商标分类 
商标转让 
您当前的位置： 失活无脂质被膜病毒的方法
2021-02-01 09:02:53|
287|
起点商标网 专利名称：失活无脂质被膜病毒的方法
本申请的主题是失活存在于源自血液、血浆或类似天然来源物的含蛋白质组合物中的无脂质被膜病毒的方法。
EP0131740B1公开了失活含不稳定蛋白质之组合物中病毒的方法。待失活的病毒含有脂质，并特别可具有脂质被膜。待除去的含脂质病毒的组合物得自天然来源物，所说的天然来源物可选自全血、血浆、血浆浓缩物、这些血浆的任何分级分离部分的沉淀物、这些血浆的任何分级分离部分的上清液、血清、冷沉淀物、细胞溶胞产物、血细胞中诱生的蛋白质、并非衍生于血液的正常细胞或肿瘤细胞的产物、或基因切接过程的产物。EP0131740B1中记载的方法在于，使含有不稳定蛋白质的组合物与有效量的磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯接触一段足够长的时间，以使含不稳定蛋白质的组合物中没有含脂质病毒而又不造成蛋白质的实质性变性。上述失活含脂质病毒的方法可与在50至70℃下加热至少5小时的加温处理步骤相结合。
但在上述类型的制品中，格外重要的是，也要失活那些不含任何脂质的病毒，特别是无脂质被膜病毒。据EP0131740B1认为是不含质脂病毒的那类非脂质被膜病毒包括甲型肝类病毒、细小病毒如细小病毒B19，以及脊髓灰质炎病毒。这些病毒可作为病原体存在于血液、血浆、血清、冷沉淀物、细胞溶胞产物及类似天然来源物中。
本发明的目的是提供一种允许失活不含脂质被膜或只含很少脂质并存在于某些制品中之病毒的方法。属于这样的制品之列的尤其是来源于全血、血浆、血浆浓缩物、这些血浆的任何分级分离部分的沉淀物、这些血浆的任何分级分离部分的上清液、血清、冷沉淀物、细胞溶胞产物、或其他类似天然来源物的含不稳定性蛋白质的组合物。
令人惊奇的是，这一目的可用一种失活存在于含蛋白质并来源于血液、血浆或类似天然来源物的组合物中病毒，特别是那些无脂质被膜的病毒的方法而实现的，在所述方法中，同时或相继地用有效量的磷酸二烷基或三烷基酯和必要时的润湿剂，在55℃至67℃范围的加温条件下将所述来源物处理5至30小时。
磷酸二烷基或三烷基酯的量优选在0.001％至1％之间。为实施该方法，温度以调节在60℃至65℃为佳。加温处理时间以至少10小时为佳。
其中不含脂质的病毒应予失活的蛋白质分级分离部分尤其来源于上述各种类型的天然来源物，并且尤可在失活反应之前用沉淀法或色谱分离法富集相应的蛋白质。
业经证明，在富集蛋白质时，使用如EP0367840A1中所述的色谱分离法来富集蛋白质分级分离部分是特别可行的。色谱分离时，首先对提供蛋白质的天然来源物经进行阴离子交换色谱分离。已证明用二乙氨基乙烯基团改性的色谱分析底物材料是特别有用的。
然后，经加温处理和用磷酸二烷基或三烷基酯处理，对天然来源物或从天然来源物中富集起来的分级分离部分进行上述病毒失活方法。
业经证实，在润湿剂存在下用磷酸二烷基或三烷基酯进行所述处理是有利的。可用的磷酸烷基酯特别是EP0131740B1中提到的磷酸酯，例如包括有含1至10个碳原子，尤其是含2到10个碳原子的烷基的磷酸二烷基酯或三烷基酯。尤其可用诸如磷酸三正丁酯、磷酸三叔丁酯、磷酸三正己酯、磷酸三(2-乙基己基)酯及磷酸三正癸酯之类的磷酸三烷基酯。混合的磷酸三烷基酯也是适用的。类似地，也可以使用取代的相应磷酸二烷基酯或者相应磷酸二烷基或三烷基酯的混合物。
润湿剂尤可使用无毒的洗涤剂。应以至少0.1％(重量)的量存在的非离子型洗涤剂，可列举下列衍生物脂肪酸的聚氧乙烯衍生物、山梨醇酐的偏酯，例如已知商品名为吐温80、吐温20和多乙氧基醚80的产品，以及油溶性非离子型润湿剂，特别是己知商品名为TritonX100(乙氧基化的烷基苯酚)的产品。也可以使用两性离子试剂，例如磺基甜菜碱类(Sulfobetaine)，如N-十二烷基-N，N-二甲基-2-铵基(ammonio)-1-乙磺酸盐或其衍生物，或者非离子型洗涤剂如辛基-β-D-吡喃葡糖苷。润湿剂的量优选为0.01％至10％。
特别优选的是结合使用磷酸三正丁酯和吐温，或胆酸钠/TNBP(磷酸三正丁酯)。
证实有利的是，在蔗糖、山梨醇或短链中性氨基酸之类的辅助物质存在下，在加温下进行该处理。原则上，可以以所述量使用EP0018561和/或DE4001451A1中提到的稳定化因子。辅助物质(稳定化因子)的浓度可以很高，例如蔗糖浓度优选至多达200％(重量)。短链氨基酸可以尤其使用甘氨酸、赖氨酸和/或精氨酸。
已出乎预料地证实的是，在加温下即使不加入钙离子亦可进行对来源于血液、血浆或类似天然来源物的含蛋白质组合物的处理。在EP0106269中，认为必须加入钙离子。因此，EP0106269公开了在其中所述的巴氏消毒处理法中用Ca2+稳定抗血友病冷沉淀物分级分离部分。而根据本发明这是不必要的。
即使在加温下，用磷酸二烷基或三烷基酯处理后，也可接着进行色谱分离纯化步骤。该色谱分离纯化步骤优选在阴离子交换材料，如DEAE改性的离子交换树脂上进行。pH值应在6至8.5范围内。
以此方法富集或得到的医药上有价值的蛋白质，如因子VIII、因子IX、血纤维蛋白原、r-球蛋白等不含甲型肝类病毒、细小病毒如细小病毒B19，或脊髓灰质炎病毒这类活性病毒。
下面用失活因子VIII制品中无脂质病毒的实施例来更为详细地阐明本发明的方法。
实施例1将商业上通用的冷沉淀物加到装有Fractogel-DEAE-树脂的柱上。收集洗脱液并检查因子VIII活性。然后，用含有110mM氯化钠、10mM柠檬酸钠×5H2O、120mM甘氨酸、1mM氯化钙×2H2O，pH为6.9至7.0(用1M HCl调pH)的缓冲液洗柱。然后，再用组成如下的缓冲液处理柱250mM氯化钠、20mM柠檬酸钠×5H2O、80mM甘氨酸、16mM赖氨酸、2.5mM氯化钙×2H2O，pH为6.9至7.0。
向如此得到的分级分离部分中加入蔗糖。然后，加入磷酸三正丁酯/吐温(0.1％/0.3％)并于64℃保持12小时。继之再在TSK-Fractogel0-DEAE或EMD-Fractogel-TMAE柱上进行离子交换色谱分离。
用含有250mM氯化钠、20mM柠檬酸钠×5H2O、80mM甘氨酸、16mM赖氨酸、2.5mM氯化钙×2H2O的缓冲液洗脱因子VIII活性馏份。
实施例2通过在加温处理前，缓冲液(洗涤缓冲液和洗脱缓冲液)中未加含钙化合物的情况下，按实施例1中所述方法处理商业上通用的冷沉淀物，在没有钙离子的条件下进行病毒失活。然后，在未添加钙离子的情况下进行加温处理，再按实施例1中所述方法作进一步加工。
权利要求
1.失活存在于源自血液、血浆或类似天然来源物之含蛋白质组合物中的病毒，特别是无脂质被膜的病毒的方法，其中同时或相继用有效量磷酸二烷基或三烷基酯及必要时的润湿剂在55℃至67℃范围的加温条件下将所述来源物处理5小时至30小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述磷酸二烷基或三烷基酯的量在0.001％和1％之间。
3.根据权利要求1和/或2所述的方法，其中所述温度在60℃和65℃之间。
4.根据权利要求1至3中至少一项所述的方法，其中所述加温处理时间至少为10小时。
5.根据权利要求1至4中至少一项所述的方法，其中首先用色谱分离法或沉淀方法从所述天然来源物中富集所述蛋白质。
6.根据权利要求1至5中至少一项所述的方法，其中在用磷酸二烷基或三烷基酯处理并同时在加温下处理之前，加入辅助物质，例如蔗糖、山梨醇或短链中性氨基酸。
7.根据权利要求6的方法，其中所述蔗糖的浓度至多为200％(重量)。
8.根据权利要求6和/或7的方法，其中所述的氨基酸采用甘氨酸、赖氨酸和/或精氨酸。
9.根据权利要求1至8中至少一项所述的方法，其中所述加温处理在未添加钙离子条件下进行。
10.根据权利要求1至9中至少一项所述的方法，其中用所述磷酸二烷基或三烷基酯处理并同时加温处理之后接着再进行色谱分离法提纯步骤。
11.根据权利要求1至10中至少一项所述的方法，其中在所述以磷酸二烷基或三烷基酯和加温处理中，pH值为6.0至8.5。
全文摘要
失活存在于源自血液、血浆或类似天然来源物之含蛋白质组合物中的病毒，特别是无脂质被膜的病毒的方法，其中同时或相继以有效量磷酸二烷基或三烷基酯及必要时的润湿剂在55℃到67℃范围的加温条件下将所述来源物处理5小时至30小时。
文档编号C07K14/435GK1118144SQ94191261
公开日1996年3月6日 申请日期1994年2月5日 优先权日1993年2月9日
发明者M·施塔德勒, H·施温, D·纽西克, W·吉林格, F·巴尔 申请人:奥克塔法马有限公司
本申请的主题是失活存在于源自血液、血浆或类似天然来源物的含蛋白质组合物中的无脂质被膜病毒的方法。
EP0131740B1公开了失活含不稳定蛋白质之组合物中病毒的方法。待失活的病毒含有脂质，并特别可具有脂质被膜。待除去的含脂质病毒的组合物得自天然来源物，所说的天然来源物可选自全血、血浆、血浆浓缩物、这些血浆的任何分级分离部分的沉淀物、这些血浆的任何分级分离部分的上清液、血清、冷沉淀物、细胞溶胞产物、血细胞中诱生的蛋白质、并非衍生于血液的正常细胞或肿瘤细胞的产物、或基因切接过程的产物。EP0131740B1中记载的方法在于，使含有不稳定蛋白质的组合物与有效量的磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯接触一段足够长的时间，以使含不稳定蛋白质的组合物中没有含脂质病毒而又不造成蛋白质的实质性变性。上述失活含脂质病毒的方法可与在50至70℃下加热至少5小时的加温处理步骤相结合。
但在上述类型的制品中，格外重要的是，也要失活那些不含任何脂质的病毒，特别是无脂质被膜病毒。据EP0131740B1认为是不含质脂病毒的那类非脂质被膜病毒包括甲型肝类病毒、细小病毒如细小病毒B19，以及脊髓灰质炎病毒。这些病毒可作为病原体存在于血液、血浆、血清、冷沉淀物、细胞溶胞产物及类似天然来源物中。
本发明的目的是提供一种允许失活不含脂质被膜或只含很少脂质并存在于某些制品中之病毒的方法。属于这样的制品之列的尤其是来源于全血、血浆、血浆浓缩物、这些血浆的任何分级分离部分的沉淀物、这些血浆的任何分级分离部分的上清液、血清、冷沉淀物、细胞溶胞产物、或其他类似天然来源物的含不稳定性蛋白质的组合物。
令人惊奇的是，这一目的可用一种失活存在于含蛋白质并来源于血液、血浆或类似天然来源物的组合物中病毒，特别是那些无脂质被膜的病毒的方法而实现的，在所述方法中，同时或相继地用有效量的磷酸二烷基或三烷基酯和必要时的润湿剂，在55℃至67℃范围的加温条件下将所述来源物处理5至30小时。
磷酸二烷基或三烷基酯的量优选在0.001％至1％之间。为实施该方法，温度以调节在60℃至65℃为佳。加温处理时间以至少10小时为佳。
其中不含脂质的病毒应予失活的蛋白质分级分离部分尤其来源于上述各种类型的天然来源物，并且尤可在失活反应之前用沉淀法或色谱分离法富集相应的蛋白质。
业经证明，在富集蛋白质时，使用如EP0367840A1中所述的色谱分离法来富集蛋白质分级分离部分是特别可行的。色谱分离时，首先对提供蛋白质的天然来源物经进行阴离子交换色谱分离。已证明用二乙氨基乙烯基团改性的色谱分析底物材料是特别有用的。
然后，经加温处理和用磷酸二烷基或三烷基酯处理，对天然来源物或从天然来源物中富集起来的分级分离部分进行上述病毒失活方法。
业经证实，在润湿剂存在下用磷酸二烷基或三烷基酯进行所述处理是有利的。可用的磷酸烷基酯特别是EP0131740B1中提到的磷酸酯，例如包括有含1至10个碳原子，尤其是含2到10个碳原子的烷基的磷酸二烷基酯或三烷基酯。尤其可用诸如磷酸三正丁酯、磷酸三叔丁酯、磷酸三正己酯、磷酸三(2-乙基己基)酯及磷酸三正癸酯之类的磷酸三烷基酯。混合的磷酸三烷基酯也是适用的。类似地，也可以使用取代的相应磷酸二烷基酯或者相应磷酸二烷基或三烷基酯的混合物。
润湿剂尤可使用无毒的洗涤剂。应以至少0.1％(重量)的量存在的非离子型洗涤剂，可列举下列衍生物脂肪酸的聚氧乙烯衍生物、山梨醇酐的偏酯，例如已知商品名为吐温80、吐温20和多乙氧基醚80的产品，以及油溶性非离子型润湿剂，特别是己知商品名为TritonX100(乙氧基化的烷基苯酚)的产品。也可以使用两性离子试剂，例如磺基甜菜碱类(Sulfobetaine)，如N-十二烷基-N，N-二甲基-2-铵基(ammonio)-1-乙磺酸盐或其衍生物，或者非离子型洗涤剂如辛基-β-D-吡喃葡糖苷。润湿剂的量优选为0.01％至10％。
特别优选的是结合使用磷酸三正丁酯和吐温，或胆酸钠/TNBP(磷酸三正丁酯)。
证实有利的是，在蔗糖、山梨醇或短链中性氨基酸之类的辅助物质存在下，在加温下进行该处理。原则上，可以以所述量使用EP0018561和/或DE4001451A1中提到的稳定化因子。辅助物质(稳定化因子)的浓度可以很高，例如蔗糖浓度优选至多达200％(重量)。短链氨基酸可以尤其使用甘氨酸、赖氨酸和/或精氨酸。
已出乎预料地证实的是，在加温下即使不加入钙离子亦可进行对来源于血液、血浆或类似天然来源物的含蛋白质组合物的处理。在EP0106269中，认为必须加入钙离子。因此，EP0106269公开了在其中所述的巴氏消毒处理法中用Ca2+稳定抗血友病冷沉淀物分级分离部分。而根据本发明这是不必要的。
即使在加温下，用磷酸二烷基或三烷基酯处理后，也可接着进行色谱分离纯化步骤。该色谱分离纯化步骤优选在阴离子交换材料，如DEAE改性的离子交换树脂上进行。pH值应在6至8.5范围内。
以此方法富集或得到的医药上有价值的蛋白质，如因子VIII、因子IX、血纤维蛋白原、r-球蛋白等不含甲型肝类病毒、细小病毒如细小病毒B19，或脊髓灰质炎病毒这类活性病毒。
下面用失活因子VIII制品中无脂质病毒的实施例来更为详细地阐明本发明的方法。
实施例1将商业上通用的冷沉淀物加到装有Fractogel-DEAE-树脂的柱上。收集洗脱液并检查因子VIII活性。然后，用含有110mM氯化钠、10mM柠檬酸钠×5H2O、120mM甘氨酸、1mM氯化钙×2H2O，pH为6.9至7.0(用1M HCl调pH)的缓冲液洗柱。然后，再用组成如下的缓冲液处理柱250mM氯化钠、20mM柠檬酸钠×5H2O、80mM甘氨酸、16mM赖氨酸、2.5mM氯化钙×2H2O，pH为6.9至7.0。
向如此得到的分级分离部分中加入蔗糖。然后，加入磷酸三正丁酯/吐温(0.1％/0.3％)并于64℃保持12小时。继之再在TSK-Fractogel0-DEAE或EMD-Fractogel-TMAE柱上进行离子交换色谱分离。
用含有250mM氯化钠、20mM柠檬酸钠×5H2O、80mM甘氨酸、16mM赖氨酸、2.5mM氯化钙×2H2O的缓冲液洗脱因子VIII活性馏份。
实施例2通过在加温处理前，缓冲液(洗涤缓冲液和洗脱缓冲液)中未加含钙化合物的情况下，按实施例1中所述方法处理商业上通用的冷沉淀物，在没有钙离子的条件下进行病毒失活。然后，在未添加钙离子的情况下进行加温处理，再按实施例1中所述方法作进一步加工。
权利要求
1.失活存在于源自血液、血浆或类似天然来源物之含蛋白质组合物中的病毒，特别是无脂质被膜的病毒的方法，其中同时或相继用有效量磷酸二烷基或三烷基酯及必要时的润湿剂在55℃至67℃范围的加温条件下将所述来源物处理5小时至30小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述磷酸二烷基或三烷基酯的量在0.001％和1％之间。
3.根据权利要求1和/或2所述的方法，其中所述温度在60℃和65℃之间。
4.根据权利要求1至3中至少一项所述的方法，其中所述加温处理时间至少为10小时。
5.根据权利要求1至4中至少一项所述的方法，其中首先用色谱分离法或沉淀方法从所述天然来源物中富集所述蛋白质。
6.根据权利要求1至5中至少一项所述的方法，其中在用磷酸二烷基或三烷基酯处理并同时在加温下处理之前，加入辅助物质，例如蔗糖、山梨醇或短链中性氨基酸。
7.根据权利要求6的方法，其中所述蔗糖的浓度至多为200％(重量)。
8.根据权利要求6和/或7的方法，其中所述的氨基酸采用甘氨酸、赖氨酸和/或精氨酸。
9.根据权利要求1至8中至少一项所述的方法，其中所述加温处理在未添加钙离子条件下进行。
10.根据权利要求1至9中至少一项所述的方法，其中用所述磷酸二烷基或三烷基酯处理并同时加温处理之后接着再进行色谱分离法提纯步骤。
11.根据权利要求1至10中至少一项所述的方法，其中在所述以磷酸二烷基或三烷基酯和加温处理中，pH值为6.0至8.5。
全文摘要
失活存在于源自血液、血浆或类似天然来源物之含蛋白质组合物中的病毒，特别是无脂质被膜的病毒的方法，其中同时或相继以有效量磷酸二烷基或三烷基酯及必要时的润湿剂在55℃到67℃范围的加温条件下将所述来源物处理5小时至30小时。
文档编号C07K14/435GK1118144SQ94191261
公开日1996年3月6日 申请日期1994年2月5日 优先权日1993年2月9日
发明者M·施塔德勒, H·施温, D·纽西克, W·吉林格, F·巴尔 申请人:奥克塔法马有限公司
起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】
与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。
此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除
热门咨询
tips