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2021-02-01 14:02:33|
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起点商标网 专利名称：新的thiomarinol衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一些新的thiomarinol衍生物，并提供了它们的制备方法以及应用它们作抗菌剂的方法和组合物。
例如，在其申请日前但在优先权日之后所公布的欧洲专利申请512824中，thiomarinol已被描述，它用结构式(A)来表示
它是由Alteromonas属的，优选Alteromonas rava菌株SANK 73390的微生物发酵生产的。我们现在已发现thiomarinol的两种衍生物，它们与原始thiomarinol有相似类型的抗菌活性。
Alteromonas属的生物能从海水中分离得到，并且其中一些已显示出产生潜在治疗用途的化合物，例如，已知的bisucaberin化合物已从Alteromonas的一个种获得，并且已显出具有抗肿瘤的活性(日本专利公开申请号63-27484)。
关于thiomarinol的结构方面，已知好几种抗菌物质具有相似结构，并且它们被分为四组。
第一组含有假单孢菌酸，首次分离于假单孢菌属(Pseudomonas.spp)。它们包括假单孢菌酸A[由荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)产生，公开于J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.294(1977)]，假单孢菌酸B[ibid，318(1977)]，假单孢菌酸C[ibid，2827(1982)]和假单孢菌酸D[ibid，2655(1983)]。假单孢菌酸A是以名称“Bactroban”销售的(Beecham，注册商标)，以2%皮肤软膏形式用于抗菌。然而，所有现有技术的这些化合物都比本发明的thiomarinol衍生物具有较弱的抗菌活性。
第二类与本发明化合物共有相似结构的物质包括含有抗菌素全霉素[Helv，Chim.Acta，42，563(1959)]，pyrrothine[J.Am.Chem.Soc.，77，2861(1955)]硫藤黄菌素[Angew.Chem.66，745(1954)]，金色抗菌素[J.Am.Chem.Soc.，74，6304(1952)]和其它的一组化合物。这些抗菌素典型地是由放线菌属产生的，并且特征在于有一个含硫色基。XenorhabdinsⅠ-Ⅴ是与金霉素相关的物质，并且也已经从细菌中分离出来(公开于WO84/01775)。
对这两组衍生物的各种研究已经进行了，但我们未认识到具有相似于thiomarinols的分子结构或具有相似性质特征的任一个已公开的物质。
第三组化合物公开于如日本申请公开号为52-102279，54-12375，54-90179，54-103871和54-125672的申请中，它公开了其中末端的羧酸被酰胺基团取代的假单孢菌酸衍生物。这些化合物不具有类似的抗菌活性，并且不存在广谱抗菌活性。实际上，这些化合物表现出一种具有弱于原始假单孢菌酸抗菌活性的趋势。
第四组包含类似于thiomarinol的化合物它起源于海生细菌的生理物质[the Am.Chem.Soc.，(1990年8月26-31，)第二部分，ORGN，No.139的200Year Conference的论文摘要)。然而，连接在该化合物末端羰基的杂环基团是2-氧代-3-哌啶基。近来已表明它具有抗微生物活性[Experimentia.Vol.48，1165-1169页(1992)]。
尽管如此，最相关的现有技术被认为是假单孢菌酸A，且所有的thiomarinol，即原始的thiomarinol，thiomarinol B和thiomarinol C明显具有比假单孢菌酸A更强的抗菌活性。
本发明目的之一是提供一些新的thiomarinol衍生物。
更具体地说本发明的另一个目的，是提供具有极好的抗菌和抗支原体活性的化合物。
其它目的和优点将随着进行的描述而变得清楚。
总之，本发明提供了thiomarinol的两种新衍生物，一种是S，S-双氧代衍生物，本文中称之为“thiomarinol B”，另一种是脱氧衍生物本文中称之为“thiomarinol C”。
thiomarinol B的结构还没有最后确定，但它能从thiomarinol本身的分子式[式(A)]看到有两种可能的位置被S-氧化。因此，对thiomarinol B本文中是以它的物理-化学性质作为特征的，如下述1)性质和外观黄色粉末。
2)分子式C30H44N2O11S2
3)分子量672(用FAB-MS测定)“FAB-MS”是高速原子轰击质谱仪。
4)高分辨质谱仪C30H45N2O11S2[(M+H)+;用FAB-MS测定]测定值673.2468计算值673.2465，5)元素分析计算值C30H44N2O11S2+H2OC，52.16%;H，6.71%;N，4.06%;S，9.28%实测值C，52.34%;H，6.79%;N，3.92%;S，9.02%6)红外吸收光谱γmax cm-1用溴化钾(KBr)盘方法测定的红外吸收光谱如下所示3660，3503，3318，3075，2966，2928，2870，1704，1653，1509，1467，1381，1349，1299，1217，1199，1152，1112，1063，1047，1019，975，949，884，839，764，730，660，609，553.
7)紫外吸收光谱λmax nm(ε)在1-丙酮中测定的紫外吸收光谱如下所示377(2，900)，301(13，000)，215(21，000)。
在1-丙醇+盐酸中测定的紫外吸收光谱如下所示377(2，900)，301(13，000)，
223(17，000)。
在1-丙醇+氢氧化钠中测定的紫外吸收光谱如下所示377(2，900)，301(13，000)，221(19，000)。
8)比旋光率[α]25D＝+7.7°(C＝1.0，1-丙醇)。
9)高效液相色谱分离柱Senshu-Pak ODS H-2151(柱直径6mm，长150mm，Senshu Scientjfjc Co.，Ltd.产品商标)。
溶剂40%V/V含水乙腈流速1.5ml/分钟保留时间8.4分钟。
10)1H-核磁共振谱(δppm)用四甲硅烷作为内标，在六氘化二甲基亚砜中测得的核磁共振谱(360MHz)如下所示。
11.28(1H，宽单峰);
10.47(1H，单峰);
7.23(1H，单峰);
5.97(1H，单峰);
5.37(2H，多重峰);
4.88(1H，双峰，J＝7.5Hz);
4.61(1H，宽单峰);
4.43(1H，双峰，J＝7.2Hz);
4.28(1H，双峰，J＝3.6Hz);
4.18(1H，双峰，J＝7.2Hz);
4.02(2H，三重峰，J＝6.6Hz);
3.74(1H，宽单峰);
3.64(1H)，3.61(1H)，3.54(1H)3.51(1H);
3.35(1H，双峰，J＝10.9Hz);
2.43(2H，三重峰，J＝7.3Hz);
2.12(1H)，2.09(1H)，2.03(1H);
2.02(3H，单峰);
1.61(1H)，1.58(1H)，1.50(2H)，1.32(2H)，1.30(2H)，1.25(2H);
0.96(3H，双峰，J＝6.3Hz);
0.92(3H，双峰，J＝6.9Hz)。
11)13C-核磁共振谱(δppm)用四甲基硅烷作内标，在六氘化二甲基亚砜中测得的核磁共振谱(90MHz)如下所示173.5(单峰)，166.1(单峰)，165.7(单峰)，160.8(单峰)，143.2(单峰)，134.2(双峰)，127.8(双峰)，123.3(单峰)，115.2(单峰)，114.4(双峰)，109.4(双峰)，76.2(双峰)，72.4(双峰)，69.6(双峰)，69.3(双峰)，64.3(三重峰)，63.9(双峰)，63.0(三重峰)，43.2(双峰)，42.2(双峰)，34.7(三重峰)，31.9(三重峰)，28.3(三重峰)，28.2(三重峰)，
28.1(三重峰)，25.3(三重峰)，24.5(三重峰)，20.0(四重峰)，15.7(四重峰)，15.6(四重峰)。
12)溶解性溶于醇类，如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，以及二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和乙醚，不溶于己烷和水。
13)薄层色谱Rf值0.52吸附剂硅胶(Merck & Co.，Inc Art.5715)展开溶剂按体积计二氯甲烷∶甲醇＝85∶15。
本发明的另一个化合物是thiomarinol C，它可用下列结构式(C)表示
本发明还提供了制备thiomarinol B或C的方法，它包括培养能产生thiomarinol的Alteromonas属微生物，并从该培养基中分离得到thiomarinol B或C。
本发明还提供了通过氧化thiomarinol制备thiomarinol B的方法。
本发明又提供了一种药物组合物，它含有与一种药学上可接受的载体或稀释剂混合的一种抗菌或抗支原体剂，其中的抗菌或抗支原体剂是选自thiomarinol B和C。
本发明此外还提供了治疗或预防细菌或支原体感染的方法，它包括给感染或对这类感染敏感的哺乳动物，可以是人，给药有效剂量的抗菌或抗支原体剂。
尽管thiomarinol B的结构还不明确，但可认为它是具有结构式(B1)或(B2)的化合物
它可能是这些化合物单独一种或者可能是这两种化合物的混合物。如果是一种混合物的话，取决于制备方法，相对比例可能是固定的或可能变化。
从上述结构式中可以清楚看到thiomarinol B和C包含许多不对称的碳原子和几个双键。异构化可能是在thiomarinol的α，β-不饱和羰基部分的特定位置上。因而，thiomarinol能形成多种立体和几何异构体。尽管这些在本文中都用单一分子结构式来表示，但本发明包括所有包括外消异构体的单独分离出的异构体及它的混合物。当使用立体有择合成技术，或旋光的活性化合物被用作起始物质时，可以直接制备单独的异构体;另一方面，如果制备了异构体的混合物，单一的异构体可以由常规的拆开外消旋混合物的技术来获得。
然而，由于该thiomarinol一般由发酵或由发酵产物的化学操作来生产，所以它们将趋于采纳标准的光学构型。因而，当提供了其它构型时，天然构型是优选的。
thiomarinol C可用下列物理-化学性质作为特征1)性质和外观黄色粉末。
2)分子式C30H44N2O8S23)分子量624(由FAB-MS测定)。
4)元素分析计算值C30H44N2O8S2+H2OC，56.05%;H，7.21%;N，4.36%;S，9.97%，实测值C，56.48%;H，7.23%;N，4.30%;S，9.11%，5)红外吸收光谱γmax cm-1用溴化钾(KBr)盘方法测定的红外吸收光谱如下所示3256，3068，2928，2858，1645，1596，1530，1455，1384，1287，1225，1151，1104，1052，974，820，712.
6)紫外吸收光谱λmax nm(ε)
在甲醇或甲醇+盐酸中测定的紫外吸收光谱如下所示388(9，600)，300(2，700)，215(17，000)。
在甲醇+氢氧化钠中测得的紫外吸收光谱如下所示386(8，600)，205(49，000)，7)比旋光率[α]25D＝-1.40°[C＝1.0，甲醇)]8)高效液相色谱分离柱Senshu-Pak ODS H-2151(柱体积直径6mm，长150mm，Senshu Scientific Co.，Ltd.)。
溶剂40%V/V含水乙腈流速1.5ml/分钟保留时间11.3分钟。
9)1H-核磁共振谱(δppm)用四甲基硅烷作为内标，在六氘化二甲基亚砜中测得的核磁共振谱(360MHz)如下所示。
10.70(1H，单峰);
9.81(1H，单峰);
7.05(1H，单峰);
5.68(1H，单峰);
5.37(1H，多重峰);
5.33(1H，多重峰);
4.64(1H，宽单峰);
4.55(1H，宽多重峰);
4.32(1H，双峰，J＝4.3Hz);
4.01(2H，三重峰，J＝6.6Hz);
3.67(1H)，3.62(1H)，3.58(1H)，3.49(1H)3.35(1H);
3.18(1H，宽多重峰)2.56(1H，宽双重峰，J＝14.2Hz);
2.34(2H，三重峰，J＝7.3Hz);
2.15(1H);
2.11(3H，单峰);
2.08(1H)，2.06(2H);
1.63(1H，多重峰)，1.56(2H，多重峰)，1.51(2H，多重峰)，1.30(2H)，1.29(2H)，1.26(2H);
0.95(3H，双峰，J＝6.3Hz);
0.91(3H，双峰，J＝6.9Hz)。
10)13C-核磁共振谱(δppm)用四甲基硅烷作内标，在六氘化二甲基亚砜中测定的核磁共振谱如下所示171.8(单峰)，167.9(单峰)，165.7(单峰)，157.9(单峰)，134.2(双峰)，133.9(单峰)，133.6(单峰)，127.6(双峰)，116.5(双峰)，
115.3(单峰)，110.4(双峰)，74.4(双峰)，69.3(双峰)，69.2(双峰)，68.1(双峰)，64.0(三重峰)，63.0(三重峰)，43.1(双重峰)，42.5(三重峰)，42.0(双峰)，34.6(三重峰)，32.1(三重峰)，28.4(三重峰)，28.3(三重峰)，28.1(三重峰)，25.2(三重峰)，24.9(三重峰)，20.0(四重峰)，18.6(四重峰)，15.7(四重峰)。
11)溶解性溶于醇类如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，以及二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和乙醚。不溶于己烷和水。
12)薄层色谱Rf值0.66吸附剂硅胶(Merck & Co.，Inc.，Art 5719)展开溶剂按体积计二氯甲烷∶甲醇＝85∶15。
thiomarinol B和C可以由培养产生thiomarinol的Alteromonas属的微生物，然后从该培养基中收集所需的thiomarinol B和/或C的方法制得。具有所需抗菌活性的thiomarinolB和/或C的变体可以用类似方式从能产生所需化合物的Alteromonas其它菌株或种中获得，或者它们可以从通过所述发酵作用获得的适当改变的化合物得到，或者它们可以被直接化学合成。
具体来说，我们特别优选使用Alteromonas rava种作该种微生物，并且尤其是近来分离出的Alteromonas rava菌株，我们已给该菌株指定为SANK73390。SANK 73390是一种海生微生物，它分离于在日本的Koina Minami-Izu Machi，Shizuoka Prefecture海边的海水，并且该菌株已在1991年4月30日被保藏于日本的Deposition Institute，Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Science & Technology Ministry of International Trade and Industry保藏号FERM BP-3381，名称叫Budapest Treaty。Alteromonas rava菌株SANK 73390的分类特征如下所示。
1)形态特征Alteromonas rava菌株SANK 73390在23℃在海琼脂(Difco)上培养24小时。接着显微观察发现该细胞是杆状，并且每个直径0.8到1.0μm长2.0到3.6μm。该菌株是格兰氏阴性，并靠极性单鞭毛运动。
2)在海琼脂上的生长SANK73390在23℃在海琼脂(Difco)上培养24小时，观察所得到的菌落为浅灰黄色，不透明的，圆形、扁平、边缘光滑的。没有形成水溶性色素。
3)生理特性(1)海水要求SANK73390的生长需要海水。
(2)氧化-发酵实验(Hugh-Leifson方法[J.Bact.，66，24-26(1953)]，从人造海水中制得的培养基)对碳水化合物无作用。
(3)氧化酶+(4)过氧化氢酶+(5)氧气的要求需氧的
(6)硝酸盐的还原-(7)淀粉的水解+(8)琼脂的降解-(9)明胶液化+(10)脱氧核糖核酸酶的产生+(11)脂肪酶的产生+(12)生长温度4℃生长较差，17℃到26℃之间生长较好，35℃不生长。
(13)生长条件要求在Journal of Bacteriology 107，268-294(1971)上所述的基础培养基上，SANK73390需要不含维生素的酪蛋白氨基酸。
(14)碳源的同化作用在Journal of Bacteriology 107，268-294(1971)所述的基础培养基上，另外含有0.1%，W/V无维生素的酪蛋白氨基酸，振荡培养表L-阿拉伯糖: - D-核糖: -D-木糖: - D-葡萄糖: +D-半乳糖: - D-果糖: -麦芽糖: + 蔗糖: -海藻糖: + 纤维二糖: -蜜二糖: - 甘露糖: -山梨糖: - 甘油: -乙酸钠: + 丙酸钠: +
4.化学分类特征(1)DNA的鸟嘌呤和胞嘧啶(G+C的含量)摩尔%43.4%(HPLC方法)(2)醌系辅酶Q-8考虑到上述所示的分类特征，把Alteromonas rava菌株SANK73390与Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology，Vol.1(1984)中所述的菌株，以及近来出版的International Journal of Systematic Bacieriology中所述的那些菌株作比较。我们发现Alteromonas rava菌株SANK73390与另外的海生微生物Alteromonas Citrea有某些相似性，把SANK73390和Alteromonas Citrea，ATCC29719(标准菌株)对照培养并作比较。
与浅灰黄色的SANK73390相比，ATCC29719;菌落是绿黄色。SANK73390也不同于Alteromonas Citrea在4℃生长，以及能用海藻糖和丙酸钠作碳源。因此，Alteromonas rava菌株SANK73390是Alteromonas rava新种的一个新菌株，并且基本特征区别于最近已知的收藏的，收藏号为ATCC29719的种。
以上所述的特征是典型的SANK73390，然而，众所周知，Alteromonas属的特征是可以天然和人工改变的。上述所定义的特征可限定所保藏的Alteromonas rava菌株，但不必是典型的Alteromonas的其它种，或Alteromonas rava的菌株，它们能够产生thiomarinol或其自然存在的变体。上述其它菌株都包括在本发明的范围内。
人们将会认识到，SANK73390，或其它任何能产生thiomarinol或其变体之一的菌株，可以继代培养，或用生物技术改变或改良来产生具有不同特征的生物体。唯一的要求是所得到的生物体能够产生所需的化合物。
这种改变和改良可以采用任一种需要的方式或者可以，例如，因有关的培养基条件而引起。菌株可以经培养来改良并且这样选择出来的菌株能具有提高生长，或在较低/较高温度下生长的特征。
生物技术的改良一般是有意的，并能够引入选择性特征，如对制菌剂的抗性或易感性，或者它们的结合，来保持纯度，或有时使培养基特别是种子培养基纯化。
可经遗传操作引入Alteromonas spp中可容许的任何其它特征。例如，可以掺入编码抗性的质粒，或者可除去任何自然存在的质粒。有益的质粒包括那些使其具有营养缺陷体的质粒。质粒可从任何适当来源获得，或者设计分离一种天然存在的Alteromonas质粒和插入一种需要的基因或其它来源的基因。也可以用需要的任何其它方式来改良天然质粒。
为从适当微生物培养基中获得thiomarinol B和/或C，在适当培养基中发酵该微生物。这种培养基在现有技术中常是已知的，并将经常用于产生其它发酵产物。
典型地，对这种培养基来说含有碳源、氮源和一种或多种可被相关微生物同化的无机盐的任何组合物都将是必要的。对这种培养基的最低要求将是它含有对该微生物生长来说必要的那些成份。
适宜的碳源包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖、甘油、糊精、燕麦粉、黑麦;玉米淀粉、马铃薯、玉米粉、大豆粉、棉花籽油、糖汁、柠檬酸和酒石酸，它们可被单独使用或与一种或多种其它物质结合使用。一般用量将在约1到10%W/V培养基用量的范围内，尽管该用量还可按所要求的和按照所需要的结果变化。
适宜的氮源包括含有如蛋白质的任何物质。氮源代表例是来自动植物的有机氮源，并可以是提取自如大豆粉、麸、花生粉、棉花籽粉、酪蛋白水解液、fermamine、鱼粉、玉米浸液、胨、肉提取物，酵母、酵母提取物，麦芽提取物的天然氮源;以及象硝酸钠，硝酸铵和硫酸铵的无机氮源。与碳源一样，这些氮源可以单独或结合使用。适当的用量一般是在约0.1到6%W/V的培养基用量范围之间。
适宜的营养无机盐是能够提供微量元素以及主要成分的那些盐类。优选的能提供象钾、钠、铵、钙、镁、铁、磷酸盐、硫酸盐、氯酸盐、碳酸盐离子的盐。也可以是如钴、锰和锶的微量金属，或能提供如溴、氟、硼酸盐或硅酸盐离子的盐。
我们将认识到Alteromonas rava是在海水中天然存在的，这样，不存在相反的指示，它的培养基的条件将与海洋环境完全相符。所以，发现于海洋中的微量离子包括在用来培养Alteromonas的任何培养基中，是很有益的。特别是，优选把该微生物培养于海水，人工海水或与海水组合物一致的成份存在下的环境。
如果要把该微生物发酵于一种液体培养液，优选使用象硅油或植物油，或其它适当的表面活性剂的防沫剂。
当用来产生thiomarinol B和/或C时，优选Alteromonas rava菌株SANK73390的培养基PH值保持在PH5.0到PH8.0之间，因此唯一的要求是PH值不应阻止该微生物的生长，或对最终产物的质量不应有不可改变的不利影响。停止发酵时，优选加过量的酸或碱。
Alteromonas rava菌株SANK73390一般在4℃到32℃温度范围内生长，最好在17℃到26℃的温度之间生长。当菌株已发展为能在较低或较高温度生长的微生物时，不落在这个范围的其它温度也可以适用。对生产thiomarinol B和/或C来说，最理想的温度在20℃到26℃之间。
thiomarinol B和/或C可经过需氧培养来完美地得到，可以使用任何适当的需氧培养技术，如例如固体培养，振荡培养或通气-搅拌培养。
如果是小批量地进行培养，那么通常优选在20℃到26℃，把振荡培养物发酵几天。
为开始发酵培养，优选的技术是使用例如在锥形烧瓶中用一或两个步骤准备好的原始接种物。对该培养基来说，可结合使用碳源和氮源，在一个恒温箱中在23℃振荡该接种物烧瓶1到3天，或直到观察到明显生长为止。然后，把所得到的种培养物用来给第二个种培养基，或者生产培养基接种。如果进行第二次接种，可以用相似方法进行。并将部分接种物用来给生产培养基接种。在如上所述的适宜的温度，振荡用发酵接种物接种的烧瓶适当的时间，例如接种1到3到天，或过滤来收集该烧瓶的内容物。
如果大规模地进行培养，最好在一个适当的通气-搅拌发酵器中培养。在这些方法中，营养培养基可在发酵器中准备。在125℃灭菌后，冷却该培养基并用在灭菌培养基上事先生长的接种物接种。培养是在20℃到26℃伴随搅拌和通气下进行的，这种方法适合收获大量的化合物。
经一般时间培养所产生的thiomarinol B和/或C的量能用如高效液相色色谱来监控。一般来说，在19小时和200小时之间这段时间之后所产生的B的量达到最高。而在19小时到200小时这段时间之后所产生的thiomarinol C的量达到最高;相对来说，在19小时到96小时之间这段时间之后所产生的thiomarinol的量达到最高。
在培养适当时间之后，用任何已知方法来分离和纯化thiomarinol B和/或C。例如，使用硅藻土助滤剂滤除固态物，或者根据thiomarinol B和/或C的物理-化学性质，经离心分离，然后提取纯化的上清液，可获得培养肉汤中存在的任何thiomarinol B和/或C。例如，存在于滤液或上清液中的thiomarinol B和/或C能够用象乙酸乙酯，氯仿、二氯乙烷，二氯甲烷或其任意混合物，在中性或酸性条件下提取，并纯化。
可选择的，作为吸附剂，也可以使用活性碳或象Amberlite(商标)XAD-2，XAD-4(Rohm和Haas)或Diaion(商标)HP-10、HP-20、(HP20、HP50(Mitsubishi Kasei Corporation)吸咐树脂。把含有thiomarinol B和/或C的液体通过吸附剂，将杂质吸附后除去，或者thiomarinol B和/或C能被吸附后用适当洗脱剂如甲醇水溶液、丙酮水溶液或丁醇/水洗脱来纯化。
细胞内的thiomarinol B和/或C可用适当溶剂提取纯化，有机溶剂为丙酮水溶液或甲醇水溶液优选的浓度按体积计50至90%随后除去有机溶剂，然后如前述提取滤液或上清液。
所得到的thiomarinol B和/或C可用熟知的技术进一步纯化，例如，用如硅胶或含镁硅胶，作载体的吸附柱色谱分离如以商品名“Florisil”出售的柱;用象Sephadex LH-20(Pharmacia产品的商品名)作吸附剂的分配柱色谱分离;或者用正相或反相柱的高效液相色谱，如本领域所熟知的，这些分离和纯化方法可以单一进行或以任何适当结合方式使用，并且，如果需要的话，重复地分离和纯化所要求的最后产物。
可选择地，thiomarinol B可以经氧化thiomarinol的方法制得，并且这种方法被认为是有益的，因为经发酵仅获得相当少的thiomarinol B。
氧化最好是在一种溶剂中和有或无碱存在下进行使氧化剂作用在thiomarinol上。
所用氧化剂的性质对本发明方法来说并不重要，在氧化反应中常用的任何氧化剂可以在此相应地使用。这类氧化剂例子包括高锰酸钾;铬酸盐类如重铬酸钾、重铬酸钠，氧化铬(Ⅵ)，铬酰氯和铬酸叔丁酯;四氧化钌;如氯、溴和碘的卤素类;臭氧;氧;过氧化氢;如双(三甲基甲硅烷基)过氧化物，枯基氢过氧化物和叔丁基氢过氧化物的有机过氧化物类;如二环氧乙烷、甲基二环氧乙烷、二甲基二环氧乙烷、二乙基二环氧乙烷、乙基甲基二环氧乙烷、甲丙基二环氧乙烷、丁基甲基二环氧乙烷、氟代二环氧乙烷、甲基氟代二环氧乙烷、二氟代二环氧乙烷、双(三氟甲基)二环氧乙烷、甲基三氟甲基二环氧乙烷和三氟甲基氯代二氟甲基二环氧乙烷的二环氧乙烷类;有机过酸类及其盐类，如过乙酸、过甲酸和间-氯过苯甲酸;以及过氧硫酸类及其盐类，如过氧一硫酸、过氧二硫酸钾和过氧一硫酸钾(特别是以商品名“Oxone”出售的，Aldrich化学公司的产品)。优选氧化剂的例子包括过氧化氢，有机过酸类及其盐，有机过氧化物类，二环氧乙烷类和过氧硫酸类及其盐，以及最佳例包括过氧化氢、二甲基二环氧乙烷和过氧硫酸类及其盐。
如果该反应中所用的碱对反应或反应试剂无不良影响，对它的性质也没有特殊限定。这类碱优选例包括无机盐类，如碱金属的碳酸盐类(如碳酸钠、碳酸钾或碳酸锂)，碱金属的碳酸氢盐类(如氢化锂、氢化钠或氢化钾)，碱金属的氢氧化物类(如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡或氢氧化锂)以及碱金属的氟化物类(如氟化钠、氟化钾或氟化铯);有机盐类，例如碱金属的醇盐类(如甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾、或甲醇锂)，碱金属的烷基硫化物类(如甲硫钠或乙硫钠);以及氮化合物类(如三乙胺、三丁胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉、吡啶、4-(N，N-二甲基氨基)吡啶，N，N-二甲基苯胺、N，N-二乙基苯胺、1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)和1，8-二氮杂双环[5.4.1]十二-7-烯(DBU)。最佳例包括碱金属的碳酸盐类和碱金属的碳酸氢盐类。
该反应一般且最好在一种溶剂中进行，这种试剂如果对该反应没有不良影响并能溶反应试剂的话，至少在某种程度上它的性质是不重要的。适宜的溶剂例子包括水、醇类，如甲醇、乙醇和丙醇;酮类，如丙酮或甲基乙基醇;有机酸类，如乙酸或甲酸;酯类，如乙酸乙酯;醚类，如乙醚或四氢呋喃;酰胺类，如二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺;以及这些溶剂的任意两种或多种混合物。优选例包括醇类以及水和酮类的混合物，而最佳例包括水和丙酮的混合物。
尽管该反应没有无机催化剂也可进行，但为了促进反应，如果必要的话，该反应可以在无机催化剂如，氧化铂或氧化钒存在下进行。
该反应将在较宽的温度范围内进行，对本发明来说所选的精确反应温度并不重要。一般来说，我们发现在-78℃到100℃，最好在-10℃到室温的温度范围内进行反应比较方便。对该反应来说所需的时间根据许多因素，主要是反应温度和反应试剂的性质，特别是所用的氧化剂和碱而广泛地变化。但是，多数情况下，反应足够时间为15分钟到30小时，最好为15分钟到2小时。
反应结束后，用常规方法从反应混合物中收集所需的化合物。例如，适当的收集技术包括把反应混合物倒入水中;用与水不混溶的溶剂提取，这种溶剂如芳烃(如苯)、醚(如乙醚)、有机酸的酯(如乙酸乙酯)或卤代烃(如二氯甲烷);然后从提取液中蒸掉溶剂。如果必要的话，把用这种方法获得的所需化合物用常规方法进一步纯化，例如，用各种色谱分离技术，主要是柱色谱分离法或制备薄层色谱法。
这种氧化反应的起始物thiomarinol能用Alteromonas属的微生物，特别是如上所述与制备thiomarinol B和/或C相关的Alteromonas rava菌株SANK73390经发酵制得。
因为thiomarinol B和/或C具有对动物体(如人、狗、猫和兔)的格兰氏阳性和格兰氏阴性细菌和支原体的抗菌作用，根据感染的性质它们能被用来治疗或预防由各种途径引起的细菌或支原体的感染。
当本发明的化合物用于治疗目的时，它们可被单独给药，或以含有另外活性化合物，一种或多种常规稀释剂，载体、赋形剂或佐剂的合适的药物配方给药。当然，这种配方的性质取决于所采用的给药途径。然而，对口腔途径来说，最好把该化合物制成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或糖浆剂。对于胃肠外给药来说，它最好被配制为注射剂(可静脉内、肌肉内或皮下使用)，作成滴剂、栓剂、油剂或擦剂。
用已知方法把上述添加剂如载体，粘合剂，崩解剂，稳定剂，矫味剂，增溶剂，香料，香水，悬浮剂或包衣剂加到该活性化合物中制成这些剂型。尽管剂量可以根据患者的症状和年龄、感染的性质和程度以及给药的途径和方式而变化，在给每位成人患者口腔给药情况下，一般以每天剂量20mg到2000mg服用本发明的化合物。该化合物可以一次剂量，或以分开的剂量，如一天两或三次的方式服用。
本发明化合物的制备由下列非限定性实施例来进一步详细说明，并且这些化合物的生物活性由下列实验例来详细说明。实施例6详细说明了thiomarinol的制备，它被用作氧化制备thiomarinol B的起始物。
实施例-1在罐中培养来制备thiomarinol BA)培养把Alteromonas rava菌株SANK 73390在海生琼脂(Difco)的产品的斜面上，在22℃培育3天。所得到的培养物悬浮于3ml灭菌的人工海水中，把0.1ml所得到的悬浮液接种到两只500ml锥形烧瓶每只当中，每只烧瓶中含有100ml具有以下组分的灭菌培养基海水肉汤(Difco) 37.4g去离子水 1000ml没有调节PH
把培养物在23℃用一台旋转振荡机以210rpm振荡下培育24小时。把所得到的培养物的全部接种到一只600升通气搅拌式培养罐中，该罐中含有200升具有如上所述相同组合物的培养基，其中每种组份都已分别灭菌。然后在23℃培养26小时，同时以空气流速为0.5vvm(即，“每分钟每体积体积”1vvm是指1分钟内所提供的空气量等于罐内空气体积)给培养基通气，并把旋转速度调整到82.5到170rpm之间来保持不溶的氧气浓度为5.0ppm。
B)分离把足量的盐酸水溶液加入230升的所得到的培养液中，调整PH值到2.5。然后把200升的丙酮加到所得到的混合物中，在搅拌下把该混合物浸提0.5小时。然后把4.0Kg的Celite 545助滤剂(美国的Jones Manvill Project公司的产品商标)加到该混合物中，过滤该混合物。该滤液(430升)用200升的乙酸乙酯萃取一次然后用100升的乙酸乙酯萃取两次，把合并的乙酸乙酯萃取液用200升的5%W/V碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用100升的饱和氯化钠水溶液洗涤，之后，把它们用无水硫酸钠干燥，然后，在减压下蒸干，得到约80g的油。
把这样得到的油全部溶于二氯甲烷，所得到的溶液被吸附在装有用二氯甲烷饱和过的1.1Kg硅胶的柱上。然后用按体积计1∶1二氯甲烷和乙酸乙酯混合物，单用乙酸乙酯和用按体积计9∶1乙酸乙酯-甲醇混合物以这个顺序(洗脱剂的极性以这个顺序增长)来洗脱该溶液，在洗脱剂被分馏为每500ml一份后，合并用乙酸乙酯和甲醇的混合物洗脱的含有thiomarinol B的部分并减压蒸干得到60g的油。
把所得到的油全部溶于6升50%V/V甲醇溶液中，并把所得到的溶液吸附于装有用水饱和过的Diaion HP-20(商标)的2.3升柱上，之后该油溶液直接用含水甲醇梯度洗脱，其中甲醇浓度逐渐由(按体积计)30%增至90%。更具体地说，4升每30%甲醇溶液、50%含水甲醇、60%甲醇溶液，70%甲醇溶液和80%甲醇溶液被用于柱上之后，用90%的甲醇溶液洗脱该柱。洗脱继续到用高效液相色谱监测没有发现更多该化合物的洗脱液为止。用来洗脱的90%甲醇溶液用量约10升。收集用90%甲醇溶液洗脱的馏分并在减压下蒸干，得到3.8g黄色粉。把该黄色粉用装有320g的已用(按体积计)19∶19∶2的二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇饱和过的Sephadex LH-20的柱进行色谱分离，之后用相同溶剂混合物洗脱来有效纯化。
把所得到的产物进一步用高效液相色谱纯化，该色谱用反相柱[Senshu-Pak ODS H-5251(柱体积20mm直径，250mm长)，Senshu Scientific Co.，Ltd的产品商标]并用40%V/V乙腈水溶液作洗脱剂，流速15ml/分钟，来纯化该产物，同时通过观察220nm的吸收值来监控纯化。由于在13到14分钟的保留时间内有一个峰时可得到thiomarinol B，收集这部分馏份并在减压下蒸干，分离得到130mg具有前面所列的物理-化学性质的标题化合物。
实施例2氧化thiomarinol来制备thiomarinol B
把100.9mg thiomarinol(如实施例6中所述制备的)溶于5ml丙酮和5ml水的混合物中;然后把所得到的溶液用冰冷却，把112.2mg的过硫酸氢钾制剂(Aldrich Chemical Co.，Inc的产品商品名)加到所得到的溶液中，然后搅拌该混合物，同时用冰冷却，40分钟。在这段时间末，把1.2ml的饱和碳酸氢钠水溶液加入该混合物中，再搅拌混合物，同时用冰冷却30分钟。然后把5ml水加到该反应混合物中，接着用(按体积计)10∶1二氯甲烷和四氢呋喃萃取混合物。把该萃取液用无水硫酸钠干燥，然后减压蒸馏除去溶剂。所得到的剩余物用反相，高效液相色谱法(用Senshu Pak ODS-5251-N柱，和40%V/V乙腈水溶液作洗脱剂)分离纯化得到79.5mg(产率75%)的浅黄色，并具有如上所列物理化学特性的thiomarinol B。
实施例3氧化thiomarinol来制备thiomarinol B把100mg thiomarinol(如实施例6中所述制备的)溶于15ml丙酮和7.5ml水的混合物中，然后把0.074ml的35%过氧化氢水溶液和2滴碳酸氢钠的稀释水溶液加到混合物中。把该反应混合物搅拌5分钟，之后减压蒸馏除去丙酮。然后把乙腈加到剩余物中，用反相高效液相色谱(用Senshu Pak ODS-4251-N柱，和40%V/V乙腈水溶液作洗脱剂)可证实生成了thiomarinol B。经减压蒸馏从反应混合物中除去溶剂，把所得到的剩余物溶于40%Ⅴ/Ⅴ乙腈溶液中。然后用反相，高效液相色谱法(用Senshu Pak ODS-4251-N柱，和40%Ⅴ/Ⅴ乙腈水溶液作洗脱剂)分离纯化得到43.2mg(产率41%)的浅黄色，并具有如上所列的物理-化学性质的thiomarinol B。
实施例4氧化thiomarinol来制备thiomarinol B把100mg thiomarinol(如实施例6中所述制备的)溶于40ml丙酮，然后在所得到的溶液中加入134mg的间-氯代过苯甲酸，同时用冰冷却并搅拌。然后在室温下搅拌该混合物1.5小时。在这段时间结束后，用二氯甲烷萃取该反应混合物，并用水把萃取液洗三次然后用饱和的硫酸氢钠的水溶液洗一次。把该萃取液用无水硫酸钠干燥，之后用减压蒸馏除去溶剂。把所得到的剩余物用反相高效液相色谱法(用Senshu Pak ODS-4251-N柱，和40%V/V乙腈水溶液作洗脱剂)分离纯化得到8.5mg(产率8%)的浅黄色，并具有如上所列的物理-化学性质的thiomarinol B。
实施例5在罐中培养来制备thiomarinol CA)培养把一个已使用并生长有Alteromonas rava菌株SANK 73390的海生琼脂(Difco)斜面加到10ml的灭菌海水肉汤(Difco)中，制得一种细菌悬浮液。
把含有15升相同海水肉汤培养基的30升的发酵罐加热来灭菌，然后把全部细菌悬浮液接种到发酵罐中，并在23℃温度下空气流速为7.5升/分钟培养24小时。开始搅拌速度为100rpm，然后适当调节搅拌速度，以保持所溶的氧气浓度为5.0ppm。
然后把具有下列组份的300升培养基放入两只每个600升的罐中
葡萄糖 1.5%Bacto胨(Difco) 1.5%Bacto发酵提取物(Difco) 0.2%NaCl 3.89%MgCl2·6H2O 2.52%Na2SO40.648%CaCl2·2H2O 0.4767%KCl 0.11%Na2CO30.038%柠檬酸铁 0.02%灭菌前pH为7.6然后加热来给该罐灭菌，然后把3升种培养液接种到每个罐，在23℃的温度下，空气流速为150升/分钟培养29小时。开始搅拌速度是82rpm，然后逐渐调节搅拌速度，以使所溶的氧气浓度保持在5.0ppm。
B)分离把足量的盐酸水溶液加到700升所得到的培养液中，调节它的PH值为3，然后把700升的丙酮加到所得到的混合物中，在搅拌下进行提取1小时。然后用700升乙酸乙酯萃取一次所得到的萃取物，再用300升的乙酸乙酯萃取一次。然后把合并的乙酸乙酯萃取液用300升5%W/V碳酸氢钠水溶液，再用300升的饱和氯化钠溶液按这个顺序洗涤，之后，把它们用无水硫酸钠干燥，再由减压蒸发除去溶剂。在蒸发过程中，加入540g的硅胶，然后继续蒸干。
把这样所得到的剩余物悬浮于二氯甲烷，把所得到的溶液装到装有4Kg用二氯甲烷饱和的硅胶柱。然后用二氯甲烷，用按体积计1∶1二氯甲烷和乙酸乙酯混合物，单用乙酸乙酯和用按体积计9∶1乙酸乙酯和甲醇的混合物按上述顺序洗脱;洗脱剂的极性按这种顺序增长。把洗脱剂分成每2升的等份，收集用乙酸乙酯和甲醇混合物洗脱含有thiomarinol C的馏份并减压蒸干。在蒸发过程中，加入50g硅胶，然后继续蒸干。
把所得到的剩余物悬浮于己烷和丙酮的混合物中，把所得悬浮液装到装有200g用己烷饱和的硅胶柱上，然后按体积计用1∶1的己烷和丙酮洗脱柱，洗脱液分馏成每500ml一等份，获得的馏分1和2含有thiomarinol C。减压蒸发浓缩馏分1。在浓缩过程中，加入25g硅胶，然后继续蒸干。然后按体积计用1∶1∶2己烷、丙酮和乙酸乙酯混合物洗脱，洗脱液分为每500ml的等份，并保留含有thiomarinol C的馏份，把该馏份与以上所得到的馏份2合并，再把合并的馏份减压蒸干浓缩。在浓缩过程中，加入20g的硅胶，然后继续蒸干。
把所得到的剩余物悬浮于按体积计1∶1∶1己烷、丙酮和乙酸乙酯的混合物中，并把所得到的悬浮液装到充有200g用己烷饱和过的硅胶柱上。用按体积计1∶1∶1己烷、丙酮和乙酸乙酯混合物洗脱。该洗脱液被分成每500ml的等份，收集含有thiomarinol C的馏份，并减压蒸发浓缩，得到一种油状物。
把上述全部油状物用一只200ml装有Sephadex LH-20用按体积计19∶19∶2的二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇混合物饱和的柱进一步色谱分离，并用相同溶剂混合物洗脱纯化。收集含thiomarinol C的馏份并减压蒸发浓缩。在浓缩过程中，加入25g硅胶，然后继续蒸干。
把所得到的剩余物悬浮于二氯甲烷中，并把该悬浮液上到装有250g的用二氯甲烷饱和过的硅胶柱上。然后用以9∶1到1∶9变化比例(按体积计)二氯甲烷和丙酮混合物洗脱，这样改变的比例使洗脱剂的极性逐渐增加。该洗脱液被分成每个1升的等份，收集含有thiomarinol C的馏份，并减压蒸干分离到150mg的具有以上所列的物理-化学性质的thiomarinol C。
实施例6thiomarinol的罐发酵A)培养在海生琼脂(Difcor的产品)斜面上把Alteromonas rava菌株SANK73390在22℃培育3天。把所得到的培养物悬浮于3ml的人造海水中。无菌取出0.1ml的上清液并接种到500ml含有100ml灭菌培养基[37.4g海水肉汤(Difco的产品)1升去离子水，pH没有调节]的锥形烧瓶中。
用一个旋转振荡器以200rpm(旋转半径为70nm)振荡下，在23℃培育该烧瓶24小时。这段时间之后，四只每个30升的发酵罐，每只含有15升的如上所述的无菌培养基，用15ml从锥形烧瓶中无菌操作取出的培养物接种，在通气率7.5升/分钟，伴随搅拌下(100rpm)，在23℃培育该发酵罐23小时。
B)分离23小时后，合并发酵罐的内容物得到60升的培养液。然后加入盐酸把该液体pH值调节到3，之后加入60升丙酮，伴随搅拌浸提该混合物30分钟，用1.2Kg的Celite 545助滤剂(从Johns Manville Co.，可得到商品的商标)，过滤该溶液。然后把所得到的110升滤液用60升乙酸乙酯萃取一次，再用乙酸乙酯萃取两次，每次用30升。把合并的有机萃取液用30升5%W/V碳酸氢钠水溶液洗涤，并随后用30升饱和的氯化钠溶液洗涤。然后用无水硫酸钠干燥该混合物，并减压蒸干，得到14g油状物。
把所得到的全部油状物溶于二氯甲烷中，并将该溶液吸附于装有200g已用二氯甲烷饱和过的硅胶柱上。然后用(按体积计)1∶1二氯甲烷和乙酸乙酯混合物，单用乙酸乙酯，用(按体积计)9∶1乙酸乙酯和甲醇，按该顺序(这个顺序下洗脱剂的极性增加)洗脱该溶液。收集洗脱液以/8ml为一份，保留用乙酸乙酯和甲醇混合物洗脱的含有thiomarinol的馏份。
把保留的馏份蒸干，得到7g油状物，把它溶于400ml50%V/V甲醇水溶液中，并吸附在600ml装有用水饱和过的Diaion HP-20(从Mitsubishi Chem.Ind得到的产品的商标)的柱。用50%V/V甲醇水溶液洗涤该柱，然后用90%V/V乙醇溶液洗脱目标物。减压蒸发从所得到的馏分中得到1g黄色粉末。把这种黄色粉末在Sephadex LH-20的柱色谱上进一步洗脱，并用按体积计19∶19∶2二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇混合物展开。从活性馏分中得到750mg的黄色粉末thiomarinol。
所得到的thiomarinol具有如下所示的性质。
1)性质和外观 黄色粉末2)熔点 84-89℃3)分子式 C30H44N2O9S24)分子量640， 用FAB-MS方法测定
(“FAB-MS”是快速原子轰击质谱仪)。
5)高分辨质谱C30H45N2O9S2[(M+H)+用FAB-MS法]计算值 641.2567实测值 641.2585。
6)元素分析计算值C，56.23%;H，6.92%;N，4.37%;S，10.01%，实测值C，55.92%;H，6.82%;N，4.23%;S，9.90%，7)红外吸收光谱该红外光谱显示了下列最大吸收值(KBr盘法，γmax cm-1)3394，2930，1649，1598，1526，1288，1216，1154，1102，1052。
8)紫外吸收光谱在甲醇，或甲醇+HCl中，thiomarinol具有的紫外吸收光谱显示如下[按λmax nm(ε)给出]387(12，000)，300(3，500)，214(26，000)。
且在甲醇+NaOH中具有的紫外吸收光谱显示如下[按λmax nm(ε)给出]386(9，600)，306(3，200)，206(25，000)。
9)比旋光率[α]25D＝+4.3°(C＝1.0，甲醇)10)高效液相色谱分离柱Senshu-Pak ODS H-2151(柱体积，6×150mm，Senshu Scientific Co.，Ltd.产品)。
溶剂40%V/V乙腈水溶液流速1.5ml/分钟波长220-350nm(用光电二极管阵列测得)保留时间5.9分钟。
11)1H-核磁共振谱(δppm)在六氘化二甲基亚砜中用四甲基硅烷作内标，核磁共振谱(270MHz)如下所示。
0.91(3H，双峰，J＝6.8Hz);
0.95(3H，双峰，J＝5.9Hz);
1.30(6H，宽多重峰);
1.55(5H，宽多重峰);
2.03(3H，单峰);
2.09(3H，多重峰);
2.34(2H，三重峰，J＝7.3Hz);
2.33(1H，双峰，J＝10.7Hz);
3.52(2H，多重峰);
3.64(2H，多重峰);
3.73(1H，双峰的双峰);
4.02(2H，三重峰，J＝6.6Hz);
4.18(1H，宽双峰，J＝7.3Hz);
4.30(1H，双峰，J＝4.4Hz);
4.44(1H，双峰，J＝7.8Hz);
4.63(1H，双峰，J＝3.4Hz);
4.89(1H，双峰，J＝7.3Hz);
5.37(2H，多重峰);
5.97(1H，宽单峰);
7.04(1H，单峰);
9.80(1H，宽单峰);
10.68(1H，宽单峰);
12)13C-核磁共振谱(δppm)用四甲基硅烷作内标，在四氘化甲醇中的核磁共振谱(68MHz)如下所示174.3(单峰)，170.4(单峰)，168.6(单峰)，161.1(单峰)，137.9(单峰)，135.7(双峰)，135.1(单峰)，129.8(双峰)，116.3(双峰)，115.8(单峰)，113.7(双峰)，77.6(双峰)，74.4(双峰)，72.1(双峰)，71.8(双峰)，66.0(三重峰)，65.7(双峰)，64.9(三重峰)，45.3(双峰)，43.9(双峰)，36.6(三重峰)，33.4(三重峰)，30.1(三重峰)，30.0(三重峰)，29.7(三重峰)，27.0(三重峰)，26.7(三重峰)，20.3(四重峰)，16.6(四重峰)，16.3(四重峰)。
13)溶解性溶于醇类如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，并溶于二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和乙醚;不溶于己烷和水。
14)颜色反应对硫酸、碘和高锰酸钾呈阳性。
15)薄层色谱Rf值0.57吸附剂硅胶(Merck和Co.，Inc.，Art 5715)展开溶剂按体积计二氯甲烷∶甲醇＝85∶15。
生物活性Thiomarinol B和C的生物活性由下列实验例证实，其中它们与假单孢菌酸A和thiomarinol比较。
试验例1Thiomarinol B和C的抗细菌活性用营养性琼脂培养基(Eiken Chemical Co.，Ltd.产品)按琼脂培养基稀释方法测得抗格兰氏阳性和格兰氏阴性细菌的thiomarinol，thiomarinol B，thiomarinol C和假单孢菌酸A(分别用“A”“B”“C”和“P”区别)的最小抑制浓度(MIC)以μg/ml给出。
下列表1给出结果。
表1MIC (μg/ml)实验的细菌菌株 A B C PStaphylococcus aureus 209P ≤0.01 ≤0.01 ≤0.01 0.05Staphylococcus aureus 56R ≤0.01 ≤0.01 ≤0.01 0.1Staphylococcus aureus 535(MRSA) ≤0.01 ≤0.01 ≤0.01 0.2Enterococcus faecalis 681 0.02 0.05 0.8 25Escherichia coli NIHJ 0.8 0.8 3.1 100Escherichia coli 609 0.8 0.8 1.5 100Salmonella enteritidis 0.4 0.4 1.5 50Klebsiella pneumoniae 806 0.8 0.8 1.5 100Klebsiella pneumoniae846 (R) 0.2 0.2 0.8 100Enterobacter cloacae 963 1.5 0.8 3.1 >100Serratia marcescens 1184 3.1 3.1 6.2 >100Proteus vulgaris 1420 0.05 0.05 0.2 0.4Morganella morganii 1510 6.2 6.2 12.5 >100Pseudomonas aeruginosa 1001 0.2 0.2 0.8 >100Pseudomonas aeruginosa No.7 0.4 0.4 0.8 >100Pseudomonas aeruginosa 3719 - 0.8 0.4 >100
实验例2Thiomarinol B和C的抗支原体活性按照如实验1的相同的方法，测得thiomarinol，thiomarinolB thiomarinol C和假单孢菌酸A(分别用“A”“B”“C”和“P”区别)，抗各种支原体的活性。该结果在下列表2中给出。
表2MIC(μg/ml)实验的支原体菌株 A B C PMycoplasma bovis Donetta 0.0125 0.006 ≤0.006 ≤0.006Mycoplasma gallisepticumPG-31 0.05 0.1 0.05 6.25Mycoplasma gallisepticumK-1 0.05 0.1 0.05 6.25Mycoplasma hyosynoviae S-16 0.025 0.78 1.56 0.39接种物0.005ml105CFU/ml用来测定的培养基对于各种微生物来说都可以在Chanock培养基[如P.N.A.S.，48，41-49(1962)所述制备并用附加20%马血清]测定thiomarinol B，thiomarinol C和假单孢菌酸A;
在下列培养基中测定thiomarinol
M.bovis和M.gallisepticumChanock培养基(如上所述制备)M.hyosynoviaeMucin PPLO＊琼脂培养基(添加15%马血清)＊-PPLO(类胸膜肺炎微生物)无CV PPLO肉汤(Difco) 21g细菌学的粘蛋白(Difco) 5g蒸馏水 800mlNoble琼脂(Difco) 12g马血清 150ml25%鲜酵母提取物 50ml培养条件37℃，5天，少量氧气(BBL气体包装法[从Cockeysville，MD2103USA的Becton Dickinson微生物体系中得到的，可随意使用的CO2发生器中培养])从以上结果清楚看到thiomarinol B和C具有极好的抗菌和抗支原体的活性，它们至少与thiomarinol一样好，并且通常显著好于假单孢菌酸A。
权利要求
1.被命名为“thiomarinol B”并具有下列特性的一种化合物1)性质和外观黄色粉末2)分子式C30H44N2O11S23)分子量672用FAB-MS测得，“FAB-MS”是高速原子轰击质谱仪4)高分辨质谱C30H45N2O11S2，(M+H)；用FAB-MS测定实测值673.2468计算值673.24655)元素分析计算值C30H44N2O11S2+H2O；C，52.16%；H，6.71%；N，4.06%；S，9.28%实测值C，52.34%；H，6.79%；N，3.92%；S，9.02%6)红外线吸收光谱γmax cm-1用溴化钾(KBr)盘方法测得的红外线吸收光谱如下所示3660，3503，3318，3075，2966，2928，2870，1704，1653，1509，1467，1381，1349，1299，1217，1199，1152，1112，1063，1047，1019，975，949，884，839，764，730，660，609，553。7)紫外线吸收光谱λmax nm(ε)在1-丙醇中测得的紫外线吸收光谱如下所示377(2，900)，301(13，000)，215(21，000)。在1-丙醇+盐酸中测得的紫外线吸收光谱如下所示377(2，900)，301(13，000)，223(17，000)。在1-丙醇+氢氧化钠中测得的紫外线吸收光谱如下所示377(2，900)，301(13，000)，221(19，000)。8)比旋光率[α]25D=7.7°(C=1.0，1-丙醇)。9)高效液相色谱分离柱Senshu-Pak ODS H-2151(柱直径6mm，长150mm，Senshu Scientific Co.，Ltd.产品商标)。溶剂40%V/V乙腈水溶液流速1.5ml/分钟保留时间8.4分钟。10)1H-核磁共振谱(δppm)用四甲基硅烷作为内标，在六氘化的二甲基亚砜中测得的核磁共振谱如下所示。11.28(1H，宽单峰)；10.47(1H，单峰)；7.23(1H，单峰)；5.97(1H，单峰)；5.37(2H，多重峰)；4.88(1H，双重峰，J=7.5Hz)；4.61(1H，宽单峰)；4.63(1H，双重峰，J=7.2Hz)；4.28(1H，双重峰,J=3.6Hz)；4.18(1H，双重峰，J=7.2Hz)；4.02(2H，三重峰，J=6.6Hz)；3.74(1H，宽单峰)；3.64(1H)，3.61(1H)，3.54(1H)，3.51(1H)；3.35(1H，双重峰，J=10.9Hz)；2.43(2H，三重峰，J=7.3Hz)；2.12(1H)，2.09(1H)，2.03(1H)；2.02(3H，单峰)；1.61(1H)，1.58(2H)，1.50(2H)，1.32(2H)，1.30(2H)，1.25(2H)；0.96(3H，双重峰，J=6.3Hz)；0.92(3H，双重峰，J=6.9Hz)。11)13C-核磁共振谱(δ∶PPm)用四甲基硅烷作内标在六氘化的二甲基亚砜中测得的核磁共振谱(90MHz)如下所示173.5(单峰)，166.1(单峰)，165.7(单峰)，160.8(单峰)，143.2(单峰)，134.2(双峰)，127.8(双峰)，123.3(单峰)，115.2(单峰)，114.4(双峰)，109.4(双峰)，76.2(双峰)，72.4(双峰)，69.6(双峰)，69.3(双峰)，64.3(三重峰)，63.9(双峰)，63.0(三重峰)，43.2(双峰)，42.2(双峰)，34.7(三重峰)，31.9(三重峰)，28.3(三重峰)，28.2(三重峰)，28.1(三重峰)，25.3(三重峰)，24.5(三重峰)，20.2(四重峰)，15.7(四重峰)，15.6(四重峰)。12)溶解性；溶于醇类，如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，以及二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和乙醚中。不溶于已烷和水。13)薄层色谱Rf值0.52吸附剂硅胶(Merrch δCo.，Inc.，Art5715)展开溶剂按体积计二氯甲烷∶甲醇=85∶15。
2.一种化合物，被命名为“thiomarinolC”并具有结构式(C)
3.制备权利要求1化合物的方法，它包括培养Alteromonas属的产生thiomarinol B的微生物并从该培养基中分离thiomarinol B。
4.权利要求3的方法，其中所述微生物是Alteromonas rava。
5.权利要求3的方法，其中的所述微生物是由保藏号FERMBP-3381所定义的Alteromonas rava菌株SANK 73390。
6.制备权利要求2的化合物的方法，它包括培养能产生thiomarinol C的Alteromonas微生物并从该培养基中分离thiomarinol C。
7.权利要求6的方法，其中所述微生物是Alteromonas rava。
8.权利要求6的方法，其中所述微生物是由保藏号FERMBP-3381所定义的Alteromonas rava菌株SANK73390。
9.一种通过氧化thiomarinol制备权利要求1的化合物的方法。
10.权利要求9的方法，其中的氧化是用氧化剂作用的，这些氧化剂选自由下列组成的一组氧化剂高锰酸钾;铬酸盐类;四氧化钌;卤素;臭氧;氧;过氧化氢;有机过氧化物;二环氧乙烷;有机过酸类及其盐;以及过氧硫酸及其盐。
11.权利要求9的方法，其中的氧化是用氧化剂作用的，该氧化剂选自下列组成的一组氧化剂过氧化氢;有机过酸及其盐，有机过氧化物，二环氧乙烷和过氧硫酸及其盐。
12.权利要求9的方法，其中的氧化是用氧化剂作用的，该氧化剂选自下列组成的一组氧化剂过氧化氢，二甲基二环氧乙烷和过氧硫酸及其盐。
13.权利要求9的方法，其中的氧化是用氧化剂作用的，该氧化剂选自由下列组成的一组氧化剂高锰酸钾、重铬酸钾、重铬酸钠、二氧化铬(Ⅵ)，二氯二氧化铬、铬酸叔丁酯、四氧化钌、氯、溴、碘、臭氧、氧、过氧化氢、双(三甲硅烷基)过氧化物、枯基氢过氧化物、叔丁基氢过氧化物、二环氧乙烷、甲基二环氧乙烷、二甲基二环氧乙烷、二乙基二环氧乙烷、乙基甲基二环氧乙烷、甲基丙基二环氧乙烷、丁基甲基二环氧乙烷、氟代二环氧乙烷、甲基氟代二环氧乙烷、二氟代二环氧乙烷、双(三氟甲基)二环氧乙烷、甲基三氟甲基二环氧乙烷、三氟甲基氯代二氟甲基二环氧乙烷、过乙酸、过甲酸、间-氯过苯甲酸、过氧一硫酸、过氧二硫酸钾和过氧-硫酸钾。
14.一种组合物，含有权利要求1的化合物和一种药学上可接受的载体。
15.一种组合物，含有权利要求2的化合物和一种药学上可接受的载体。
16.一种治疗或预防细菌感染的方法，该方法包括给患有或易感这类感染的哺乳动物给药有效剂量的权利要求1的化合物。
17.权利要求16的方法，其中所述的哺乳动物是人。
18.一种治疗或预防细菌感染的方法，该方法包括给患有或易感这类感染的哺乳动物给药有效剂量的权利要求2的化合物。
19.权利要求18的方法，其中所述的哺乳动物是人。
全文摘要
具有抗菌和抗支原体特性的两种thiomarinol衍生物，可从Alteromonas属的微生物中获得并命名为“thiomarinol B”和“thiomarinol C”。“Thiomarinol B”还可通过氧化“thiomarinol的方法制得。
文档编号C07D339/04GK1092811SQ93119620
公开日1994年9月28日 申请日期1993年9月18日 优先权日1992年9月18日
发明者高桥秀次, 藤本克巳, 平井功一, 加贺崎武之, 塩泽秀幸, 岩野雄次, 鸟潟显雄, 小川佳年生, 境田义阳, 小玉健太郎, 石井晃 申请人:三共株式会社
技术领域：
本发明涉及一些新的thiomarinol衍生物，并提供了它们的制备方法以及应用它们作抗菌剂的方法和组合物。
例如，在其申请日前但在优先权日之后所公布的欧洲专利申请512824中，thiomarinol已被描述，它用结构式(A)来表示
它是由Alteromonas属的，优选Alteromonas rava菌株SANK 73390的微生物发酵生产的。我们现在已发现thiomarinol的两种衍生物，它们与原始thiomarinol有相似类型的抗菌活性。
Alteromonas属的生物能从海水中分离得到，并且其中一些已显示出产生潜在治疗用途的化合物，例如，已知的bisucaberin化合物已从Alteromonas的一个种获得，并且已显出具有抗肿瘤的活性(日本专利公开申请号63-27484)。
关于thiomarinol的结构方面，已知好几种抗菌物质具有相似结构，并且它们被分为四组。
第一组含有假单孢菌酸，首次分离于假单孢菌属(Pseudomonas.spp)。它们包括假单孢菌酸A[由荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)产生，公开于J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.294(1977)]，假单孢菌酸B[ibid，318(1977)]，假单孢菌酸C[ibid，2827(1982)]和假单孢菌酸D[ibid，2655(1983)]。假单孢菌酸A是以名称“Bactroban”销售的(Beecham，注册商标)，以2%皮肤软膏形式用于抗菌。然而，所有现有技术的这些化合物都比本发明的thiomarinol衍生物具有较弱的抗菌活性。
第二类与本发明化合物共有相似结构的物质包括含有抗菌素全霉素[Helv，Chim.Acta，42，563(1959)]，pyrrothine[J.Am.Chem.Soc.，77，2861(1955)]硫藤黄菌素[Angew.Chem.66，745(1954)]，金色抗菌素[J.Am.Chem.Soc.，74，6304(1952)]和其它的一组化合物。这些抗菌素典型地是由放线菌属产生的，并且特征在于有一个含硫色基。XenorhabdinsⅠ-Ⅴ是与金霉素相关的物质，并且也已经从细菌中分离出来(公开于WO84/01775)。
对这两组衍生物的各种研究已经进行了，但我们未认识到具有相似于thiomarinols的分子结构或具有相似性质特征的任一个已公开的物质。
第三组化合物公开于如日本申请公开号为52-102279，54-12375，54-90179，54-103871和54-125672的申请中，它公开了其中末端的羧酸被酰胺基团取代的假单孢菌酸衍生物。这些化合物不具有类似的抗菌活性，并且不存在广谱抗菌活性。实际上，这些化合物表现出一种具有弱于原始假单孢菌酸抗菌活性的趋势。
第四组包含类似于thiomarinol的化合物它起源于海生细菌的生理物质[the Am.Chem.Soc.，(1990年8月26-31，)第二部分，ORGN，No.139的200Year Conference的论文摘要)。然而，连接在该化合物末端羰基的杂环基团是2-氧代-3-哌啶基。近来已表明它具有抗微生物活性[Experimentia.Vol.48，1165-1169页(1992)]。
尽管如此，最相关的现有技术被认为是假单孢菌酸A，且所有的thiomarinol，即原始的thiomarinol，thiomarinol B和thiomarinol C明显具有比假单孢菌酸A更强的抗菌活性。
本发明目的之一是提供一些新的thiomarinol衍生物。
更具体地说本发明的另一个目的，是提供具有极好的抗菌和抗支原体活性的化合物。
其它目的和优点将随着进行的描述而变得清楚。
总之，本发明提供了thiomarinol的两种新衍生物，一种是S，S-双氧代衍生物，本文中称之为“thiomarinol B”，另一种是脱氧衍生物本文中称之为“thiomarinol C”。
thiomarinol B的结构还没有最后确定，但它能从thiomarinol本身的分子式[式(A)]看到有两种可能的位置被S-氧化。因此，对thiomarinol B本文中是以它的物理-化学性质作为特征的，如下述1)性质和外观黄色粉末。
2)分子式C30H44N2O11S2
3)分子量672(用FAB-MS测定)“FAB-MS”是高速原子轰击质谱仪。
4)高分辨质谱仪C30H45N2O11S2[(M+H)+;用FAB-MS测定]测定值673.2468计算值673.2465，5)元素分析计算值C30H44N2O11S2+H2OC，52.16%;H，6.71%;N，4.06%;S，9.28%实测值C，52.34%;H，6.79%;N，3.92%;S，9.02%6)红外吸收光谱γmax cm-1用溴化钾(KBr)盘方法测定的红外吸收光谱如下所示3660，3503，3318，3075，2966，2928，2870，1704，1653，1509，1467，1381，1349，1299，1217，1199，1152，1112，1063，1047，1019，975，949，884，839，764，730，660，609，553.
7)紫外吸收光谱λmax nm(ε)在1-丙酮中测定的紫外吸收光谱如下所示377(2，900)，301(13，000)，215(21，000)。
在1-丙醇+盐酸中测定的紫外吸收光谱如下所示377(2，900)，301(13，000)，
223(17，000)。
在1-丙醇+氢氧化钠中测定的紫外吸收光谱如下所示377(2，900)，301(13，000)，221(19，000)。
8)比旋光率[α]25D＝+7.7°(C＝1.0，1-丙醇)。
9)高效液相色谱分离柱Senshu-Pak ODS H-2151(柱直径6mm，长150mm，Senshu Scientjfjc Co.，Ltd.产品商标)。
溶剂40%V/V含水乙腈流速1.5ml/分钟保留时间8.4分钟。
10)1H-核磁共振谱(δppm)用四甲硅烷作为内标，在六氘化二甲基亚砜中测得的核磁共振谱(360MHz)如下所示。
11.28(1H，宽单峰);
10.47(1H，单峰);
7.23(1H，单峰);
5.97(1H，单峰);
5.37(2H，多重峰);
4.88(1H，双峰，J＝7.5Hz);
4.61(1H，宽单峰);
4.43(1H，双峰，J＝7.2Hz);
4.28(1H，双峰，J＝3.6Hz);
4.18(1H，双峰，J＝7.2Hz);
4.02(2H，三重峰，J＝6.6Hz);
3.74(1H，宽单峰);
3.64(1H)，3.61(1H)，3.54(1H)3.51(1H);
3.35(1H，双峰，J＝10.9Hz);
2.43(2H，三重峰，J＝7.3Hz);
2.12(1H)，2.09(1H)，2.03(1H);
2.02(3H，单峰);
1.61(1H)，1.58(1H)，1.50(2H)，1.32(2H)，1.30(2H)，1.25(2H);
0.96(3H，双峰，J＝6.3Hz);
0.92(3H，双峰，J＝6.9Hz)。
11)13C-核磁共振谱(δppm)用四甲基硅烷作内标，在六氘化二甲基亚砜中测得的核磁共振谱(90MHz)如下所示173.5(单峰)，166.1(单峰)，165.7(单峰)，160.8(单峰)，143.2(单峰)，134.2(双峰)，127.8(双峰)，123.3(单峰)，115.2(单峰)，114.4(双峰)，109.4(双峰)，76.2(双峰)，72.4(双峰)，69.6(双峰)，69.3(双峰)，64.3(三重峰)，63.9(双峰)，63.0(三重峰)，43.2(双峰)，42.2(双峰)，34.7(三重峰)，31.9(三重峰)，28.3(三重峰)，28.2(三重峰)，
28.1(三重峰)，25.3(三重峰)，24.5(三重峰)，20.0(四重峰)，15.7(四重峰)，15.6(四重峰)。
12)溶解性溶于醇类，如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，以及二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和乙醚，不溶于己烷和水。
13)薄层色谱Rf值0.52吸附剂硅胶(Merck & Co.，Inc Art.5715)展开溶剂按体积计二氯甲烷∶甲醇＝85∶15。
本发明的另一个化合物是thiomarinol C，它可用下列结构式(C)表示
本发明还提供了制备thiomarinol B或C的方法，它包括培养能产生thiomarinol的Alteromonas属微生物，并从该培养基中分离得到thiomarinol B或C。
本发明还提供了通过氧化thiomarinol制备thiomarinol B的方法。
本发明又提供了一种药物组合物，它含有与一种药学上可接受的载体或稀释剂混合的一种抗菌或抗支原体剂，其中的抗菌或抗支原体剂是选自thiomarinol B和C。
本发明此外还提供了治疗或预防细菌或支原体感染的方法，它包括给感染或对这类感染敏感的哺乳动物，可以是人，给药有效剂量的抗菌或抗支原体剂。
尽管thiomarinol B的结构还不明确，但可认为它是具有结构式(B1)或(B2)的化合物
它可能是这些化合物单独一种或者可能是这两种化合物的混合物。如果是一种混合物的话，取决于制备方法，相对比例可能是固定的或可能变化。
从上述结构式中可以清楚看到thiomarinol B和C包含许多不对称的碳原子和几个双键。异构化可能是在thiomarinol的α，β-不饱和羰基部分的特定位置上。因而，thiomarinol能形成多种立体和几何异构体。尽管这些在本文中都用单一分子结构式来表示，但本发明包括所有包括外消异构体的单独分离出的异构体及它的混合物。当使用立体有择合成技术，或旋光的活性化合物被用作起始物质时，可以直接制备单独的异构体;另一方面，如果制备了异构体的混合物，单一的异构体可以由常规的拆开外消旋混合物的技术来获得。
然而，由于该thiomarinol一般由发酵或由发酵产物的化学操作来生产，所以它们将趋于采纳标准的光学构型。因而，当提供了其它构型时，天然构型是优选的。
thiomarinol C可用下列物理-化学性质作为特征1)性质和外观黄色粉末。
2)分子式C30H44N2O8S23)分子量624(由FAB-MS测定)。
4)元素分析计算值C30H44N2O8S2+H2OC，56.05%;H，7.21%;N，4.36%;S，9.97%，实测值C，56.48%;H，7.23%;N，4.30%;S，9.11%，5)红外吸收光谱γmax cm-1用溴化钾(KBr)盘方法测定的红外吸收光谱如下所示3256，3068，2928，2858，1645，1596，1530，1455，1384，1287，1225，1151，1104，1052，974，820，712.
6)紫外吸收光谱λmax nm(ε)
在甲醇或甲醇+盐酸中测定的紫外吸收光谱如下所示388(9，600)，300(2，700)，215(17，000)。
在甲醇+氢氧化钠中测得的紫外吸收光谱如下所示386(8，600)，205(49，000)，7)比旋光率[α]25D＝-1.40°[C＝1.0，甲醇)]8)高效液相色谱分离柱Senshu-Pak ODS H-2151(柱体积直径6mm，长150mm，Senshu Scientific Co.，Ltd.)。
溶剂40%V/V含水乙腈流速1.5ml/分钟保留时间11.3分钟。
9)1H-核磁共振谱(δppm)用四甲基硅烷作为内标，在六氘化二甲基亚砜中测得的核磁共振谱(360MHz)如下所示。
10.70(1H，单峰);
9.81(1H，单峰);
7.05(1H，单峰);
5.68(1H，单峰);
5.37(1H，多重峰);
5.33(1H，多重峰);
4.64(1H，宽单峰);
4.55(1H，宽多重峰);
4.32(1H，双峰，J＝4.3Hz);
4.01(2H，三重峰，J＝6.6Hz);
3.67(1H)，3.62(1H)，3.58(1H)，3.49(1H)3.35(1H);
3.18(1H，宽多重峰)2.56(1H，宽双重峰，J＝14.2Hz);
2.34(2H，三重峰，J＝7.3Hz);
2.15(1H);
2.11(3H，单峰);
2.08(1H)，2.06(2H);
1.63(1H，多重峰)，1.56(2H，多重峰)，1.51(2H，多重峰)，1.30(2H)，1.29(2H)，1.26(2H);
0.95(3H，双峰，J＝6.3Hz);
0.91(3H，双峰，J＝6.9Hz)。
10)13C-核磁共振谱(δppm)用四甲基硅烷作内标，在六氘化二甲基亚砜中测定的核磁共振谱如下所示171.8(单峰)，167.9(单峰)，165.7(单峰)，157.9(单峰)，134.2(双峰)，133.9(单峰)，133.6(单峰)，127.6(双峰)，116.5(双峰)，
115.3(单峰)，110.4(双峰)，74.4(双峰)，69.3(双峰)，69.2(双峰)，68.1(双峰)，64.0(三重峰)，63.0(三重峰)，43.1(双重峰)，42.5(三重峰)，42.0(双峰)，34.6(三重峰)，32.1(三重峰)，28.4(三重峰)，28.3(三重峰)，28.1(三重峰)，25.2(三重峰)，24.9(三重峰)，20.0(四重峰)，18.6(四重峰)，15.7(四重峰)。
11)溶解性溶于醇类如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，以及二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和乙醚。不溶于己烷和水。
12)薄层色谱Rf值0.66吸附剂硅胶(Merck & Co.，Inc.，Art 5719)展开溶剂按体积计二氯甲烷∶甲醇＝85∶15。
thiomarinol B和C可以由培养产生thiomarinol的Alteromonas属的微生物，然后从该培养基中收集所需的thiomarinol B和/或C的方法制得。具有所需抗菌活性的thiomarinolB和/或C的变体可以用类似方式从能产生所需化合物的Alteromonas其它菌株或种中获得，或者它们可以从通过所述发酵作用获得的适当改变的化合物得到，或者它们可以被直接化学合成。
具体来说，我们特别优选使用Alteromonas rava种作该种微生物，并且尤其是近来分离出的Alteromonas rava菌株，我们已给该菌株指定为SANK73390。SANK 73390是一种海生微生物，它分离于在日本的Koina Minami-Izu Machi，Shizuoka Prefecture海边的海水，并且该菌株已在1991年4月30日被保藏于日本的Deposition Institute，Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Science & Technology Ministry of International Trade and Industry保藏号FERM BP-3381，名称叫Budapest Treaty。Alteromonas rava菌株SANK 73390的分类特征如下所示。
1)形态特征Alteromonas rava菌株SANK 73390在23℃在海琼脂(Difco)上培养24小时。接着显微观察发现该细胞是杆状，并且每个直径0.8到1.0μm长2.0到3.6μm。该菌株是格兰氏阴性，并靠极性单鞭毛运动。
2)在海琼脂上的生长SANK73390在23℃在海琼脂(Difco)上培养24小时，观察所得到的菌落为浅灰黄色，不透明的，圆形、扁平、边缘光滑的。没有形成水溶性色素。
3)生理特性(1)海水要求SANK73390的生长需要海水。
(2)氧化-发酵实验(Hugh-Leifson方法[J.Bact.，66，24-26(1953)]，从人造海水中制得的培养基)对碳水化合物无作用。
(3)氧化酶+(4)过氧化氢酶+(5)氧气的要求需氧的
(6)硝酸盐的还原-(7)淀粉的水解+(8)琼脂的降解-(9)明胶液化+(10)脱氧核糖核酸酶的产生+(11)脂肪酶的产生+(12)生长温度4℃生长较差，17℃到26℃之间生长较好，35℃不生长。
(13)生长条件要求在Journal of Bacteriology 107，268-294(1971)上所述的基础培养基上，SANK73390需要不含维生素的酪蛋白氨基酸。
(14)碳源的同化作用在Journal of Bacteriology 107，268-294(1971)所述的基础培养基上，另外含有0.1%，W/V无维生素的酪蛋白氨基酸，振荡培养表L-阿拉伯糖: - D-核糖: -D-木糖: - D-葡萄糖: +D-半乳糖: - D-果糖: -麦芽糖: + 蔗糖: -海藻糖: + 纤维二糖: -蜜二糖: - 甘露糖: -山梨糖: - 甘油: -乙酸钠: + 丙酸钠: +
4.化学分类特征(1)DNA的鸟嘌呤和胞嘧啶(G+C的含量)摩尔%43.4%(HPLC方法)(2)醌系辅酶Q-8考虑到上述所示的分类特征，把Alteromonas rava菌株SANK73390与Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology，Vol.1(1984)中所述的菌株，以及近来出版的International Journal of Systematic Bacieriology中所述的那些菌株作比较。我们发现Alteromonas rava菌株SANK73390与另外的海生微生物Alteromonas Citrea有某些相似性，把SANK73390和Alteromonas Citrea，ATCC29719(标准菌株)对照培养并作比较。
与浅灰黄色的SANK73390相比，ATCC29719;菌落是绿黄色。SANK73390也不同于Alteromonas Citrea在4℃生长，以及能用海藻糖和丙酸钠作碳源。因此，Alteromonas rava菌株SANK73390是Alteromonas rava新种的一个新菌株，并且基本特征区别于最近已知的收藏的，收藏号为ATCC29719的种。
以上所述的特征是典型的SANK73390，然而，众所周知，Alteromonas属的特征是可以天然和人工改变的。上述所定义的特征可限定所保藏的Alteromonas rava菌株，但不必是典型的Alteromonas的其它种，或Alteromonas rava的菌株，它们能够产生thiomarinol或其自然存在的变体。上述其它菌株都包括在本发明的范围内。
人们将会认识到，SANK73390，或其它任何能产生thiomarinol或其变体之一的菌株，可以继代培养，或用生物技术改变或改良来产生具有不同特征的生物体。唯一的要求是所得到的生物体能够产生所需的化合物。
这种改变和改良可以采用任一种需要的方式或者可以，例如，因有关的培养基条件而引起。菌株可以经培养来改良并且这样选择出来的菌株能具有提高生长，或在较低/较高温度下生长的特征。
生物技术的改良一般是有意的，并能够引入选择性特征，如对制菌剂的抗性或易感性，或者它们的结合，来保持纯度，或有时使培养基特别是种子培养基纯化。
可经遗传操作引入Alteromonas spp中可容许的任何其它特征。例如，可以掺入编码抗性的质粒，或者可除去任何自然存在的质粒。有益的质粒包括那些使其具有营养缺陷体的质粒。质粒可从任何适当来源获得，或者设计分离一种天然存在的Alteromonas质粒和插入一种需要的基因或其它来源的基因。也可以用需要的任何其它方式来改良天然质粒。
为从适当微生物培养基中获得thiomarinol B和/或C，在适当培养基中发酵该微生物。这种培养基在现有技术中常是已知的，并将经常用于产生其它发酵产物。
典型地，对这种培养基来说含有碳源、氮源和一种或多种可被相关微生物同化的无机盐的任何组合物都将是必要的。对这种培养基的最低要求将是它含有对该微生物生长来说必要的那些成份。
适宜的碳源包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖、甘油、糊精、燕麦粉、黑麦;玉米淀粉、马铃薯、玉米粉、大豆粉、棉花籽油、糖汁、柠檬酸和酒石酸，它们可被单独使用或与一种或多种其它物质结合使用。一般用量将在约1到10%W/V培养基用量的范围内，尽管该用量还可按所要求的和按照所需要的结果变化。
适宜的氮源包括含有如蛋白质的任何物质。氮源代表例是来自动植物的有机氮源，并可以是提取自如大豆粉、麸、花生粉、棉花籽粉、酪蛋白水解液、fermamine、鱼粉、玉米浸液、胨、肉提取物，酵母、酵母提取物，麦芽提取物的天然氮源;以及象硝酸钠，硝酸铵和硫酸铵的无机氮源。与碳源一样，这些氮源可以单独或结合使用。适当的用量一般是在约0.1到6%W/V的培养基用量范围之间。
适宜的营养无机盐是能够提供微量元素以及主要成分的那些盐类。优选的能提供象钾、钠、铵、钙、镁、铁、磷酸盐、硫酸盐、氯酸盐、碳酸盐离子的盐。也可以是如钴、锰和锶的微量金属，或能提供如溴、氟、硼酸盐或硅酸盐离子的盐。
我们将认识到Alteromonas rava是在海水中天然存在的，这样，不存在相反的指示，它的培养基的条件将与海洋环境完全相符。所以，发现于海洋中的微量离子包括在用来培养Alteromonas的任何培养基中，是很有益的。特别是，优选把该微生物培养于海水，人工海水或与海水组合物一致的成份存在下的环境。
如果要把该微生物发酵于一种液体培养液，优选使用象硅油或植物油，或其它适当的表面活性剂的防沫剂。
当用来产生thiomarinol B和/或C时，优选Alteromonas rava菌株SANK73390的培养基PH值保持在PH5.0到PH8.0之间，因此唯一的要求是PH值不应阻止该微生物的生长，或对最终产物的质量不应有不可改变的不利影响。停止发酵时，优选加过量的酸或碱。
Alteromonas rava菌株SANK73390一般在4℃到32℃温度范围内生长，最好在17℃到26℃的温度之间生长。当菌株已发展为能在较低或较高温度生长的微生物时，不落在这个范围的其它温度也可以适用。对生产thiomarinol B和/或C来说，最理想的温度在20℃到26℃之间。
thiomarinol B和/或C可经过需氧培养来完美地得到，可以使用任何适当的需氧培养技术，如例如固体培养，振荡培养或通气-搅拌培养。
如果是小批量地进行培养，那么通常优选在20℃到26℃，把振荡培养物发酵几天。
为开始发酵培养，优选的技术是使用例如在锥形烧瓶中用一或两个步骤准备好的原始接种物。对该培养基来说，可结合使用碳源和氮源，在一个恒温箱中在23℃振荡该接种物烧瓶1到3天，或直到观察到明显生长为止。然后，把所得到的种培养物用来给第二个种培养基，或者生产培养基接种。如果进行第二次接种，可以用相似方法进行。并将部分接种物用来给生产培养基接种。在如上所述的适宜的温度，振荡用发酵接种物接种的烧瓶适当的时间，例如接种1到3到天，或过滤来收集该烧瓶的内容物。
如果大规模地进行培养，最好在一个适当的通气-搅拌发酵器中培养。在这些方法中，营养培养基可在发酵器中准备。在125℃灭菌后，冷却该培养基并用在灭菌培养基上事先生长的接种物接种。培养是在20℃到26℃伴随搅拌和通气下进行的，这种方法适合收获大量的化合物。
经一般时间培养所产生的thiomarinol B和/或C的量能用如高效液相色色谱来监控。一般来说，在19小时和200小时之间这段时间之后所产生的B的量达到最高。而在19小时到200小时这段时间之后所产生的thiomarinol C的量达到最高;相对来说，在19小时到96小时之间这段时间之后所产生的thiomarinol的量达到最高。
在培养适当时间之后，用任何已知方法来分离和纯化thiomarinol B和/或C。例如，使用硅藻土助滤剂滤除固态物，或者根据thiomarinol B和/或C的物理-化学性质，经离心分离，然后提取纯化的上清液，可获得培养肉汤中存在的任何thiomarinol B和/或C。例如，存在于滤液或上清液中的thiomarinol B和/或C能够用象乙酸乙酯，氯仿、二氯乙烷，二氯甲烷或其任意混合物，在中性或酸性条件下提取，并纯化。
可选择的，作为吸附剂，也可以使用活性碳或象Amberlite(商标)XAD-2，XAD-4(Rohm和Haas)或Diaion(商标)HP-10、HP-20、(HP20、HP50(Mitsubishi Kasei Corporation)吸咐树脂。把含有thiomarinol B和/或C的液体通过吸附剂，将杂质吸附后除去，或者thiomarinol B和/或C能被吸附后用适当洗脱剂如甲醇水溶液、丙酮水溶液或丁醇/水洗脱来纯化。
细胞内的thiomarinol B和/或C可用适当溶剂提取纯化，有机溶剂为丙酮水溶液或甲醇水溶液优选的浓度按体积计50至90%随后除去有机溶剂，然后如前述提取滤液或上清液。
所得到的thiomarinol B和/或C可用熟知的技术进一步纯化，例如，用如硅胶或含镁硅胶，作载体的吸附柱色谱分离如以商品名“Florisil”出售的柱;用象Sephadex LH-20(Pharmacia产品的商品名)作吸附剂的分配柱色谱分离;或者用正相或反相柱的高效液相色谱，如本领域所熟知的，这些分离和纯化方法可以单一进行或以任何适当结合方式使用，并且，如果需要的话，重复地分离和纯化所要求的最后产物。
可选择地，thiomarinol B可以经氧化thiomarinol的方法制得，并且这种方法被认为是有益的，因为经发酵仅获得相当少的thiomarinol B。
氧化最好是在一种溶剂中和有或无碱存在下进行使氧化剂作用在thiomarinol上。
所用氧化剂的性质对本发明方法来说并不重要，在氧化反应中常用的任何氧化剂可以在此相应地使用。这类氧化剂例子包括高锰酸钾;铬酸盐类如重铬酸钾、重铬酸钠，氧化铬(Ⅵ)，铬酰氯和铬酸叔丁酯;四氧化钌;如氯、溴和碘的卤素类;臭氧;氧;过氧化氢;如双(三甲基甲硅烷基)过氧化物，枯基氢过氧化物和叔丁基氢过氧化物的有机过氧化物类;如二环氧乙烷、甲基二环氧乙烷、二甲基二环氧乙烷、二乙基二环氧乙烷、乙基甲基二环氧乙烷、甲丙基二环氧乙烷、丁基甲基二环氧乙烷、氟代二环氧乙烷、甲基氟代二环氧乙烷、二氟代二环氧乙烷、双(三氟甲基)二环氧乙烷、甲基三氟甲基二环氧乙烷和三氟甲基氯代二氟甲基二环氧乙烷的二环氧乙烷类;有机过酸类及其盐类，如过乙酸、过甲酸和间-氯过苯甲酸;以及过氧硫酸类及其盐类，如过氧一硫酸、过氧二硫酸钾和过氧一硫酸钾(特别是以商品名“Oxone”出售的，Aldrich化学公司的产品)。优选氧化剂的例子包括过氧化氢，有机过酸类及其盐，有机过氧化物类，二环氧乙烷类和过氧硫酸类及其盐，以及最佳例包括过氧化氢、二甲基二环氧乙烷和过氧硫酸类及其盐。
如果该反应中所用的碱对反应或反应试剂无不良影响，对它的性质也没有特殊限定。这类碱优选例包括无机盐类，如碱金属的碳酸盐类(如碳酸钠、碳酸钾或碳酸锂)，碱金属的碳酸氢盐类(如氢化锂、氢化钠或氢化钾)，碱金属的氢氧化物类(如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡或氢氧化锂)以及碱金属的氟化物类(如氟化钠、氟化钾或氟化铯);有机盐类，例如碱金属的醇盐类(如甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾、或甲醇锂)，碱金属的烷基硫化物类(如甲硫钠或乙硫钠);以及氮化合物类(如三乙胺、三丁胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉、吡啶、4-(N，N-二甲基氨基)吡啶，N，N-二甲基苯胺、N，N-二乙基苯胺、1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)和1，8-二氮杂双环[5.4.1]十二-7-烯(DBU)。最佳例包括碱金属的碳酸盐类和碱金属的碳酸氢盐类。
该反应一般且最好在一种溶剂中进行，这种试剂如果对该反应没有不良影响并能溶反应试剂的话，至少在某种程度上它的性质是不重要的。适宜的溶剂例子包括水、醇类，如甲醇、乙醇和丙醇;酮类，如丙酮或甲基乙基醇;有机酸类，如乙酸或甲酸;酯类，如乙酸乙酯;醚类，如乙醚或四氢呋喃;酰胺类，如二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺;以及这些溶剂的任意两种或多种混合物。优选例包括醇类以及水和酮类的混合物，而最佳例包括水和丙酮的混合物。
尽管该反应没有无机催化剂也可进行，但为了促进反应，如果必要的话，该反应可以在无机催化剂如，氧化铂或氧化钒存在下进行。
该反应将在较宽的温度范围内进行，对本发明来说所选的精确反应温度并不重要。一般来说，我们发现在-78℃到100℃，最好在-10℃到室温的温度范围内进行反应比较方便。对该反应来说所需的时间根据许多因素，主要是反应温度和反应试剂的性质，特别是所用的氧化剂和碱而广泛地变化。但是，多数情况下，反应足够时间为15分钟到30小时，最好为15分钟到2小时。
反应结束后，用常规方法从反应混合物中收集所需的化合物。例如，适当的收集技术包括把反应混合物倒入水中;用与水不混溶的溶剂提取，这种溶剂如芳烃(如苯)、醚(如乙醚)、有机酸的酯(如乙酸乙酯)或卤代烃(如二氯甲烷);然后从提取液中蒸掉溶剂。如果必要的话，把用这种方法获得的所需化合物用常规方法进一步纯化，例如，用各种色谱分离技术，主要是柱色谱分离法或制备薄层色谱法。
这种氧化反应的起始物thiomarinol能用Alteromonas属的微生物，特别是如上所述与制备thiomarinol B和/或C相关的Alteromonas rava菌株SANK73390经发酵制得。
因为thiomarinol B和/或C具有对动物体(如人、狗、猫和兔)的格兰氏阳性和格兰氏阴性细菌和支原体的抗菌作用，根据感染的性质它们能被用来治疗或预防由各种途径引起的细菌或支原体的感染。
当本发明的化合物用于治疗目的时，它们可被单独给药，或以含有另外活性化合物，一种或多种常规稀释剂，载体、赋形剂或佐剂的合适的药物配方给药。当然，这种配方的性质取决于所采用的给药途径。然而，对口腔途径来说，最好把该化合物制成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或糖浆剂。对于胃肠外给药来说，它最好被配制为注射剂(可静脉内、肌肉内或皮下使用)，作成滴剂、栓剂、油剂或擦剂。
用已知方法把上述添加剂如载体，粘合剂，崩解剂，稳定剂，矫味剂，增溶剂，香料，香水，悬浮剂或包衣剂加到该活性化合物中制成这些剂型。尽管剂量可以根据患者的症状和年龄、感染的性质和程度以及给药的途径和方式而变化，在给每位成人患者口腔给药情况下，一般以每天剂量20mg到2000mg服用本发明的化合物。该化合物可以一次剂量，或以分开的剂量，如一天两或三次的方式服用。
本发明化合物的制备由下列非限定性实施例来进一步详细说明，并且这些化合物的生物活性由下列实验例来详细说明。实施例6详细说明了thiomarinol的制备，它被用作氧化制备thiomarinol B的起始物。
实施例-1在罐中培养来制备thiomarinol BA)培养把Alteromonas rava菌株SANK 73390在海生琼脂(Difco)的产品的斜面上，在22℃培育3天。所得到的培养物悬浮于3ml灭菌的人工海水中，把0.1ml所得到的悬浮液接种到两只500ml锥形烧瓶每只当中，每只烧瓶中含有100ml具有以下组分的灭菌培养基海水肉汤(Difco) 37.4g去离子水 1000ml没有调节PH
把培养物在23℃用一台旋转振荡机以210rpm振荡下培育24小时。把所得到的培养物的全部接种到一只600升通气搅拌式培养罐中，该罐中含有200升具有如上所述相同组合物的培养基，其中每种组份都已分别灭菌。然后在23℃培养26小时，同时以空气流速为0.5vvm(即，“每分钟每体积体积”1vvm是指1分钟内所提供的空气量等于罐内空气体积)给培养基通气，并把旋转速度调整到82.5到170rpm之间来保持不溶的氧气浓度为5.0ppm。
B)分离把足量的盐酸水溶液加入230升的所得到的培养液中，调整PH值到2.5。然后把200升的丙酮加到所得到的混合物中，在搅拌下把该混合物浸提0.5小时。然后把4.0Kg的Celite 545助滤剂(美国的Jones Manvill Project公司的产品商标)加到该混合物中，过滤该混合物。该滤液(430升)用200升的乙酸乙酯萃取一次然后用100升的乙酸乙酯萃取两次，把合并的乙酸乙酯萃取液用200升的5%W/V碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用100升的饱和氯化钠水溶液洗涤，之后，把它们用无水硫酸钠干燥，然后，在减压下蒸干，得到约80g的油。
把这样得到的油全部溶于二氯甲烷，所得到的溶液被吸附在装有用二氯甲烷饱和过的1.1Kg硅胶的柱上。然后用按体积计1∶1二氯甲烷和乙酸乙酯混合物，单用乙酸乙酯和用按体积计9∶1乙酸乙酯-甲醇混合物以这个顺序(洗脱剂的极性以这个顺序增长)来洗脱该溶液，在洗脱剂被分馏为每500ml一份后，合并用乙酸乙酯和甲醇的混合物洗脱的含有thiomarinol B的部分并减压蒸干得到60g的油。
把所得到的油全部溶于6升50%V/V甲醇溶液中，并把所得到的溶液吸附于装有用水饱和过的Diaion HP-20(商标)的2.3升柱上，之后该油溶液直接用含水甲醇梯度洗脱，其中甲醇浓度逐渐由(按体积计)30%增至90%。更具体地说，4升每30%甲醇溶液、50%含水甲醇、60%甲醇溶液，70%甲醇溶液和80%甲醇溶液被用于柱上之后，用90%的甲醇溶液洗脱该柱。洗脱继续到用高效液相色谱监测没有发现更多该化合物的洗脱液为止。用来洗脱的90%甲醇溶液用量约10升。收集用90%甲醇溶液洗脱的馏分并在减压下蒸干，得到3.8g黄色粉。把该黄色粉用装有320g的已用(按体积计)19∶19∶2的二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇饱和过的Sephadex LH-20的柱进行色谱分离，之后用相同溶剂混合物洗脱来有效纯化。
把所得到的产物进一步用高效液相色谱纯化，该色谱用反相柱[Senshu-Pak ODS H-5251(柱体积20mm直径，250mm长)，Senshu Scientific Co.，Ltd的产品商标]并用40%V/V乙腈水溶液作洗脱剂，流速15ml/分钟，来纯化该产物，同时通过观察220nm的吸收值来监控纯化。由于在13到14分钟的保留时间内有一个峰时可得到thiomarinol B，收集这部分馏份并在减压下蒸干，分离得到130mg具有前面所列的物理-化学性质的标题化合物。
实施例2氧化thiomarinol来制备thiomarinol B
把100.9mg thiomarinol(如实施例6中所述制备的)溶于5ml丙酮和5ml水的混合物中;然后把所得到的溶液用冰冷却，把112.2mg的过硫酸氢钾制剂(Aldrich Chemical Co.，Inc的产品商品名)加到所得到的溶液中，然后搅拌该混合物，同时用冰冷却，40分钟。在这段时间末，把1.2ml的饱和碳酸氢钠水溶液加入该混合物中，再搅拌混合物，同时用冰冷却30分钟。然后把5ml水加到该反应混合物中，接着用(按体积计)10∶1二氯甲烷和四氢呋喃萃取混合物。把该萃取液用无水硫酸钠干燥，然后减压蒸馏除去溶剂。所得到的剩余物用反相，高效液相色谱法(用Senshu Pak ODS-5251-N柱，和40%V/V乙腈水溶液作洗脱剂)分离纯化得到79.5mg(产率75%)的浅黄色，并具有如上所列物理化学特性的thiomarinol B。
实施例3氧化thiomarinol来制备thiomarinol B把100mg thiomarinol(如实施例6中所述制备的)溶于15ml丙酮和7.5ml水的混合物中，然后把0.074ml的35%过氧化氢水溶液和2滴碳酸氢钠的稀释水溶液加到混合物中。把该反应混合物搅拌5分钟，之后减压蒸馏除去丙酮。然后把乙腈加到剩余物中，用反相高效液相色谱(用Senshu Pak ODS-4251-N柱，和40%V/V乙腈水溶液作洗脱剂)可证实生成了thiomarinol B。经减压蒸馏从反应混合物中除去溶剂，把所得到的剩余物溶于40%Ⅴ/Ⅴ乙腈溶液中。然后用反相，高效液相色谱法(用Senshu Pak ODS-4251-N柱，和40%Ⅴ/Ⅴ乙腈水溶液作洗脱剂)分离纯化得到43.2mg(产率41%)的浅黄色，并具有如上所列的物理-化学性质的thiomarinol B。
实施例4氧化thiomarinol来制备thiomarinol B把100mg thiomarinol(如实施例6中所述制备的)溶于40ml丙酮，然后在所得到的溶液中加入134mg的间-氯代过苯甲酸，同时用冰冷却并搅拌。然后在室温下搅拌该混合物1.5小时。在这段时间结束后，用二氯甲烷萃取该反应混合物，并用水把萃取液洗三次然后用饱和的硫酸氢钠的水溶液洗一次。把该萃取液用无水硫酸钠干燥，之后用减压蒸馏除去溶剂。把所得到的剩余物用反相高效液相色谱法(用Senshu Pak ODS-4251-N柱，和40%V/V乙腈水溶液作洗脱剂)分离纯化得到8.5mg(产率8%)的浅黄色，并具有如上所列的物理-化学性质的thiomarinol B。
实施例5在罐中培养来制备thiomarinol CA)培养把一个已使用并生长有Alteromonas rava菌株SANK 73390的海生琼脂(Difco)斜面加到10ml的灭菌海水肉汤(Difco)中，制得一种细菌悬浮液。
把含有15升相同海水肉汤培养基的30升的发酵罐加热来灭菌，然后把全部细菌悬浮液接种到发酵罐中，并在23℃温度下空气流速为7.5升/分钟培养24小时。开始搅拌速度为100rpm，然后适当调节搅拌速度，以保持所溶的氧气浓度为5.0ppm。
然后把具有下列组份的300升培养基放入两只每个600升的罐中
葡萄糖 1.5%Bacto胨(Difco) 1.5%Bacto发酵提取物(Difco) 0.2%NaCl 3.89%MgCl2·6H2O 2.52%Na2SO40.648%CaCl2·2H2O 0.4767%KCl 0.11%Na2CO30.038%柠檬酸铁 0.02%灭菌前pH为7.6然后加热来给该罐灭菌，然后把3升种培养液接种到每个罐，在23℃的温度下，空气流速为150升/分钟培养29小时。开始搅拌速度是82rpm，然后逐渐调节搅拌速度，以使所溶的氧气浓度保持在5.0ppm。
B)分离把足量的盐酸水溶液加到700升所得到的培养液中，调节它的PH值为3，然后把700升的丙酮加到所得到的混合物中，在搅拌下进行提取1小时。然后用700升乙酸乙酯萃取一次所得到的萃取物，再用300升的乙酸乙酯萃取一次。然后把合并的乙酸乙酯萃取液用300升5%W/V碳酸氢钠水溶液，再用300升的饱和氯化钠溶液按这个顺序洗涤，之后，把它们用无水硫酸钠干燥，再由减压蒸发除去溶剂。在蒸发过程中，加入540g的硅胶，然后继续蒸干。
把这样所得到的剩余物悬浮于二氯甲烷，把所得到的溶液装到装有4Kg用二氯甲烷饱和的硅胶柱。然后用二氯甲烷，用按体积计1∶1二氯甲烷和乙酸乙酯混合物，单用乙酸乙酯和用按体积计9∶1乙酸乙酯和甲醇的混合物按上述顺序洗脱;洗脱剂的极性按这种顺序增长。把洗脱剂分成每2升的等份，收集用乙酸乙酯和甲醇混合物洗脱含有thiomarinol C的馏份并减压蒸干。在蒸发过程中，加入50g硅胶，然后继续蒸干。
把所得到的剩余物悬浮于己烷和丙酮的混合物中，把所得悬浮液装到装有200g用己烷饱和的硅胶柱上，然后按体积计用1∶1的己烷和丙酮洗脱柱，洗脱液分馏成每500ml一等份，获得的馏分1和2含有thiomarinol C。减压蒸发浓缩馏分1。在浓缩过程中，加入25g硅胶，然后继续蒸干。然后按体积计用1∶1∶2己烷、丙酮和乙酸乙酯混合物洗脱，洗脱液分为每500ml的等份，并保留含有thiomarinol C的馏份，把该馏份与以上所得到的馏份2合并，再把合并的馏份减压蒸干浓缩。在浓缩过程中，加入20g的硅胶，然后继续蒸干。
把所得到的剩余物悬浮于按体积计1∶1∶1己烷、丙酮和乙酸乙酯的混合物中，并把所得到的悬浮液装到充有200g用己烷饱和过的硅胶柱上。用按体积计1∶1∶1己烷、丙酮和乙酸乙酯混合物洗脱。该洗脱液被分成每500ml的等份，收集含有thiomarinol C的馏份，并减压蒸发浓缩，得到一种油状物。
把上述全部油状物用一只200ml装有Sephadex LH-20用按体积计19∶19∶2的二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇混合物饱和的柱进一步色谱分离，并用相同溶剂混合物洗脱纯化。收集含thiomarinol C的馏份并减压蒸发浓缩。在浓缩过程中，加入25g硅胶，然后继续蒸干。
把所得到的剩余物悬浮于二氯甲烷中，并把该悬浮液上到装有250g的用二氯甲烷饱和过的硅胶柱上。然后用以9∶1到1∶9变化比例(按体积计)二氯甲烷和丙酮混合物洗脱，这样改变的比例使洗脱剂的极性逐渐增加。该洗脱液被分成每个1升的等份，收集含有thiomarinol C的馏份，并减压蒸干分离到150mg的具有以上所列的物理-化学性质的thiomarinol C。
实施例6thiomarinol的罐发酵A)培养在海生琼脂(Difcor的产品)斜面上把Alteromonas rava菌株SANK73390在22℃培育3天。把所得到的培养物悬浮于3ml的人造海水中。无菌取出0.1ml的上清液并接种到500ml含有100ml灭菌培养基[37.4g海水肉汤(Difco的产品)1升去离子水，pH没有调节]的锥形烧瓶中。
用一个旋转振荡器以200rpm(旋转半径为70nm)振荡下，在23℃培育该烧瓶24小时。这段时间之后，四只每个30升的发酵罐，每只含有15升的如上所述的无菌培养基，用15ml从锥形烧瓶中无菌操作取出的培养物接种，在通气率7.5升/分钟，伴随搅拌下(100rpm)，在23℃培育该发酵罐23小时。
B)分离23小时后，合并发酵罐的内容物得到60升的培养液。然后加入盐酸把该液体pH值调节到3，之后加入60升丙酮，伴随搅拌浸提该混合物30分钟，用1.2Kg的Celite 545助滤剂(从Johns Manville Co.，可得到商品的商标)，过滤该溶液。然后把所得到的110升滤液用60升乙酸乙酯萃取一次，再用乙酸乙酯萃取两次，每次用30升。把合并的有机萃取液用30升5%W/V碳酸氢钠水溶液洗涤，并随后用30升饱和的氯化钠溶液洗涤。然后用无水硫酸钠干燥该混合物，并减压蒸干，得到14g油状物。
把所得到的全部油状物溶于二氯甲烷中，并将该溶液吸附于装有200g已用二氯甲烷饱和过的硅胶柱上。然后用(按体积计)1∶1二氯甲烷和乙酸乙酯混合物，单用乙酸乙酯，用(按体积计)9∶1乙酸乙酯和甲醇，按该顺序(这个顺序下洗脱剂的极性增加)洗脱该溶液。收集洗脱液以/8ml为一份，保留用乙酸乙酯和甲醇混合物洗脱的含有thiomarinol的馏份。
把保留的馏份蒸干，得到7g油状物，把它溶于400ml50%V/V甲醇水溶液中，并吸附在600ml装有用水饱和过的Diaion HP-20(从Mitsubishi Chem.Ind得到的产品的商标)的柱。用50%V/V甲醇水溶液洗涤该柱，然后用90%V/V乙醇溶液洗脱目标物。减压蒸发从所得到的馏分中得到1g黄色粉末。把这种黄色粉末在Sephadex LH-20的柱色谱上进一步洗脱，并用按体积计19∶19∶2二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇混合物展开。从活性馏分中得到750mg的黄色粉末thiomarinol。
所得到的thiomarinol具有如下所示的性质。
1)性质和外观 黄色粉末2)熔点 84-89℃3)分子式 C30H44N2O9S24)分子量640， 用FAB-MS方法测定
(“FAB-MS”是快速原子轰击质谱仪)。
5)高分辨质谱C30H45N2O9S2[(M+H)+用FAB-MS法]计算值 641.2567实测值 641.2585。
6)元素分析计算值C，56.23%;H，6.92%;N，4.37%;S，10.01%，实测值C，55.92%;H，6.82%;N，4.23%;S，9.90%，7)红外吸收光谱该红外光谱显示了下列最大吸收值(KBr盘法，γmax cm-1)3394，2930，1649，1598，1526，1288，1216，1154，1102，1052。
8)紫外吸收光谱在甲醇，或甲醇+HCl中，thiomarinol具有的紫外吸收光谱显示如下[按λmax nm(ε)给出]387(12，000)，300(3，500)，214(26，000)。
且在甲醇+NaOH中具有的紫外吸收光谱显示如下[按λmax nm(ε)给出]386(9，600)，306(3，200)，206(25，000)。
9)比旋光率[α]25D＝+4.3°(C＝1.0，甲醇)10)高效液相色谱分离柱Senshu-Pak ODS H-2151(柱体积，6×150mm，Senshu Scientific Co.，Ltd.产品)。
溶剂40%V/V乙腈水溶液流速1.5ml/分钟波长220-350nm(用光电二极管阵列测得)保留时间5.9分钟。
11)1H-核磁共振谱(δppm)在六氘化二甲基亚砜中用四甲基硅烷作内标，核磁共振谱(270MHz)如下所示。
0.91(3H，双峰，J＝6.8Hz);
0.95(3H，双峰，J＝5.9Hz);
1.30(6H，宽多重峰);
1.55(5H，宽多重峰);
2.03(3H，单峰);
2.09(3H，多重峰);
2.34(2H，三重峰，J＝7.3Hz);
2.33(1H，双峰，J＝10.7Hz);
3.52(2H，多重峰);
3.64(2H，多重峰);
3.73(1H，双峰的双峰);
4.02(2H，三重峰，J＝6.6Hz);
4.18(1H，宽双峰，J＝7.3Hz);
4.30(1H，双峰，J＝4.4Hz);
4.44(1H，双峰，J＝7.8Hz);
4.63(1H，双峰，J＝3.4Hz);
4.89(1H，双峰，J＝7.3Hz);
5.37(2H，多重峰);
5.97(1H，宽单峰);
7.04(1H，单峰);
9.80(1H，宽单峰);
10.68(1H，宽单峰);
12)13C-核磁共振谱(δppm)用四甲基硅烷作内标，在四氘化甲醇中的核磁共振谱(68MHz)如下所示174.3(单峰)，170.4(单峰)，168.6(单峰)，161.1(单峰)，137.9(单峰)，135.7(双峰)，135.1(单峰)，129.8(双峰)，116.3(双峰)，115.8(单峰)，113.7(双峰)，77.6(双峰)，74.4(双峰)，72.1(双峰)，71.8(双峰)，66.0(三重峰)，65.7(双峰)，64.9(三重峰)，45.3(双峰)，43.9(双峰)，36.6(三重峰)，33.4(三重峰)，30.1(三重峰)，30.0(三重峰)，29.7(三重峰)，27.0(三重峰)，26.7(三重峰)，20.3(四重峰)，16.6(四重峰)，16.3(四重峰)。
13)溶解性溶于醇类如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，并溶于二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和乙醚;不溶于己烷和水。
14)颜色反应对硫酸、碘和高锰酸钾呈阳性。
15)薄层色谱Rf值0.57吸附剂硅胶(Merck和Co.，Inc.，Art 5715)展开溶剂按体积计二氯甲烷∶甲醇＝85∶15。
生物活性Thiomarinol B和C的生物活性由下列实验例证实，其中它们与假单孢菌酸A和thiomarinol比较。
试验例1Thiomarinol B和C的抗细菌活性用营养性琼脂培养基(Eiken Chemical Co.，Ltd.产品)按琼脂培养基稀释方法测得抗格兰氏阳性和格兰氏阴性细菌的thiomarinol，thiomarinol B，thiomarinol C和假单孢菌酸A(分别用“A”“B”“C”和“P”区别)的最小抑制浓度(MIC)以μg/ml给出。
下列表1给出结果。
表1MIC (μg/ml)实验的细菌菌株 A B C PStaphylococcus aureus 209P ≤0.01 ≤0.01 ≤0.01 0.05Staphylococcus aureus 56R ≤0.01 ≤0.01 ≤0.01 0.1Staphylococcus aureus 535(MRSA) ≤0.01 ≤0.01 ≤0.01 0.2Enterococcus faecalis 681 0.02 0.05 0.8 25Escherichia coli NIHJ 0.8 0.8 3.1 100Escherichia coli 609 0.8 0.8 1.5 100Salmonella enteritidis 0.4 0.4 1.5 50Klebsiella pneumoniae 806 0.8 0.8 1.5 100Klebsiella pneumoniae846 (R) 0.2 0.2 0.8 100Enterobacter cloacae 963 1.5 0.8 3.1 >100Serratia marcescens 1184 3.1 3.1 6.2 >100Proteus vulgaris 1420 0.05 0.05 0.2 0.4Morganella morganii 1510 6.2 6.2 12.5 >100Pseudomonas aeruginosa 1001 0.2 0.2 0.8 >100Pseudomonas aeruginosa No.7 0.4 0.4 0.8 >100Pseudomonas aeruginosa 3719 - 0.8 0.4 >100
实验例2Thiomarinol B和C的抗支原体活性按照如实验1的相同的方法，测得thiomarinol，thiomarinolB thiomarinol C和假单孢菌酸A(分别用“A”“B”“C”和“P”区别)，抗各种支原体的活性。该结果在下列表2中给出。
表2MIC(μg/ml)实验的支原体菌株 A B C PMycoplasma bovis Donetta 0.0125 0.006 ≤0.006 ≤0.006Mycoplasma gallisepticumPG-31 0.05 0.1 0.05 6.25Mycoplasma gallisepticumK-1 0.05 0.1 0.05 6.25Mycoplasma hyosynoviae S-16 0.025 0.78 1.56 0.39接种物0.005ml105CFU/ml用来测定的培养基对于各种微生物来说都可以在Chanock培养基[如P.N.A.S.，48，41-49(1962)所述制备并用附加20%马血清]测定thiomarinol B，thiomarinol C和假单孢菌酸A;
在下列培养基中测定thiomarinol
M.bovis和M.gallisepticumChanock培养基(如上所述制备)M.hyosynoviaeMucin PPLO＊琼脂培养基(添加15%马血清)＊-PPLO(类胸膜肺炎微生物)无CV PPLO肉汤(Difco) 21g细菌学的粘蛋白(Difco) 5g蒸馏水 800mlNoble琼脂(Difco) 12g马血清 150ml25%鲜酵母提取物 50ml培养条件37℃，5天，少量氧气(BBL气体包装法[从Cockeysville，MD2103USA的Becton Dickinson微生物体系中得到的，可随意使用的CO2发生器中培养])从以上结果清楚看到thiomarinol B和C具有极好的抗菌和抗支原体的活性，它们至少与thiomarinol一样好，并且通常显著好于假单孢菌酸A。
权利要求
1.被命名为“thiomarinol B”并具有下列特性的一种化合物1)性质和外观黄色粉末2)分子式C30H44N2O11S23)分子量672用FAB-MS测得，“FAB-MS”是高速原子轰击质谱仪4)高分辨质谱C30H45N2O11S2，(M+H)；用FAB-MS测定实测值673.2468计算值673.24655)元素分析计算值C30H44N2O11S2+H2O；C，52.16%；H，6.71%；N，4.06%；S，9.28%实测值C，52.34%；H，6.79%；N，3.92%；S，9.02%6)红外线吸收光谱γmax cm-1用溴化钾(KBr)盘方法测得的红外线吸收光谱如下所示3660，3503，3318，3075，2966，2928，2870，1704，1653，1509，1467，1381，1349，1299，1217，1199，1152，1112，1063，1047，1019，975，949，884，839，764，730，660，609，553。7)紫外线吸收光谱λmax nm(ε)在1-丙醇中测得的紫外线吸收光谱如下所示377(2，900)，301(13，000)，215(21，000)。在1-丙醇+盐酸中测得的紫外线吸收光谱如下所示377(2，900)，301(13，000)，223(17，000)。在1-丙醇+氢氧化钠中测得的紫外线吸收光谱如下所示377(2，900)，301(13，000)，221(19，000)。8)比旋光率[α]25D=7.7°(C=1.0，1-丙醇)。9)高效液相色谱分离柱Senshu-Pak ODS H-2151(柱直径6mm，长150mm，Senshu Scientific Co.，Ltd.产品商标)。溶剂40%V/V乙腈水溶液流速1.5ml/分钟保留时间8.4分钟。10)1H-核磁共振谱(δppm)用四甲基硅烷作为内标，在六氘化的二甲基亚砜中测得的核磁共振谱如下所示。11.28(1H，宽单峰)；10.47(1H，单峰)；7.23(1H，单峰)；5.97(1H，单峰)；5.37(2H，多重峰)；4.88(1H，双重峰，J=7.5Hz)；4.61(1H，宽单峰)；4.63(1H，双重峰，J=7.2Hz)；4.28(1H，双重峰,J=3.6Hz)；4.18(1H，双重峰，J=7.2Hz)；4.02(2H，三重峰，J=6.6Hz)；3.74(1H，宽单峰)；3.64(1H)，3.61(1H)，3.54(1H)，3.51(1H)；3.35(1H，双重峰，J=10.9Hz)；2.43(2H，三重峰，J=7.3Hz)；2.12(1H)，2.09(1H)，2.03(1H)；2.02(3H，单峰)；1.61(1H)，1.58(2H)，1.50(2H)，1.32(2H)，1.30(2H)，1.25(2H)；0.96(3H，双重峰，J=6.3Hz)；0.92(3H，双重峰，J=6.9Hz)。11)13C-核磁共振谱(δ∶PPm)用四甲基硅烷作内标在六氘化的二甲基亚砜中测得的核磁共振谱(90MHz)如下所示173.5(单峰)，166.1(单峰)，165.7(单峰)，160.8(单峰)，143.2(单峰)，134.2(双峰)，127.8(双峰)，123.3(单峰)，115.2(单峰)，114.4(双峰)，109.4(双峰)，76.2(双峰)，72.4(双峰)，69.6(双峰)，69.3(双峰)，64.3(三重峰)，63.9(双峰)，63.0(三重峰)，43.2(双峰)，42.2(双峰)，34.7(三重峰)，31.9(三重峰)，28.3(三重峰)，28.2(三重峰)，28.1(三重峰)，25.3(三重峰)，24.5(三重峰)，20.2(四重峰)，15.7(四重峰)，15.6(四重峰)。12)溶解性；溶于醇类，如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，以及二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和乙醚中。不溶于已烷和水。13)薄层色谱Rf值0.52吸附剂硅胶(Merrch δCo.，Inc.，Art5715)展开溶剂按体积计二氯甲烷∶甲醇=85∶15。
2.一种化合物，被命名为“thiomarinolC”并具有结构式(C)
3.制备权利要求1化合物的方法，它包括培养Alteromonas属的产生thiomarinol B的微生物并从该培养基中分离thiomarinol B。
4.权利要求3的方法，其中所述微生物是Alteromonas rava。
5.权利要求3的方法，其中的所述微生物是由保藏号FERMBP-3381所定义的Alteromonas rava菌株SANK 73390。
6.制备权利要求2的化合物的方法，它包括培养能产生thiomarinol C的Alteromonas微生物并从该培养基中分离thiomarinol C。
7.权利要求6的方法，其中所述微生物是Alteromonas rava。
8.权利要求6的方法，其中所述微生物是由保藏号FERMBP-3381所定义的Alteromonas rava菌株SANK73390。
9.一种通过氧化thiomarinol制备权利要求1的化合物的方法。
10.权利要求9的方法，其中的氧化是用氧化剂作用的，这些氧化剂选自由下列组成的一组氧化剂高锰酸钾;铬酸盐类;四氧化钌;卤素;臭氧;氧;过氧化氢;有机过氧化物;二环氧乙烷;有机过酸类及其盐;以及过氧硫酸及其盐。
11.权利要求9的方法，其中的氧化是用氧化剂作用的，该氧化剂选自下列组成的一组氧化剂过氧化氢;有机过酸及其盐，有机过氧化物，二环氧乙烷和过氧硫酸及其盐。
12.权利要求9的方法，其中的氧化是用氧化剂作用的，该氧化剂选自下列组成的一组氧化剂过氧化氢，二甲基二环氧乙烷和过氧硫酸及其盐。
13.权利要求9的方法，其中的氧化是用氧化剂作用的，该氧化剂选自由下列组成的一组氧化剂高锰酸钾、重铬酸钾、重铬酸钠、二氧化铬(Ⅵ)，二氯二氧化铬、铬酸叔丁酯、四氧化钌、氯、溴、碘、臭氧、氧、过氧化氢、双(三甲硅烷基)过氧化物、枯基氢过氧化物、叔丁基氢过氧化物、二环氧乙烷、甲基二环氧乙烷、二甲基二环氧乙烷、二乙基二环氧乙烷、乙基甲基二环氧乙烷、甲基丙基二环氧乙烷、丁基甲基二环氧乙烷、氟代二环氧乙烷、甲基氟代二环氧乙烷、二氟代二环氧乙烷、双(三氟甲基)二环氧乙烷、甲基三氟甲基二环氧乙烷、三氟甲基氯代二氟甲基二环氧乙烷、过乙酸、过甲酸、间-氯过苯甲酸、过氧一硫酸、过氧二硫酸钾和过氧-硫酸钾。
14.一种组合物，含有权利要求1的化合物和一种药学上可接受的载体。
15.一种组合物，含有权利要求2的化合物和一种药学上可接受的载体。
16.一种治疗或预防细菌感染的方法，该方法包括给患有或易感这类感染的哺乳动物给药有效剂量的权利要求1的化合物。
17.权利要求16的方法，其中所述的哺乳动物是人。
18.一种治疗或预防细菌感染的方法，该方法包括给患有或易感这类感染的哺乳动物给药有效剂量的权利要求2的化合物。
19.权利要求18的方法，其中所述的哺乳动物是人。
全文摘要
具有抗菌和抗支原体特性的两种thiomarinol衍生物，可从Alteromonas属的微生物中获得并命名为“thiomarinol B”和“thiomarinol C”。“Thiomarinol B”还可通过氧化“thiomarinol的方法制得。
文档编号C07D339/04GK1092811SQ93119620
公开日1994年9月28日 申请日期1993年9月18日 优先权日1992年9月18日
发明者高桥秀次, 藤本克巳, 平井功一, 加贺崎武之, 塩泽秀幸, 岩野雄次, 鸟潟显雄, 小川佳年生, 境田义阳, 小玉健太郎, 石井晃 申请人:三共株式会社
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