羟苯甲酸丙酯0.1Diisiopropyldimerate2.0C12-C15醇苯甲酸酯 6.0咪唑烷醇尿素0.3该组合物局部施用抑制皮肤和/或毛发中的黑素生成是有用的。使用组合物的量为足以使皮肤和/或毛囊沉积MI蛋白质约0.01毫克/平方厘米的量。该组合物每天施用一次，可终身使用。
实施例15利用常规混合技术合并下列组分制成一种透明凝胶。
组分占组合物的重量百分比去离子水足够量Carbopol980(B.F.Goodrich，0.5Cleveland，OH)EDTA-2Na0.02SEQIDNO10.599%三乙醇胺0.5丙二醇3.0羟苯甲酸甲酯0.2该组合物局施用抑制皮肤和/或毛发中的黑素生成是有用的。使用组合物的量为足以使皮肤和/或毛囊中沉积的MI蛋白质活性片段约0.01毫克/平方厘米的量。该组合物每天施用三次，使用六个月。
实施例16利用常规混和方法合并下列组分制成一种水包油聚合物乳剂。
组分占组合物的重量百分比去离子水足够量Carbopol980(B.F.Goodrich，0.2Cleveland，OH)PemulenTR-2(B.F.Goodrich，0.15Cleveland，OH)甘油3.0SEQIDNO20.7599%三乙醇胺0.35棕榈酸鲸蜡酯2.0二氧代硬脂酰三甲基硅烷和1.0十八烷醇角鲨烷6.0羟苯甲酸丙酯0.1
羟苯甲酸甲酯0.2咪唑烷醇尿素0.3该组合物局部施用抑制黑素生成是有用的。用量为足以使皮肤和/或毛囊沉积的MI蛋白质活性片段达0.1毫克/平方厘米的量。该组合物每周施用一次，使用一年。
实施例17利用常规混合技术合并下列组分制成一种水包油微乳状液。
组分占组合物的重量百分比去离子水足够量MI蛋白质1.0PEG4脱水山梨醇单月桂酸酯22.5PEG5脱水山梨醇单油酸酯2.5Cetearyl，octanoate25.0DMDM乙内酰脲和3-碘-2-0.2丙炔基丁基氨基甲酸酯(glydantplus)该组合物局部施用抑制黑素生成是有用的。用量为足以使皮肤和/或毛囊中沉积的MI蛋白质达0.4毫克/平方厘米的量。该组合物每周施用三次，使用五年。
可以理解，能进行修改而不违背本发明的精神实质。这样，可以理解申请人的发明不仅包括完整MI蛋白质及其使用和制备的方法，而且包括MI蛋白质的活性片段。同样，本领域技术人员能够制备MI蛋白质的衍生物和类似物，例如对MI顺序中一个或多个氨基酸进行保守改变。此外，非肽类模拟物也可以按照MI蛋白质的活性片段而模仿出来，这样，这些模拟物并不违背本发明的精神实质。相应地，本发明的范围应该按下列权利要求书考虑，而且可以理解，它并不局限于说明书中所显示和描述的。
权利要求
1.一种产生抑制色素细胞黑素生成的蛋白质的方法，其特征在于包括下列步骤(a)将哺乳动物皮肤移植到活的宿主上；(b)使所述哺乳动物皮肤在所述活的宿主上保持预定的一段时间；(c)从所述宿主移去所述哺乳动物皮肤；和(d)从所述皮肤中提取所述蛋白质。
2.按照权利要求1的方法，其特征还在于，所述宿主是裸鼠。
3.按照权利要求2的方法，其特征还在于，哺乳动物皮肤是人皮肤。
4.按照权利要求3的方法，其特征还在于，使所述人皮肤在所述宿主上至少保持两周。
5.按照权利要求4的方法，其特征在于，所述蛋白质的所述提取包括下列步骤(a)用生理盐水从所述皮肤提取一种皮肤蛋白质抽提物;(b)通过离子交换色谱法将所述皮肤蛋白质分级分离成至少两种溶液，其中至少一种所述溶液包括所述蛋白质;(c)将包含所述蛋白质的一种所述溶液进行双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以在聚丙烯酰胺凝胶上将所述蛋白质分离成一个斑点;和(d)从所述斑点电洗脱所述蛋白质。
6.按照权利要求5的方法，其特征还在于，所述蛋白质具有下列氨基酸顺序SEQIDNO4。
7.一种抑制色素细胞黑素生成的足够纯化的蛋白质，其特征在于所述蛋白质具有下列氨基酸顺序SEQIDNO4，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或类似物。
8.一种抑制色素细胞黑素生成的足够纯化的蛋白质，其特征在于所述蛋白质具有下列氨基酸顺序SEQIDNO4。
9.一种控制色素细胞黑素生成的方法，其特征在于包括下列步骤(a)提供有效量的黑素生成抑制剂，它包括黑素生成抑制因子蛋白质，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或类似物，所述蛋白质具有下列氨基酸顺序SEQIDNO4;(b)将所述黑素生成抑制剂与合适的载体合并;和(c)将所述合并的黑素生成抑制剂施用于要控制的色素细胞。
10.按照权利要求9的方法，其特征还在于，所述施用步骤是通过注射进行的。
11.按照权利要求9的方法，其特征还在于，所述施用步骤是通过局部施用而进行的。
12.按照权利村注11的方法，其特征还在于所述色素细胞是皮肤色素细胞。
13.根据权利要求11的方法，其特征还在于，所述色素细胞是毛发色素细胞。
14.根据权利要求10的方法，其特征还在于，所述黑素生成抑制剂是所述黑素生成抑制因子蛋白质。
15.根据权利要求11的方法，其特征还在于，所述黑素生成抑制剂是所述黑素生成抑制因子蛋白质。
16.一种选择性消灭黑素瘤细胞的方法，其特征在于，包括下列步骤(a)提供有效量的黑素生成抑制剂，它包括黑素生成抑制因子蛋白质，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或类似物，所述蛋白质具有下列氨基酸顺序SEQIDNO4。(b)将所述黑素生成抑制剂与合适的载体合并;和(c)将所述合并的黑素生成抑制剂施用于要消灭的黑素瘤细胞。
17.按照权利要求16的方法，其特征还在于所述黑素生成抑制剂是所述黑素生成抑制因子蛋白质。
18.按照权利要求17的方法，其特征还在于，所述施用步骤是通过注射进行的。
19.按照权利要求17的方法，其特征还在于，所述施用步骤是通过局部施用进行的。
全文摘要
一种纯的天然黑素生成抑制因子蛋白质，能抑制色素细胞黑素生成，氨基酸顺序为SEQIDNO:4。一种产生黑素生成抑制因子蛋白质的方法，包括将哺乳动物皮肤移植于活宿主，保持预定时间后移去此皮肤，并从中提取该蛋白质。控制色素细胞黑素生成或选择性消灭黑素瘤细胞的方法，包括将有效量黑素生成抑制因子蛋白质或其活性片段、衍生物或类似物与合适载体混合，将此混合物施用于色素细胞或黑素瘤细胞。
文档编号C07K14/47GK1092294SQ9311483
公开日1994年9月21日 申请日期1993年11月24日 优先权日1992年11月24日
发明者J·J·诺德伦德, J·Z·法鲁奎 申请人:辛辛纳提大学
技术领域：
本发明涉及一种黑素生成抑制剂，及其制备和使用的方法。更为具体地，该黑素生成抑制剂包含一种天然的蛋白质或其有效片段。它能降低酪氨酸酶活性、抑制色素细胞增殖，并对黑素瘤细胞有细胞毒性。
色素沉着过多症影响全世界许多人，常常使人极其窘迫或产生更坏后果。这类疾病包括诸如雀斑、日照着色斑(褐黄斑)、烧伤病人移植皮肤常见的颜色明显变深，以及最为严重的黑素瘤。此外，许多人仅仅从美容角度也希望减轻他们的皮肤底色。
过去采用了不同的方法来降低色素沉着过多区域的色素沉着或减轻皮肤底色。虽然这些治疗取得了种种结果，然而大部分会产生不希望得到的副作用。用于漂白皮肤或脱去色素的化合物包括氢醌及其衍生物。氯化氨基汞、抗坏血酸、巯基胺类、4-异丙基儿茶酚、以及过氧化物。然而没有一种业已证明是完全可靠，没有副作用的。
欧洲专利申请389，950揭示了一种促黑素细胞激素(MSH)抑制剂，据报道其对诸如预防或减轻褐黄斑或雀斑等症状是有用的。该抑制剂包含由下列式子代表的氨基酸顺序-His-Ser-Arg-Trp-;-Trp-Arg-Ser-His;或-Leu-Ala-Cys-Ala-Arg-。前面二种顺序代表的肽类对黑素细胞表面包含的MSH受体具有亲和力，由此拮抗MSH。第三种顺序代表的肽类对MSH本身具有亲和力，由此抑制MSH的作用。
在他们发明之后，申请人得知一篇新近的出版论文，其中揭示了一种蛋白质，可能与他们已经制备的有关，事实上可能是一样的(Madsen，P.etal.，I.InvestDermatol99∶299-305(1992)。这种蛋白质据报道在牛皮癣角质细胞中受到高度的正调节，但是报道没有提到与黑素生成的关系。
一种更为严重的皮肤色素沉着过多症是黑素瘤。它影响世界上数百万人。虽然早期诊断的活，有时可以得到治疗，但黑素瘤常常是致命的。目前已有的治疗方法，如化学疗法，常会引起严重的副作用，并且从不会对所有病人完全有效。
然而，迄今为止，没有一种天然来源的组合物能够可靠的抑制黑素生成，由此减少皮肤色素沉着，并对黑素瘤细胞有选择性细胞毒性，而且没有任何副作用。
下面描述本发明的一些重要特征和目的，但不是全部的。
本发明的一个目的是提供一种天然来源的黑素生成抑制剂，用于减少皮肤色素沉着，有选择地破坏黑素瘤细胞。
本发明的另一个目的是提供一种天然来源的黑素生成抑制剂，包含一种天然来源的黑素生成抑制因子蛋白质或其有效片段。
本发明的另一个目的是提供一种制备黑素生成抑制因子蛋白质的方法。
本发明的另一个目的是提供一种利用天然来源的黑素生成抑制因子蛋白质或其有效片段来控制皮肤和/或毛发色素沉着。
本发明的另一个目的是提供一种利用天然来源的黑素生成抑制因子蛋白质或其有效片段来破坏黑素瘤细胞，而不影响正常的非色素细胞。
如本文所用，“黑素生成”是指由活细胞生成黑素;“抑制黑素生成”包括抑制各个细胞产生黑素的能力和/或减小能产生黑素的细胞群体。
按照本发明的一个方面，提供了一种在此之前未知的天然来源的蛋白质，它能够抑制色素细胞的黑素生成，选择性破坏黑素瘤细胞，而不伤害其他细胞。该黑素生成抑制因子(MI)蛋白质具有下列氨基酸顺序(与其相应的密码子一起列出，每个氨基酸下面的数字指MI顺序中氨基酸的位置)SEQIDNO3ATGGCCACAGTTCAGCAGCTGGAAGGAAGATGGCGCCTGGTGMetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510GACAGCAAAGGCTTTGATGAATACATGAAGGAGCTAGGAGTGAspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025GGAATAGCTTTGCGAAAAATGGGCGCAATGGCCAAGCCAGATGlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540TGTATCATCACTTGTGATGGTAAAAACCTCACCATAAAAACTCysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055GAGAGCACTTTGAAAACAACACAGTTTTCTTGTACCCTGGGAGluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GAGAAGTTTGAAGAAACCACAGCTGATGGCAGAAAAACTCAGGluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ACTGTCTGCAACTTTACAGATGGTGCATTGGTTCAGCATCAGThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GAGTGGGATGGGAAGGAAAGCACAATAACAAGAAAATTGAAAGluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110
GATGGGAAATTAGTGGTGGAGTGTGTCATGAACAATGTCACCAspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125TGTACTCGGATCTATGAAAAAGTAGAATAACysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135为了简明起见,整个MI蛋白质的顺序如下所示:
SEQIDNO.4:
MetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510AspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025GlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540CysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055GluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110
AspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125CysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135按照本发明的另一个方面，提供了一种制备MI蛋白质的方法，包括下列步骤(a)将哺乳动物皮肤，较好是人皮肤，移植到活的裸鼠上;(b)让此哺乳动物皮肤在裸鼠上保持预定的一段时间;(c)从裸鼠上移走此哺乳动物皮肤;以及(d)从此哺乳动物皮肤提取包含MI蛋白质的蛋白质部分。较好是让哺乳动物植皮在裸鼠上保持至少6个星期。同样，较好是提取步骤包括用生理盐水从哺乳动物皮肤提取蛋白质，用离子交换色谱法分级分离皮肤蛋白质提取物，用双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离色谱法得到的适当的级分中的皮肤蛋白质提取物，以及用电洗脱法从电泳凝胶中分离MI蛋白质。
按照本发明的另一个方面，还提供了一种控制色素细胞(特别是皮肤和毛发中的色素细胞)黑素生成的方法，其步骤包括形成一种有效量MI蛋白质和合适载体的混合物，然后将此混合物施用于欲控制的色素细胞。MI蛋白质或其活性片段可施用于例如皮肤，来治疗某些色素沉着过多症或仅仅为了美容目的。MI蛋白质也可施用于美容方面的毛发脱色或减色，例如使体毛(如阴毛，腋毛，胸毛，腿毛，臂毛，背毛)变得不那么清晰可见。使用这种组合物可使刮顺，脱毛或电针除毛不便之处较少见，比较好的是将混合物局部施用于色素细胞，并且最好是用MI蛋白质活性片段。或者M白质或其活性片段可以与适当的载体一起注射，以便将组合物施用于色素细胞。合适的载体可有无数种，其选择依赖于施用的最终目的。这样，MI蛋白质或最好是其活性片段，可以与皮肤修补剂结合使用，以减轻老年斑，同时也改善皮肤皱纹状态。
按照本发明的另一个方面，提供了一种通过将有效剂量的MI蛋白质或其活性片段与合适载体混合，应用于黑素瘤细胞，从而选择性破坏黑素瘤细胞的方法。同样先多种载体可以使用，其选择依赖于该组合物的应用方法。比较好的是将该组合物局部使用，并且利用MI蛋白质的活性片段。
A.MI蛋白质的开发研究移植到烧伤病人的皮肤色素过多沉着以前已有记载，并被认为是一种炎症后机制起作用的结果。也观察到皮肤色素沉着增加与日照灼伤和其他皮炎过程的关系，并把这种增加归结于功能性黑素细胞(“多巴阳性”黑素细胞)数量的增加和黑素细胞实际黑素合成的增加。
为了检查移植皮肤的色素反应，将小块人皮肤样本植到先天性无胸腺小鼠(裸鼠)上。裸鼠经证明是一种用于研究正常和病理异种移植组织体内行为的优异宿主，因为它们不会排斥不同系统发生来源的移植物。裸鼠已经广泛地用于人类皮肤的研究。移植到裸鼠上的人类皮肤仍保持其结构和免疫特性，以及一些主要的功能性质。
在这一讨论和接下来的所有实施例中，存活的供体皮肤来自于高加索人种成人尸体。用植皮刀取皮肤，厚度为一吋的12-14/1000，并贮存于F-12组织培养基(自GibcoLaboratories，GrandIsland，NY)，4℃。将裸鼠先用Nembutol麻醉，从躯体合适部位除去皮肤，准备移植部位。将裂口厚度(12-14/1000吋)的供体皮肤置于小鼠合适部位并缝合得当。移植皮肤是在供体死亡48小时之内移植到小鼠上的。需要时，将小鼠用过量的Nembutol处死，通过消毒外科技术，取下异种移植物。
如所期望，这种异种移植物表现出与报道的烧伤病人中相同的色素过多沉着。在移植之前以及移植后不同时间，对异种移植物进行了各种组织学试验和检查，以研究这种观察到的色素过多沉着。明显的异种移植物颜色变深早在移植两周后就出现了。而且，尽管存在观察关异，所有的异种移植物都表现出色素过多沉着。然而，观察到的色素过多沉着只局限于异种移植物，并不延伸到宿主皮肤。
异种移植物样本的显微镜分析揭示出与移植前相比，异种移植物中多巴阳性黑素细数量有显著的增加。多巴阳性细胞是指存在功能性酪氨酸酶的细胞，因而能产生色素。虽然增加的程度有些不同，但是多巴阳性黑素细胞数目的增加至少有3倍，而且所有的样本在移植后6周左右都出现一个峰值。从这点开始，多巴阳性黑素的细胞数目逐步下降，但在某些异种移植物中，迟至移植30周，仍会维持在略有增加的程度。
作为黑素生成活性的一种指示，也测定了黑素细胞体的大小。在所有的情形中，黑素细胞的大小比移植前样品中观察的要大一倍以上，同时细胞大小变化也显示出一个峰值，随之逐步减小。此外，异种移植物中黑素细胞树突也显著增加。树突的增加一般会导致皮肤色素沉着的增加，因为树突负责运输黑素至表皮。虽然色素过多沉着的程度并不总是与多巴阳性黑素细胞的数目相关，但的确倾向于与黑素细胞树突相关。这似乎表明，观察到的色素过多沉着与其说是黑素细胞实际数目增加的结果，不如说是黑素生成活性增加的结果。
为了确定低分子量和高分子量蛋白质区是否存在任何差别，对移植前和移植后的人皮肤提取液进行了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。虽然在移植后不同时间取样的样品间，蛋白质电泳带型没有任何明显的差异，但是，在移植后异种移植物样品中，独特地显示出一条表观分子量大约为13到14千道尔顿(KDa)的蛋白质带，而在移植前皮肤中没有发现此带。在趣的是，在裸鼠皮肤提取物中也发现了一种具有类似分子量的蛋白质。该13到14KDa蛋白质带早至移植后二周就出现，并持续出现到移植14周以后。
在下面的实施例中，不同的蛋白质级分和纯化的蛋白质被用于几种不同类型的细胞，以确定提取自移植前和移植后的皮肤中的蛋白质对色素作用的影响，如果有的话。移植前皮肤仅指正常人皮肤，而移植后皮肤指由裸鼠支持的活的异种移植物。这种试验的最终结果就是从上面提到的13到14KDa带中分离出单一的黑素生成抑制因子(MI)蛋白质。虽然申请人并不能确定MI蛋白质如何影响黑素生成和选择性地杀灭黑素瘤细胞，但是没有任何理由相信这些作用是通过MSH和/或其受体引起的。
实施例1采用的第一种细胞类型是克劳德曼(Cloudman)S91黑素瘤。这是一种中等程度鼠黑素沉着病细胞，已广泛用于研究黑素生成和色素细胞生长。黑素瘤细胞以单层培养物形式保存于Ham F-10培养基(购自Gibco Laboratories，Grand Insland，NY)，其中补充有10%热激活小鼠血清，2.5%热激活胎牛血清，100单位/毫升青霉素，及100微克/毫升链霉素，置于37℃含5%CO2的湿润温育器中。细胞每周传代培养，并保存在培养物中仅10代，以避免表型漂移。从液氮中冷冻保藏的细胞重新获取单层备用培养物(参见Zalfa Abdel-Malek et al.，Cancer Research 47∶3141-6(1987))。
通过除去皮下脂肪，然后将皮肤样品切成小片，从移植前和移植后(移植12至15周之后)的皮肤样品中制备蛋白质提取物。用polytron匀浆器制皮肤匀浆，制备20-30%含1mM甲苯磺酰氟(PMSF)的磷酸盐缓冲液(PBS)匀浆。2000×g离心20分钟，取出粗抽提液，再于100，000×g离心1小时，获得澄清可溶的上清部分。将上清液过滤灭菌，用Bio-Rad方法测定蛋白质含量。
然后，用含EDTA的Tyrodes溶液取代培养基，收获Cloudman S91黑素瘤细胞。将细胞按大约0.2×106/25cm2密度接种于每个瓶中。对于每个实验组，接种三瓶，并做对照瓶。24小时后，用含不同浓度的按上法制备的移植前或移植后上清液的新鲜培养基替换老的培养基，温育24小时。最后，加入含3H-酪氨酸(1微居里/毫升)和上清液(与前面所用浓度相同)的新鲜培养基，再温育24小时。按照修改的Pomerantz活性炭吸附法(如Fuller，B.B.&Viskochil，B.H.，Life Sci.24∶2405-2416(1979)所述)，原位测定酪氨酸酶的酪氨酸羟化酶活性。此检测是通过测定由酪氨酸酶将3H-酪氨酸转变为L-多巴后3H2O的释放量来测定酪氨酸酶的活性，也是对黑素生成活性的一种显著的指示，因为酪氨酸酶活性的降低将会导致相应的黑素生成活性的降低(例如皮肤色素沉着的减轻)。
与对照相比，用25微克/毫升移植后蛋白质提取物处理的黑素瘤细胞，其酪氨酸酶活性大约增加20%。浓度低于25微克/毫升不再会增加酪氨酸酶活性。然而，在较高浓度的移植后蛋白质提取物时，黑素瘤细胞的酪氨酸酶活性以剂量依赖性方式降低。浓度为50微克/毫升时，酪氨酸酶活性大约降低20%，75微克/毫升降低30%，100微克/毫升降低50%。与此对照，用移植前皮肤蛋白质提取物处理的黑素瘤细胞培养物，不显示任何有统计学意义的酪氨酸酶活性的变化。因此，显然当人皮肤移植到活的宿主上时会诱导产生出一种强有力的黑素生成抑制因子，这种抑制因子存在于移植后皮肤的蛋白质提取物中。
实施例2同样，检查了实施例1中的蛋白质提取物对正常人黑素细胞的影响。先除去新生儿背侧包皮皮下组织，而获得正常黑素细胞。然后将组织培养在0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。接着用后工将表皮从真皮撕开，两者均置于培养基中剧烈旋转。然后取出上清液，转移到一25平方厘米的组织培养瓶(步骤详见Zalfa Abdel-Malek et al.，Journal of Cellular Physiology，150∶416-25(1992))。用于上述两种提取物和保存细胞的培养基包含Ham F-10培养基，10-4M3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，5%热失活胎牛血清，5%新生牛血清，5微克/毫升胰岛素，2微克/毫升α-生育酚，2微克/毫升转铁蛋白，5纳克/毫升TPA，20纳克/毫升霍乱毒素，10，000单位/毫升青霉素，以及10，000微克/毫升链霉素。细胞仍于37℃保存在含5%CO2的湿润的温育器中。然后按0.15×106细胞/孔的密度将黑素细胞种于一起的6个孔中(表面积9.6平方厘米)。其余步骤，包括移植前和移植后(12至15周)皮肤蛋白质抽提物的提取，同实施例1。
测定了不同浓度(25-100微克/毫升)蛋白质抽提物处理的正常黑素细胞中的酪氨酸酶活性。依然观察到了移植后蛋白抽提物低浓度处理酪氨酸酶活性的增加和随后的较高浓度处理酪氨酸酶活性剂量依赖性的下降。观察到的每种浓度下酪氨酸酶活性的变化与实施例1中记录的黑素瘤细胞的结果大致相同，培养在100微克/毫升移植后蛋白质抽提物中的细胞中酪氨酸酶活性下降50%。用移植前皮肤蛋白质抽提物处理的细胞不表现任何统计上有意义的酪氨酸酶活性的变化。由此，存在于移植后皮肤蛋白质抽提物中的黑素生成抑制因子对正常黑素细胞和黑素瘤细胞两者具有同等的抑制作用。
实施例3为了检测移植前和移植后皮肤蛋白质抽提物中所含的不同蛋白质，进行了单向0.1%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。电泳使用15%丙烯酰胺凝胶，采用Laemmli所述的不连续缓冲系统(报道于Nature227∶680-5(1970))。用考马斯亮兰R-250染色显示蛋白质带。对移植前和移植后粗抽提物(2000×g)和上清液(100，000×g)(按实施例1所述方法制备)都进行了分析。此外，用TritonX-100抽提100，000×g离心后的沉淀物，以溶解任何颗粒部分，并同样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
在移植前粗抽提物和上清液蛋白质电泳结果之间没有观察到明显的差异。同样，在移植后粗抽提物和上清液之间，也没有明显的差异。然而，在移植前和移植后蛋白质电泳结果之间，存在显著的差异。最显著地是在移植后皮肤样品中独有地出现一条13至14KDa的双带。而且，用TritonX-100抽提沉淀所得部分不包含这条蛋白质带，表明这条带含有可溶性蛋白质。同时，将移植后皮肤真皮和表皮撕开，重复上述步骤。两种样品中都存在13至14KDa蛋白质带，但在表皮中显示程度更强。
同样，对在宿主上存在不同长短时间的移植后皮肤也进行了上述分析。该13至14KDa蛋白质带早在移植后两周就出现了，并且持续显现超过移植后14周。在移植后2周和14周样品之间，未记录到蛋白质带型的任何明显的差异。
实施例4为了确定该13至14KDa蛋白质带是否含多种蛋白质，对移植前后两者皮肤上清液进行了双向聚丙烯酰胺凝胶电泳。不过先用DEAE-纤维素柱(15厘米×1.5厘米)对移植后皮肤上清抽提物(如实施例1所述方法得到)进行离子交换色谱分析。将上清液(15毫升)加到色谱柱上，用磷酸盐缓冲洗柱以洗脱未结合的蛋白质。每5分钟收集5毫升级分，并对每一收集的级分测定280纳米光吸收。用磷酸盐缓冲液洗柱直至洗脱级分光吸收近于可忽略不计。此后，用0至1.0M的盐梯度(Nacl于磷酸盐缓冲液中)洗脱柱中结合的蛋白质。各级分光谱分析结果表明存在两个分立的吸收峰(280纳米处)。
接着，收集与两吸收峰有关的级分，并对含0.02%叠氮钠的重蒸馏水充分透析至少36小时。然后将透析峰样品冻干过夜以获取干粉。再将干粉溶于蒸馏水。并测定蛋白质含量。然后将此两峰级分分别进行双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
为了进行双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，将含700-800微克蛋白质的两峰级分小份样品冻干。然后将两份样品溶于9M尿素，其中含2%CHAPS去垢剂(购自SigmaChemicalCo.)、2%两性电解质(pH3-10)和2%β-巯基乙醇，室温下保温2小时。14，000rpm离心15分钟后，将样品加样于等电聚焦凝胶。用两性电解质(pH3-10)进行等电聚焦电泳，700伏过夜(如Farrell，J.Biol.Chem.250∶4007-21，(1975)所述)。然后将凝胶用SDS-平衡缓冲液平衡至少15分钟，再上样至平板凝胶，用15%凝胶进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶用考马斯亮兰染色，以显示不同的蛋白质斑点。
在移植后皮肤上清液样品中，第一吸收峰级分中的13至14KDa蛋白质带可分辨出四个蛋白质斑点，其等电点pI值在6.5至7.5之间。然而，第二个吸收峰级分在此分子量范围内，没有显示任何蛋白质。同样，当对移植前皮肤样品重复上述步骤时，没有显现这些蛋白质。由此可看出，在移植后皮肤中发现的13至14KDa蛋白质带实际上包含四种不同的蛋白质。
实施例5为了分离和试验13至14KDa蛋白质带中包含的四种蛋白质，采用了电洗胶。移植后皮肤上清液经实施例3步骤进行单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将未染色凝胶与染色凝胶(作为标记)并排放置，从未染色凝胶中切下该13至14KDa蛋白质带。然后将凝胶切碎，转移到SchleicherandSchuell电洗脱装置的电洗脱槽中(购自S.S.Inc.，Keene，NH)。加入含20mMTris、150mM甘氨酸和.05%SDS的缓冲系统，150伏电洗脱过夜。然后收集电洗脱级分，用Centricon-3浓缩器浓缩、透析(得自AmiconCorp.，divisionofW.R.Grace&Co.，Beverly，MA)，至体积约0.5毫升。最后，将此浓缩的13至14KDa蛋白质混合物过滤灭菌，并测定蛋白质含量。
按照实施例1的步骤，来检测电洗脱蛋白质对黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性的影响。将从移植后皮肤上清液中获得的13-14KDa蛋白质混合物加到细胞培养物中，浓度范围从0.25到1.0微克/毫升。为了保证观察到的效应的确是由于来自移植后皮肤的13-14Da带中的蛋白质混合物所致，也用移植前皮肤上清液进行了同样的步骤。
得自移植后皮肤的13-14KDa蛋白质混合物引起了黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性相当显著的剂量依赖性下降。事实上，在蛋白质浓度为1.0微克/毫升时，几乎下降90%。作为对照，用相应量的得自移植前皮肤上清液的溶液进行试验，结果只引起酪氨酸酶活性轻微的，不显著的下降。
当用正常人黑素细胞(按实施例2方法所得)重复同样的试验时，该13-14KDa蛋白质混合物同样引起酪氨酸酶活性下降。浓度为0.25微克/毫升时，观察到酪氨酸酶活性大约下降37%;0.5微克/毫升时，观察到下降约为53%。当使用移植前皮肤抽提物时，观察到酪氨酸酶活性下降非常小。这些结果表明，存在于移植后皮肤抽提取物中的黑素生成抑制因子包含在该13-14KDa蛋白质混合物中。
实施例6通过检测3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入(此为细胞中DNA合成速率的量度)，测定了移植前和后皮肤抽提物对细胞增殖的影响。很明显，黑素细胞增殖的降低将会引起受观察皮肤色素沉着的相应降低，因为黑素细胞直接负责色素产生。将Cloudman黑素瘤细胞接种于一96孔平底培养板上，200微升/孔。使F-10生长培养基中的细胞附着，第二天用100微升新鲜培养基和选定量的皮肤蛋白质抽提物替换一半体积的培养基。每一实验组包含6孔。经24小时处理后，再用新鲜培养基和皮肤蛋白质抽提物替一半培养基。在后一处理期间，将细胞用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(1微居里/孔)脉冲标记。
培育24小时后，用半自动PHD细胞收获器(购自CambridgeTechnology)将细胞收集到玻璃纤维滤膜上。滤膜于空气中过夜干燥，分别转移到闪烁小瓶中，用450微升Protosol组织和凝胶溶解液处理。然后将小瓶置于烘箱中，66℃保温75分钟，再冷却。接着，第一小瓶中加入100微升冰醋酸和9.5毫升EconoFluor-2(一种非水性闪烁液)。小瓶置于冷冻闪烁计数器中冷却24小时，然后测定每分钟计数。
在使用13-14KDa蛋白质混合物(如实施例5电洗脱)的样品中，观察到对黑素瘤细胞增殖剂量依赖性的抑制(与对照样品比较)。蛋白质混合物浓度为0.25微克/毫升时，这种抑制超过30%;浓度为0.50微克/毫升时抑制几乎为50%。作为对照，用移植前皮肤抽提物处理的黑素瘤细胞只表现出轻微的不显著的抑制细胞增殖。当用正常人黑素细胞重复这些试验时，13-14KDa蛋白质混合物对正常黑素细胞增殖抑制程度相同。同样，移植前皮肤抽提物并不抑制正常黑素细胞的增殖。
为了研究其形态学，也用相差显微镜观察了培养后的黑素瘤细胞。在没有处理的细胞(对照)和用移植前皮肤抽提物处理的细胞样品中，细胞看来是正常健康的，具有显著延伸到细胞间并形成特征网络的树突。作为对照，用13-14KDa蛋白质混合物处理的细胞是不健康的，有很多不附着的、漂浮的死细胞。事实上，仅有大约40%细胞存活，细胞密度下降很多。此外，从余下的细胞中，很少有树突延伸出来，实际上所有细胞形状都是圆的。这清楚地表明，黑素生成抑制因子不但抑制色素细胞增殖，而且对黑素瘤细胞具有细胞毒性。
实施例7为了确定从移植后的皮肤中分离的13-14KDa蛋白质混合物是否只是一种一般代谢抑制剂，用正常人成纤维细胞重复了3H-胸腺嘧啶脱氧核苷细胞增殖试验。正常人二倍体所生儿包皮成纤维细胞购自Clonetics Corporation，并在到货后，在T-25瓶中，用加有10%胎牛血清的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)培养。37℃培育三天后，将成纤维细胞用胰蛋白酶处理，以每平方厘米3，000个细胞的密度接种到48孔微量滴定板上。然后37℃培育三天。接着，将培养基换成含0.2%血清的DMEM，细胞在这种环境保持四到五天，不加任何其他添加物。
进行了两种类型的试验激动剂和拮抗剂。在激动剂试验中，将不同浓度的移植后皮肤蛋白质抽提液加入随机选择的孔中。用成纤难细胞生长因子(FGF)作为阳性对照。同时加入3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(以研究增殖)或3H-脯氨酸(以研究胶原产生)。细胞在此培养基中分别培养二天(增殖)和四天(胶原产生)。然后移去培养基，洗涤细胞，然后用SDS溶解细胞。将1毫升溶解物加到9毫升闪烁液中并计数。拮抗剂试验采用同样的步骤，只是还将FGF加到含蛋白质混合物的每个孔中，以确定是否混合物中的活性组分与FGF竞争并表现出3H-胸腺嘧啶脱氧核苷或3H-脯氨酸掺入的相应降低。在激动剂或拮抗剂试验中，蛋白质抽提物对细胞增殖和胶原产生没有显示出任何效应，无论其浓度如何。因此，明显地，13-14KDa蛋白质混合物的作用是对色素细胞特异的，而且该混合物中的黑素生成抑制剂也不仅仅是一种一般代谢抑制剂。
实施例8
实施例4所述的研究表明，起黑素生成抑制作用的13-14KDa蛋白质混合物实际上包含四种不同的蛋白质，因此，进行了试验以确定其中哪种蛋白质与观察到的效应有关。用如实施例4的DEAE-纤维素离子交换柱将移植后皮肤上清液分级分离。收集合并与第一个峰相应的级分(见实施例4)，再将此混合物透析、冻干。然后进行双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(如实施例4所述)，以将此蛋白质混合物分成前面发现的四种不同的蛋白质。用考马斯亮兰将凝胶染色，分别从凝胶中切下四种蛋白质“斑点”。然后将四种蛋白质的每一种从凝胶中电洗脱下来(如前所述)并浓缩。再测定所得溶液的蛋白质含量。这样，获得四种纯化的蛋白质(相互分离的)。
用前述的步骤研究Cloudman黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性和3-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入。这些试验中采用蛋白质浓度大约1.0微克/毫升的每一种纯化蛋白质，作为对照，实验中包含了未处理的和α-MSH(10-7M)处理的细胞培养物。用与第三种蛋白质“斑点”对应的纯化蛋白质处理的培养物，其酪氨酸酶活性大约下降40%。但是，用其余三种蛋白质处理的培养物，未显示酪氨酸酶活性的明显下降。类似地，当对应于第三“斑点”的纯化蛋白质存在时，细胞增殖受到显著的抑制(约45%)，但其他蛋白质对细胞增殖没有明显影响。
根据这些试验，显然从第三种凝胶“斑点”电洗脱下来的蛋白质是与前面观察到的黑素生成抑制作用和细胞增殖抑制作用有关的。前面的双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，这种对应于第三“斑点”的黑素生成抑制因子(“MI”)蛋白质，其分子量约为14，000，等电点大约在7.2至7.5之间。
实施例9为了测定该13-14KDa蛋白质混合物中所含四种蛋白质的氨基酸顺序，再对按前述方法分级分离的移植后皮肤抽提物进行双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。将蛋白质印迹到ImmobilonPSQ(一种聚二氟乙烯膜)，用酰胺黑染色显示。然后从印迹处切下四种“斑点”，与碘乙酰胺反应，再进行顺序测定。蛋白质顺序测定在AppliedBiosystems475A蛋白测序仪上按脉冲液相化学法进行(Speicher，D.W.，(1989)，TechniquesinProteinChemistry，(T.E.HugliEd.)，AcademicPress，SanDiego，CA，pp.24-35)。
第一“斑点”部分N-端氨基酸顺序分析表明，该蛋白质与小鼠transthyretin或前清蛋白相同。Transthyretin是一种血清蛋白质，分子量55KDa，但是它是由四种相同的亚基组成，亚基分子量约为14KDa。第二“斑点”顺序分析表明，该蛋白质与血红蛋白一条链有很高的同源性。第四“斑点”的顺序与已知蛋白质只有很低或没有同源性。
由于完整的MI蛋白质(第三“斑点”)的N-端氨基酸顺序分析表明，该蛋白质N-端是封闭的，因此决定用蛋白酶将其消化成片段，然后对产生的肽段测序。将四个ImmobilonPSQ印迹点MI蛋白质切下，还原，用碘乙酰胺烷化，再用内切蛋白酶LysC消化(Stone，K.L.，M.B.LoPresti，J.M.Crawfrod，R.DeAngelisandK.R.Willims，(1989)，APracticalGuidetoProteinandPeptidePurificationforMicrosequencing，，(P.T.Matsudaira，Ed.)，AcademicPress，SanDiego，CA，pp.31047)。
MI蛋白质蛋白酶解后，对其中第二峰的顺序测定更为成功，并得到下列氨基酸顺序
SEQIDNO1ThrGlnThrValXaaAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHis151015GlnGluXaaXaaGlyLys20“Xaa”表示的位点是指尚未确证或根本就没能测定的位点。将第5位暂定为Cys，第19位暂定为Asp。有趣的是，该蛋白质片段C-端12个氨基酸中有(个与小鼠脂肪酸结合蛋白(mFABP)的一个区域相对应，但是该片段N-端没有发现任何明显的同源性。
得自MI蛋白质的第三峰的顺序测定如下SEQIDNO2LeuValValGluCysValMetAsnAsnValThrCysThrArgXaa151015TyrGluLys此外，将第15位暂定为Ile。此例中，该片段18个氨基酸的13个与mFABP一区域对应，在第12，15和18位氨基酸处仅有保守的改变。
在此序列测定的基础上，显然MI蛋白质与mFABP高度相关，虽然肯定不是相同的。小鼠脂肪酸结合蛋白属于一个蛋白质家族，其中包括脂肪酸结合蛋白、视黄酸结合蛋白、脂肪细胞分化蛋白质和髓磷脂P2蛋白，而且，根据两段已测定的顺序，预计MI蛋白质也是该家族的一员。这样，由于该家族中大部分蛋白质包含大约131个氨基酸，进一步可以预计MI蛋白质包含大约131个氨基酸。MI蛋白质与已知的蛋白质如mFABP有密切的同源性，这一事实也强有力地表明，如申请人的研究所示，它是一种生物学有关的分子。
实施例10为了测定MI蛋白质的全顺序，制备了针对MI蛋白质的合适的寡核苷酸探针，如下所列5′-CAGCCCGCCCGCACC-3′5′-AAAAAAGAAAGAAACAGTATG-3′利用这些寡核苷酸对人皮肤RNA进行多聚酶链反应(PCR)，其中人皮肤是按前述方法移植到裸鼠后所得。PCR反应导致产生相当数量的编码MI蛋白质的单一大小的DNA。然后将分离的DNA克隆到顺序测定载体并按已知方法测定其顺序。核酸序列如下所示(相应的MI蛋白质氨基酸顺序与列于对应的密码子之下，数目表示MI蛋白质中氨基酸的位置)SEQIDNO3ATGGCCACAGTTCAGCAGCTGGAAGGAAGATGGCGCCTGGTGMetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510GACAGCAAAGGCTTTGATGAATACATGAAGGAGCTAGGAGTGAspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025GGAATAGCTTTGCGAAAAATGGGCGCAATGGCCAAGCCAGATGlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540TGTATCATCACTTGTGATGGTAAAAACCTCACCATAAAAACTCysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055
GAGAGCACTTTGAAAACAACACAGTTTTCTTGTACCCTGGGAGluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GAGAAGTTTGAAGAAACCACAGCTGATGGCAGAAAAACTCAGGluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ACTGTCTGCAACTTTACAGATGGTGCATTGGTTCAGCATCAGThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GAGTGGGATGGGAAGGAAAGCACAATAACAAGAAAATTGAAAGluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110GATGGGAAATTAGTGGTGGAGTGTGTCATGAACAATGTCACCAspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125TGTACTCGGATCTATGAAAAAGTAGAATAACysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135为简明起见,整个MI蛋白质顺序如下所示:
SEQIDNO:4:
MetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510AspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025
GlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540CysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055GluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110AspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125CysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135为了证明SEQ ID NO4确实是MI蛋白质，按熟知的方法从SEQ ID NO4重组表达出一种蛋白质。然后通过检测3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入速率(与实施列6方式类似)，测定该重组表达蛋白质对黑素细胞增殖的效应。结果观察到显著的对黑素细胞增殖的剂量依赖性抑制，这清楚表明，从SEQ ID NO4重组表达的蛋白质的确是MI蛋白质。因此，MI蛋白质的结构便如SEQ ID NO4所示。如熟悉本领域人员所能认识的，SEQ ID NO3也可用于熟知的方法，来证明根据申请人的的合成方法制备的任何产物的确是MI蛋白质。
实施例11为了检测MI蛋白质对色素过多沉着的移植皮肤的体内影响，将包含MI的完整13-14KDa蛋白质混合物注射到按前述方法预先移植到裸鼠上的人皮肤中。在这些试验中用了七只小鼠，而且试验前这些小鼠已经支持人皮肤移植物10至12个月。这些试验的异种移植物中存在不同程度的色素过多沉着。
将用于试验的小鼠进一步分成一个实验组(5只小鼠)和一个对照组(其余2只小鼠)。对照组小鼠不给予任何注射。实验组中，按每周间隔，在人皮肤移植物左侧进行皮下注射，共注射5周。每次注射剂量为50微升溶液，其中包含2微克蛋白质混合物，其余为生理盐水。作为一种内部对照，按同样时间间隔在移植物右侧注射50微升生理盐水。在第一轮5次注射一周之后，重复进行整个试验方案。但是，第二轮5次注射时，注射部位改变了。在此期间，蛋白质混合物注射到移植物背部区域，而生理盐水(对照)注射到移植物腹部区域。
在一系列注射之前，第一轮5次注射之后一周(但在第二轮注射之前)以及最后注射之后分别对皮肤移植物进行了活组织检查。活检部位取自注射蛋白质级分和生理盐水的位点附近。也对对照组进行了活组织检查。
对每一活检中多巴阳性黑素细胞进行了计数，试验的总结果如下列于表1。多巴阳性黑素细胞数目是黑素细胞中酪氨酸酶活性的一种直接量度。示于表1的结果表明，含MI蛋白质的蛋白质混合物能降低酪氨酸酶活性。多巴阳性黑素细胞数目的减少从9.0%到32.3%。对照组或实验组注射生理盐水部位的活检结果，表明没有任何明显的减少。
表1多巴阳性黑素细胞数目的减少(%)小鼠蛋白质混合物注射部位盐水注射部位A32.32.5B29.01.3C24.60D9.00E10.12.0F-对照00G-对照00目视检查小鼠表明，经过仅两次蛋白质混合物注射之后，色素过多沉着明显减少，特别是注射部位。在对照组或实验组注射生理盐水部位，没有观察到这种减少。
将几个活检切片还用苏木精和曙红染色，进行显微镜观察，以检查由于蛋白质混合物的注射引起的任何形态学变化。实验组和对照组之间没有什么差别，两组都没有表现出任何表皮或真皮损伤或毒性的迹象。由此，MI蛋白质能够减少色素过多沉着而不引起不希望产生的副作用。
实施例12为了检测MI蛋白质在预防或延缓移植后通常立刻发生的皮肤移植物色素过多沉着中的作用，将实施例11中使用的蛋白质混合物也注射到刚刚支持人皮肤移植物2周的裸鼠上。采用实施例11中的方法，不过只进行第一轮5次注射。将蛋白质混合物注射到皮肤移植物背部，生理盐水注射到腹部。在将要进行第一次注射前，对多巴阳性黑素细胞进行起始计数。
目视检查小鼠揭示出在蛋白质混合物注射部位色素过多沉着有些减少。更为重要的是，如表2所示，从蛋白质混合物注射部位取样活检表明，多巴阳性黑素细胞数目又一次显著减少。如所预料，作为对照，从对照组和实验组生理盐水注射部位取样活检，表明多巴阳性黑素细胞数目增加。增加范围从190%到300%，而含MI的蛋白质混合物引起的减少范围从8.3%到31.6%。注射蛋白质混合物的小鼠也无任何毒性迹象。这一结果证实，MI蛋白质能防止或逆转色素过多沉着，很可能是通过改变酪氨酸酶活性，而不是通过影响细胞生活能力。
表2多巴阳性黑素细胞数目的减少(%)小鼠蛋白质混合物注射部位盐水注射部位H-31.6+230I-17.5+300J-11.2+210K-27.5+190L-8.3+200M-对照>+200+240N-对照>+200+228实施例13另外也检查了MI蛋白质对色素正常的小鼠(C57BL/6)的体内效应。这种特殊类型的小经证明对于研究色素沉着和毛发生长是有用的，因为这种小鼠躯干皮肤色素沉着起源于毛囊中而不是表皮中的黑素细胞。一旦将这些毛囊除去，下面的皮肤就由于黑素细胞的减少而变得色素减少。虽然毛囊除去后马上又会长出来，但皮肤的色素沉着再发生要5到6天之后。这样，这种小鼠是一种良好模型，用于检查MI蛋白质在延缓色素重新沉着中的作用。
使用5只C57BL/6小鼠，从背部左右两边小块区域除去毛囊。将实施例11中所用的蛋白质混合物(体积50微升，含2微克蛋白质混合物)皮下注射到每只小鼠左背部除去毛囊区域。作为对照，将获自正常人皮肤(在任何移植之前)的电洗脱13至14KDa蛋白质级分注射到每只小鼠右背部区域。该正常人皮肤蛋白质级分按前述相同方法获得。每天注射1次，共5天。每天照相以监测皮肤颜色变化，并从每只小鼠左右背部区域取样活检。
注射含MI蛋白质的蛋白质混合物的左背部区域，在仅注射2次之后，就表现出皮肤颜色减淡，而右背部区域未观察到皮肤颜色明显减淡。此外，与右边(对照)相比，左背部区域新毛囊的出现也延迟了。
对左右背部区域两边取样进行活检，其苏木精和曙红染色图象看来是正常的，两者间也没观察到任何形态学差异。另外也没有任何毒性迹象，但是注射了含MI蛋白质的蛋白质混合物的左背部区域的活检结果显示出毛囊中黑色素染色减少(如多巴染色所示)。B.药用和化妆品组合物及方法如本文中所用，“局部施用”指直接敷于或涂布于皮肤外部;“皮肤注射”指通过皮下注射针将物质引入皮下或皮肤中;“包含”、“包括”(comprising)指可以加入不影响最终结果的其它步骤和其它成分。这最后一个术语就包含了“由…组成”和“基本由…组成”。
本发明还涉及到一种组合物，包含a)一种抑制色素细胞中黑素生成的足够纯的蛋白质，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或类似物，所述蛋白质分子量约为14，000，等电点大约在7.2到7.5之间，以及具有SEQIDNO4的氨基酸顺序;和b)一种化妆用或药用可接受的载体。在本发明的一项实施方案中，该载体是一种可注射的载体。在本发明的另一项实施方案中，该载体是一种局部应用的载体。
本发明的组合物包括固体的，半固体的，或液体的在化妆品方面和/或生理学上可接受的载体，以使MI蛋白质，或其活性片段、衍生物或类似物能够以合适的浓度释放到所需靶部位。载体本身可以是惰性的或者可以具有生理的或药用的价值。载体的性质将由所选择的该组合物的用法所决定。安全有效的载体的量比较好的是占组合物的约50%到约99.9999%，更好是约90%到约99.9%。这些载体配方的变化将会导致产生大量不同的产品，它们都在本发明的范围之内。MI蛋白质或其活性片段、组合物的用法可以从体内给药法如注射到局部外用法。
MI蛋白质或其活性片段较好的给药法是通过皮肤注射。这种给药法的辅助载体较好的是包括水或盐溶液，理想的是等渗盐溶液。
MI蛋白质或其活性片段更好的用法是局部施用。本发明的局部药用组合物可以制成大量不同类型的产品。包括(但不局部于)洗剂、冷霜类、防晒油类、凝胶、粘剂、喷雾剂、软膏、糊剂、摩丝和化妆品。这些产品种类可以包括几种类型的载体系统，包括(但不局限于)溶液、乳剂、凝胶和固体。
本发明的局部药用组合物还包含一种局部药用可接受的润肤剂，含量从约2%到约50%。如本文中所用，“润肤剂”指用于预防或减轻皮肤干燥及保护皮肤的物质。已知大量合适的润肤剂可以用于此处。Sagarin，Cosmetics，ScienceandTechnology，2ndEdition，Vol.1，pp32-43(1972)(结合于此作为参考)包含大量合适物质的例子。特别有用的具有护肤作用的润肤剂为甘油、己三醇、丁三醇、乳酸及其盐、尿素、吡咯烷酮羧酸及其盐、氨基酸类、胍、双甘油和三甘油。
本发明进一步涉及一种抑制哺乳动物皮肤和/或毛发中黑素生成的方法。该方法包括用安全有效量的MI蛋白质或其活性片段、衍生物或类似物处理皮肤和/或毛发。根据受试者已经存在的色素沉着和/或黑素生成水平以及所希望的黑素生成抑制程度，所用的MI蛋白质或其活性片段的剂量和处理频度将有广泛变动。
较好的处理皮肤和/或毛发的方法是经皮注射安全有效剂量的MI蛋白质或其活性片段来抑制哺乳动物皮肤和/或毛发中的黑素生成。MI蛋白质或其活性片段注射所用的载体较好的是包括水或盐溶液。根据个人需要，皮肤注射的MI蛋白质或其活性片段的量及注射频度可有很大变动。作为皮肤注射处理的一个例子，建议将包含MI蛋白质或其活性片段的适于皮肤注射的组合物按每天一次到每六个月一次进行皮肤注射，较好的是从每周三次到第月一次，更好是每周一次到每月两次。用于皮肤注射的组合物可包含约0.0001%到约10%，较好的是约0.001%到约5%，更好的是0.01%到1%的MI蛋白质。注射期可以为约一个月到约十年，较好的是约三个月到约两年，更好是的约六个月到约一年，从而对哺乳动物皮肤和/或毛发黑素生成产生抑制作用。
更好的一种处理皮肤和/或毛发的方法是通过局部施用安全有效量的MI蛋白质或其活性片段来抑制哺乳动物皮肤和/或毛发中的黑素生成。根据个人需要，MI蛋白质或其活性片段的量以及局部施用于皮肤和/或毛发的频度可变化很大，但作为一个例子，建议局部施用可从约每周一次到约每天十次，较好是约每周两次到约每天四次，更好是每周三次到每天两次，最好是约每天一次。局部施用组合物可包括约0.001到约20%、较好为约0.01%到约10%、更好为约0.1%到约5%的MI蛋白质或其活性片段、衍生物或类似物。局部施用期较好是从约一个月到约十年，更好为约三个月到约两年、再好些为约六个月到约一年，从而对哺乳动物皮肤和/或毛发中的黑素生成产生抑制作用。
下面的实施例进一步描述和论证本发明范围内某些较好的具体实施方案。给予实施例仅为了说明起见，而不能认为是对本发明的限制，因为它们的很多变化是可能的，而不会违背本发明的精神实质和范围。这些实施例仅仅用来证实可以怎样使用本发明的黑素生成抑制剂。
实施例14利用常规混合技术，将下列组分合并制成一种水包油乳剂。
组分占组合物的重量百分比去离子水足够量甘油3羟苯甲酸甲酯0.2MI蛋白质0.1Steareth20(Brij78R)1单硬脂酸甘油酯和PEG1000.5(Arlacel165R)Carbopol940(B.F.Goodrich，0.2Cleveland，OH)99%三乙醇胺0.2十六烷醇1.0十八烷醇1.0羟苯甲酸丙酯0.1Diisiopropyldimerate2.0C12-C15醇苯甲酸酯 6.0咪唑烷醇尿素0.3该组合物局部施用抑制皮肤和/或毛发中的黑素生成是有用的。使用组合物的量为足以使皮肤和/或毛囊沉积MI蛋白质约0.01毫克/平方厘米的量。该组合物每天施用一次，可终身使用。
实施例15利用常规混合技术合并下列组分制成一种透明凝胶。
组分占组合物的重量百分比去离子水足够量Carbopol980(B.F.Goodrich，0.5Cleveland，OH)EDTA-2Na0.02SEQIDNO10.599%三乙醇胺0.5丙二醇3.0羟苯甲酸甲酯0.2该组合物局施用抑制皮肤和/或毛发中的黑素生成是有用的。使用组合物的量为足以使皮肤和/或毛囊中沉积的MI蛋白质活性片段约0.01毫克/平方厘米的量。该组合物每天施用三次，使用六个月。
实施例16利用常规混和方法合并下列组分制成一种水包油聚合物乳剂。
组分占组合物的重量百分比去离子水足够量Carbopol980(B.F.Goodrich，0.2Cleveland，OH)PemulenTR-2(B.F.Goodrich，0.15Cleveland，OH)甘油3.0SEQIDNO20.7599%三乙醇胺0.35棕榈酸鲸蜡酯2.0二氧代硬脂酰三甲基硅烷和1.0十八烷醇角鲨烷6.0羟苯甲酸丙酯0.1
羟苯甲酸甲酯0.2咪唑烷醇尿素0.3该组合物局部施用抑制黑素生成是有用的。用量为足以使皮肤和/或毛囊沉积的MI蛋白质活性片段达0.1毫克/平方厘米的量。该组合物每周施用一次，使用一年。
实施例17利用常规混合技术合并下列组分制成一种水包油微乳状液。
组分占组合物的重量百分比去离子水足够量MI蛋白质1.0PEG4脱水山梨醇单月桂酸酯22.5PEG5脱水山梨醇单油酸酯2.5Cetearyl，octanoate25.0DMDM乙内酰脲和3-碘-2-0.2丙炔基丁基氨基甲酸酯(glydantplus)该组合物局部施用抑制黑素生成是有用的。用量为足以使皮肤和/或毛囊中沉积的MI蛋白质达0.4毫克/平方厘米的量。该组合物每周施用三次，使用五年。
可以理解，能进行修改而不违背本发明的精神实质。这样，可以理解申请人的发明不仅包括完整MI蛋白质及其使用和制备的方法，而且包括MI蛋白质的活性片段。同样，本领域技术人员能够制备MI蛋白质的衍生物和类似物，例如对MI顺序中一个或多个氨基酸进行保守改变。此外，非肽类模拟物也可以按照MI蛋白质的活性片段而模仿出来，这样，这些模拟物并不违背本发明的精神实质。相应地，本发明的范围应该按下列权利要求书考虑，而且可以理解，它并不局限于说明书中所显示和描述的。
权利要求
1.一种产生抑制色素细胞黑素生成的蛋白质的方法，其特征在于包括下列步骤(a)将哺乳动物皮肤移植到活的宿主上；(b)使所述哺乳动物皮肤在所述活的宿主上保持预定的一段时间；(c)从所述宿主移去所述哺乳动物皮肤；和(d)从所述皮肤中提取所述蛋白质。
2.按照权利要求1的方法，其特征还在于，所述宿主是裸鼠。
3.按照权利要求2的方法，其特征还在于，哺乳动物皮肤是人皮肤。
4.按照权利要求3的方法，其特征还在于，使所述人皮肤在所述宿主上至少保持两周。
5.按照权利要求4的方法，其特征在于，所述蛋白质的所述提取包括下列步骤(a)用生理盐水从所述皮肤提取一种皮肤蛋白质抽提物;(b)通过离子交换色谱法将所述皮肤蛋白质分级分离成至少两种溶液，其中至少一种所述溶液包括所述蛋白质;(c)将包含所述蛋白质的一种所述溶液进行双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以在聚丙烯酰胺凝胶上将所述蛋白质分离成一个斑点;和(d)从所述斑点电洗脱所述蛋白质。
6.按照权利要求5的方法，其特征还在于，所述蛋白质具有下列氨基酸顺序SEQIDNO4。
7.一种抑制色素细胞黑素生成的足够纯化的蛋白质，其特征在于所述蛋白质具有下列氨基酸顺序SEQIDNO4，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或类似物。
8.一种抑制色素细胞黑素生成的足够纯化的蛋白质，其特征在于所述蛋白质具有下列氨基酸顺序SEQIDNO4。
9.一种控制色素细胞黑素生成的方法，其特征在于包括下列步骤(a)提供有效量的黑素生成抑制剂，它包括黑素生成抑制因子蛋白质，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或类似物，所述蛋白质具有下列氨基酸顺序SEQIDNO4;(b)将所述黑素生成抑制剂与合适的载体合并;和(c)将所述合并的黑素生成抑制剂施用于要控制的色素细胞。
10.按照权利要求9的方法，其特征还在于，所述施用步骤是通过注射进行的。
11.按照权利要求9的方法，其特征还在于，所述施用步骤是通过局部施用而进行的。
12.按照权利村注11的方法，其特征还在于所述色素细胞是皮肤色素细胞。
13.根据权利要求11的方法，其特征还在于，所述色素细胞是毛发色素细胞。
14.根据权利要求10的方法，其特征还在于，所述黑素生成抑制剂是所述黑素生成抑制因子蛋白质。
15.根据权利要求11的方法，其特征还在于，所述黑素生成抑制剂是所述黑素生成抑制因子蛋白质。
16.一种选择性消灭黑素瘤细胞的方法，其特征在于，包括下列步骤(a)提供有效量的黑素生成抑制剂，它包括黑素生成抑制因子蛋白质，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或类似物，所述蛋白质具有下列氨基酸顺序SEQIDNO4。(b)将所述黑素生成抑制剂与合适的载体合并;和(c)将所述合并的黑素生成抑制剂施用于要消灭的黑素瘤细胞。
17.按照权利要求16的方法，其特征还在于所述黑素生成抑制剂是所述黑素生成抑制因子蛋白质。
18.按照权利要求17的方法，其特征还在于，所述施用步骤是通过注射进行的。
19.按照权利要求17的方法，其特征还在于，所述施用步骤是通过局部施用进行的。
全文摘要
一种纯的天然黑素生成抑制因子蛋白质，能抑制色素细胞黑素生成，氨基酸顺序为SEQIDNO:4。一种产生黑素生成抑制因子蛋白质的方法，包括将哺乳动物皮肤移植于活宿主，保持预定时间后移去此皮肤，并从中提取该蛋白质。控制色素细胞黑素生成或选择性消灭黑素瘤细胞的方法，包括将有效量黑素生成抑制因子蛋白质或其活性片段、衍生物或类似物与合适载体混合，将此混合物施用于色素细胞或黑素瘤细胞。
文档编号C07K14/47GK1092294SQ9311483
公开日1994年9月21日 申请日期1993年11月24日 优先权日1992年11月24日
发明者J·J·诺德伦德, J·Z·法鲁奎 申请人:辛辛纳提大学
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