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2021-02-01 10:02:55|
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起点商标网 专利名称：生物活性化合物的制作方法
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本发明涉及可溶的合成聚合物结合的蒽环类化合物，它们的制备和含有它们的药物组合物。
现有技术中已知的及当前用于临床治疗恶性肿瘤的蒽环类化合物的例子有阿霉素、4’-表阿霉素和4-去甲氧基柔红霉素；见如F.Aramone“Doxorubicin”MedicinalChemistrymonograph，vol，7，AcademicPress1981。
已制备了许多具有抗肿瘤活性的阿霉素聚合物衍生物。这些衍生物中特别有希望临床应用的是可溶的聚合物结合的阿霉素，它由亲水片段和连结阿霉素和2-羟基丙胺的肽链组成。通过盐酸阿霉素与含肽基链的甲基丙烯酸聚合物前体(活化为对硝基苯基酯)在三乙胺存在下在二甲亚砜中缩合，然后剩余的酯基用1-氨基-2-羟基丙烷氨解，制备这些聚合物结合的阿霉素。这些物质与鼠溶酶体酶一起孵育，可裂解末端氨基酸与阿霉素之间的酰胺链[J.Kopecek等，Biomaterials10，335(1989)；R.Duncan等，Biochem，Pharmacol.，39，1125(1990)；R.Duncan等，J.ControlleolRelease，10，51(1989)；18，123(1992)和19，331(1992)]。
例如上述的传统方法的问题在于难以从阿霉素聚合物共轭体中去除阿霉素。这是因为结合的和游离的阿霉素之间形成了π-复合物；已表明此物在电泳、分子过滤和凝胶色谱中表现为一个整体[J.Feijen等，J.ControlledRelease1，301(1985)]。
本发明的聚合物结合的蒽环系统是基于含亲水片段的甲基丙烯酸聚合物、只连结于蒽环的氨基的肽基侧链和甘氨酸残基，或为游离酸形式或为酰胺衍生物形式。这些系统与现有技术相比，其优点是蒽环化合物易于从其所结合的聚合物上释放出来。另外，本发明的聚合物结合的蒽环类化合物比相应的游离蒽环化合物具有更宽的抗肿瘤活性和更低的全身毒性。
因此，本发明提供式A聚合物结合的蒽环类化合物，其基本由式1、2和3代表的3个单元组成
其中Gly代表甘氨酸；n为0或1x为70-98mol%，y为1-29mol%，z为1-29mol%R1为被一个或多个羟基取代的C1-6烷基；Y为氨基酸残基或肽间隔基；[NH-D]为氨基糖甙蒽环化合物[NH2-D]的残基；Z为羟基或如上所定义的式-NHR1的残基。
其残基为[NH-D]的氨基糖甙蒽环化合物用[NH2-D]代表，其中D指蒽环氨基糖甙减去糖片段的氨基所剩结构。
聚合物结合的蒽环化合物优选含有90-98mol%的式1单元、1-10mol%的式2单元和1-10mol%的式3单元。
肽基链在体内酶水解只使活性药物D-NH2释放，而单元3不受影响。
R1代表的适当烷基为被一个或多个羟基取代的C1-4烷基；例如羟乙基、2-羟丙基和3-羟丙基。
肽间隔基Y应易于细胞内水解，而可耐受细胞外水解。肽间隔基的长度可为1-10(例如2-4)个氨基酸残基。典型的肽间隔基为三肽或四肽。
组成肽间隔基Y的每个手性氨基酸残基可为D或L光学异构体，或D/L混合物。这里使用表示氨基酸的常规三字系统，其中这些符号表示手性氨基酸的L构型，除非另有说明。肽间隔基Y可以消旋混合物或光学纯异构体。
优选地，Y选自Gly-Phe-Gly、Gly-Leu-Gly、Phe-Leu-Gly、Gly-Phe-Leu-Gly、或Leu-Leu-Gly，每例中甘氨酸残基与氨基糖甙蒽环连结。
适宜的氨基糖甙蒽环残基[NH-D]为下式Q的蒽环氨基糖甙[NH2-D]的残基
其中，RⅠ和RⅡ之一为氢原子，另一个为羟基或碘；RⅢ为氢原子或OCH3，及RⅣ为氢原子或羟基。
蒽环氨基糖甙[NH2-D]的优选例为阿霉素、4’-表阿霉素、4’-去甲氧基柔红霉素、idarubicin和4’-碘、4’-去氧阿霉素。
本发明还提供聚合物结合的蒽环化合物A的制备方法，其中A主要由如上所定义的单元1、2和3组成。此方法包括ⅰ)聚合物中间体B，其中B基本由下式1和4的单元组成 其中式1中的X、n和R如上所定义，w为30-2mol%，R2为羟基或离去基团，与通式5的蒽环衍生物反应其中[NH-D]和Y如上所定义；及ⅱ)必要时，为制备其中式3单元中Z为NHR1的聚合物结合的蒽环化合物，将其中R2为离去基团的步骤ⅰ)的产物与式NH2R1化合物反应，其中R1如上所定义。
R2可代表的适宜的离去基团为苯环上被一个或多个吸电子基团取代的苯氧基。吸电子基团的适当例子包括硝基(-NO2)和卤原子。R2优选为下式离去基团 其中L为吸电子基团如-NO2或卤原子如氟或氯，及m为1-5的整数，特别是1-3，优选1-2。R2优选为对硝基苯氧基或2，4-二氯苯氧基。
由于其高亲脂性，式5化合物易于从式A的聚合物共轭体中分离出来。因此，如上所述，本发明聚合物结合的蒽环化合物的制备途径克服了传统的蒽环与聚合物缩合方法的主要缺点，即难于从聚合物共轭体中分出游离的蒽环化合物。
如上所定义，聚合物中间体B主要由单元1和4组成，其通过下式6和7的甲基丙烯酰化合物的自由基共聚合来制备
其中n、R1和R2如上所定义。
基本由单元1和4组成的一些聚合物是文献中已知的；例如聚合物B1，它由其中R1代表-CH2CH(OH)CH3，n=0的单元1和其中R2代表对硝基苯酚残基的单元4组成，通过N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺[6aR1=CH2CH(OH)CH3，n=0]与N-甲基丙烯酰甘氨酰对硝基苯基酯[7aR2=O-C6H4NO2]的自由基沉淀共聚合来制备，如 J.Kopecek，Makromol.Chem.178，2159(1977)中所述。其中R2代表羟基的由单元1和4组成的聚合物中间体可通过自由基均聚合来制备。
式6和7的一些单体为已知的。其中n=0及R1为带有仲羟基的烷基的式6化合物，一般通过甲基丙烯酰氯与带有仲羟基的脂肪胺反应来制备。另一方面，其中n=0及R1为含伯羟基的烷基的式6化合物，可从甲基丙烯酸和氨基化合物在缩合剂如1-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉存在下制得。
本发明的另一方面是肽基-蒽环衍生物。它们的制备方法是已知的。例如，因为适当的N-保护的肽与蒽环反应很重要，反以一定要选择在对蒽环稳定的条件下能够被除去的肽基N-保护基，例如三苯甲基。
式5的肽基蒽环衍生物可通过下述方法制备，它包括(ⅰ)式8或9的N-保护的肽
其中R3为对酸敏感的氨基保护基，P为离去基团，Y为如上所定义的氨基酸残基或肽间隔基，与如上所定义的蒽环氨基糖甙[NH2-D]反应，生成通式10的中间体
其中[NH-D]、Y和R3如上所定义；及(ⅱ)除去保护基R3，生成游离碱形式的肽基-蒽环衍生物5。
P可为如上R2中所定义和例举的离去集团。另外，P可为五氟苯氧基或N-羟基-琥珀酰亚氨基。对酸敏感的保护基R3的例子包括三苯甲基和二苯基氨基。
式8和9的肽基衍生物根据有关肽文献中已知的标准合成步骤来制备。用酸敏感基团如三苯甲基保护氨基官能团典型地根据Theodoro-poulos等[J.Org.Chem.47，1324(1982)]来进行。设计制备化合物8，9和10的反应条件以避免消旋化；这样生成的肽基衍生物与起始氨基酸的构型相同。
为了制备式5的蒽环衍生物，化合物9可与蒽环化合物盐酸盐在无水极性溶剂如二甲基甲酰胺中，在等当量的有机碱如三乙胺存在下，例如在室温下反应15小时，生成式10中间体，通过色谱纯化并在例如75%的乙酸中在室温下脱保护，得到式5衍生物。
应该注意，在C-14位带有羟基的蒽环如阿霉素和4’-表阿霉素以盐酸盐形式与式9肽基衍生物在有机碱存在下的以应，并需要在极性溶剂中将蒽环的3’-氨基脱保护，生成衍生物10和在糖片段的氨基和在C-14位都被取代的蒽环衍生物的混合物。通过色谱从此混合物中除去二(3’-N，14-O-肽基)衍生物。
还可以通过式8N-保护的肽与盐酸盐形式的蒽环化合物，在干燥的极性溶剂如二甲基亚砜中，在等当量的缩合剂如1-乙氧基-羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉存在下反应来制备式10化合物。此步骤不会产生C-14位带有羟基的蒽环化合物的双肽基衍生物。
中间体B与式5的肽基蒽环衍生物缩合，然后任选地替换剩余的离去基团，生成基本由单元1、2和3组成的聚合物结合的蒽环化合物。应该强调的是此步骤避免了伯羟基与侧链甘氨酰活化酯之间形成酯键。
如上所定义的，其中单元3的Z残基代表式NHR1的基团的式A聚合物结合的药物，优选通过其中R2为如上所定义的离去基团的中间体B与式5蒽环衍生物，在无水极性溶剂如二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中反应来制备。此反应典型地在8-24小时内完成。该反应典型地在15-30℃温度范围内进行，优选在室温进行15小时，然后通过其共轭体与如上所定义的式NH2R1化合物在室温反应0.5-3小时，以置换剩余的离去基团。
其中单元2的残基Z代表羟基的式A聚合物结合药物，优选通过其中R2为羟基的中间体B与式5蒽环衍生物，在无水极性有机溶剂如二甲基甲酰胺或二甲亚砜中反应来制备。此反应典型地在8-24小时内完成。此反应典型地在15-30℃温度下进行，优选在室温下进行15小时。
例如，为了制备其中Z为残基NHR1(如上所定义)的聚合物结合蒽环衍生物，其中R2为离去基团如对硝基苯氧基的中间体B用肽基蒽环5在室温下处理15小时。适当地使用14%w/v的B和2.3%w/v的5。然后典型地加入0.1%w/v的式NH2R1化合物(如上所定义)反应混合物在室温保持3小时。用丙酮沉淀此共轭体，用绝对乙醇溶解，典型浓度为8%(w/w)，再用丙酮沉淀，得到目标聚合物结合蒽环衍生物。
在上述方法中避免了在C-14羟基化的蒽环化合物与侧链甘氨酰活化酯之间形成酯键，这是因为在此缩合步骤中没有任何有机碱存在。
又如，为了制备其中Z为羟基的聚合物结合蒽环A，其中R2为羟基的中间体B(如上所定义)在无水二甲亚砜中，用肽基蒽环化合物5在室温下处理15小时。适当地使用14%w/v的B和2.3%w/v的5。用丙酮沉淀此共轭体，溶于绝对乙醇中，其典型浓度为8%(w/w)，再用丙酮沉淀，得到如上所定义的式A聚合物结合的蒽环衍生物。
共轭体A的蒽环含量通过分析酸水解后从结合的蒽环中释放出来的糖苷配基来测定；这样，亚德里亚霉醌(driamycinone)为阿霉素和4’-表阿霉素的糖甘配基片段，4-去甲氧基柔毛霉醌为4-去甲氧基柔红霉素的糖苷配基。
本发明的聚合物结合的蒽环化合物具有良好的水溶性、生物相容性、在生理PH下的稳定性，在与溶酶体酶孵育后释放游离活性药物，D-NH2。
式A化合物在实验模型中显示抗肿瘤活性增强，并且与游离蒽环化合物相比全身毒性降低。
式A的聚合物结合的蒽环化合物具有抗肿瘤活性。因此可用包括服用治疗有效量的式A聚合物结合的蒽环化合物的方法来治疗人或动物。病人或动物的状况可因此得到改善。
所采用的剂量范围取决于给药途径和欲治疗病人的年龄、体重和状态。式A的聚合物结合的蒽环化合物典型地通过非胃肠内给药，例如肌内注射、静脉注射或大团输注。适宜的剂量范围为5-800mg/m2蒽环当量，例如20-500mg/m2。适宜的原则是将25mg蒽环当量/m2的溶液静脉给药，体积为10ml/kg体重，给药周期2周，时间为第5、9和15天。
式A的聚合物结合的蒽环化合物可与药用载体或稀释剂一起配制成药物组合物。一般将此聚合物结合的蒽环化合物配制成用于非胃肠内给药的剂型，例如溶解于无菌水或注射用水中。
下列实施例进一步说明本发明。
实施例1-6涉及制备式6和7的单体及中间体B的合成步骤。
实施例1[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]2-羟基丙胺(6b) 按照Makromol.Chem.178，2159(1977)中所述方法制得的甲基丙烯酰甘氨酰对硝基苯基酯(7a5.28g，20mmol)，溶解在无水四氢呋喃(20ml)中，用1-氨基-2-羟基丙烷(3.2ml，40mmol)处理。室温下20分钟后，减压除去溶剂，用丙酮/乙酸乙酯结晶后回收标题化合物6b(3.3g，收率82.5%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为二氯甲烷/丙酮(体积比90∶10)Rf=0.47实施例2[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]-羟乙胺(6c)
搅拌下向1-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(37g，0.15mol)和氨基乙醇(9.75g，0.15mol)在无水甲苯(150ml)中的混合物中，15分钟内滴加溶于无水甲苯(300ml)中的甲基丙烯酸(14ml，0.165mol)。在室温下搅拌反应混合物24小时。用正己烷沉淀后回收到标题化合物6c。在Kiesegel板F254(Merck)上的TLC，洗脱系统为二氯甲烷/丙酮(体积比90∶10)，Rf=0.35。
实施例3[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]2，3-二氯苯基酯(7b) 从如Makromol.chem.178，2159(1977)中所述制得的甲基丙烯酰甘氨酸(2.66g，20mmol)和2，4-二氯苯酚在无水四氢呋喃(50ml)中，在DCC(4.2g，21mmol)存在下制得标题化合物7b。化合物7b(4.7g，收率80%)从乙酸乙酯和正己烷中结晶。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为乙醚，Rf=0.47。
实施例4N-甲基丙烯酰胺-2-羟基丙烷和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(B2)
将N-甲基丙烯酰胺-2-羟基丙烷(25.2g，0.18mol)、甲基丙烯酰甘氨酸(2.86g，20mmol)和α，α’-偶氮(二)异丁腈(5.9g)溶解在无水甲醇(164ml)中。混合物在60℃、氮气下保持20小时，然后搅拌下将反应混合物加入丙酮(2000ml)中。收集沉淀，用丙酮洗涤，干燥至恒重，得到标题聚合物B2(26g)。羧基含量(w)10mol%。
实施例5[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]L-羟基丙胺和N-(甲基丙烯酰甘氨酰)2，4-二氯苯基酯的共聚物(B3) 如Mdkromol.Chem.178，2159(1977)中所述，化合物6b(14.4g，72mmol)和化合物7b(5.19g，18mmol)在无水丙酮(300ml)中在α，α’-偶氮(二)异丁腈(1g，6mmol)存在下聚合为标题化合物B3。从反应混合物中过滤回收聚合物，溶解在绝对乙醇中并用丙酮再沉淀。氯含量计算值6.89mol%，实测值2.84mol%(w)。
实施例6[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]-羟乙胺和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(B4) 如实施例2中所述，从N-甲基丙烯酰胺-2-羟乙烷(6c23.2g，0.18mol)、甲基丙烯酰甘氨酸(2.86g，20mmol)和α，α’-偶氮(二)异丁腈(5.9g)在无水甲醇(164ml)中制备标题聚合物中间体B4。羧基含量(w)10%。
实施例7-12涉及制备式5的肽基-蒽环化合物的方法。
实施例7N-三苯甲基-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰4-硝基苯基酯将如J.Org.Chem，47，1324(1982)中所述制得的N-三苯甲基-L-苯丙氨酸(20.3g，50mmol)溶解在无水四氢呋喃(150ml)中，并加入无水N-羟基苯并三唑(8gr)。将此混合物冷却至0℃并用1，3-二环己基碳化二亚胺(11.7gr，50mmol)处理，10分钟后，滴加L-亮氨酰甘氨酸乙酯对甲苯磺酸盐(20g，50mmol)在无水四氢呋喃(100ml)和N-甲基吗啉(7ml)的混合物中的溶液。反应混合物在0℃下保持1小时，再在室温下过夜，然后过滤，减压除去溶剂。粗品用乙酸乙酯溶解，依次用冷的5%柠檬酸水溶液(3×100ml)、冷的5%碳酸氢钠水溶液和水洗涤，然后浓缩，在硅胶上层析，用二氯甲烷和甲醇的混合物(体积比99∶1)洗脱，得到N-三苯甲基-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰丙氨酸乙酯(18g，30mmol)，后者在95%乙醇(400ml)中室温下用1N氢氧化钠(30ml)处理2小时。转化为相应的酸8a(17g)。
在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为二氯甲烷/甲醇(体积比80∶20)，Rf=0.53。
1H-NMR(200 MHz，CDCl3)0.88(d，J=5.9Hz，6H，δ+δ′Leu);1.2-1.6(m，3H，B+_Leu);2.00(dd，J=5.7Hz，J=13.4Hz，1H，BPhe);2.83(dd，J=5.2Hz，J=13.4Hz，1H，B′Phe);3.51(t，J=5.4，1H，aPhe);3.99(d，J=4.4Hz，2H，a+a′Gly);4.55(m，1H，aLeu);6.8-7.4(m，22H，NHgly，NHLeu，4-C6H5).
将化合物8a溶解在无水四氢呋喃(450ml)中，并加入对硝基苯酚(5.5g，40mmol)。混合物被冷却至0℃，滴加1，3-二环己基碳化二亚胺(8.24g，40mmol)，4℃下保持过夜。然后过滤混合物并减压除去溶剂。将残余物溶解在乙酸乙酯中，冷却至0℃。一小时后过滤此混合物并除去溶剂，从乙醚中结晶后得到标题化合物9a(20g，收率97%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为乙醚Rf=0.80。
FD-MSm/z699[M+H]+1H-NMR(200MHz，CDCl3)0.86(d，J=6.2Hz，3H，δLeu);0.88(d，J=6.4Hz，3H，δ′Leu);1.2-1.8(m，3H，B+_Leu);1.90(dd，J=5.9Hz，J=13.5Hz，1H，BPhe);2.89(dd，J=4.6Hz，J=13.5Hz，1H，B′Phe);3.52(dd，J=4.6Hz，J=5.9Hz，1H，aPhe);4.0-4.4(m，3H，aLeu，a+a′Gly);6.78(t，J=5.7Hz，1H，NHGly);7.04(d，J=7.7Hz，1H，NHLeu);6.8-7.4(m，22Hz，4-C6H5and 2，6 COO NO2);8.25(m，2H，5，5 COO NO2).
实施例8N-三苯甲基-甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰对硝基苯基酯如实施例7所述方法制备的中间体N-三苯甲基-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酸乙酯(6g，10mmol)，在室温下用75%乙酸水溶液处理一小时，得到L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰乙酯，后者与N-三苯甲基-甘氨酸(3g，10mmol)在N-羟基苯并三唑和1，3-二环己基碳化二亚胺存在下缩合，然后水解并用对硝基酚以如实施例7的方法活化，得到标题化合物9b(3.8g，收率50%)。在Kiesel-gel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为乙醚Rf=0.63。FD-MSm/g755[M+H]+。
实施例93’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5a) 溶解于无水二甲基甲酰胺(50ml)和三乙胺(0.5ml)中的阿霉素盐酸盐，与如实施例7所述方法制备的N-三苯甲基-丙氨酰亮氨酰甘氨酰对硝基苯基酯(9a3.5g，5mmol)反应。反应混合物在室温下保持过夜，然后用乙醚和正己烷1∶1的混合物沉淀。固体通过硅胶柱纯化，用二氯甲烷和甲醇(体积比98∶2)的混合物洗脱，得到N-保护的肽基阿霉素10a(4.6g)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为二氯甲烷/甲醇(体积比95∶5)Rf=0.35。
FD-MSm/g1103[M+H]+化合物10a用75%乙酸水溶液(250ml)在室温下溶解一小时，然后用水和二氯甲烷的1∶1混合物(2500ml)稀释，用固体碳酸氢钠调PH到7。分离有机相，减压除去溶剂，得到标题化合物5a(3.45g，收率80%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，用二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(体积比80∶20∶7∶3)展开。
R=0.5.FD-MS:m/z 861[M+H]+1H-NMR(400MHz，DMSO)0.80(d，J=6.4Hz，3H，δLeu);0.83(d，J=6.4Hz，3H，δ′Leu);1.10(d，J=6.8Hz，3H，6′CH3);1.3-1.6(m，4H，B+_Leu and 2′eqH);1.83(ddd，J=2.8Hz，J=13.2Hz，J=13.2Hz，1H，2′axH);2.09(dd，J=6.0Hz，J=14.5Hz，1H，8axH);2.18(d，J=14.5Hz，1H，8-eq);2.8-3.2(m，4H，10CH2and BPhe);3.36(m，1H，4′);3.64(m，2H，aGly);3.95(s，3H，OCH3);3.9-4.1(m，2H，3′and aPhe);4.15(q，J=6.4Hz，1H，5′H);4.29(q，J=7.7Hz，1H，aLeu);4.55(s，2H，14CH2);4.7-5.0(m，3H，7H and 4′OH and 14OH);5.20(d，J=3.4Hz，1H，1′H);5.46(s，1H，9OH);7.1-7.3(m，5H，Ar-Phe);7.54(d，J=8.5Hz，1H，3′NH);7.63(m，1H，3H);7.88(m，2H，1H and 2H);8.17(m，4H，NH+and NHGly);8.70(d，J=8.1Hz，1H，NHLeu);13.23(s，1H，11OH);14.00(s，1H，6OH).
实施例103’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰甘氨酰)阿霉素(5b)
将盐酸阿霉素(2.9g，5mmol)与如实施例8所制备的N-三苯甲基-甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰对硝基苯基酯(9b3.8g，5mmol)反应，然后如实施例9所述用75%乙酸水溶液处理，得到标题化合物5b(4g，收率90%)。
在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，用二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(体积比80∶20∶7∶3)展开，Rf=0.44，FD-MSm/g938[M+H]+实施例114-去甲氧基-3’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)柔红霉素(5c) 采用实施例9中指述的相同步骤，从4-脱甲氧基柔红霉素盐酸盐(2.9g，5mmol)和N-三苯甲基-苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰对硝基苯基酯(9a3.5g，5mmol)制备了标题化合物5c(3g，收率75%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(体积比80∶20∶7∶3)展开，Rf=0.51。
FD-MS:m/z 815[M+H]+1H-NMR(200 MHz，CDCl3)0.84(d，J=6.0Hz，3H，δLeu);0.88(d，J=6.0Hz，3H，δ′Leu);1.27(d，J=6.4Hz，3H，6′CH3);1.4-1.7(m，3H，B+Leu);1.7-2.0(m，2H，2′CH2);2.06(dd，J=4.2H，J=14.9Hz，1H，8axH);2.32(d，J=14.9Hz，1H，8eqH);2.40(s，3H，COCH3);2.70(dd，J=8.6Hz，J=13Hz，1H，BPhe);3.12(dd，J=4.2Hz，J=13.7Hz，1H，B′Phe);2.94，3.23(two d，J=19.2Hz，2H，10CH2);3.5-3.8(m，3H，4′H，aPhe and aGly);3.9-4.3(m，4H，a′Gly，aLeu，5′H，3′H);5.19(m，1H，7H);5.45(d，J=2.7Hz，1H，1′H);6.9-8.4(m，12H，1H，2H，3H，4H，ArPhe，3′NH，NHGly，NHLeu).
实施例124’-表-3’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5d) 用实施例9中描述的相同步骤，从4’-表阿霉素盐酸盐(2.9g，5mmol)和N-三苯甲基-苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰对硝基苯基酯(9a3.5g，5mmol)制备了标题化合物5d(3.25g，收率86%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(体积比80∶20∶7∶3)展开，Rf=0.46，FD-MSm/g861[M+H]+。
1H-NMR(400 MHz，DMSO)0.79(d，J=6.3Hz，3H，δLeu);0.81(d，J=6.3Hz，3H，δ′Leu);1.19(d，J=5.9Hz，3H，6′CH3);1.3-1.6(m，4H，2′Hax，B，B′Leu，_Leu);1.82(dd，J=4.7Hz，J=12.5Hz，1H，2′Heq);2.1-2.3(m，2H，8-CH2);2.59(dd，J=8.2Hz，J=13.7Hz，1H，BPhe);2.9-3.1(m，4H，B′Phe，10-CH2，h′H);3.41(dd，4.7Hz，J=8.2Hz，aPhe);3.54(dd，J=5.5Hz，J=16.4Hz，1H，aGly);3.67(dd，J=6.2Hz，J=16.4Hz，1H，a′Gly);3.80(m，1H，3′H);3.90(m，1H，5′H);3.95(s，3H，OCH3);4.18(m，1H，aLeu);4.55(m，2H，14-CH2);4.3-5.0(m，3H，14-OH，7H，4′-OH);5.17(d，J=3.1Hz，1H，1′H);5.46(s，1H，9-OH);7.1-7.3(m，5H，Ar-Phe);7.53(d，J=8.2Hz，1H，NH-Gly);7.60(m，1H，3H);7.86(m，2H，1H，2H);8.05(d，J=6.4Hz，1H，NH-Leu);8.11(t，J=5.9Hz，1H，NH-Gly).
实施例133-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(A1)
将如实施例4中所述方法制备的聚合物前体B2(7.15g，5mmol的-COOH)、和3’-N-(甘氨酰-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5a2.36g，2.5mmol)溶解在无水二甲基甲酰胺(100ml)中，然后加入N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(0.7g，2.5mmol)。搅拌下，混合物在室温保持24小时，然后倾入乙醚(800ml)中。沉淀用乙醇(100ml)溶解，再用丙酮(800ml)沉淀，干燥至恒重，得到标题化合物A1(7g)。盐酸阿霉素含量9%(w/w)。
实施例143-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和(N-甲基丙烯酰甘氨酰)2-羟基丙胺的共聚物(A2)
按Makromal.chem.178，2159(1977)中所述方法制备的聚合物前体B1(10g，2.7×10-3当量的对硝基苯基酯)，溶解在干燥的二甲基甲酰胺(60ml)中，加入3’-N-(甘氨酰-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5a0.53g，1.72mmol)。搅拌下混合物在室温保持24小时，然后加入1-氨基丙醇(0.13ml)。一小时后，将反应混合物中加入搅拌下的丙酮/乙醚(体积比3/1，1.21)的混合物中，并过滤。沉淀用乙醇(150ml)溶解，用丙酮/乙醚(1.21，体积比4/1)沉淀，得到式A2的聚合物10g。盐酸阿霉素含量9%(w/w)。实施例13-18说明制备式A的聚合物结合的蒽环衍生物的步骤。
实施例153-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、4-去甲氧基-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)柔红霉素和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(A3)
如实施例13，4-去甲氧基-3’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)柔红霉素(5d1.48g，1.72mmol)与聚合物前体132(10g)在N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(0.48g)存在下，在无水二甲基甲酰胺中反应，得到标题化合物A3。
4-去甲氧基柔红霉素盐酸盐含量9%(w/w)。
实施例163-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、4’-表-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和1-N-(甲基丙烯酰甘氨酰)-2-羟基丙烷的共聚物(A4)
如实施例14，4’-表-3’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5e1.48g，1.72mmol)与聚合物前体B1反应，然后与1-氨基丙醇(0.13ml)反应，得到式A4的4’-表-阿霉素聚合物共轭体(10g)。4’-表阿霉素盐酸盐含量9%(W/W)。
实施例173-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、4’-表-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(A5)
如实施例13，从聚合物中间体B2、4’-表-3’-N-(甘氨酰亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5e)和N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉在无水二甲基甲酰胺中反应，制备了标题化合物。
实施例18[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]-羟基乙胺、3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(A6)
如实施例13所述方法，通过聚合物中间体B4和3’-N-(甘氨酰-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5e)，在N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉存在下，在无水二甲基甲酰胺中缩合，制备了标题化合物聚合物前药A6。
实施例19化合物A1对M5076的抗肿瘤活性实施例13描述的A1的抗肿瘤活性测试如下材料和方法1.给药所有药物溶液都在使用前即时制备。在第5、9和15天静脉内给药10ml/kg体重，进行治疗。蒽环化合物溶解在无菌水中，用分光光度法测定其浓度。冷干的聚合物溶解在水中形成25mg蒽环当量/ml的起始溶液，根据所报导的浓度，用水进行进一步稀释。
2.实体瘤通过系列肌内通道得到M5076鼠网状肉瘤，并皮下植入(5×105细胞/鼠)(75B1/6鼠以评估对原发肿瘤的活性。
3.测定抗肿瘤活性和毒性肿瘤生长用测经器测量，肿瘤重用Geran等的方法估测，见Cancerchemother.Rep.3，1(1972)。
抗肿瘤活性用肿瘤重达到一克所需时间(天)来测定，报告为肿瘤生长延迟(TGD)。
用下式计算存活时间的平均增长值(T/C%)T/C%= (治疗组的平均存活时间)/(对照组的平均存活时间) ×100在体重减小、肉眼观察和手触摸到的肝脾缩小来评价毒性。神经毒性用丧失运动机能的鼠的数目来测定。
结果列于表1中表1化合物剂量1TDG2A.U.C T.C.3Tox4LTS5无肿瘤者6mg/kg(1g)抑制率%%对照--150/100/10阿霉素7.535901480/260/260/2610.0391001533/260/260/26A130.0801003780/104/103/1040.0nd100>3690/106/105/1050.0nd100>3692/10*7/107/10
皮下注射5×105个细胞/鼠nd=未测定*神经毒性1在第5、9、15天给药治疗2TDG=肿瘤增长延迟3被治疗鼠的平均存活时间/对照组的平均存活时间×1004中毒死亡数目/鼠总数5长时间存活者6实验结束时无肿瘤的鼠实施例20化合物A3对M7076的抗肿瘤活性用实施例19的方法和材料测试实施例15描述的A3的抗肿瘤活性。结果示于表2中
表2化合物剂量1TDG2A.U.C T.C.3Tox4LTS5无肿瘤者6mg/kg(1g)抑制率%%对照--150/100/104-去甲氧1.019471420/90/90/9基柔红霉素1.528801600/90/90/9A34.0491001980/100/100/105.0501002050/100/100/106.0551002120/90/90/9皮下注射5×105个细胞/鼠*神经毒性1在第5、9、15天给药治疗2TDG=肿瘤增长延迟3被治疗鼠的平均存活时间/对照组的平均存活时间×1004中毒死亡数目/鼠总数5长期存活者
6实验结束时无肿瘤的鼠化合物A4(3-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、4’-表-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和1-N-(甲基丙烯酰甘氨酰)-2-羟基丙烷的共聚物)的抗肿瘤活性与4’-表阿霉素盐酸盐比较对4’-表阿霉素盐酸盐和化合物4用相同的处理方法，测试其抗肿瘤活性。
对早期M5076鼠网状肉瘤，化合物4在所有试验剂量下都比游离药物活性高(表3)表3.化合物4与4’-表阿霉素盐酸盐相比，对M5076鼠网状肉瘤的抗肿瘤活性。
化合物剂量1TDG2A.U.C. T.C.3TOX4mg/kg(1g)抑制率%%4'-表阿霉522511050/9素盐酸盐7.534901240/91040991250/9A410621001900/920621002190/930711002290/9皮下注射5×105个细胞/鼠1在第5、9、15天给药治疗2TDG=肿瘤增长延迟3被治疗鼠的平均存活时间/对照组的平均存活时间×1004中毒死亡数目/鼠总数化合物4-(3-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、4’-表-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和1-N-(甲基丙烯酰甘氨酰)-2-羟基丙烷的共聚物)的毒性与4’-表阿霉素盐酸盐比较对健康的C57B1F鼠静脉给以单一剂量的4’-表阿霉素盐酸盐(13.2-16.15-19-20.6-25.2和33.2mg/kg)和化合物A4(50-63-79-100-120-140mg/kg)来评价其毒性。
恢复三周后进行Probit分析，以确定在健康C57 B1F鼠体的LD10和LD50。
用下式计算治疗指数治疗指数= (DE50(半数有效量))/(LD50(半数致死量))半数有效量为使肿瘤生长减少50%的剂量。观察90天内动物的安全性。
在C57 B1/F鼠中的LD10和LD50值如下化合物 LD10LD50(mg/kg)(mg/kg)4'-表阿霉素盐酸盐16.421.4A4128.0389(外推值)化合物A4的低毒性允许给药剂量更大，达到与4’-表阿霉素盐酸盐等同更好的效果，得到更好的治疗指数。4’-表阿霉素盐酸盐和化合物A4的治疗指数分别为3和40。
权利要求
1.式A的聚合物结合的蒽环化合物，其基本由式1、2和3代表的三个单元组成 其中Gly代表甘氨酸；n为0或1；x为70-98mol%，y为1-29mol%，z为1-29mol%，R1为被一个或多个羟基取代的C1-6烷基；Y为氨基酸残基或肽间隔基；[NH-D]为蒽环氨基糖甙[NH2-D]的残基；及Z为羟基或式-NHR1的残基，其中R1如上所定义。
2.根据权利要求1的聚合物结合的蒽环化合物，其中[NH-D]为下式Q的蒽环氨基糖甙的残基 其中RⅠ和RⅡ之一为氢原子，另一个为羟基或碘原子，RⅢ为氢原子OCH3，RⅣ为氢原子或羟基。
3.根据权利要求1或2的聚合物结合的蒽环化合物，其中x为90-98mol%，y为1-10mol%，z为1-10mol%。
4.根据权利要求1、2或3的聚合物结合的蒽环化合物，其中R1为羟乙基、2-羟丙基或3-羟丙基。
5.根据前述权利要求中任一项的聚合物结合的蒽环化合物，其中Y为Gly-Phe-Gly、Gly-Leu-Gly、Phe-Leu-Gly、Gly-Phe-Leu-Gly、或Leu-Leu-Gly。
6.根据前述权利要求中任一项的聚合物结合的蒽环化合物，其中[NH-D]为阿霉素、4’-表阿霉素、4’-去甲氧基-柔红霉素、idarubicin或4’-碘、4’-脱氧阿霉素的残基。
7.权利要求1中定义的式A聚合物结合的蒽环化合物的制备方法，该方法包括ⅰ)聚合物中间体B，其中B基本由下式1和4的单元组成 其中式1中x、n和R1如权利要求1中所定义，W为30-2mol%，R2为羟基或离去基团；与通式5的蒽环衍生物反应其中[NH-D]和Y如权利要求1中所定义；和ⅱ)必要时为制备其中式3的单元中Z为-NHR1的聚合物结合的蒽环化合物，将其中R2为离去基团的ⅰ)步的产品与式NH2R1的化合物反应，其中R1如上所定义。
8.式5的蒽环衍生物其中[NH-D]和Y如权利要求1或2中所定义。
9.如权利要求8所定义的式5的蒽环衍生物的制备方法，该方法包括(ⅰ)式8和9的N-保护的肽其中R3为对酸敏感的氨基保护基，P为离去基团，Y如权利要求7中所定义，与蒽环衍生物[NH2-D]反应，生成通式10的中间体。其中[NH-D]如权利要求1或2中所定义，Y和R3如上所定义，及ⅱ)除去保护基R3，得到游离碱形式的肽基-蒽环衍生物5。
10.药物组合物，其含有药用载体或稀释剂，和作为活性成分的权利要求1-6中任一项要求的聚合物结合的蒽环化合物或权利要求8所要求的式5的蒽环衍生物。
全文摘要
本发明提供式A的聚合物结合的蒽环衍生物，其基本由式1、2和3代表的三个单元组成，其中Gly为甘氨酸；n为0或1；x为70—98mol％；y为1—29mol％；z为1—29mol％，R
文档编号C07K5/107GK1108454SQ94190242
公开日1995年9月13日 申请日期1994年4月8日 优先权日1993年5月11日
发明者F·安吉勤克, M·格兰迪, A·苏拉托 申请人:法米塔利亚·卡洛·埃巴有限责任公司
技术领域：
本发明涉及可溶的合成聚合物结合的蒽环类化合物，它们的制备和含有它们的药物组合物。
现有技术中已知的及当前用于临床治疗恶性肿瘤的蒽环类化合物的例子有阿霉素、4’-表阿霉素和4-去甲氧基柔红霉素；见如F.Aramone“Doxorubicin”MedicinalChemistrymonograph，vol，7，AcademicPress1981。
已制备了许多具有抗肿瘤活性的阿霉素聚合物衍生物。这些衍生物中特别有希望临床应用的是可溶的聚合物结合的阿霉素，它由亲水片段和连结阿霉素和2-羟基丙胺的肽链组成。通过盐酸阿霉素与含肽基链的甲基丙烯酸聚合物前体(活化为对硝基苯基酯)在三乙胺存在下在二甲亚砜中缩合，然后剩余的酯基用1-氨基-2-羟基丙烷氨解，制备这些聚合物结合的阿霉素。这些物质与鼠溶酶体酶一起孵育，可裂解末端氨基酸与阿霉素之间的酰胺链[J.Kopecek等，Biomaterials10，335(1989)；R.Duncan等，Biochem，Pharmacol.，39，1125(1990)；R.Duncan等，J.ControlleolRelease，10，51(1989)；18，123(1992)和19，331(1992)]。
例如上述的传统方法的问题在于难以从阿霉素聚合物共轭体中去除阿霉素。这是因为结合的和游离的阿霉素之间形成了π-复合物；已表明此物在电泳、分子过滤和凝胶色谱中表现为一个整体[J.Feijen等，J.ControlledRelease1，301(1985)]。
本发明的聚合物结合的蒽环系统是基于含亲水片段的甲基丙烯酸聚合物、只连结于蒽环的氨基的肽基侧链和甘氨酸残基，或为游离酸形式或为酰胺衍生物形式。这些系统与现有技术相比，其优点是蒽环化合物易于从其所结合的聚合物上释放出来。另外，本发明的聚合物结合的蒽环类化合物比相应的游离蒽环化合物具有更宽的抗肿瘤活性和更低的全身毒性。
因此，本发明提供式A聚合物结合的蒽环类化合物，其基本由式1、2和3代表的3个单元组成
其中Gly代表甘氨酸；n为0或1x为70-98mol%，y为1-29mol%，z为1-29mol%R1为被一个或多个羟基取代的C1-6烷基；Y为氨基酸残基或肽间隔基；[NH-D]为氨基糖甙蒽环化合物[NH2-D]的残基；Z为羟基或如上所定义的式-NHR1的残基。
其残基为[NH-D]的氨基糖甙蒽环化合物用[NH2-D]代表，其中D指蒽环氨基糖甙减去糖片段的氨基所剩结构。
聚合物结合的蒽环化合物优选含有90-98mol%的式1单元、1-10mol%的式2单元和1-10mol%的式3单元。
肽基链在体内酶水解只使活性药物D-NH2释放，而单元3不受影响。
R1代表的适当烷基为被一个或多个羟基取代的C1-4烷基；例如羟乙基、2-羟丙基和3-羟丙基。
肽间隔基Y应易于细胞内水解，而可耐受细胞外水解。肽间隔基的长度可为1-10(例如2-4)个氨基酸残基。典型的肽间隔基为三肽或四肽。
组成肽间隔基Y的每个手性氨基酸残基可为D或L光学异构体，或D/L混合物。这里使用表示氨基酸的常规三字系统，其中这些符号表示手性氨基酸的L构型，除非另有说明。肽间隔基Y可以消旋混合物或光学纯异构体。
优选地，Y选自Gly-Phe-Gly、Gly-Leu-Gly、Phe-Leu-Gly、Gly-Phe-Leu-Gly、或Leu-Leu-Gly，每例中甘氨酸残基与氨基糖甙蒽环连结。
适宜的氨基糖甙蒽环残基[NH-D]为下式Q的蒽环氨基糖甙[NH2-D]的残基
其中，RⅠ和RⅡ之一为氢原子，另一个为羟基或碘；RⅢ为氢原子或OCH3，及RⅣ为氢原子或羟基。
蒽环氨基糖甙[NH2-D]的优选例为阿霉素、4’-表阿霉素、4’-去甲氧基柔红霉素、idarubicin和4’-碘、4’-去氧阿霉素。
本发明还提供聚合物结合的蒽环化合物A的制备方法，其中A主要由如上所定义的单元1、2和3组成。此方法包括ⅰ)聚合物中间体B，其中B基本由下式1和4的单元组成 其中式1中的X、n和R如上所定义，w为30-2mol%，R2为羟基或离去基团，与通式5的蒽环衍生物反应其中[NH-D]和Y如上所定义；及ⅱ)必要时，为制备其中式3单元中Z为NHR1的聚合物结合的蒽环化合物，将其中R2为离去基团的步骤ⅰ)的产物与式NH2R1化合物反应，其中R1如上所定义。
R2可代表的适宜的离去基团为苯环上被一个或多个吸电子基团取代的苯氧基。吸电子基团的适当例子包括硝基(-NO2)和卤原子。R2优选为下式离去基团 其中L为吸电子基团如-NO2或卤原子如氟或氯，及m为1-5的整数，特别是1-3，优选1-2。R2优选为对硝基苯氧基或2，4-二氯苯氧基。
由于其高亲脂性，式5化合物易于从式A的聚合物共轭体中分离出来。因此，如上所述，本发明聚合物结合的蒽环化合物的制备途径克服了传统的蒽环与聚合物缩合方法的主要缺点，即难于从聚合物共轭体中分出游离的蒽环化合物。
如上所定义，聚合物中间体B主要由单元1和4组成，其通过下式6和7的甲基丙烯酰化合物的自由基共聚合来制备
其中n、R1和R2如上所定义。
基本由单元1和4组成的一些聚合物是文献中已知的；例如聚合物B1，它由其中R1代表-CH2CH(OH)CH3，n=0的单元1和其中R2代表对硝基苯酚残基的单元4组成，通过N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺[6aR1=CH2CH(OH)CH3，n=0]与N-甲基丙烯酰甘氨酰对硝基苯基酯[7aR2=O-C6H4NO2]的自由基沉淀共聚合来制备，如 J.Kopecek，Makromol.Chem.178，2159(1977)中所述。其中R2代表羟基的由单元1和4组成的聚合物中间体可通过自由基均聚合来制备。
式6和7的一些单体为已知的。其中n=0及R1为带有仲羟基的烷基的式6化合物，一般通过甲基丙烯酰氯与带有仲羟基的脂肪胺反应来制备。另一方面，其中n=0及R1为含伯羟基的烷基的式6化合物，可从甲基丙烯酸和氨基化合物在缩合剂如1-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉存在下制得。
本发明的另一方面是肽基-蒽环衍生物。它们的制备方法是已知的。例如，因为适当的N-保护的肽与蒽环反应很重要，反以一定要选择在对蒽环稳定的条件下能够被除去的肽基N-保护基，例如三苯甲基。
式5的肽基蒽环衍生物可通过下述方法制备，它包括(ⅰ)式8或9的N-保护的肽
其中R3为对酸敏感的氨基保护基，P为离去基团，Y为如上所定义的氨基酸残基或肽间隔基，与如上所定义的蒽环氨基糖甙[NH2-D]反应，生成通式10的中间体
其中[NH-D]、Y和R3如上所定义；及(ⅱ)除去保护基R3，生成游离碱形式的肽基-蒽环衍生物5。
P可为如上R2中所定义和例举的离去集团。另外，P可为五氟苯氧基或N-羟基-琥珀酰亚氨基。对酸敏感的保护基R3的例子包括三苯甲基和二苯基氨基。
式8和9的肽基衍生物根据有关肽文献中已知的标准合成步骤来制备。用酸敏感基团如三苯甲基保护氨基官能团典型地根据Theodoro-poulos等[J.Org.Chem.47，1324(1982)]来进行。设计制备化合物8，9和10的反应条件以避免消旋化；这样生成的肽基衍生物与起始氨基酸的构型相同。
为了制备式5的蒽环衍生物，化合物9可与蒽环化合物盐酸盐在无水极性溶剂如二甲基甲酰胺中，在等当量的有机碱如三乙胺存在下，例如在室温下反应15小时，生成式10中间体，通过色谱纯化并在例如75%的乙酸中在室温下脱保护，得到式5衍生物。
应该注意，在C-14位带有羟基的蒽环如阿霉素和4’-表阿霉素以盐酸盐形式与式9肽基衍生物在有机碱存在下的以应，并需要在极性溶剂中将蒽环的3’-氨基脱保护，生成衍生物10和在糖片段的氨基和在C-14位都被取代的蒽环衍生物的混合物。通过色谱从此混合物中除去二(3’-N，14-O-肽基)衍生物。
还可以通过式8N-保护的肽与盐酸盐形式的蒽环化合物，在干燥的极性溶剂如二甲基亚砜中，在等当量的缩合剂如1-乙氧基-羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉存在下反应来制备式10化合物。此步骤不会产生C-14位带有羟基的蒽环化合物的双肽基衍生物。
中间体B与式5的肽基蒽环衍生物缩合，然后任选地替换剩余的离去基团，生成基本由单元1、2和3组成的聚合物结合的蒽环化合物。应该强调的是此步骤避免了伯羟基与侧链甘氨酰活化酯之间形成酯键。
如上所定义的，其中单元3的Z残基代表式NHR1的基团的式A聚合物结合的药物，优选通过其中R2为如上所定义的离去基团的中间体B与式5蒽环衍生物，在无水极性溶剂如二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中反应来制备。此反应典型地在8-24小时内完成。该反应典型地在15-30℃温度范围内进行，优选在室温进行15小时，然后通过其共轭体与如上所定义的式NH2R1化合物在室温反应0.5-3小时，以置换剩余的离去基团。
其中单元2的残基Z代表羟基的式A聚合物结合药物，优选通过其中R2为羟基的中间体B与式5蒽环衍生物，在无水极性有机溶剂如二甲基甲酰胺或二甲亚砜中反应来制备。此反应典型地在8-24小时内完成。此反应典型地在15-30℃温度下进行，优选在室温下进行15小时。
例如，为了制备其中Z为残基NHR1(如上所定义)的聚合物结合蒽环衍生物，其中R2为离去基团如对硝基苯氧基的中间体B用肽基蒽环5在室温下处理15小时。适当地使用14%w/v的B和2.3%w/v的5。然后典型地加入0.1%w/v的式NH2R1化合物(如上所定义)反应混合物在室温保持3小时。用丙酮沉淀此共轭体，用绝对乙醇溶解，典型浓度为8%(w/w)，再用丙酮沉淀，得到目标聚合物结合蒽环衍生物。
在上述方法中避免了在C-14羟基化的蒽环化合物与侧链甘氨酰活化酯之间形成酯键，这是因为在此缩合步骤中没有任何有机碱存在。
又如，为了制备其中Z为羟基的聚合物结合蒽环A，其中R2为羟基的中间体B(如上所定义)在无水二甲亚砜中，用肽基蒽环化合物5在室温下处理15小时。适当地使用14%w/v的B和2.3%w/v的5。用丙酮沉淀此共轭体，溶于绝对乙醇中，其典型浓度为8%(w/w)，再用丙酮沉淀，得到如上所定义的式A聚合物结合的蒽环衍生物。
共轭体A的蒽环含量通过分析酸水解后从结合的蒽环中释放出来的糖苷配基来测定；这样，亚德里亚霉醌(driamycinone)为阿霉素和4’-表阿霉素的糖甘配基片段，4-去甲氧基柔毛霉醌为4-去甲氧基柔红霉素的糖苷配基。
本发明的聚合物结合的蒽环化合物具有良好的水溶性、生物相容性、在生理PH下的稳定性，在与溶酶体酶孵育后释放游离活性药物，D-NH2。
式A化合物在实验模型中显示抗肿瘤活性增强，并且与游离蒽环化合物相比全身毒性降低。
式A的聚合物结合的蒽环化合物具有抗肿瘤活性。因此可用包括服用治疗有效量的式A聚合物结合的蒽环化合物的方法来治疗人或动物。病人或动物的状况可因此得到改善。
所采用的剂量范围取决于给药途径和欲治疗病人的年龄、体重和状态。式A的聚合物结合的蒽环化合物典型地通过非胃肠内给药，例如肌内注射、静脉注射或大团输注。适宜的剂量范围为5-800mg/m2蒽环当量，例如20-500mg/m2。适宜的原则是将25mg蒽环当量/m2的溶液静脉给药，体积为10ml/kg体重，给药周期2周，时间为第5、9和15天。
式A的聚合物结合的蒽环化合物可与药用载体或稀释剂一起配制成药物组合物。一般将此聚合物结合的蒽环化合物配制成用于非胃肠内给药的剂型，例如溶解于无菌水或注射用水中。
下列实施例进一步说明本发明。
实施例1-6涉及制备式6和7的单体及中间体B的合成步骤。
实施例1[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]2-羟基丙胺(6b) 按照Makromol.Chem.178，2159(1977)中所述方法制得的甲基丙烯酰甘氨酰对硝基苯基酯(7a5.28g，20mmol)，溶解在无水四氢呋喃(20ml)中，用1-氨基-2-羟基丙烷(3.2ml，40mmol)处理。室温下20分钟后，减压除去溶剂，用丙酮/乙酸乙酯结晶后回收标题化合物6b(3.3g，收率82.5%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为二氯甲烷/丙酮(体积比90∶10)Rf=0.47实施例2[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]-羟乙胺(6c)
搅拌下向1-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(37g，0.15mol)和氨基乙醇(9.75g，0.15mol)在无水甲苯(150ml)中的混合物中，15分钟内滴加溶于无水甲苯(300ml)中的甲基丙烯酸(14ml，0.165mol)。在室温下搅拌反应混合物24小时。用正己烷沉淀后回收到标题化合物6c。在Kiesegel板F254(Merck)上的TLC，洗脱系统为二氯甲烷/丙酮(体积比90∶10)，Rf=0.35。
实施例3[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]2，3-二氯苯基酯(7b) 从如Makromol.chem.178，2159(1977)中所述制得的甲基丙烯酰甘氨酸(2.66g，20mmol)和2，4-二氯苯酚在无水四氢呋喃(50ml)中，在DCC(4.2g，21mmol)存在下制得标题化合物7b。化合物7b(4.7g，收率80%)从乙酸乙酯和正己烷中结晶。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为乙醚，Rf=0.47。
实施例4N-甲基丙烯酰胺-2-羟基丙烷和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(B2)
将N-甲基丙烯酰胺-2-羟基丙烷(25.2g，0.18mol)、甲基丙烯酰甘氨酸(2.86g，20mmol)和α，α’-偶氮(二)异丁腈(5.9g)溶解在无水甲醇(164ml)中。混合物在60℃、氮气下保持20小时，然后搅拌下将反应混合物加入丙酮(2000ml)中。收集沉淀，用丙酮洗涤，干燥至恒重，得到标题聚合物B2(26g)。羧基含量(w)10mol%。
实施例5[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]L-羟基丙胺和N-(甲基丙烯酰甘氨酰)2，4-二氯苯基酯的共聚物(B3) 如Mdkromol.Chem.178，2159(1977)中所述，化合物6b(14.4g，72mmol)和化合物7b(5.19g，18mmol)在无水丙酮(300ml)中在α，α’-偶氮(二)异丁腈(1g，6mmol)存在下聚合为标题化合物B3。从反应混合物中过滤回收聚合物，溶解在绝对乙醇中并用丙酮再沉淀。氯含量计算值6.89mol%，实测值2.84mol%(w)。
实施例6[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]-羟乙胺和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(B4) 如实施例2中所述，从N-甲基丙烯酰胺-2-羟乙烷(6c23.2g，0.18mol)、甲基丙烯酰甘氨酸(2.86g，20mmol)和α，α’-偶氮(二)异丁腈(5.9g)在无水甲醇(164ml)中制备标题聚合物中间体B4。羧基含量(w)10%。
实施例7-12涉及制备式5的肽基-蒽环化合物的方法。
实施例7N-三苯甲基-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰4-硝基苯基酯将如J.Org.Chem，47，1324(1982)中所述制得的N-三苯甲基-L-苯丙氨酸(20.3g，50mmol)溶解在无水四氢呋喃(150ml)中，并加入无水N-羟基苯并三唑(8gr)。将此混合物冷却至0℃并用1，3-二环己基碳化二亚胺(11.7gr，50mmol)处理，10分钟后，滴加L-亮氨酰甘氨酸乙酯对甲苯磺酸盐(20g，50mmol)在无水四氢呋喃(100ml)和N-甲基吗啉(7ml)的混合物中的溶液。反应混合物在0℃下保持1小时，再在室温下过夜，然后过滤，减压除去溶剂。粗品用乙酸乙酯溶解，依次用冷的5%柠檬酸水溶液(3×100ml)、冷的5%碳酸氢钠水溶液和水洗涤，然后浓缩，在硅胶上层析，用二氯甲烷和甲醇的混合物(体积比99∶1)洗脱，得到N-三苯甲基-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰丙氨酸乙酯(18g，30mmol)，后者在95%乙醇(400ml)中室温下用1N氢氧化钠(30ml)处理2小时。转化为相应的酸8a(17g)。
在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为二氯甲烷/甲醇(体积比80∶20)，Rf=0.53。
1H-NMR(200 MHz，CDCl3)0.88(d，J=5.9Hz，6H，δ+δ′Leu);1.2-1.6(m，3H，B+_Leu);2.00(dd，J=5.7Hz，J=13.4Hz，1H，BPhe);2.83(dd，J=5.2Hz，J=13.4Hz，1H，B′Phe);3.51(t，J=5.4，1H，aPhe);3.99(d，J=4.4Hz，2H，a+a′Gly);4.55(m，1H，aLeu);6.8-7.4(m，22H，NHgly，NHLeu，4-C6H5).
将化合物8a溶解在无水四氢呋喃(450ml)中，并加入对硝基苯酚(5.5g，40mmol)。混合物被冷却至0℃，滴加1，3-二环己基碳化二亚胺(8.24g，40mmol)，4℃下保持过夜。然后过滤混合物并减压除去溶剂。将残余物溶解在乙酸乙酯中，冷却至0℃。一小时后过滤此混合物并除去溶剂，从乙醚中结晶后得到标题化合物9a(20g，收率97%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为乙醚Rf=0.80。
FD-MSm/z699[M+H]+1H-NMR(200MHz，CDCl3)0.86(d，J=6.2Hz，3H，δLeu);0.88(d，J=6.4Hz，3H，δ′Leu);1.2-1.8(m，3H，B+_Leu);1.90(dd，J=5.9Hz，J=13.5Hz，1H，BPhe);2.89(dd，J=4.6Hz，J=13.5Hz，1H，B′Phe);3.52(dd，J=4.6Hz，J=5.9Hz，1H，aPhe);4.0-4.4(m，3H，aLeu，a+a′Gly);6.78(t，J=5.7Hz，1H，NHGly);7.04(d，J=7.7Hz，1H，NHLeu);6.8-7.4(m，22Hz，4-C6H5and 2，6 COO NO2);8.25(m，2H，5，5 COO NO2).
实施例8N-三苯甲基-甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰对硝基苯基酯如实施例7所述方法制备的中间体N-三苯甲基-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酸乙酯(6g，10mmol)，在室温下用75%乙酸水溶液处理一小时，得到L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰乙酯，后者与N-三苯甲基-甘氨酸(3g，10mmol)在N-羟基苯并三唑和1，3-二环己基碳化二亚胺存在下缩合，然后水解并用对硝基酚以如实施例7的方法活化，得到标题化合物9b(3.8g，收率50%)。在Kiesel-gel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为乙醚Rf=0.63。FD-MSm/g755[M+H]+。
实施例93’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5a) 溶解于无水二甲基甲酰胺(50ml)和三乙胺(0.5ml)中的阿霉素盐酸盐，与如实施例7所述方法制备的N-三苯甲基-丙氨酰亮氨酰甘氨酰对硝基苯基酯(9a3.5g，5mmol)反应。反应混合物在室温下保持过夜，然后用乙醚和正己烷1∶1的混合物沉淀。固体通过硅胶柱纯化，用二氯甲烷和甲醇(体积比98∶2)的混合物洗脱，得到N-保护的肽基阿霉素10a(4.6g)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为二氯甲烷/甲醇(体积比95∶5)Rf=0.35。
FD-MSm/g1103[M+H]+化合物10a用75%乙酸水溶液(250ml)在室温下溶解一小时，然后用水和二氯甲烷的1∶1混合物(2500ml)稀释，用固体碳酸氢钠调PH到7。分离有机相，减压除去溶剂，得到标题化合物5a(3.45g，收率80%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，用二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(体积比80∶20∶7∶3)展开。
R=0.5.FD-MS:m/z 861[M+H]+1H-NMR(400MHz，DMSO)0.80(d，J=6.4Hz，3H，δLeu);0.83(d，J=6.4Hz，3H，δ′Leu);1.10(d，J=6.8Hz，3H，6′CH3);1.3-1.6(m，4H，B+_Leu and 2′eqH);1.83(ddd，J=2.8Hz，J=13.2Hz，J=13.2Hz，1H，2′axH);2.09(dd，J=6.0Hz，J=14.5Hz，1H，8axH);2.18(d，J=14.5Hz，1H，8-eq);2.8-3.2(m，4H，10CH2and BPhe);3.36(m，1H，4′);3.64(m，2H，aGly);3.95(s，3H，OCH3);3.9-4.1(m，2H，3′and aPhe);4.15(q，J=6.4Hz，1H，5′H);4.29(q，J=7.7Hz，1H，aLeu);4.55(s，2H，14CH2);4.7-5.0(m，3H，7H and 4′OH and 14OH);5.20(d，J=3.4Hz，1H，1′H);5.46(s，1H，9OH);7.1-7.3(m，5H，Ar-Phe);7.54(d，J=8.5Hz，1H，3′NH);7.63(m，1H，3H);7.88(m，2H，1H and 2H);8.17(m，4H，NH+and NHGly);8.70(d，J=8.1Hz，1H，NHLeu);13.23(s，1H，11OH);14.00(s，1H，6OH).
实施例103’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰甘氨酰)阿霉素(5b)
将盐酸阿霉素(2.9g，5mmol)与如实施例8所制备的N-三苯甲基-甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰对硝基苯基酯(9b3.8g，5mmol)反应，然后如实施例9所述用75%乙酸水溶液处理，得到标题化合物5b(4g，收率90%)。
在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，用二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(体积比80∶20∶7∶3)展开，Rf=0.44，FD-MSm/g938[M+H]+实施例114-去甲氧基-3’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)柔红霉素(5c) 采用实施例9中指述的相同步骤，从4-脱甲氧基柔红霉素盐酸盐(2.9g，5mmol)和N-三苯甲基-苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰对硝基苯基酯(9a3.5g，5mmol)制备了标题化合物5c(3g，收率75%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(体积比80∶20∶7∶3)展开，Rf=0.51。
FD-MS:m/z 815[M+H]+1H-NMR(200 MHz，CDCl3)0.84(d，J=6.0Hz，3H，δLeu);0.88(d，J=6.0Hz，3H，δ′Leu);1.27(d，J=6.4Hz，3H，6′CH3);1.4-1.7(m，3H，B+Leu);1.7-2.0(m，2H，2′CH2);2.06(dd，J=4.2H，J=14.9Hz，1H，8axH);2.32(d，J=14.9Hz，1H，8eqH);2.40(s，3H，COCH3);2.70(dd，J=8.6Hz，J=13Hz，1H，BPhe);3.12(dd，J=4.2Hz，J=13.7Hz，1H，B′Phe);2.94，3.23(two d，J=19.2Hz，2H，10CH2);3.5-3.8(m，3H，4′H，aPhe and aGly);3.9-4.3(m，4H，a′Gly，aLeu，5′H，3′H);5.19(m，1H，7H);5.45(d，J=2.7Hz，1H，1′H);6.9-8.4(m，12H，1H，2H，3H，4H，ArPhe，3′NH，NHGly，NHLeu).
实施例124’-表-3’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5d) 用实施例9中描述的相同步骤，从4’-表阿霉素盐酸盐(2.9g，5mmol)和N-三苯甲基-苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰对硝基苯基酯(9a3.5g，5mmol)制备了标题化合物5d(3.25g，收率86%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展开系统为二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(体积比80∶20∶7∶3)展开，Rf=0.46，FD-MSm/g861[M+H]+。
1H-NMR(400 MHz，DMSO)0.79(d，J=6.3Hz，3H，δLeu);0.81(d，J=6.3Hz，3H，δ′Leu);1.19(d，J=5.9Hz，3H，6′CH3);1.3-1.6(m，4H，2′Hax，B，B′Leu，_Leu);1.82(dd，J=4.7Hz，J=12.5Hz，1H，2′Heq);2.1-2.3(m，2H，8-CH2);2.59(dd，J=8.2Hz，J=13.7Hz，1H，BPhe);2.9-3.1(m，4H，B′Phe，10-CH2，h′H);3.41(dd，4.7Hz，J=8.2Hz，aPhe);3.54(dd，J=5.5Hz，J=16.4Hz，1H，aGly);3.67(dd，J=6.2Hz，J=16.4Hz，1H，a′Gly);3.80(m，1H，3′H);3.90(m，1H，5′H);3.95(s，3H，OCH3);4.18(m，1H，aLeu);4.55(m，2H，14-CH2);4.3-5.0(m，3H，14-OH，7H，4′-OH);5.17(d，J=3.1Hz，1H，1′H);5.46(s，1H，9-OH);7.1-7.3(m，5H，Ar-Phe);7.53(d，J=8.2Hz，1H，NH-Gly);7.60(m，1H，3H);7.86(m，2H，1H，2H);8.05(d，J=6.4Hz，1H，NH-Leu);8.11(t，J=5.9Hz，1H，NH-Gly).
实施例133-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(A1)
将如实施例4中所述方法制备的聚合物前体B2(7.15g，5mmol的-COOH)、和3’-N-(甘氨酰-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5a2.36g，2.5mmol)溶解在无水二甲基甲酰胺(100ml)中，然后加入N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(0.7g，2.5mmol)。搅拌下，混合物在室温保持24小时，然后倾入乙醚(800ml)中。沉淀用乙醇(100ml)溶解，再用丙酮(800ml)沉淀，干燥至恒重，得到标题化合物A1(7g)。盐酸阿霉素含量9%(w/w)。
实施例143-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和(N-甲基丙烯酰甘氨酰)2-羟基丙胺的共聚物(A2)
按Makromal.chem.178，2159(1977)中所述方法制备的聚合物前体B1(10g，2.7×10-3当量的对硝基苯基酯)，溶解在干燥的二甲基甲酰胺(60ml)中，加入3’-N-(甘氨酰-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5a0.53g，1.72mmol)。搅拌下混合物在室温保持24小时，然后加入1-氨基丙醇(0.13ml)。一小时后，将反应混合物中加入搅拌下的丙酮/乙醚(体积比3/1，1.21)的混合物中，并过滤。沉淀用乙醇(150ml)溶解，用丙酮/乙醚(1.21，体积比4/1)沉淀，得到式A2的聚合物10g。盐酸阿霉素含量9%(w/w)。实施例13-18说明制备式A的聚合物结合的蒽环衍生物的步骤。
实施例153-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、4-去甲氧基-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)柔红霉素和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(A3)
如实施例13，4-去甲氧基-3’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)柔红霉素(5d1.48g，1.72mmol)与聚合物前体132(10g)在N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(0.48g)存在下，在无水二甲基甲酰胺中反应，得到标题化合物A3。
4-去甲氧基柔红霉素盐酸盐含量9%(w/w)。
实施例163-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、4’-表-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和1-N-(甲基丙烯酰甘氨酰)-2-羟基丙烷的共聚物(A4)
如实施例14，4’-表-3’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5e1.48g，1.72mmol)与聚合物前体B1反应，然后与1-氨基丙醇(0.13ml)反应，得到式A4的4’-表-阿霉素聚合物共轭体(10g)。4’-表阿霉素盐酸盐含量9%(W/W)。
实施例173-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、4’-表-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(A5)
如实施例13，从聚合物中间体B2、4’-表-3’-N-(甘氨酰亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5e)和N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉在无水二甲基甲酰胺中反应，制备了标题化合物。
实施例18[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]-羟基乙胺、3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(A6)
如实施例13所述方法，通过聚合物中间体B4和3’-N-(甘氨酰-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5e)，在N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉存在下，在无水二甲基甲酰胺中缩合，制备了标题化合物聚合物前药A6。
实施例19化合物A1对M5076的抗肿瘤活性实施例13描述的A1的抗肿瘤活性测试如下材料和方法1.给药所有药物溶液都在使用前即时制备。在第5、9和15天静脉内给药10ml/kg体重，进行治疗。蒽环化合物溶解在无菌水中，用分光光度法测定其浓度。冷干的聚合物溶解在水中形成25mg蒽环当量/ml的起始溶液，根据所报导的浓度，用水进行进一步稀释。
2.实体瘤通过系列肌内通道得到M5076鼠网状肉瘤，并皮下植入(5×105细胞/鼠)(75B1/6鼠以评估对原发肿瘤的活性。
3.测定抗肿瘤活性和毒性肿瘤生长用测经器测量，肿瘤重用Geran等的方法估测，见Cancerchemother.Rep.3，1(1972)。
抗肿瘤活性用肿瘤重达到一克所需时间(天)来测定，报告为肿瘤生长延迟(TGD)。
用下式计算存活时间的平均增长值(T/C%)T/C%= (治疗组的平均存活时间)/(对照组的平均存活时间) ×100在体重减小、肉眼观察和手触摸到的肝脾缩小来评价毒性。神经毒性用丧失运动机能的鼠的数目来测定。
结果列于表1中表1化合物剂量1TDG2A.U.C T.C.3Tox4LTS5无肿瘤者6mg/kg(1g)抑制率%%对照--150/100/10阿霉素7.535901480/260/260/2610.0391001533/260/260/26A130.0801003780/104/103/1040.0nd100>3690/106/105/1050.0nd100>3692/10*7/107/10
皮下注射5×105个细胞/鼠nd=未测定*神经毒性1在第5、9、15天给药治疗2TDG=肿瘤增长延迟3被治疗鼠的平均存活时间/对照组的平均存活时间×1004中毒死亡数目/鼠总数5长时间存活者6实验结束时无肿瘤的鼠实施例20化合物A3对M7076的抗肿瘤活性用实施例19的方法和材料测试实施例15描述的A3的抗肿瘤活性。结果示于表2中
表2化合物剂量1TDG2A.U.C T.C.3Tox4LTS5无肿瘤者6mg/kg(1g)抑制率%%对照--150/100/104-去甲氧1.019471420/90/90/9基柔红霉素1.528801600/90/90/9A34.0491001980/100/100/105.0501002050/100/100/106.0551002120/90/90/9皮下注射5×105个细胞/鼠*神经毒性1在第5、9、15天给药治疗2TDG=肿瘤增长延迟3被治疗鼠的平均存活时间/对照组的平均存活时间×1004中毒死亡数目/鼠总数5长期存活者
6实验结束时无肿瘤的鼠化合物A4(3-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、4’-表-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和1-N-(甲基丙烯酰甘氨酰)-2-羟基丙烷的共聚物)的抗肿瘤活性与4’-表阿霉素盐酸盐比较对4’-表阿霉素盐酸盐和化合物4用相同的处理方法，测试其抗肿瘤活性。
对早期M5076鼠网状肉瘤，化合物4在所有试验剂量下都比游离药物活性高(表3)表3.化合物4与4’-表阿霉素盐酸盐相比，对M5076鼠网状肉瘤的抗肿瘤活性。
化合物剂量1TDG2A.U.C. T.C.3TOX4mg/kg(1g)抑制率%%4'-表阿霉522511050/9素盐酸盐7.534901240/91040991250/9A410621001900/920621002190/930711002290/9皮下注射5×105个细胞/鼠1在第5、9、15天给药治疗2TDG=肿瘤增长延迟3被治疗鼠的平均存活时间/对照组的平均存活时间×1004中毒死亡数目/鼠总数化合物4-(3-甲基丙烯酰氨基-2-羟基丙烷、4’-表-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和1-N-(甲基丙烯酰甘氨酰)-2-羟基丙烷的共聚物)的毒性与4’-表阿霉素盐酸盐比较对健康的C57B1F鼠静脉给以单一剂量的4’-表阿霉素盐酸盐(13.2-16.15-19-20.6-25.2和33.2mg/kg)和化合物A4(50-63-79-100-120-140mg/kg)来评价其毒性。
恢复三周后进行Probit分析，以确定在健康C57 B1F鼠体的LD10和LD50。
用下式计算治疗指数治疗指数= (DE50(半数有效量))/(LD50(半数致死量))半数有效量为使肿瘤生长减少50%的剂量。观察90天内动物的安全性。
在C57 B1/F鼠中的LD10和LD50值如下化合物 LD10LD50(mg/kg)(mg/kg)4'-表阿霉素盐酸盐16.421.4A4128.0389(外推值)化合物A4的低毒性允许给药剂量更大，达到与4’-表阿霉素盐酸盐等同更好的效果，得到更好的治疗指数。4’-表阿霉素盐酸盐和化合物A4的治疗指数分别为3和40。
权利要求
1.式A的聚合物结合的蒽环化合物，其基本由式1、2和3代表的三个单元组成 其中Gly代表甘氨酸；n为0或1；x为70-98mol%，y为1-29mol%，z为1-29mol%，R1为被一个或多个羟基取代的C1-6烷基；Y为氨基酸残基或肽间隔基；[NH-D]为蒽环氨基糖甙[NH2-D]的残基；及Z为羟基或式-NHR1的残基，其中R1如上所定义。
2.根据权利要求1的聚合物结合的蒽环化合物，其中[NH-D]为下式Q的蒽环氨基糖甙的残基 其中RⅠ和RⅡ之一为氢原子，另一个为羟基或碘原子，RⅢ为氢原子OCH3，RⅣ为氢原子或羟基。
3.根据权利要求1或2的聚合物结合的蒽环化合物，其中x为90-98mol%，y为1-10mol%，z为1-10mol%。
4.根据权利要求1、2或3的聚合物结合的蒽环化合物，其中R1为羟乙基、2-羟丙基或3-羟丙基。
5.根据前述权利要求中任一项的聚合物结合的蒽环化合物，其中Y为Gly-Phe-Gly、Gly-Leu-Gly、Phe-Leu-Gly、Gly-Phe-Leu-Gly、或Leu-Leu-Gly。
6.根据前述权利要求中任一项的聚合物结合的蒽环化合物，其中[NH-D]为阿霉素、4’-表阿霉素、4’-去甲氧基-柔红霉素、idarubicin或4’-碘、4’-脱氧阿霉素的残基。
7.权利要求1中定义的式A聚合物结合的蒽环化合物的制备方法，该方法包括ⅰ)聚合物中间体B，其中B基本由下式1和4的单元组成 其中式1中x、n和R1如权利要求1中所定义，W为30-2mol%，R2为羟基或离去基团；与通式5的蒽环衍生物反应其中[NH-D]和Y如权利要求1中所定义；和ⅱ)必要时为制备其中式3的单元中Z为-NHR1的聚合物结合的蒽环化合物，将其中R2为离去基团的ⅰ)步的产品与式NH2R1的化合物反应，其中R1如上所定义。
8.式5的蒽环衍生物其中[NH-D]和Y如权利要求1或2中所定义。
9.如权利要求8所定义的式5的蒽环衍生物的制备方法，该方法包括(ⅰ)式8和9的N-保护的肽其中R3为对酸敏感的氨基保护基，P为离去基团，Y如权利要求7中所定义，与蒽环衍生物[NH2-D]反应，生成通式10的中间体。其中[NH-D]如权利要求1或2中所定义，Y和R3如上所定义，及ⅱ)除去保护基R3，得到游离碱形式的肽基-蒽环衍生物5。
10.药物组合物，其含有药用载体或稀释剂，和作为活性成分的权利要求1-6中任一项要求的聚合物结合的蒽环化合物或权利要求8所要求的式5的蒽环衍生物。
全文摘要
本发明提供式A的聚合物结合的蒽环衍生物，其基本由式1、2和3代表的三个单元组成，其中Gly为甘氨酸；n为0或1；x为70—98mol％；y为1—29mol％；z为1—29mol％，R
文档编号C07K5/107GK1108454SQ94190242
公开日1995年9月13日 申请日期1994年4月8日 优先权日1993年5月11日
发明者F·安吉勤克, M·格兰迪, A·苏拉托 申请人:法米塔利亚·卡洛·埃巴有限责任公司
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