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2021-02-01 13:02:46|
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起点商标网 专利名称：环状粘合抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及式Ⅰ的新的环肽及其生理上可接受的盐，环-(Arg-B-Asp-D-E)Ⅰ其中B为Gly、Ala、-HN-Q-CO-且、D和E各自独立地为Gly、-HN-Q-CO-、Ala、Asn、Asp、Asp(OR)、Arg、Cha、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Lys(AC)、Lys(ACNH2)、Lys(ACSH)、Met、Nal、Nle、Orn、Phe、4-Hal-Phe、Phg、Pro、Pya、Ser、Thr、Tia、Tic、Trp、Tyr或Val，这些氨基酸残基也可被衍生，R为有1-6个碳原子的烷基，Hal为F、Cl、Br或I，Q为有1-6个碳原子的亚烷基Ac为有1-10个碳原子的烷酰基，在残基为旋光活性的氨基酸和氨基酸衍生物的情况下，则既包括D-式，也包括L-式。
类似化合物可从Pharmazie 40(8)，532-5(1985)中知晓。
本发明的目的是要找到具有有用性质，尤其是可用于制备药物的新化合物。
现已发现，式Ⅰ化合物及其盐具有非常有用的性质。尤其是，它们可作为整合素(integrin)抑制剂，在这种情况下它们具体是抑制β3-或β5一整合素受体与配位体之间的相互作用。该化合物对avβ3、avβ5和a11bβ3整合素尤其有效。这一作用可通过例如J.W.Smith等人在J.Biol.Chem.265，12267-12271(1990)中所述的方法加以证实。另外，它们还具有消炎作用，这一作用也可采用文献中已知的方法加以证实。
本发明化合物可用作人药和兽药中的药物活性成分，尤其是用于预防和治疗循环系统疾病、血栓形成、心肌梗塞、动脉硬化、炎症、中风、心绞痛、肿瘤、溶骨疾病尤其是骨质疏松症、血管成形术后血管生成和再狭窄。它们也可用于伤口愈合过程中的辅助治疗。
本发明化合物也适宜作为杀微生物剂，避免由例如细菌、真菌或酵母等引起的感染。在如插入异体物质如生物材料、植入物、导管或心脏起搏器而进行的手术中，该物质可用作协同杀微生物剂。它们作为抗菌剂。
上、下文中所示的氨基酸缩写符号代表如下氨基酸Abu 4-氨基丁酸Aha 6-氨基己酸Ala 丙氨酸Arg 精氨酸Asn 天冬酰胺Asp 天冬氨酸Asp(OR) 天冬氨酸(β-酯)
Cit 瓜氨酸Cys 半胱氨酸Dab 2，4-二氨基丁酸Gln 谷氨酰胺Glu 谷氨酸Gly 甘氨酸His 组氨酸Ile 异亮氨酸Leu 亮氨酸Lys 赖氨酸Lys(AC) Nε-酰基赖氨酸Lys(ACNH2) Nε-氨基酰基赖氨酸Lys(ACSH) Nε-巯基酰基赖氨酸Met 甲硫氨酸Nal 3-(2-萘基)-丙氨酸Nle 正亮氨酸Orn 鸟氨酸Phe 苯丙氨酸4-Hal-Phe 4-卤代苯丙氨酸Phg 苯基甘氨酸Pro 脯氨酸Pya 3-(2-吡啶基)-丙氨酸Ser 丝氨酸Tia 3-(2-噻吩基)-丙氨酸
Tic 四氢异喹啉-3-羧酸Thr 苏氨酸Trp 色氨酸Tyr 酪氨酸Val 缬氨酸另外，以下各缩写符号含义如下BOC 叔丁氧羰基CBZ 苄氧羰基DCCI 二环己基碳化二亚胺DMF 二甲基甲酰胺EDCI N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐Et 乙基FMOC 9-芴基甲氧羰基HOBt 1-羟基苯并三唑Me 甲基Mtr 4-甲氧基-2，3，6-三甲苯基磺酰基OBut 叔丁基酯OMe 甲基酯OEt 乙基酯POA 苯氧基乙酰基TBTu 2-(1H-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲
TFA 三氟乙酸如果上面提到的氨基酸以数种对映体形式存在，则所有这些形式及其混合物(如DL-形式)均包括在其中，例如作为式Ⅰ化合物的组成成分。还可以给作为式Ⅰ化合物组成成分的氨基酸提供本身已知的保护基。
本发明还涉及制备式Ⅰ化合物或其一种盐的方法，其特征在于通过用溶剂分解剂或氢解剂处理将式Ⅰ化合物或其盐从其一种功能性衍生物中释放出来，或者用一环化剂处理式Ⅱ肽或其反应性衍生物，H-Z-OH Ⅱ其中Z为 -Arg-B-Asp-D-E--B-Asp-D-E-Arg--Asp-D-E-Arg-B--D-E-Arg-B-Asp--E-Arg-B-Asp-D-，和/或通过用酸或碱处理使式Ⅰ的碱性或酸性化合物转化为其一种盐。
除非另外说明，上、下文中残基B、D、E和Z的含义同式Ⅰ和Ⅱ。
上式中，烷基优选为甲基、乙基、异丙基或叔丁基。
基团B优选为Gly，但也可为-HN-(-CH2)2-CO-、-HN-(CH2)3-CO-、-HN-(CH2)5-CO或Ala。D优选为Phe。尤其是D-Phe，但也可为4-Hal-Phe，尤其是4-I-Phe，以及Pro、Tie、Lys、Nal或Phg，尤其优选D-式。
因此，本发明尤其涉及其中至少一个所述残基具有上述优选定义之一的式Ⅰ化合物。
一组优选的化合物可用部分式Ⅰa表示，它在其它方面均对应于式Ⅰ，只是B为Gly、-HN-(CH2)2-CO-、-HN-(CH2)3-CO-、-HN-(CH2)5-CO-或Ala，D为D-Pro、D-Tic、Phe、D-Nal、D-Phg或4-I-Phe，E为Val、Lys、Gly、Ala、Phe、Lau、Lys(Ac)或Nle。
更优选的一组化合物可用式Ⅰb表示，它在其它方面对应于式Ⅰ，只是B为Gly，D为D-Phe，且E为Val、Lys或Gly。
式Ⅰ化合物及制备它们的起始物可另外通过已知方法制得，如Houben-Weyl，Methoden der organischen Chemie(Methods of Organic Chemistry)等经典著作中所述的方法，尤其是在已知的且适用于该反应的条件下进行。在这里也可使用没有详细提到的已知改进方法。
根据需要，也可就地形成起始物，使其不从反应混合物中分离出来，而是立即进一步反应，以得到式Ⅰ化合物。
通过溶剂分解，尤其是水解，或者通过氢解使式Ⅰ化合物从其功能性衍生物中释放出来，也可得到式Ⅰ化合物。
用于溶剂分解或氢解的优选起始物是其中含有适当保护的氨基和/或羟基以代替一个或多个游离氨基和/或羟基的化合物，优选携带氨基保护基以代替与N原子键合的H原子的化合物，例如对应于式Ⅰ，但含有NHR′基团(其中R′为氨基保护基，如BOC或CBZ)，以代替NH2基团的化合物。
另外，优选以羟基保护基代替羟基的氢原子的起始物，如对应于式Ⅰ但以R″O-苯基(其中R″为羟基保护基)代替羟苯基的起始物。
起始物分子中可存在多个-相同或不同-保护氨基和/或羟基。如果所存在的保护基彼此不同，在许多情况下它们可被选择性地除去。
术语“氨基保护基”是普遍已知的，它是指适用于保护(封阻)氨基不受化学反应，但所需化学反应在分子中其它位置发生后又易于除去的基团。典型的这类基团尤其是未取代或取代酰基、芳基、芳烷氧甲基或芳烷基。由于氨基保护基在所需反应(或反应序列)之后被除去，所以它们的性质及大小并不太重要，但优选有1-20个，尤其是1-8个碳原子的保护基。术语“酰基”在本发明的方法和本发明的化合物中取其最宽含义。它包括得自脂族、芳脂族、芳族或杂环羧酸或磺酸的酰基，尤其是烷氧羰基，芳氧羰基尤其是芳烷氧羰基。这类酰基的例子有烷酰基，如乙酰基、丙酰基或丁酰基;芳烷酰基，如苯基乙酰基;芳酰基，如苯甲酰基或甲苯甲酰基;芳氧烷酰基，如POA;烷氧羰基，如甲氧羰基、乙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基、BOC、2-碘乙氧羰基;芳烷氧羰基，如CBZ(“苄酯基”)，4-甲氧苄氧羰基，FMOC和芳基磺酰基，如Mtr。优选的氨基保护基是BOC和Mtr，另外还有CBZ、FMOC、苄基和乙酰基。
术语“羟基保护基”也是普遍已知的，它系指适用于保护羟基不受化学反应，但在所需反应于分子中其它位置发生后又易于除去的基团。典型的这类基团是上述未取代或取代芳基、芳烷基或酰基，另外还有烷基。由于羟基保护基在所需化学反应或反应序列后被除去，它们的性质和大小并不重要;优选有1-20个，尤其是1-10个碳原子的保护基。羟基保护基的例子有苄基、对-硝基苯甲酰基、对-甲苯磺酰基和乙酰基，尤其优选苄基和乙酰基。天冬氨酸和谷氨酸中的COOH基团优选以其叔丁酯形式(如Asp(OBut))保护。
用作起始物的式Ⅰ化合物的功能性衍生物也可采用常规的氨基酸和肽合成法制得，例如所述经典著作和专利申请以及Merrifield solid phase method(B.F.Gyain和R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.94，3102et seq(1972))中所述的方法。
根据所使用的保护基，利用强酸(优选TFA或高氯酸)，但也可利用其它强无机酸(如盐酸或硫酸)或强有机羧酸(如三氯乙酸)或磺酸(如苯磺酸或对-甲苯磺酸)，可将式Ⅰ化合物从其功能性衍生物中释放出来。其它惰性溶剂的存在是可能的，但并不总是必要的。合适的惰性溶剂优选为有机溶剂，如乙酸等羧酸，四氢呋喃或二噁烷等醚，DMF等酰胺，二氯甲烷等卤代烃，甲醇、乙醇或异丙醇等醇和水。另外，以上溶剂的混合物也是适合的。TFA优选过量使用而不加入其它溶剂，高氯酸是与乙酸混合使用，且按9∶1的比例使用70%的高氯酸。用于断裂的反应温度宜为0-50℃，优选15-30℃(室温)。
基团BOC、OBut和Mtr优选利用TFA的二氯甲烷溶液或利用约3-5N HCl的二噁烷溶液于15-30℃除去，FMOC基团优选利用约5-50%二甲胺、二乙胺或哌啶的DMF溶液于15-30℃除去。
经氢解可除去的保护基(如CBZ或苄基)可在催化剂(如钯等贵金属催化剂，优选存在于碳等载体上)存在下通过氢气处理除去。适用于这一情况的溶剂是上面所述的溶剂，尤其是例如甲醇或乙醇等醇类或DMF等酰胺。氢解一般在温度为0-100℃，压力为1-200巴(优选20-30℃和1-10巴)的条件下进行。CBZ基团的氢解易于在5-10%pd-C的甲醇溶液中或利用甲酸铵(代替H2)在pd-C的甲醇/DMF溶液中于20-30℃进行。
也可按例如Houben-Weyl，loc cdt，volume 15/ll，pages 1-806(1974)中所述的方法，在适用于肽合成的条件下环化反应式Ⅱ化合物获得式Ⅰ化合物。
反应优选在脱水剂，如碳化二亚胺(如DCCI或EDCI)、丙烷膦酸酐(比照Angem.Chem.92，129(1980))、二苯磷酰基叠氮化物或2-乙氧基-N-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉存在下，于惰性溶剂如二氯甲烷等卤代烃、四氢呋喃或二噁烷等醚、DMF或二甲基乙酰胺等酰胺、乙腈等腈类或这些溶剂的混合物中于-10至40℃(优选0-30℃)进行。为了促进在分子间肽键合前的分子内环化，优选在稀溶液中操作(稀释原理)。
除式Ⅱ化合物外，这些物质的合适反应性衍生物，如反应性基团被保护基居间封阻的化合物，也可用于该反应。氨基酸衍生物Ⅱ可以其活性酯形式使用，该活性酯宜通过加入HOBt或N-羟基琥珀酰亚胺就地形成。
式Ⅱ起始物一般是新的。它们可通过已知方法，例如上述肽合成法和保护基除去法制备。
一般来说，首先合成的是式R′-Z-OR″的被保护五肽酯，如BOC-Z-OMe或BOC-Z-OEt，将其水解后得到式R′-Z-OH的酸，如BOC-Z-OH;从其中除去保护基R′，利用它得到式H-Z-OH(Ⅱ)的游离肽。
式Ⅰ的碱可用酸转化为适当的酸加成盐。适用于该反应的酸尤其是产生生理上可接受的盐的酸，因此，可使用硫酸、硝酸、氢卤酸(如盐酸或氢溴酸)、磷酸(如正磷酸)和氨基磺酸等无机酸，以及有机酸，尤其是脂族、脂环族、芳脂族、芳族或杂环一元或多元羧酸、磺酸或硫酸，如甲酸、乙酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、水杨酸、2-或3-苯基丙酸、柠檬酸、谷氨酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸或乙磺酸、乙烷二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、萘磺酸或萘二磺酸以及十二烷基硫酸。与生理上不可接受的酸形成的盐，如苦味酸盐，可用于分离和/或纯化式Ⅰ化合物。
另一方面，式Ⅰ的酸也可通过与碱反应转化为其一种生理上可接受的金属盐或铵盐。此处合适的盐尤其是钠、钾、镁、钙和铵盐，也可以是取代的铵盐，如二甲基-、二乙基-或二异丙基铵盐，单乙醇-、二乙醇-或三乙醇铵盐，环己基-或二环己基铵盐，二苄基乙二铵盐，以及与N-甲基-D-葡糖胺或精氨酸或赖氨酸形成的盐。
通过将式Ⅰ新化合物及其生理上可接受的盐与至少一种赋形剂或助剂-根据需要还包括一种或多种其它活性成分-一起制成合适的剂量形式，可生产出药物制剂。由此获得的制剂可作为人用或兽用药品使用。合适的赋形物质是适用于肠内(如口腔、直肠)、非肠道(如静脉注射)或局部(如表皮、皮肤、眼或鼻)给药或适用于以吸入喷雾方式给药且不与新化合物反应的有机或无机物质，如水或等渗盐水溶液、低级醇、植物油、苄基醇、聚乙二醇、三乙酸甘油酯和其它脂肪酸甘油酯、明胶、大豆卵磷脂、碳水化合物(如乳糖或淀粉)、硬脂酸镁、滑石、纤维素和矿糖。片剂、包衣片剂、胶囊、糖浆、汁液或滴剂等尤其是用于口服给药;尤其感兴趣的是薄膜片剂和包有肠溶衣或胶囊壳的胶囊。栓剂适用于直肠给药，溶液(优选油状溶液或水溶液)、悬浮液、乳液或植入物等被用于通过非肠道途径给药。溶液(如可以眼滴剂形式使用)、悬浮液、乳液、乳油、软膏或敷布等适用于表皮给药。含有溶于或悬浮于推进气体或推进气体混合物(如CO2或含氯氟烃)中的活性成分的喷雾剂可用作吸入喷雾剂。这里，活性成分宜于以微粒化形式使用，其中也可存在一种或多种生理上可耐受的其它溶剂，如乙醇。吸入溶液可借助常规吸入器给药。也可将新化合物冷却干燥，并将所获得的冻干粉用于生产注射制剂。注射液可以大药丸或连续输液(如静脉、肌内、皮下或鞘内)方式给药。上述制剂可被消毒和/或可含有辅助物质，如防腐剂、稳定性和/或湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲物质、着色剂和/或调味剂。根据需要，它们也可含有一种或多种其它活性物质，如一种或多种维生素。
一般来说，本发明物质可按类似于其它已知市售肽的方式，尤其是类似于US-A-4，472，305中所述化合物的方式给药，优选每剂量单位的剂量为0.05-500mg，尤其是0.5-100mg。日剂量优选为0.01-2mg/kg体重。针对每一患者的具体剂量取决于许多不同因素，例如所用具体化合物的活性，患者的年龄、体重、总的健康状况、性别，饮食，给药时间和途径，排泄途径，药物组合情况以及所要治疗的具体疾病的严重程度。优选非肠道途径给药。
另外，式Ⅰ新化合物可作为整合素配位体用于制备亲和层析柱，该柱用于制备纯整合素。
在这种情况下，配位体，即式Ⅰ肽衍生物是通过其结合功能团与聚合支持物共价偶联。
合适的聚合支持材料是肽化学中本身已知的聚合固相，优选具有亲水性质，如交联多糖(如纤维素、琼脂糖或交联葡聚糖)、丙烯酰胺、以聚乙二醇为主要成分的聚合物或Tentakel polymers 。
与聚合支持物交联的合适结合官能团优选为有2-12个碳原子的线性亚烷基链，其一端直接与聚合物键合，且另一端具有如羟基、氨基、巯基、马来酰亚氨基或-COOH等官能团，并适于与相应肽的C-或N-末端部分相连。
在这种情况下，肽也可能直接地或以类似方式通过另一个结合官能团与聚合物的结合部位键合。含有功能化侧链的氨基酸残基的肽也可通过它们与聚合物的结合官能团键合。
而且，可对作为式Ⅰ肽组分的某些氨基酸残基进行侧链修饰，使得它们适合于通过SH、OH、NH2或COOH等基团与聚合物的结合部位结合。
在这方面，异常氨基酸也是可能的，如在苯环的4-位上携带了巯基、羟基、氨基或羧烷基链的苯丙氨酸衍生物，其官能团位于链的末端。
其侧链可直接用作结合官能团的氨基酸的例子有Lys、Orn、Arg、Dab、Asp、Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、Cys、Cit或Tyr。
N-末端结合点的例子有-CO-CnH2n-NH2、-CO-CnH2n-OH、-CO-CnH2n-SH或-CO-CnH2n-COOH，其中n＝2-12，亚烷基链的长度并不是关键，根据情况它也可被合适的芳基或烷芳基部分或完全取代。
C-末端结合点可以是例如-O-CnH2n-SH、-O-CnH2n-OH、-O-CnH2n-NH2、-O-CnH2n-COOH、-NH-CnH2n-SH、-NH-CnH2n-OH、-NH-CnH2n-NH2或-NH-CnH2n-COOH，其中n和亚烷基链的定义与前述部分相同。
N-末端和C-末端结合点也可用作已功能化的氨基酸侧链的结合成分，这里合适的氨基酸残基是例如Lys(CO-C5H10-NH2)、Asp(NH-C3H6-COOH)或Cys(C3H6-NH3)，该结合点总是与侧链官能团键合。
制备亲和层柱材料是在本身已知的缩合氨基酸的常规条件下进行，它们已在式Ⅰ化合物的制备部分进行了概括。
上、下文中所有温度均指摄氏度。在以下实施例中，“常规操作”指加水，根据需要用乙醚或二氯甲烷中和并萃取混合物，分离出有机相，于Na2SO4上干燥，过滤，蒸发并将残余物通过硅胶层析或结晶纯化。RT＝在Lichrosorb RPR Select B(250-4.7μm)柱上的保留时间，洗脱剂0.3%TFA的水溶液;异丙醇梯度在50分钟内以1ml/min的流速并在215nm处检测时为0-80%(体积)。M+＝质谱中的分子峰，通过快速原子轰击法(FAB)测得。
实施例1将0.2gH-Arg-Gly-Asp-D-Pro-Val-ONa[可通过用哌啶/DMF除去Fmoc并用TFA/CH2Cl2(1∶1)除去树脂而从Fmoc-Arg-Gly-Asp-D-Pro-Val-O-wang获得，其中-O-wang为改进的Merrifield技术中使用的4-氧甲基-苯氧甲基聚苯乙烯树脂的残基]的15ml DMF溶液用85ml二氯甲烷稀释，并用50mg NaHCO3处理。于干冰/丙酮混合物中冷却后，加入40μl二苯基磷酰基叠氮化物。于室温下放置16小时后，浓缩溶液。浓缩物经凝胶过滤(于异丙醇/水8∶2中的Sephadex G10柱)后按常规方式进行HPLC纯化。得到环-(Arg-Gly-Asp-D-Pro-Val);RT＝13.4;M+525。
类似地，通过环化相应的线性肽得到如下产物
环-(Arg-Gly-Asp-D-Tic-Val);RT＝18.4;M+587;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val);M+575;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Lys-Val);RT＝6.8;M+556;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys);RT＝10.9;M+604;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Gly);RT＝13.1;M+533;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Ala);RT＝14.3;M+547;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Phe);RT＝22.0;M+623;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu);RT＝21.2;M+589;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Nal-Val);RT＝24.7;M+625;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phg-Val);RT＝16.5;M+561;
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-Gly);RT＝13.2;M+533;
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Ala);RT＝14.8;M+547;
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Phe);RT＝20.2;M+623;
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Leu);RT＝21.4;M+589;
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-D-Phe-Lys);RT＝23.4;M+816;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(H3C-CO);RT＝17.0;M+646;
环-(Arg(Mtr)-β-Ala-Asp-Phe-D-Val);RT＝28.2;M+801;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Nle);RT＝22.0;M+589;
环-(D-Arg-Gly-D-Asp-D-Phe-Val);RT＝17.5;M+575;
环-(Arg-Gly-D-Asp-D-Phe-D-Gly);RT＝18.7;M+575;
环-(Arg-D-Ala-Asp-D-Phe-Val);RT＝18.9;M+589;
环-(Arg-D-Ala-Asp-Phe-D-Val);RT＝19.1;M+589;
环-(Arg-Aha-Asp-D-Phe-Val);RT＝20.8;M+631;
环-(Arg-Aha-Asp-Phe-D-Val);RT＝17.2;M+603;
环-(Arg-Aha-Asp-Phe-D-Val);RT＝19.8;M+631;
环-(Arg-Abu-Asp-D-Phe-Val);RT＝17.8;M+603;
环-(Arg-Gly-Asp-D-(4-I-Phe)-Val);RT＝23.3;M+701;
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-Val);RT＝21.8;M+575;
环-(Arg-Gly-D-Asp-D-Phe-Val);RT＝20.7;M+575;
环-(D-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val);RT＝20.8;M+575;
环-(D-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val);RT＝21.9;M+575;
环-(Arg-Gly-D-Asp-D-Phe-Val);RT＝20.7;M+575;
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Nal);
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Leu);
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Ser);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Nal-Leu);
环-(Arg-Gly-Asp-Nal-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-Phg-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-Trp-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-Ala(2-thienyl)-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-Lys-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-(4-NO2-Phe)-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-Cha-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-β-Ala);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Abu);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aha);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Pro);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Arg);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(Aha));
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Nal);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Ser);
环-(D-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-D-Asp(OEt)-D-Phe-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-D-Nal);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-D-Leu);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-D-Ser);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-D-Nal-Leu);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Nal-D-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phg-D-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Trp-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(BOC-Aha);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO-CH2SH));
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO-(CH2)2SH));
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO-(CH2)3SH));
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO-(CH2)4SH));
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO-(CH2)5SH));
环-(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-(4-Cl-Phe)-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Pya-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-NMe-Phe-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Tyr(OEt)-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Arg-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Trp-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Ala(2-thienyl)-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-NMe-Val);
环-(Arg-Gly-D-Asp-D-Phe-Val);
环-(Arg-Gly-D-Asp-Phe-D-Val);
环-(D-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val);
环-(D-Arg-Gly-D-Asp-Phe-Val)。
实施例2将0.28g环-(Arg(Mtr)-β-Ala-Asp-Phe-D-Val)[可按照实例1环化得到]于8.4ml TFA、1.7ml二氯甲烷及0.9ml硫酚中的溶液于室温下放置4小时，然后浓缩，水稀释后冻干。于Sephedex G10(乙酸/水1∶1)上过滤，随后在给定条件下通过制备性HPLC纯化，得到环-(Arg-β-Ala-Asp-Phe-D-Val);RT＝17.0;M+589。
类似地，由以下起始物得到以下产物
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-D-Phe-Lys)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys);Rt＝10.9;M+604环-(D-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Val)环-(D-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-D-Asp(OEt)-D-Phe-Val)环-(Arg-Gly-D-Asp-D-Phe-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-D-Nal)环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Nal);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-D-Ser)环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Leu);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-D-Ser)环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Ser);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-D-Nal-Leu)环-(Arg-Gly-Asp-D-Nal-Leu);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Nal-D-Val)环-(Arg-Gly-Asp-Nal-D-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phg-D-Val)环-(Arg-Gly-Asp-Phg-D-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Trp-D-Val)环-(Arg-Gly-Asp-Trp-D-Val).
实施例3将80mg环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu)溶于0.01M HCl中五至六次，并在每次溶解后冻干。经HPLC纯化后得到环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu)。HCl;RT＝20.6;M+589。
类似地，由以下反应物得到以下产物
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val).BCl;RT＝18.4;M+575;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu).HCl;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu)用乙酸处理环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu).H3C-COOH;RT＝19.2;M+589;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu)用硝酸处理环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu).HNO3;RT＝20.4;M+589;
实施例4为了制备亲和相，将0.9g N-马来酰亚氨-(CH2)5-CO-NH-(CH2)3-聚合物[可通过缩合N-马来酰亚氨-(CH2)5-COOH与H2N-(CH2)3-聚合物得到]悬浮于10ml 0.1M磷酸钠缓冲液(PH7)中，并于4℃加入1当量环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO(CH2)2SH)。搅拌反应混合物4小时，同时温热至室温，滤出固体残渣，并两次用10ml缓冲溶液(PH7)洗涤，接着三次用10ml水洗涤。得到环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO(CH2)2S-3-(N-马来酰亚氨-(CH2)5-CONH-(CH2)3-聚合物))。
实施例5类似于实施例1，通过缩合聚合物-O-(CH2)3-NH2[市售]与环-(Arg-Gly-Asp-D-Pro-Lys(CO(CH2)4COOH)[可通过在所述条件下缩合己二酸与环-(Arg-Gly-Asp-D-Pro-Lys)-得到]可得到以下聚合相环-(Arg-Gly-Asp-D-Pro-Lys-(CO-(CH2)4-CO-NH-(CH2)3-O-聚合物)。
类似地，通过缩合环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys-(CO-(CH2)5-NH2))与HOOC-CH2-O-聚合物可得到以下产物环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys-(CO-(CH2)5-NH-CO-CH2-O-聚合物))。
以下实施例涉及药物制剂。
实施例A注射瓶剂用2N盘酸调节100g式Ⅰ环肽和5g磷酸氢二钠的3l双蒸水溶液至PH6.5，无菌过滤，装入注射瓶中并在无菌条件下冷冻干燥，以无菌方式封瓶。每一注射瓶含5mg活性化合物。
实施例B栓剂将20g式Ⅰ活性化合物5100g大豆卵磷脂和1400g可可油熔合，混合物倒入模中冷却。每一栓剂含20mg活性化合物。
实施例C溶液将1g式Ⅰ活性化合物、9.38g NaH2PO4·2H2O、28.48g Na2HPO4·12H2O和0.1g氯化苄烷铵在940ml双蒸水中制成溶液。调节溶液至PH6.8，加足至11，并照射无菌。该溶液可用作眼睛滴剂。
实施例D软膏将500mg式Ⅰ活性化合物与99.5g矿脂在无菌条件下混合。
实施例E片剂将100g式Ⅰ环肽、1kg乳糖、600g微结晶纤维素、600g玉米淀粉、100g聚乙烯吡咯烷酮、80g滑石和10g硬脂酸镁按常规方式挤压成片剂，使得每片含10mg活性化合物。
实施例F包衣片剂按实例E挤压片剂，然后按常规方式包衣一层蔗糖、玉米淀粉、滑石、黄蓍胶和着色剂。
实施例G胶囊按常规方式向硬明胶胶囊中填入式Ⅰ活性化合物，使得每一胶囊含5mg活性化合物。
实施例H吸入喷雾剂将14g式Ⅰ活性化合物溶于10l等离子NaCl溶液中，然后将该溶液装入市售的具有泵功能的喷雾容器中。该溶液可喷入口腔或鼻。一次喷发(约0.1ml)相当于约0.14mg的剂量。
权利要求
1.式Ⅰ的环肽或其生理上可接受的盐，环-(Arg-B-Asp-D-E) Ⅰ其中B为Gly、Ala、-HN-Q-CO-，D和E各自独立地为Gly，-HN-Q-CO-，Ala，Asn，Asp，Asp(OR)，Arg，Cha，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Lys(Ac)，Lys(AcNH2)，Lys(AcSH)，Met，Nal，Nle，Orn，Phe，4-Hal-Phe，Phg，Pro，Pya，Ser，Thr，Tia，Tic，Trp，Tyr or Val，上述氨基酸残基也可被衍生，R为有1-6个碳原子的烷基Hal为F、Cl、Br或I，Q为有1-6个碳原子的亚烷基，Ac为有1-10个碳原子的烷酰基，在氨基酸或氨基酸衍生物具有旋光活性的残基的情况下，则既包括其D-型也包括其L-型。
2.根据权利要求1的式Ⅰ化合物的对映体或非对映体。
3.(a)环-(Arg-Gly-Asp-D-Lys-Val);(b)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys);(c)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Gly);(d)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Phe);(e)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu);(f)环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Leu);
4.制备权利要求1式Ⅰ化合物或其一种盐的方法，其特征在于通过用溶剂分解剂或氢解剂处理使其从其一种功能性衍生物中释放出来，或用环化剂处理式Ⅱ的肽或其反应性衍生物，H-Z-OH其中Z为-Arg-B-Asp-D-E--B-Asp-D-E-Arg--Asp-D-E-Arg-B--D-E-Arg-B-Asp--E-Arg-B-Asp-D-，和/或通过用酸或碱处理将式Ⅰ的碱性或酸性化合物转化为其一种盐。
5.生产药物的方法，其特征在于将权利要求1的式Ⅰ化合物和/或其一种生理上可接受的盐与至少一种固体、液体或半固体赋形剂或辅助剂一起制成合适的剂量形式。
6.药物制剂，其特征在于它含有至少一种权利要求1的式Ⅰ化合物和/或一种其生理上可接受的盐。
7.权利要求1的式Ⅰ化合物或其生理上可接受的盐用于生产可控制疾病的药物。
8.权利要求1的式Ⅰ化合物或其生理上可接受的盐用于控制疾病。
9.权利要求1的式Ⅰ化合物用于生产亲和柱层析用的固定化配位体。
10.权利要求1的式Ⅰ化合物用于通过亲和层析纯化整合素。
全文摘要
本发明涉及式I新的环肽及其盐环-(Arg-B-Asp-D-E) I这些化合物可作为整合素抑制剂，并且尤其可用于预防和治疗循环系统疾病和肿瘤。
文档编号C07K17/08GK1099760SQ94103298
公开日1995年3月8日 申请日期1994年3月30日 优先权日1993年4月1日
发明者A·琼兹克, G·霍尔泽曼, B·佛尔丁-哈伯曼, F·里泼曼, B·狄芬巴赫, H·克思勒, R·豪伯尔, J·沃姆斯 申请人:默克专利股份有限公司
技术领域：
本发明涉及式Ⅰ的新的环肽及其生理上可接受的盐，环-(Arg-B-Asp-D-E)Ⅰ其中B为Gly、Ala、-HN-Q-CO-且、D和E各自独立地为Gly、-HN-Q-CO-、Ala、Asn、Asp、Asp(OR)、Arg、Cha、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Lys(AC)、Lys(ACNH2)、Lys(ACSH)、Met、Nal、Nle、Orn、Phe、4-Hal-Phe、Phg、Pro、Pya、Ser、Thr、Tia、Tic、Trp、Tyr或Val，这些氨基酸残基也可被衍生，R为有1-6个碳原子的烷基，Hal为F、Cl、Br或I，Q为有1-6个碳原子的亚烷基Ac为有1-10个碳原子的烷酰基，在残基为旋光活性的氨基酸和氨基酸衍生物的情况下，则既包括D-式，也包括L-式。
类似化合物可从Pharmazie 40(8)，532-5(1985)中知晓。
本发明的目的是要找到具有有用性质，尤其是可用于制备药物的新化合物。
现已发现，式Ⅰ化合物及其盐具有非常有用的性质。尤其是，它们可作为整合素(integrin)抑制剂，在这种情况下它们具体是抑制β3-或β5一整合素受体与配位体之间的相互作用。该化合物对avβ3、avβ5和a11bβ3整合素尤其有效。这一作用可通过例如J.W.Smith等人在J.Biol.Chem.265，12267-12271(1990)中所述的方法加以证实。另外，它们还具有消炎作用，这一作用也可采用文献中已知的方法加以证实。
本发明化合物可用作人药和兽药中的药物活性成分，尤其是用于预防和治疗循环系统疾病、血栓形成、心肌梗塞、动脉硬化、炎症、中风、心绞痛、肿瘤、溶骨疾病尤其是骨质疏松症、血管成形术后血管生成和再狭窄。它们也可用于伤口愈合过程中的辅助治疗。
本发明化合物也适宜作为杀微生物剂，避免由例如细菌、真菌或酵母等引起的感染。在如插入异体物质如生物材料、植入物、导管或心脏起搏器而进行的手术中，该物质可用作协同杀微生物剂。它们作为抗菌剂。
上、下文中所示的氨基酸缩写符号代表如下氨基酸Abu 4-氨基丁酸Aha 6-氨基己酸Ala 丙氨酸Arg 精氨酸Asn 天冬酰胺Asp 天冬氨酸Asp(OR) 天冬氨酸(β-酯)
Cit 瓜氨酸Cys 半胱氨酸Dab 2，4-二氨基丁酸Gln 谷氨酰胺Glu 谷氨酸Gly 甘氨酸His 组氨酸Ile 异亮氨酸Leu 亮氨酸Lys 赖氨酸Lys(AC) Nε-酰基赖氨酸Lys(ACNH2) Nε-氨基酰基赖氨酸Lys(ACSH) Nε-巯基酰基赖氨酸Met 甲硫氨酸Nal 3-(2-萘基)-丙氨酸Nle 正亮氨酸Orn 鸟氨酸Phe 苯丙氨酸4-Hal-Phe 4-卤代苯丙氨酸Phg 苯基甘氨酸Pro 脯氨酸Pya 3-(2-吡啶基)-丙氨酸Ser 丝氨酸Tia 3-(2-噻吩基)-丙氨酸
Tic 四氢异喹啉-3-羧酸Thr 苏氨酸Trp 色氨酸Tyr 酪氨酸Val 缬氨酸另外，以下各缩写符号含义如下BOC 叔丁氧羰基CBZ 苄氧羰基DCCI 二环己基碳化二亚胺DMF 二甲基甲酰胺EDCI N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐Et 乙基FMOC 9-芴基甲氧羰基HOBt 1-羟基苯并三唑Me 甲基Mtr 4-甲氧基-2，3，6-三甲苯基磺酰基OBut 叔丁基酯OMe 甲基酯OEt 乙基酯POA 苯氧基乙酰基TBTu 2-(1H-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲
TFA 三氟乙酸如果上面提到的氨基酸以数种对映体形式存在，则所有这些形式及其混合物(如DL-形式)均包括在其中，例如作为式Ⅰ化合物的组成成分。还可以给作为式Ⅰ化合物组成成分的氨基酸提供本身已知的保护基。
本发明还涉及制备式Ⅰ化合物或其一种盐的方法，其特征在于通过用溶剂分解剂或氢解剂处理将式Ⅰ化合物或其盐从其一种功能性衍生物中释放出来，或者用一环化剂处理式Ⅱ肽或其反应性衍生物，H-Z-OH Ⅱ其中Z为 -Arg-B-Asp-D-E--B-Asp-D-E-Arg--Asp-D-E-Arg-B--D-E-Arg-B-Asp--E-Arg-B-Asp-D-，和/或通过用酸或碱处理使式Ⅰ的碱性或酸性化合物转化为其一种盐。
除非另外说明，上、下文中残基B、D、E和Z的含义同式Ⅰ和Ⅱ。
上式中，烷基优选为甲基、乙基、异丙基或叔丁基。
基团B优选为Gly，但也可为-HN-(-CH2)2-CO-、-HN-(CH2)3-CO-、-HN-(CH2)5-CO或Ala。D优选为Phe。尤其是D-Phe，但也可为4-Hal-Phe，尤其是4-I-Phe，以及Pro、Tie、Lys、Nal或Phg，尤其优选D-式。
因此，本发明尤其涉及其中至少一个所述残基具有上述优选定义之一的式Ⅰ化合物。
一组优选的化合物可用部分式Ⅰa表示，它在其它方面均对应于式Ⅰ，只是B为Gly、-HN-(CH2)2-CO-、-HN-(CH2)3-CO-、-HN-(CH2)5-CO-或Ala，D为D-Pro、D-Tic、Phe、D-Nal、D-Phg或4-I-Phe，E为Val、Lys、Gly、Ala、Phe、Lau、Lys(Ac)或Nle。
更优选的一组化合物可用式Ⅰb表示，它在其它方面对应于式Ⅰ，只是B为Gly，D为D-Phe，且E为Val、Lys或Gly。
式Ⅰ化合物及制备它们的起始物可另外通过已知方法制得，如Houben-Weyl，Methoden der organischen Chemie(Methods of Organic Chemistry)等经典著作中所述的方法，尤其是在已知的且适用于该反应的条件下进行。在这里也可使用没有详细提到的已知改进方法。
根据需要，也可就地形成起始物，使其不从反应混合物中分离出来，而是立即进一步反应，以得到式Ⅰ化合物。
通过溶剂分解，尤其是水解，或者通过氢解使式Ⅰ化合物从其功能性衍生物中释放出来，也可得到式Ⅰ化合物。
用于溶剂分解或氢解的优选起始物是其中含有适当保护的氨基和/或羟基以代替一个或多个游离氨基和/或羟基的化合物，优选携带氨基保护基以代替与N原子键合的H原子的化合物，例如对应于式Ⅰ，但含有NHR′基团(其中R′为氨基保护基，如BOC或CBZ)，以代替NH2基团的化合物。
另外，优选以羟基保护基代替羟基的氢原子的起始物，如对应于式Ⅰ但以R″O-苯基(其中R″为羟基保护基)代替羟苯基的起始物。
起始物分子中可存在多个-相同或不同-保护氨基和/或羟基。如果所存在的保护基彼此不同，在许多情况下它们可被选择性地除去。
术语“氨基保护基”是普遍已知的，它是指适用于保护(封阻)氨基不受化学反应，但所需化学反应在分子中其它位置发生后又易于除去的基团。典型的这类基团尤其是未取代或取代酰基、芳基、芳烷氧甲基或芳烷基。由于氨基保护基在所需反应(或反应序列)之后被除去，所以它们的性质及大小并不太重要，但优选有1-20个，尤其是1-8个碳原子的保护基。术语“酰基”在本发明的方法和本发明的化合物中取其最宽含义。它包括得自脂族、芳脂族、芳族或杂环羧酸或磺酸的酰基，尤其是烷氧羰基，芳氧羰基尤其是芳烷氧羰基。这类酰基的例子有烷酰基，如乙酰基、丙酰基或丁酰基;芳烷酰基，如苯基乙酰基;芳酰基，如苯甲酰基或甲苯甲酰基;芳氧烷酰基，如POA;烷氧羰基，如甲氧羰基、乙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基、BOC、2-碘乙氧羰基;芳烷氧羰基，如CBZ(“苄酯基”)，4-甲氧苄氧羰基，FMOC和芳基磺酰基，如Mtr。优选的氨基保护基是BOC和Mtr，另外还有CBZ、FMOC、苄基和乙酰基。
术语“羟基保护基”也是普遍已知的，它系指适用于保护羟基不受化学反应，但在所需反应于分子中其它位置发生后又易于除去的基团。典型的这类基团是上述未取代或取代芳基、芳烷基或酰基，另外还有烷基。由于羟基保护基在所需化学反应或反应序列后被除去，它们的性质和大小并不重要;优选有1-20个，尤其是1-10个碳原子的保护基。羟基保护基的例子有苄基、对-硝基苯甲酰基、对-甲苯磺酰基和乙酰基，尤其优选苄基和乙酰基。天冬氨酸和谷氨酸中的COOH基团优选以其叔丁酯形式(如Asp(OBut))保护。
用作起始物的式Ⅰ化合物的功能性衍生物也可采用常规的氨基酸和肽合成法制得，例如所述经典著作和专利申请以及Merrifield solid phase method(B.F.Gyain和R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.94，3102et seq(1972))中所述的方法。
根据所使用的保护基，利用强酸(优选TFA或高氯酸)，但也可利用其它强无机酸(如盐酸或硫酸)或强有机羧酸(如三氯乙酸)或磺酸(如苯磺酸或对-甲苯磺酸)，可将式Ⅰ化合物从其功能性衍生物中释放出来。其它惰性溶剂的存在是可能的，但并不总是必要的。合适的惰性溶剂优选为有机溶剂，如乙酸等羧酸，四氢呋喃或二噁烷等醚，DMF等酰胺，二氯甲烷等卤代烃，甲醇、乙醇或异丙醇等醇和水。另外，以上溶剂的混合物也是适合的。TFA优选过量使用而不加入其它溶剂，高氯酸是与乙酸混合使用，且按9∶1的比例使用70%的高氯酸。用于断裂的反应温度宜为0-50℃，优选15-30℃(室温)。
基团BOC、OBut和Mtr优选利用TFA的二氯甲烷溶液或利用约3-5N HCl的二噁烷溶液于15-30℃除去，FMOC基团优选利用约5-50%二甲胺、二乙胺或哌啶的DMF溶液于15-30℃除去。
经氢解可除去的保护基(如CBZ或苄基)可在催化剂(如钯等贵金属催化剂，优选存在于碳等载体上)存在下通过氢气处理除去。适用于这一情况的溶剂是上面所述的溶剂，尤其是例如甲醇或乙醇等醇类或DMF等酰胺。氢解一般在温度为0-100℃，压力为1-200巴(优选20-30℃和1-10巴)的条件下进行。CBZ基团的氢解易于在5-10%pd-C的甲醇溶液中或利用甲酸铵(代替H2)在pd-C的甲醇/DMF溶液中于20-30℃进行。
也可按例如Houben-Weyl，loc cdt，volume 15/ll，pages 1-806(1974)中所述的方法，在适用于肽合成的条件下环化反应式Ⅱ化合物获得式Ⅰ化合物。
反应优选在脱水剂，如碳化二亚胺(如DCCI或EDCI)、丙烷膦酸酐(比照Angem.Chem.92，129(1980))、二苯磷酰基叠氮化物或2-乙氧基-N-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉存在下，于惰性溶剂如二氯甲烷等卤代烃、四氢呋喃或二噁烷等醚、DMF或二甲基乙酰胺等酰胺、乙腈等腈类或这些溶剂的混合物中于-10至40℃(优选0-30℃)进行。为了促进在分子间肽键合前的分子内环化，优选在稀溶液中操作(稀释原理)。
除式Ⅱ化合物外，这些物质的合适反应性衍生物，如反应性基团被保护基居间封阻的化合物，也可用于该反应。氨基酸衍生物Ⅱ可以其活性酯形式使用，该活性酯宜通过加入HOBt或N-羟基琥珀酰亚胺就地形成。
式Ⅱ起始物一般是新的。它们可通过已知方法，例如上述肽合成法和保护基除去法制备。
一般来说，首先合成的是式R′-Z-OR″的被保护五肽酯，如BOC-Z-OMe或BOC-Z-OEt，将其水解后得到式R′-Z-OH的酸，如BOC-Z-OH;从其中除去保护基R′，利用它得到式H-Z-OH(Ⅱ)的游离肽。
式Ⅰ的碱可用酸转化为适当的酸加成盐。适用于该反应的酸尤其是产生生理上可接受的盐的酸，因此，可使用硫酸、硝酸、氢卤酸(如盐酸或氢溴酸)、磷酸(如正磷酸)和氨基磺酸等无机酸，以及有机酸，尤其是脂族、脂环族、芳脂族、芳族或杂环一元或多元羧酸、磺酸或硫酸，如甲酸、乙酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、水杨酸、2-或3-苯基丙酸、柠檬酸、谷氨酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸或乙磺酸、乙烷二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、萘磺酸或萘二磺酸以及十二烷基硫酸。与生理上不可接受的酸形成的盐，如苦味酸盐，可用于分离和/或纯化式Ⅰ化合物。
另一方面，式Ⅰ的酸也可通过与碱反应转化为其一种生理上可接受的金属盐或铵盐。此处合适的盐尤其是钠、钾、镁、钙和铵盐，也可以是取代的铵盐，如二甲基-、二乙基-或二异丙基铵盐，单乙醇-、二乙醇-或三乙醇铵盐，环己基-或二环己基铵盐，二苄基乙二铵盐，以及与N-甲基-D-葡糖胺或精氨酸或赖氨酸形成的盐。
通过将式Ⅰ新化合物及其生理上可接受的盐与至少一种赋形剂或助剂-根据需要还包括一种或多种其它活性成分-一起制成合适的剂量形式，可生产出药物制剂。由此获得的制剂可作为人用或兽用药品使用。合适的赋形物质是适用于肠内(如口腔、直肠)、非肠道(如静脉注射)或局部(如表皮、皮肤、眼或鼻)给药或适用于以吸入喷雾方式给药且不与新化合物反应的有机或无机物质，如水或等渗盐水溶液、低级醇、植物油、苄基醇、聚乙二醇、三乙酸甘油酯和其它脂肪酸甘油酯、明胶、大豆卵磷脂、碳水化合物(如乳糖或淀粉)、硬脂酸镁、滑石、纤维素和矿糖。片剂、包衣片剂、胶囊、糖浆、汁液或滴剂等尤其是用于口服给药;尤其感兴趣的是薄膜片剂和包有肠溶衣或胶囊壳的胶囊。栓剂适用于直肠给药，溶液(优选油状溶液或水溶液)、悬浮液、乳液或植入物等被用于通过非肠道途径给药。溶液(如可以眼滴剂形式使用)、悬浮液、乳液、乳油、软膏或敷布等适用于表皮给药。含有溶于或悬浮于推进气体或推进气体混合物(如CO2或含氯氟烃)中的活性成分的喷雾剂可用作吸入喷雾剂。这里，活性成分宜于以微粒化形式使用，其中也可存在一种或多种生理上可耐受的其它溶剂，如乙醇。吸入溶液可借助常规吸入器给药。也可将新化合物冷却干燥，并将所获得的冻干粉用于生产注射制剂。注射液可以大药丸或连续输液(如静脉、肌内、皮下或鞘内)方式给药。上述制剂可被消毒和/或可含有辅助物质，如防腐剂、稳定性和/或湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲物质、着色剂和/或调味剂。根据需要，它们也可含有一种或多种其它活性物质，如一种或多种维生素。
一般来说，本发明物质可按类似于其它已知市售肽的方式，尤其是类似于US-A-4，472，305中所述化合物的方式给药，优选每剂量单位的剂量为0.05-500mg，尤其是0.5-100mg。日剂量优选为0.01-2mg/kg体重。针对每一患者的具体剂量取决于许多不同因素，例如所用具体化合物的活性，患者的年龄、体重、总的健康状况、性别，饮食，给药时间和途径，排泄途径，药物组合情况以及所要治疗的具体疾病的严重程度。优选非肠道途径给药。
另外，式Ⅰ新化合物可作为整合素配位体用于制备亲和层析柱，该柱用于制备纯整合素。
在这种情况下，配位体，即式Ⅰ肽衍生物是通过其结合功能团与聚合支持物共价偶联。
合适的聚合支持材料是肽化学中本身已知的聚合固相，优选具有亲水性质，如交联多糖(如纤维素、琼脂糖或交联葡聚糖)、丙烯酰胺、以聚乙二醇为主要成分的聚合物或Tentakel polymers 。
与聚合支持物交联的合适结合官能团优选为有2-12个碳原子的线性亚烷基链，其一端直接与聚合物键合，且另一端具有如羟基、氨基、巯基、马来酰亚氨基或-COOH等官能团，并适于与相应肽的C-或N-末端部分相连。
在这种情况下，肽也可能直接地或以类似方式通过另一个结合官能团与聚合物的结合部位键合。含有功能化侧链的氨基酸残基的肽也可通过它们与聚合物的结合官能团键合。
而且，可对作为式Ⅰ肽组分的某些氨基酸残基进行侧链修饰，使得它们适合于通过SH、OH、NH2或COOH等基团与聚合物的结合部位结合。
在这方面，异常氨基酸也是可能的，如在苯环的4-位上携带了巯基、羟基、氨基或羧烷基链的苯丙氨酸衍生物，其官能团位于链的末端。
其侧链可直接用作结合官能团的氨基酸的例子有Lys、Orn、Arg、Dab、Asp、Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、Cys、Cit或Tyr。
N-末端结合点的例子有-CO-CnH2n-NH2、-CO-CnH2n-OH、-CO-CnH2n-SH或-CO-CnH2n-COOH，其中n＝2-12，亚烷基链的长度并不是关键，根据情况它也可被合适的芳基或烷芳基部分或完全取代。
C-末端结合点可以是例如-O-CnH2n-SH、-O-CnH2n-OH、-O-CnH2n-NH2、-O-CnH2n-COOH、-NH-CnH2n-SH、-NH-CnH2n-OH、-NH-CnH2n-NH2或-NH-CnH2n-COOH，其中n和亚烷基链的定义与前述部分相同。
N-末端和C-末端结合点也可用作已功能化的氨基酸侧链的结合成分，这里合适的氨基酸残基是例如Lys(CO-C5H10-NH2)、Asp(NH-C3H6-COOH)或Cys(C3H6-NH3)，该结合点总是与侧链官能团键合。
制备亲和层柱材料是在本身已知的缩合氨基酸的常规条件下进行，它们已在式Ⅰ化合物的制备部分进行了概括。
上、下文中所有温度均指摄氏度。在以下实施例中，“常规操作”指加水，根据需要用乙醚或二氯甲烷中和并萃取混合物，分离出有机相，于Na2SO4上干燥，过滤，蒸发并将残余物通过硅胶层析或结晶纯化。RT＝在Lichrosorb RPR Select B(250-4.7μm)柱上的保留时间，洗脱剂0.3%TFA的水溶液;异丙醇梯度在50分钟内以1ml/min的流速并在215nm处检测时为0-80%(体积)。M+＝质谱中的分子峰，通过快速原子轰击法(FAB)测得。
实施例1将0.2gH-Arg-Gly-Asp-D-Pro-Val-ONa[可通过用哌啶/DMF除去Fmoc并用TFA/CH2Cl2(1∶1)除去树脂而从Fmoc-Arg-Gly-Asp-D-Pro-Val-O-wang获得，其中-O-wang为改进的Merrifield技术中使用的4-氧甲基-苯氧甲基聚苯乙烯树脂的残基]的15ml DMF溶液用85ml二氯甲烷稀释，并用50mg NaHCO3处理。于干冰/丙酮混合物中冷却后，加入40μl二苯基磷酰基叠氮化物。于室温下放置16小时后，浓缩溶液。浓缩物经凝胶过滤(于异丙醇/水8∶2中的Sephadex G10柱)后按常规方式进行HPLC纯化。得到环-(Arg-Gly-Asp-D-Pro-Val);RT＝13.4;M+525。
类似地，通过环化相应的线性肽得到如下产物
环-(Arg-Gly-Asp-D-Tic-Val);RT＝18.4;M+587;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val);M+575;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Lys-Val);RT＝6.8;M+556;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys);RT＝10.9;M+604;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Gly);RT＝13.1;M+533;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Ala);RT＝14.3;M+547;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Phe);RT＝22.0;M+623;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu);RT＝21.2;M+589;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Nal-Val);RT＝24.7;M+625;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phg-Val);RT＝16.5;M+561;
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-Gly);RT＝13.2;M+533;
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Ala);RT＝14.8;M+547;
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Phe);RT＝20.2;M+623;
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Leu);RT＝21.4;M+589;
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-D-Phe-Lys);RT＝23.4;M+816;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(H3C-CO);RT＝17.0;M+646;
环-(Arg(Mtr)-β-Ala-Asp-Phe-D-Val);RT＝28.2;M+801;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Nle);RT＝22.0;M+589;
环-(D-Arg-Gly-D-Asp-D-Phe-Val);RT＝17.5;M+575;
环-(Arg-Gly-D-Asp-D-Phe-D-Gly);RT＝18.7;M+575;
环-(Arg-D-Ala-Asp-D-Phe-Val);RT＝18.9;M+589;
环-(Arg-D-Ala-Asp-Phe-D-Val);RT＝19.1;M+589;
环-(Arg-Aha-Asp-D-Phe-Val);RT＝20.8;M+631;
环-(Arg-Aha-Asp-Phe-D-Val);RT＝17.2;M+603;
环-(Arg-Aha-Asp-Phe-D-Val);RT＝19.8;M+631;
环-(Arg-Abu-Asp-D-Phe-Val);RT＝17.8;M+603;
环-(Arg-Gly-Asp-D-(4-I-Phe)-Val);RT＝23.3;M+701;
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-Val);RT＝21.8;M+575;
环-(Arg-Gly-D-Asp-D-Phe-Val);RT＝20.7;M+575;
环-(D-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val);RT＝20.8;M+575;
环-(D-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val);RT＝21.9;M+575;
环-(Arg-Gly-D-Asp-D-Phe-Val);RT＝20.7;M+575;
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Nal);
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Leu);
环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Ser);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Nal-Leu);
环-(Arg-Gly-Asp-Nal-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-Phg-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-Trp-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-Ala(2-thienyl)-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-Lys-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-(4-NO2-Phe)-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-Cha-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-β-Ala);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Abu);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aha);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Pro);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Arg);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(Aha));
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Nal);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Ser);
环-(D-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-D-Asp(OEt)-D-Phe-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-D-Nal);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-D-Leu);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-D-Ser);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-D-Nal-Leu);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Nal-D-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phg-D-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Trp-D-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(BOC-Aha);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO-CH2SH));
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO-(CH2)2SH));
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO-(CH2)3SH));
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO-(CH2)4SH));
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO-(CH2)5SH));
环-(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-(4-Cl-Phe)-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Pya-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-NMe-Phe-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Tyr(OEt)-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Arg-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Trp-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Ala(2-thienyl)-Val);
环-(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-NMe-Val);
环-(Arg-Gly-D-Asp-D-Phe-Val);
环-(Arg-Gly-D-Asp-Phe-D-Val);
环-(D-Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val);
环-(D-Arg-Gly-D-Asp-Phe-Val)。
实施例2将0.28g环-(Arg(Mtr)-β-Ala-Asp-Phe-D-Val)[可按照实例1环化得到]于8.4ml TFA、1.7ml二氯甲烷及0.9ml硫酚中的溶液于室温下放置4小时，然后浓缩，水稀释后冻干。于Sephedex G10(乙酸/水1∶1)上过滤，随后在给定条件下通过制备性HPLC纯化，得到环-(Arg-β-Ala-Asp-Phe-D-Val);RT＝17.0;M+589。
类似地，由以下起始物得到以下产物
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-D-Phe-Lys)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys);Rt＝10.9;M+604环-(D-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Val)环-(D-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-D-Asp(OEt)-D-Phe-Val)环-(Arg-Gly-D-Asp-D-Phe-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-D-Nal)环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Nal);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-D-Ser)环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Leu);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-D-Ser)环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Ser);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-D-Nal-Leu)环-(Arg-Gly-Asp-D-Nal-Leu);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Nal-D-Val)环-(Arg-Gly-Asp-Nal-D-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phg-D-Val)环-(Arg-Gly-Asp-Phg-D-Val);
环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Trp-D-Val)环-(Arg-Gly-Asp-Trp-D-Val).
实施例3将80mg环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu)溶于0.01M HCl中五至六次，并在每次溶解后冻干。经HPLC纯化后得到环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu)。HCl;RT＝20.6;M+589。
类似地，由以下反应物得到以下产物
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val).BCl;RT＝18.4;M+575;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu).HCl;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu)用乙酸处理环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu).H3C-COOH;RT＝19.2;M+589;
环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu)用硝酸处理环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu).HNO3;RT＝20.4;M+589;
实施例4为了制备亲和相，将0.9g N-马来酰亚氨-(CH2)5-CO-NH-(CH2)3-聚合物[可通过缩合N-马来酰亚氨-(CH2)5-COOH与H2N-(CH2)3-聚合物得到]悬浮于10ml 0.1M磷酸钠缓冲液(PH7)中，并于4℃加入1当量环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO(CH2)2SH)。搅拌反应混合物4小时，同时温热至室温，滤出固体残渣，并两次用10ml缓冲溶液(PH7)洗涤，接着三次用10ml水洗涤。得到环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(CO(CH2)2S-3-(N-马来酰亚氨-(CH2)5-CONH-(CH2)3-聚合物))。
实施例5类似于实施例1，通过缩合聚合物-O-(CH2)3-NH2[市售]与环-(Arg-Gly-Asp-D-Pro-Lys(CO(CH2)4COOH)[可通过在所述条件下缩合己二酸与环-(Arg-Gly-Asp-D-Pro-Lys)-得到]可得到以下聚合相环-(Arg-Gly-Asp-D-Pro-Lys-(CO-(CH2)4-CO-NH-(CH2)3-O-聚合物)。
类似地，通过缩合环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys-(CO-(CH2)5-NH2))与HOOC-CH2-O-聚合物可得到以下产物环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys-(CO-(CH2)5-NH-CO-CH2-O-聚合物))。
以下实施例涉及药物制剂。
实施例A注射瓶剂用2N盘酸调节100g式Ⅰ环肽和5g磷酸氢二钠的3l双蒸水溶液至PH6.5，无菌过滤，装入注射瓶中并在无菌条件下冷冻干燥，以无菌方式封瓶。每一注射瓶含5mg活性化合物。
实施例B栓剂将20g式Ⅰ活性化合物5100g大豆卵磷脂和1400g可可油熔合，混合物倒入模中冷却。每一栓剂含20mg活性化合物。
实施例C溶液将1g式Ⅰ活性化合物、9.38g NaH2PO4·2H2O、28.48g Na2HPO4·12H2O和0.1g氯化苄烷铵在940ml双蒸水中制成溶液。调节溶液至PH6.8，加足至11，并照射无菌。该溶液可用作眼睛滴剂。
实施例D软膏将500mg式Ⅰ活性化合物与99.5g矿脂在无菌条件下混合。
实施例E片剂将100g式Ⅰ环肽、1kg乳糖、600g微结晶纤维素、600g玉米淀粉、100g聚乙烯吡咯烷酮、80g滑石和10g硬脂酸镁按常规方式挤压成片剂，使得每片含10mg活性化合物。
实施例F包衣片剂按实例E挤压片剂，然后按常规方式包衣一层蔗糖、玉米淀粉、滑石、黄蓍胶和着色剂。
实施例G胶囊按常规方式向硬明胶胶囊中填入式Ⅰ活性化合物，使得每一胶囊含5mg活性化合物。
实施例H吸入喷雾剂将14g式Ⅰ活性化合物溶于10l等离子NaCl溶液中，然后将该溶液装入市售的具有泵功能的喷雾容器中。该溶液可喷入口腔或鼻。一次喷发(约0.1ml)相当于约0.14mg的剂量。
权利要求
1.式Ⅰ的环肽或其生理上可接受的盐，环-(Arg-B-Asp-D-E) Ⅰ其中B为Gly、Ala、-HN-Q-CO-，D和E各自独立地为Gly，-HN-Q-CO-，Ala，Asn，Asp，Asp(OR)，Arg，Cha，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Lys(Ac)，Lys(AcNH2)，Lys(AcSH)，Met，Nal，Nle，Orn，Phe，4-Hal-Phe，Phg，Pro，Pya，Ser，Thr，Tia，Tic，Trp，Tyr or Val，上述氨基酸残基也可被衍生，R为有1-6个碳原子的烷基Hal为F、Cl、Br或I，Q为有1-6个碳原子的亚烷基，Ac为有1-10个碳原子的烷酰基，在氨基酸或氨基酸衍生物具有旋光活性的残基的情况下，则既包括其D-型也包括其L-型。
2.根据权利要求1的式Ⅰ化合物的对映体或非对映体。
3.(a)环-(Arg-Gly-Asp-D-Lys-Val);(b)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys);(c)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Gly);(d)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Phe);(e)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Leu);(f)环-(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Leu);
4.制备权利要求1式Ⅰ化合物或其一种盐的方法，其特征在于通过用溶剂分解剂或氢解剂处理使其从其一种功能性衍生物中释放出来，或用环化剂处理式Ⅱ的肽或其反应性衍生物，H-Z-OH其中Z为-Arg-B-Asp-D-E--B-Asp-D-E-Arg--Asp-D-E-Arg-B--D-E-Arg-B-Asp--E-Arg-B-Asp-D-，和/或通过用酸或碱处理将式Ⅰ的碱性或酸性化合物转化为其一种盐。
5.生产药物的方法，其特征在于将权利要求1的式Ⅰ化合物和/或其一种生理上可接受的盐与至少一种固体、液体或半固体赋形剂或辅助剂一起制成合适的剂量形式。
6.药物制剂，其特征在于它含有至少一种权利要求1的式Ⅰ化合物和/或一种其生理上可接受的盐。
7.权利要求1的式Ⅰ化合物或其生理上可接受的盐用于生产可控制疾病的药物。
8.权利要求1的式Ⅰ化合物或其生理上可接受的盐用于控制疾病。
9.权利要求1的式Ⅰ化合物用于生产亲和柱层析用的固定化配位体。
10.权利要求1的式Ⅰ化合物用于通过亲和层析纯化整合素。
全文摘要
本发明涉及式I新的环肽及其盐环-(Arg-B-Asp-D-E) I这些化合物可作为整合素抑制剂，并且尤其可用于预防和治疗循环系统疾病和肿瘤。
文档编号C07K17/08GK1099760SQ94103298
公开日1995年3月8日 申请日期1994年3月30日 优先权日1993年4月1日
发明者A·琼兹克, G·霍尔泽曼, B·佛尔丁-哈伯曼, F·里泼曼, B·狄芬巴赫, H·克思勒, R·豪伯尔, J·沃姆斯 申请人:默克专利股份有限公司
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