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2021-01-31 21:01:11|
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起点商标网 专利名称：用作抗增殖药物及garft抑制剂的化合物的制作方法
背景技术：
本发明涉及如下定义的结构式I的化合物，该化合物可以抑制甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶(GARFT)。本发明还涉及制备这些化合物的中间体、含有这些化合物的药物组合物、它们抑制GARFT的用途及它们抑制高等生物细胞或微生物(例如细菌、酵母和真菌)的生长及增殖的用途。这些化合物具有抗肿瘤、抗炎、治疗牛皮癣和/或免疫抑制活性。本发明还涉及所述这些化合物的制备。
在抗增殖药物的大类中包括抗代谢化合物。被称为抗叶酸药物的一类特殊的抗代谢药物是维生素叶酸的拮抗剂。一般地，抗叶酸药物与叶酸的结构非常相似并能掺入叶酸的特征性的对苯甲酰谷氨酸部分。叶酸的谷氨酸部分在生理性pH条件下带有两个负电荷。因此，该化合物及其类似物具有激活的能量驱动转运系统以穿过细胞膜并产生代谢作用。
GARFT是嘌呤的从头生物合成途径中的叶酸依赖性酶。该途径对细胞的分裂和增殖非常重要。已知切断该途径具有抗增殖的效果，具体地讲是抗肿瘤的效果。因此，已经合成了大量的叶酸类似物并对其抑制GARFT的能力进行了研究。据报道，典型的特异性牢固结合的GARFT抑制剂5，10-二去氮杂四氢叶酸具有抗肿瘤活性。参见F.M.Muggia，“嘌呤从头合成的叶酸抗代谢物抑制剂”，癌症化疗中的新药、概念和结果，KluwerAcademic Publishers，Boston(1992)，65-87。
最近，在由本申请人于1994年1月18日递交的国际申请PCT/US94/00418中公开了用作抗增殖药物或GARFT抑制剂的稠合杂环状谷氨酸衍生物。本申请通过对更有用的抗增殖药物和GARFT抑制剂的发展继续该领域内的进展。
发明概述本发明涉及如下定义的结构式I的化合物。这些化合物对抑制甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶(GARFT)和高等生物细胞或微生物(例如细菌、酵母和真菌)的生长及增殖有效。本发明进一步涉及含有这些化合物或其适当的盐的药物组合物以及这些化合物作为GARFT酶抑制剂的用途。
如上所述，本发明的化合物具有抗增殖活性，该特性可表现为抗肿瘤活性。本发明的化合物可以是活性成分本身，或是作为可在体内转变为活性化合物的前体。本发明的优选化合物对抑制GARFT酶特别有效。特别优选的化合物对抑制L1210细胞系(一种可以在组织培养液中生长的小鼠白血病细胞系)有效。本发明的化合物还对抑制细菌(例如可在培养液中生长的革兰氏阴性大肠杆菌)的生长有效。
可以将本发明的化合物及其可药用的盐制成方便的剂型，例如胶囊、片剂和可注射制剂。还可以使用固体或液体的可药用载体、稀释剂或赋性剂。
固体载体包括淀粉、乳糖、二水硫酸钙、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、盐溶液和水。
载体和稀释剂包括任何延长释放的材料，例如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，单独使用或与蜡一起使用。当使用液体载体时，制剂可以是糖浆、酏剂、乳剂、软明胶胶囊、无菌注射液(例如溶液)或者非水性或水性液体悬浮液的形式。
药物制剂按照药剂师的常规技术制备，当需要片剂剂型时包括例如混合、制粒和压片等步骤，或者包括混合、装灌和溶解成分等步骤以制得用于口服、胃肠外、局部、阴道内、鼻内、支气管内、眼内、耳内或直肠内给药的所需产品。
本发明的组合物还可以进一步含有一种或多种其它的药物活性化合物。例如，可以在组合物中含有一种如下的抗肿瘤药物有丝分裂抑制剂(例如长春花碱)；烷化剂；二氢叶酸还原酶抑制剂或TS抑制剂；抗代谢物(例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷)；嵌入型抗生素(例如阿霉素、博来霉素)；酶(例如天冬酰胺酶)；拓扑异构酶抑制剂(例如鬼臼乙叉甙)；和生物反应调节剂(例如干扰素)。本发明的组合物还可以含有其它的GARFT抑制剂或抗增殖药物，例如国际公开号WO 94/13295(1994年6月23日公开)或国际公开号WO 92/05153(1992年4月2日公开)中所记载的化合物，在此引入其公开的内容作为参考。本发明的组合物还可以含有一种或多种抗菌、抗真菌、抗寄生虫、抗病毒、抗牛皮癣或抗球虫药物。抗病毒药物的例子包括磺胺，例如磺胺甲基异恶唑、磺胺嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶和磺胺邻二甲氧嘧啶；二氢叶酸还原酶抑制剂，例如甲氧苄氨嘧啶、bromodiaprim和三甲曲沙；青霉素；头孢菌素；喹诺酮羧酸及其稠合的异噻唑类似物。
本发明的另一方面涉及抑制高等生物细胞或微生物的生长或增殖的治疗方法，该方法包括向宿主施用有效量的本发明的化合物。本发明的化合物对治疗哺乳动物宿主(例如人类宿主)和鸟类宿主特别有用。一个特别优选的治疗方法包括向宿主施用可有效抑制GARFT的剂量的本发明的化合物。
在此记载的许多抗增殖化合物及其可药用的盐可以用于本发明的治疗方法。这些化合物可以以含有上述稀释剂或载体的可药用组合物的形式进行给药。
组合物的剂量至少含有有效量的活性化合物，并且优选由一个或多个药物剂量单位组成。“有效量”是足以抑制叶酸的代谢途径并由此产生有益效果的量，例如通过施用一个或多个药物剂量单位。
用于脊椎动物宿主的示范性每日剂量包括每公斤宿主至多1克活性化合物的剂量，优选每公斤宿主体重0.5克，更为优选100毫克，最为优选大约50毫克或更少。选定的剂量可以通过任何适当的给药方法，包括局部给药，例如膏或霜；口服；直肠给药，例如栓剂；通过注射的胃肠外给药；或通过阴道内、鼻内、支气管内、耳内或眼内浸出的持续给药，向温血动物或哺乳动物(例如需要通过抑制叶酸代谢途径进行治疗的病人)进行给药。
本发明的化合物可以产生抗增殖、抗菌、抗寄生虫、抗牛皮癣、抗原生动物、抗球虫、抗炎、免疫抑制及抗真菌效果中的一种或多种效果。该化合物对于患有肿瘤的脊椎动物产生抗肿瘤效果特别有用。
发明详述具体地讲，本发明涉及结构式I的抗增殖化合物
其中A是O、S或Se；X是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是O、S或NH；B是氢或卤素(F、Cl、Br或I)；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R1和R2彼此独立的是氢或与相连的CO2一起形成易于水解的酯基的基团，例如C1-C6烷基。本发明进一步涉及结构式I的化合物的可药用的盐。本发明还涉及制备这些化合物的中间体。
尽管结构式I的化合物是以4-氧代的形式表示的，并且在整个说明书中也是以这种形式提到该化合物，但该羰基基团与相应的4-羟基基团以互变异构的平衡存在。因此，应当理解术语“结构式I的化合物”意味着以结构描述的4-氧代以及互变异构的4-羟基形式。因此，本发明还涉及结构式I所描述的4-羟基互变异构体的可药用的盐。
当X或C是取代的基团时，优选的取代基包括C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、卤素、氨基、羟基、硝基、巯基、单环的碳环、单环的杂环、稠合及非稠合的多环碳环、稠合及非稠合的多环杂环、羟基C1-C6烷基及C1-C6烷氧基C1-C6烷基。
优选X是CH2、CH2CH2、NH、氧、硫、CH(CH2OH)、或NCH3。优选Y是S或O。优选B是氢。优选C是氢或CH3。优选R1和R2是彼此独立地选自氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基和芳烷基，最为优选的是选自氢和C1-C2烷基。当A和Y均是硫并且X是CH2时特别优选。
结构式I的化合物可用作GARFT抑制剂。其中的R1和R2均是氢的结构式I的化合物是特别有效的抗肿瘤或抗增殖药物。其中的R1和R2均是与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团(优选为乙基)的结构式I的化合物，是可以形成该化合物的游离谷氨酸形式的有用的中间体，可以在体内水解从而起到前药的作用。
本发明的可药用的盐包括，例如本发明的谷氨酸化合物的碱金属盐、碱土金属盐、其它无毒的金属盐、以及铵盐和取代的铵盐。盐的例子包括，游离酸化合物的钠、钾、锂、钙、镁、吡啶和取代吡啶盐。
本发明的化合物可以如下进行制备。制备结构式I的化合物(其中X是CH2)的一个有用的起始原料是结构式II的化合物
其中B、C和X如上结构式I所定义；D是Cl、Br或I；R6是氢或与相连的CO2一起形成易于水解的酯基的基团。优选D是溴或碘。优选R6是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基，更为优选氢或C1-C2烷基。
将结构式II的化合物与结构式III的化合物反应
其中R3是取代或未取代的C1-C6烷基、或三取代的甲硅烷基。优选R3是CH2OH或三甲基甲硅烷基。
结构式II和III的化合物的反应在适当的过渡金属催化剂(优选钯或镍)和非亲核性辅助碱(优选取代的胺)的存在下、在溶剂中进行，在所述溶剂中，至少一种反应物在反应条件下是至少部分可溶的，足以生成结构式IV的化合物
其中B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义；R3如上结构式III所定义。
当R3是三取代的甲硅烷基时，优选用亲核性的碱(例如碳酸钾的甲醇或乙醇溶液)或氟化物盐(例如氟化钾、氟化铯或四丁基氟化铵)，在对至少一种反应物是至少部分可溶的溶剂中(例如甲醇、二甲基甲酰胺、乙醇、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜或异丙醇)将硅烷基脱除，生成结构式V的化合物
其中B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义。
将结构式V的化合物与亲核试剂(优选为N-保护的甘氨酸(glycinal)，更为优选N-叔丁氧羰酰基甘氨酸或二-N-叔丁氧羰酰基甘氨酸)，在碱性条件下用非亲核性的碱(优选二-三甲基甲硅烷基氨基锂、二-三甲基甲硅烷基氨基钾、二-三甲基甲硅烷基氨基钠或二异丙基氨基锂)在低温下(优选从-90℃至25℃)、在对至少一种反应物是至少部分可溶的适当溶剂(优选四氢呋喃、乙醚或二噁烷)中反应，生成结构式VI的化合物
其中B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义；R4和R5彼此独立的是氢或易于脱除的氮-保护基。优选R4和R5是氢、叔丁氧羰基、苄氧羰基或苄基。
然后将结构式VI的化合物还原，优选用氢气在适当的金属催化剂的存在下还原，制得结构式VII的化合物
其中B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义；R4和R5如上结构式VI所定义。
然后将结构式VII的化合物与酰化或磺酰化试剂(优选甲磺酰氯或对甲苯磺酰氯)在非亲核性碱(优选三乙胺或二异丙基乙基胺)的存在下、在对至少一种反应物是至少部分可溶的适当溶剂中反应，产生活化的羟基。将该活化的羟基用适当的亲核试剂(优选硫代乙酸盐，更为优选硫代乙酸钾)取代，生成结构式VIII的化合物
其中A、B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义；R4和R5如上结构式VI所定义；Ac是酰基，优选乙酰基。
或者，将结构式VII的化合物用三苯膦、氮杂二羧酸二乙酯或二甲酯、和酸性亲核试剂(优选硫代乙酸)，在适当的溶剂中经一步化学反应转变成结构式VIII的化合物。
将结构式VIII的化合物用亲核性的碱(优选碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾)在醇性溶剂(优选甲醇、乙醇或异丙醇)中，在烷基化试剂(优选氯代丙二酸二甲酯或二乙酯)的存在下处理，制得结构式IX的化合物
其中A、B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义；R4和R5如上结构式VI所定义。
将结构式IX的化合物在适当的条件下处理以部分或全部脱除R4和R5保护基，制得结构式X的化合物
其中A、B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义。当保护基是叔丁氧羰基(t-BOC)时，脱除该基团的条件优选是用三氟乙酸处理，然后中和以制备结构式X的化合物。
将结构式X的化合物与烷基化试剂(优选氧鎓四氟硼酸三甲酯或三乙酯)在适当的溶剂(优选二氯甲烷)中反应，生成内酰亚胺醚中间体。将该内酰亚胺醚中间体与胍在醇性溶剂(优选甲醇、乙醇或异丙醇)中反应，生成结构式XI的化合物
其中A、B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义。
或者，通过将结构式X的化合物与硫醇化试剂(优选P2S5或2，4-二(4-甲氧苯基)-1，3-二硫代-2，4-二磷烷(phosphetane)-2，4-二硫醚)反应生成硫代内酰胺中间体，然后用烷基化试剂(优选碘甲烷或氧鎓四氟硼酸三甲酯或三乙酯)将其烷基化，然后与胍在醇性溶剂(优选甲醇、乙醇或异丙醇)中反应，生成结构式XI的化合物。
将结构式XI的化合物在碱性条件下水解，生成结构式XII的化合物
其中A、B、C和Y如上结构式I所定义。当结构式XI的化合物中的R6是氢时，则无需进行水解反应，结构式XI的化合物如下所述进行肽的偶联。
结构式XII的化合物(或结构式XI的化合物，其中R6是氢)为游离的羧酸形式，可以通过本领域技术人员公知的方法与谷氨酸二酯的盐酸盐进行肽的偶联，生成结构式XIII的二酯
其中A、B、C和Y如上结构式I所定义；R1和R2彼此独立的是与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团，例如C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基。
最后，如需要，将结构式XIII的化合物水解为结构式I的游离的谷氨酸形式(R1和R2均是氢)。
结构式I的化合物(其中X是除CH2之外的基团)可以用结构式XIV的烯制备
其中B、C和Y如上结构式I所定义，X是如上结构式I所定义的除CH2之外的基团，R6如上结构式II所定义。
当X是硫、氧、取代或未取代的氨基时，结构式XIV的化合物通过将结构式XV的化合物烷基化来制备
其中B、C和Y如通式I定义；X是硫、氧或者取代或未取代氨基；R6如通式II定义。可用烯丙基卤完成烷基化反应，优选烯丙基溴在非亲核性碱(优选三乙胺或二异丙基乙胺)存在下而得通式XIV化合物。
当X是取代或未取代的C1-C2烷基(CH2除外)、取代或未取代的C2-C3链烯基或取代或未取代的C2-C3炔基时，通式XIV化合物是通过下式XVI醛的烯化作用而制备的
其中B、C和Y如通式I定义；X是取代或未取代的C1-C2烷基(CH2除外)、取代或未取代的C2-C3链烯基或取代或未取代的C2-C3炔基。通过ChuanShih等在药物化学杂志第35卷(1992)，1109-1116中描述的类似方法制备通式XVI醛。用亚甲基转移剂(优选亚甲基-三苯基正膦)完成该醛的烯化作用。
将通式XIV化合物与二羟基化试剂(优选四氧化锇)在适当氧化剂(优选甲基吗啉-N-氧化物)存在下反应而得通式XVII化合物
其中B、C和Y如通式I定义；X如通式I定义，只是不为CH2；R6如通式II定义。
将通式XVII化合物与磺酰化试剂(优选对苯甲磺酰氯或甲磺酰氯)在非亲核碱(优选三乙胺或二异丙基乙胺)存在下反应制备中间体单磺酰化合物。将该中间体与强碱(优选氢化钠)反应而得通式XVIII化合物
其中B、C、X、Y和R6如通式XVII定义。
将通式XVIII的环氧化物与含氮亲核试剂(优选叠氮化钠)在中度Lewis酸催化剂(优选高氯酸锂或高氯酸镁)存在下反应而得中间体叠氮化醇。优选将此中间体与氢气在金属催化剂存在下还原，然后用适当氮保护基(优选叔丁氧羰基、苄氧羰基或苄基)保护而得通式VII’化合物
其中B、C、X、Y和R6如通式XVII定义；R4和R5如通式VI定义。
然后将通式VII’化合物与酰化剂或磺酰化剂(优选甲磺酰氯或对甲苯磺酰氯)在非亲核碱(优选三乙胺或二异丙基乙胺)存在下于适当溶剂(至少一种反应物至少是部分可溶于其中)中反应而得活化羟基。用适当亲核试剂(优选硫代酸盐，更优选硫代乙酸盐)取代活化羟基而得通式VIII’化合物
其中A如通式I定义；B、C、X、Y和R6如通式XVII定义；Ac是酰基，优选乙酰基。
另外，可用三苯膦、氮杂二羧酸二乙酯或二甲酯和酸性亲核试剂(优选硫代乙酸)在适当溶剂中将通式VII’化合物一步转化为通式VIII’化合物。
用亲核碱(优选碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾)在适当醇溶剂(优选甲醇、乙醇或异丙醇)中在烷基化试剂(优选氯代丙二酸二甲酯或二乙酯)存在下处理通式VIII’化物而得通式IX’化合物
其中A如通式I定义；B、C、X、Y和R6如通式XVII定义；R4和R5如通式VI定义。
在适于除去R4和R5保护基其一或两者的条件下处理通式IX’化合物而
其中A如通式I定义；B、C、X、Y和R6如通式XVII定义。当保护基为叔丁氧羰基时，除去该基团的条件优选是先用三氟乙酸处理，然后中和而得X’化合物。
将通式X’化合物与烷化剂(优选四氟硼酸三甲基氧鎓或四氟硼酸三乙基氧鎓)在适当溶剂(优选二氯甲烷)中反应而形成中间体内酰亚胺醚。将该中间体内酰亚胺醚与胍在醇溶剂(优选甲醇、乙醇或异丙醇)中反应而形成XI’化合物
其中A如通式I定义；B、C、X、Y和R6如通式XVII定义。
另外，将通式X’化合物与硫醇试剂(优选P2S5或2，4-二(4-甲氧基苯基)-1，3-二硫-2，4-二膦烷-2，4-二硫化物)反应形成硫内酰胺中间体而使通式X’化合物转化为通式XI’化合物。然后将其先用烷化剂(优选甲基碘或四氟硼酸三甲基氧鎓或四氟硼酸三乙基氧鎓)然后用胍在醇溶剂(优选甲醇、乙醇或异丙醇)中烷化而得通式XI’化合物。
在碱性条件下将通式XI’化合物水解而形成通式XII’化合物
其中A如通式I定义；B、C、X、Y和R6如通式XVII定义。当通式XI’化合物中R6是氢时，则不必进行水解反应，然后将通式XI’化合物如下进行肽连接。
通过本领域专业人员熟知的方法用谷氨酸二酯盐酸盐将游离羧酸形式的通式XII’化合物(或者其中R6是氢的通式XI’化合物)进行肽连接而形成通式XIII’二酯
其中A如通式I定义；B、C、X和Y如通式XVII定义；R1和R2各自独立地与所连接的CO2形成易于水解的酯基，其可为如C1-C6烷基、羟基烷基、烷基芳基或芳基烷基。
最后，如果需要游离酸形式，可将通式XIII’化合物水解而得R1和R2为H的通式I化合物。
通式I优选的化合物包括(4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸)二乙酯；4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸；4-[3-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-丙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸；4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6l[1，4l噻嗪-6-基)-乙基]-3-甲基-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸；以及4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][ 1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-呋喃基氨基-L-谷氨酸。
本发明化合物含有一个或多个手性中心。本发明包括了外消旋混合物和非对映体以及光学活性化合物，例如基本上不含其它光学异构体的化合物，所述光学活性化合物可通过本领域专业人员已知的方法获得。
通式I优选化合物的详细合成方法如下实施例所述。实施例4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸(化合物1)
5-溴代-2-噻吩甲酸甲酯2的制备
按照S.Gronowitz在Ark.Kemi 8，1995，87和S.O.Lawesson在Ark.Kemi 11，1957，337中描述的方法制备化合物2(CAS Reg.No.[62224-19-5])。
5-乙炔基-2-甲酸甲酯基噻吩3的制备
在搅拌下的5克(22.7毫摩尔)溴化物3、160毫克(0.23毫摩尔)氯化三苯膦钯(II)和65毫克(0.34毫摩尔)碘化亚铜的75毫升二乙胺溶液中加入4.8毫升(34毫摩尔)三甲基甲硅烷乙炔。于25℃搅拌所得溶液。18小时后，减压除去溶剂，将粗残余物溶于300毫升乙醚中，用100毫升1N盐酸和100毫升饱和碳酸氢盐溶液提取。干燥(硫酸钠)有机层，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用5％乙醚/己烷洗脱而得4.4克(81％产率)的黄色固体状甲硅烷基保护的产物。将该产物直接用于下一步骤。
在4.4克(18.5毫摩尔)上述甲硅烷基保护的乙炔50毫升二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入3.3克(35.2毫摩尔)一水氟化钾。在25℃15分钟后，将混合物倒入500毫升乙醚中，用100毫升水提取四次(4×100毫升水)。干燥(硫酸钠)有机溶液，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用10％乙醚/己烷洗脱而得2.65克(86％产率)的橙色固体状所需产物3。 NMR(CDCl3)δ3.45(s，1H)，3.88(s，3H)，7.22(d，1H，J＝3.5Hz)，7.65(d，1H，J＝3.5Hz).
元素分析C8H6SO2理论值C，57.81；H，3.64；S，19.29实测值C，57.91；H，3.71；S，19.18。
也可用另一方法如下除去甲硅烷基。在搅拌下的3.7克(0.02摩尔)无水碳酸钾的700毫升甲醇悬浮液中加入如上制备的59.7克甲硅烷基乙炔固体。于35℃搅拌该悬浮液2小时，然后蒸发掉甲醇。将残余物加到50毫升水中，用3×150毫升乙醚提取，干燥(硫酸钠)合并的有机部分并蒸发。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用7％乙醚/己烷洗脱而得98％产率(38.72克)的所需产物3。
N-(叔丁氧羰基)-甘氨酸4的制备
于-78℃在搅拌下的2克(12.4毫摩尔)N-(叔丁氧羰基)-2-羟基-乙胺(从Sigma Chemicals获得)的80毫升二氯甲烷溶液中加入1.3毫升(18.6毫摩尔)二甲基亚砜(DMSO)和1.2毫升(13.7毫摩尔)草酰氯。5分钟后，加入5.4毫升(38.4毫摩尔)三乙胺，使溶液升温至25℃。将该混合物倒入200毫升乙醚中，用100毫升水、100毫升0.5N HCl和100毫升饱和碳酸氢盐溶液提取。干燥(硫酸钠)有机部分，减压除去溶剂。将粗醛溶于100毫升苯中，于减压下再次除去溶剂。将此不稳定的粗产物立即用于下一步骤。
4-N-(叔丁氧羰基)-3-羟基-1-(2-甲酯基-5-噻吩)-丁炔5的制备
-78℃时，在1.7克(10.2毫摩尔)乙炔3的10毫升无水四氢呋喃(THF)溶液中加入14.3毫升(14.0毫摩尔)1M的二-三甲基甲硅烷酰胺的THF溶液。10分钟后，滴加入上述粗醛4的5毫升无水THF溶液。与-78℃搅拌反应10分钟，经20分钟升温至0℃。向其中加入5毫升饱和氯化铵水溶液。将该混合物倒入200毫升乙醚中，用100毫升水和50毫升饱和氯化钠溶液洗涤。干燥(硫酸钠)有机层，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用10-40％乙酸乙酯/己烷洗脱而得0.96克(29％)淡黄色油状所需醇5。
NMR(CDCl3)δ1.46(s，9H)，3.38 and 3.58(AB，2H，J＝3，7Hz)，3.88(s，3H)，4.71(dt，1H，J＝2.9，5.2Hz)，5.05(brs，1H)，7.15(d，1H，J＝3.9Hz)，7.64(d，1H，J＝3.9Hz).IR(neat)2978.3，1729.5，1685，1523，1452，1368，1286，1167，1098，959，822，750.4cm-1.高分辨率质谱，计算值C15H19NO5SM+Cs+，458.0038.实测值458.0051.
5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-羟基)-丁基]-噻吩基-2-甲酸甲酯6的制备
在搅拌下的940毫克(2.89毫摩尔)上述乙炔5的50毫升乙酸乙酯溶液中加入320毫克5％Pd/C。将该混合物置于40psi下的氢气中，于25℃搅拌17小时。通过硅藻土过滤混合物，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用20％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱而得800毫克(84％产率)黄色油状所需醇。NMR(CDCl3)δ1.44(s，9H)，1.81(m，2H)，2.28(brs，1H)，2.99(m，2H)，3.10 and 3.29(AB，2H，J＝3，6.9Hz)，3.74(m，1H)，3.86(s，3H)，4.89(brs，1H)，6.82(d，1H，J＝3.7Hz)，7.63(d，1H，J＝3.7Hz).计算值C15H23NO5SC，54.69；H，7.04；N，4.25；S，9.73.实测值C，54.79；H，7.02；N，4.29；S，9.63.
另一制备醇6的方法使用如下二-叔丁氧羰基烯丙胺14。
二-叔丁氧羰基烯丙胺14的制备
在57.10克(1.0摩尔)的烯丙胺和1.2克(0.01摩尔)的二甲基氨基吡啶(DMAP)的500毫升乙腈溶液中加入220克(1摩尔)(t-BOC)2O的100毫升乙腈溶液，将所得混合物搅拌6小时。用甲苯(100毫升)稀释反应混合物，于60℃减压蒸发溶剂。将所得油再次溶于乙腈(40毫升)中，加入1.2克(0.01摩尔)DMAP，在此溶液中缓慢加入220克(1摩尔)(t-BOC)2O的100毫升乙腈溶液。于60℃搅拌反应混合物12小时，与60℃减压蒸发溶剂，加入稀碳酸氢钠(100毫升)。将其用3×150毫升二氯甲烷提取，合并的有机层用盐水洗涤，干燥(硫酸钠)并蒸发。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用5-20％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱而得156.9克(63％产率)澄清晶状固体所需产物14。(m.p.43-44℃)1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.5(s，18H)，4.18(dd，2H，J＝15Hz，J＝1Hz)，5.14(ddd，2H，J＝15Hz，J＝10Hz，J＝1Hz)，5.85(ddt，2H，J＝10Hz，J＝5Hz，J＝1Hz).IR(KBr)2978，2935，2860，1724，1689，1342，1130cm-1.计算值C13H23NO4C，60.68；H，9.01；N，5.44.实测值C，60.78；H，9.04；N，5.50.1-(二叔丁氧羰基氨基)-2-乙醛15的制备
在-78℃将0.60克(2.34毫摩尔)二-叔丁氧羰基烯丙胺14的20毫升二氯甲烷溶液臭氧化(40伏特，500安培，1.01/分钟，氧气@3psi)直至蓝色稳定，加入10毫升二甲硫醚，于25℃搅拌该混合物14小时。将该混合物加到稀盐水中，用二氯甲烷提取(3×50毫升)，干燥(硫酸钠)有机部分并蒸发。闪式硅胶色谱后得到603毫克(99％产率)的澄清晶状固体所需产物15(熔点37-39℃)。
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.50(s，18H)，4.38(s，2H)，9.55(s，1H).IR(KBr)2984，2935，2724，1792，1734，1699，1362，1153cm-1.计算值C12H21NO5C，55.58；H，8.16；N，5.40.实测值C，55.20；H，8.19；N，5.19.
5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-羟基)-丁基]-噻吩基-2-甲酸甲酯6的制备-78℃下在9.64克(59毫摩尔)5-乙炔基-2-甲酯基噻吩3的THF(250毫升)溶液中加入65.6毫升(60毫摩尔)六甲基二硅烷叠氮化锂(LiHMDS)，于-78℃搅拌该混合物2小时。将15.6克(60毫摩尔)1-(二叔丁氧羰基氨基)-2-乙醛15的THF(40毫升)溶液加到反应混合物中，将反应混合物于-78℃搅拌8小时。加入3.4毫升(60毫摩尔)乙酸的甲醇(10毫升)溶液骤冷，搅拌混合物10分钟升温至0℃，加入水(60毫升)。用乙酸乙酯提取(3×100毫升)，有机提取物用稀碳酸氢钠洗涤并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂得约50毫升。在此所得残余物中加入乙酸乙酯(125毫升)，将该溶液加到含有7.38克(30重量％的乙炔起始物)5％披钯碳的Parr瓶中，于55psi氢气中氢化24小时。通过硅藻土过滤粗氢化产物，滤饼用甲醇(100毫升)和乙酸乙酯(100毫升)洗涤。减压蒸发溶剂，通过硅胶过滤粗残余物，用50％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，蒸发溶剂。将残余物溶于20毫升甲醇-苯(50毫升)共沸物中，再溶于无水甲醇(20毫升)中。将该混合物加到新制的60毫升(2M)甲醇钠的甲醇溶液中。搅拌反应混合物45分钟，加入稀盐酸(0.1M，50毫升)，用乙酸乙酯提取(3×75毫升)。合并有机部分，用pH 7的缓冲液(1M)洗涤，干燥(硫酸钠)并蒸发。将粗残余物在闪式硅胶上进行色谱，用40％乙酸乙酯/己烷洗脱而得9.32克(48％产率)的所需产物6。
5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-乙酰硫代)-丁基]-2-噻吩甲酸甲酯7的制备
0℃在搅拌下的9.26克(28.1毫摩尔)醇6的100毫升THF溶液中加入5.9毫升(42毫摩尔)三乙胺(TEA)和2.4毫升(31毫摩尔)甲磺酰氯。20分钟后，加入100毫升DMF和12.8克(110毫摩尔)硫代乙酸钾，将所得溶液升温至25℃。3天后，将混合物倒入500毫升水中，用800毫升乙醚提取。有机层用200毫升水、200毫升1N盐酸、200毫升饱和碳酸氢盐溶液和100毫升饱和氯化钠溶液洗涤。干燥(硫酸镁)有机层，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用25％乙酸乙酯/己烷洗脱后而得10.3克(95％产率)黄色油状所需硫代乙酸盐7。
NMR(CDCl3)δ1.44(s，9H)，1.91 and 2.04(ABm，2H)，2.37(s，3H)，2.96(m，2H)，3.36(m，2H)，3.61(m，1H)，3.86(s，3H)，4.74(brs，1H)，6.79(d，1H，J＝3.6Hz)，7.62(d，1H，J＝3.6Hz).IR(neat)3366，2976.4，1713，1520，1462.1，1366，1290.5，1267.3，1169，1098，752，631cm-1.高分辨率质谱，计算值C17H25NO5S2M+Cs+，520.0229.实测值520.0240.
5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-(二甲基丙二酰基)硫代)-丁基]-2-噻吩甲酸甲酯8的制备
0℃在10.2克(26毫摩尔)搅拌下的上述硫代乙酸盐7的200毫升无水甲醇溶液中加入7.2克(52毫摩尔)碳酸钾和3.7毫升(29毫摩尔)氯代丙二酸二甲酯。3小时后，将混合物倒入500毫升水中，用乙醚提取(3×500毫升)。合并的有机层用500毫升水和200毫升饱和氯化钠溶液洗涤，干燥(硫酸镁)。减压除去溶剂，将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用30％乙酸乙酯/己烷洗脱而得11.46克(93％产率)淡黄色油状所需硫醚8。
NMR，(CDCl3)δ1.44(s，9H)，1.85 and 2.00(ABm，2H)，3.03 (m，3H)3.30(m，2H)，3.80(s，6H)，3.86(s，3H)，5.10(brs，1H)，6.82(d，1H，J＝3.8Hz)，7.63(d，1H，J＝3.8Hz).IR(neat)3442，2974，2955，1734，1713，1512，1460，1435，1366，1291，1267，1167，1098，1022，752cm-1.高分辨率质谱，计算值C20H29NO8S2M+Cs+，608.0389.实测值608.0370.
6-[(5-甲酯基噻吩-2-基)-乙基]-2-甲酯基-3-氧代-3，4，5，6-四氢-[1，4]-噻嗪9的制备
0℃在搅拌下的470毫克(0.99毫摩尔)上述硫醚8的12毫升二氯甲烷溶液中加入4毫升三氟乙酸(TFA)。1.5小时后，将混合物倒入50毫升饱和碳酸氢钠溶液中并用二氯甲烷提取(4×100毫升)。减压除去溶剂，将粗残余物溶于10毫升甲醇中。于25℃搅拌1.5小时后，减压除去溶剂，将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用40％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱而得298毫克(88％产率)无色油状所需内酰胺9。
NMR(CDCl3)δ1.94(m，2H)，3.01(m，2H)，3.4-3.7(m，4H)，3.80 and 3.82(s，3H)，3.87(s，3H)，6.25(brs，1H，)，6.83(d，1H，J＝3.7Hz)，7.64(d，1H，J＝3.7Hz).IR(KBr)2951，1732，1669，1462，1294，1267，1194，1157，1098，1005，752cm-1.计算值C14H17NO5S2C，48.96；H，4.99；N，4.08；S，18.67.实测值C，49.06；H，4.93；N，4.09；S，18.60.[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩甲酸甲酯10的制备
在搅拌下的上述内酰胺9的150毫升无水二氯甲烷溶液中即刻加入1.06克(7.2毫摩尔)四氟硼酸三甲基氧鎓。于25℃搅拌该溶液6小时。将所得混合物倒入50毫升10％碳酸钾水溶液中，用二氯甲烷提取(3×200毫升)。干燥(硫酸镁)合并的有机层，减压除去溶剂。将所得产物直接用于下一步骤。
将1.58克(16.6毫摩尔)无水盐酸胍置于分液瓶中。向其中加入600毫升无水甲醇。将干燥氩气通入溶液中10分钟，然后加入926毫克(17.1毫摩尔)无水甲醇钠。将上述制备的粗内酰胺醚的20毫升甲醇溶液经套管加到所得混合物中。在氩气下回流溶液20小时。用1N盐酸调节PH值至4，减压除去溶剂。将粗残余物溶于500毫升氯仿中，用2×100毫升水洗涤。干燥(硫酸镁)合并的有机层，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用5-10％甲醇/二氯甲烷洗脱而得413毫克灰白色固体。然后将此产物溶于25毫升热甲醇中，经18小时缓慢冷却至4℃。过滤收集固体而得180毫克(9％产率)淡黄色固体状所需嘧啶酮。
NMR(d6-DMSO)δ1.72(m，1H)，1.88(m，1H)，2.8-3.22(m，4H)，3.50(dt，1H，J＝2，8Hz)，5.99(brs，2H)，6.64(brs，1H)，6.98(d，1H，J＝3.8Hz)7.62(d，1H，J＝3.8Hz)，10.02(brs，1H).高分辨率质谱，计算值C14H16N4O3S2M+Na+，375.0562.实测值375.0550.
也可如下制备嘧啶酮10。在搅拌下的500毫克(1.46毫摩尔)内酰胺9的20毫升无水THF溶液中加入648毫克(1.60毫摩尔)Lawesson’s试剂(2，4-二(4-甲氧基苯基)-1，3-二硫-2，4-二磷烷-2，4-二硫醚)。于25℃搅拌混合物20小时后，将其倒入50毫升饱和碳酸氢盐溶液中，用2×200毫升乙酸乙酯提取。合并的有机层用50毫升饱和氯化钠溶液洗涤，干燥(硫酸镁)，减压除去溶剂。将粗硫内酰胺在硅胶上进行闪式色谱，用8％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱而得525毫克相应的硫内酰胺11
将该产物直接用于下一步骤。
在525毫克硫内酰胺11的10毫升无水THF和10毫升无水甲醇混合物中加入1.6毫升1N氢氧化钠。向其中加入0.1毫升(1.6毫摩尔)甲基碘而得甲基化的硫内酰胺，不必纯化而将其用于下步。将1.39克(14.6毫摩尔)无水盐酸胍置于分液瓶中。向其中加入300毫升无水甲醇。将干燥氩气通入溶液10分钟，然后加入796毫克(14.7毫摩尔)无水甲醇钠。经套管向所得混合物中加入如上制备的粗甲基化硫内酰胺。在氩气下回流溶液48小时。用1N盐酸调节PH值至4，减压除去溶剂。将粗残余物溶于500毫升氯仿中，用2×100毫升水洗涤。干燥(硫酸镁)有机层，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用5-10％甲醇/二氯甲烷洗脱。然后将产物溶于20毫升热甲醇中，经18小时冷却至4℃。过滤收集得131毫克(9％产率)所需嘧啶酮10。[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩甲酸12的制备
在180毫克(0.51毫摩尔)嘧啶酮10中加入5毫升1N氢氧化钠水溶液。于25℃搅拌所得溶液20小时。冷却至0℃后，用1N盐酸调节PH值至2。滤除褐色固体，用水洗涤，真空干燥得111毫克(64％产率)淡褐色固体状所需酸12。NMR(d6-DMSO)δ1.72(m，1H)，1.92(m，1H)，2.78-3.68(m)，6.07(brs，2H)，6.68(brs，1H)，6.92(d，1H，J＝3.7Hz)，7.52(d，1H，J＝3.7Hz)，10.12(brs，1H)，12.8 9(brs，1H).高分辨率质谱，计算值C13H14N4O3S2M+，338.0507.实测值338.0517.
4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸二乙酯13的制备
在搅拌下的110毫克(0.33毫摩尔)上述酸12的5毫升无水DMF溶液中加入48毫克(0.36毫摩尔)1-羟基苯并三唑水合物、62微升(0.36毫摩尔)二异丙基乙胺、86毫克(0.36毫摩尔)谷氨酸二乙酯盐酸盐和106毫克(0.36毫摩尔)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺甲基碘化物。于25℃氩气下搅拌所得溶液20小时，然后倒入50毫升水。用2×150毫升乙酸乙酯提取水层。合并的有机层用3×50毫升水和10毫升饱和氯化钠溶液反萃取，然后干燥(硫酸镁)。减压除去溶剂，将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用0-10％甲醇/二氯甲烷洗脱而得120毫克(71％产率)淡黄色无定形固体状的所需酰胺13。
NMR(d6-Acetone)δ1.20(m，6H)，2.2(m，1H)，2.46(t.1H，J＝7.6Hz)，2.78(s，1H)，2.82(s，1H)，2.92-3.1(m，2H)，3.41(m，1H)，3.72(dt，1H，J＝3.0，12.7Hz)，4.02-4.2(m，4H)，4.58(m，1H)，5.90(brs，1H)，6.05(brs，1H)，6.90(d，1H，8。J＝3.8Hz)，7.58(d，1H，J＝3.8Hz)，7.78(d，1H，J＝8Hz).高分辨率质谱，计算值C22H29N5O6S2M+H+，524.1638.实测值524.1650.
4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，41噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸1的制备在上述115毫克(0.22毫摩尔)二乙酯13中加入3毫升1N氢氧化钠水溶液。将所得混合物于25℃搅拌14小时。冷却至0℃后，用盐酸水溶液调节PH值至3.5。过滤固体，用水洗涤，真空干燥而得82毫克(80％产率)灰白色固体状的所需酸。
NMR(d6-DMSO)δ1.62-2.02(m，4H)，2.27(m，2H)，2.78-3.00(m，3H)，4.27(dd，1H，J＝6，6.8Hz)，6.00(brs，2H)，6.63(brs，1H)，6.88(d，1H，J＝3.7Hz)，7.63(d，1H，J＝3.7Hz)，8.37(d，1H，J＝7.4Hz)，10.05(brs，1H)，12.85(brs，2H).IR(KBr)3371，1700，1643，1543，1345cm-1.
高分辨率质谱C18H21N5O6S2理论值M＋H+，468.1012，实测值468.1025。元素分析C18H21N5O6S2·1.5H2O理论值C，43.71；H，4.89；N14.16；S，12.97实测值C，43.50；H4.67；N14.07；S，12.72生物学和生物化学评价GAR转甲酰酶抑制常数的确定将Young等在生物化学23(1984)，3979-3986中的GAR-转甲酰酶(GARFT)分析方法修饰后用于如下。反应混合物含有人GARFT催化区、0-250nM化合物1、20uM甘氨酰胺核糖核苷酸(GAR)、10或20uMN10-甲酰基-5，8-脱氮杂叶酸(FDDF)、50mMHEPES-KOH(PH 7.5)和50mMKCl。加入酶使终浓度为11nM而启动反应，然后监测20℃在294nm的吸收增加(e294＝18.9mM-1cm-1)。
GARFT抑制常数(Ki)是由稳态催化率对抑制剂和底物浓度的依赖性所决定的。表观Ki(Ki，app)对FDDF浓度的依赖决定了抑制类型为对FDDF竞争性抑制，由下式描述Ki，app＝Ki+(Ki/Km)[FDDF]。FDDF的Michaelis常数，即Km，独立地由催化率对FDDF浓度的依赖性决定。Km和Ki数据符合非线性方法的Michaelis等式，或者竞争性抑制Michaelis等式。分析从紧密结合抑制中得到的数据，将数据代入非线性方法Morrison紧密结合等式(Biochem Biophys Acta 185(1969)，269-286)而得Ki。
细胞系使用的细胞系及其起源列于表1中。每一细胞系的生长状况和培养基要求如表2所示。将所有的培养基保持在37℃，5％空气-二氧化碳的潮湿保温箱中。
体外生长抑制在10mM碳酸氢钠水溶液中制备抑制剂储备液，于-20℃以1毫升等分试样保存以用于细胞培养实验。通过修饰后的Mosmann方法(J.Immuol.Methods 65(1983))测量细胞生长抑制。
在含有渗析后小牛血清(Hyclone Laboratories Inc.，Logan，UT)的新制RPMI生长培养基(Mediatech，washington，DC)中将每个细胞系的对数中期相细胞稀释至18500细胞/毫升，然后等分成96孔微滴定板的2至12组。第1组填充有等体积(135毫升)的无细胞新制培养基以用作空白。然后将板置于37℃、5％空气-二氧化碳的保温箱中。1至4小时后，取出板，然后在12至4组中加入化合物1(10×终浓度，15毫升/孔，二等分稀释法)。在逆向实验中，所有的药物溶液(终浓度175mM)中都含有次黄嘌呤(1.75mM)或AICA(1.75mM)。在每板上制备四份含有化合物1每个浓度的孔。将15毫升不含化合物1的培养基加到板1组的孔中。然后将细胞放入保温箱中，直至完成培养期。L1210和L1210/CI920细胞的第3天或CCRF-CEM细胞的第5天，将溶于组织培养基中的50毫升0.8mg/ml MTT((4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑；Sigma catalog no.M2128)加到所有板的每个孔中，然后再放到保温箱中。4小时后，取出板，在1200rpm离心7分钟。吸掉培养基，将150毫升DMSO加到所有板中的孔中。然后于室温暗处在涡旋混合器中缓慢混合板。于540nm在Molecular DevicesVmax动力学微板读数器上用分光光度法测量被代谢的MTT量。通过MTT代谢测定的50％抑制细胞生长所需药物的浓度通过内推法在对照O.D.(减空白)上及低于50％O.D.(减空白)确定。
表1用于体外研究的细胞系的组织起源和根源细胞系 根源 起源L1210 ATCC#小鼠，淋巴细胞白血病CCRF-CEMATCC#人，急性成淋巴细胞白血病#ATCC＝美国典型培养物中心表2微滴定分析中使用的培养基状况、板密度和培养时间细胞系 培养基 DFCS 板密度培养时间浓度(％)*(细胞/孔) (天)L1210 RPMI-1640 5 2500 3CCRF-CEM RPMI-1640 102500 5DFCS浓度*＝渗析后小牛血清浓度。
表3连续(72小时)接触后化合物1生长抑制数据化合物 GARFTKiIC50细胞培养IC50细胞培养(nM) L1210(nM)aL1210(nM)a14.5 16 4.3a平均IC50±标准偏差体内抗肿瘤活性第零天时，将6C3HED淋巴肉瘤的2mm2套针片段于腋部皮下植入到6C3H/He雌性大鼠各组。第一天开始，将试验化合物的40％Encapsin溶液每日一次腹膜内给药9天。对照组动物接受相同处理，只是没有试验化合物。下表4所示的抑制百分数是通过比较第11天对照组(仅接受稀释剂)与接受测试化合物组的肿瘤质量计算而得的。
表4化合物剂量(mg/kg) 抑制百分数存活数1 12.5100 6/61 25 100 3/61 50 毒性0/6在第零天，将C3H/BA乳腺癌的2mm2套针片段经腋部皮下植入到6C3H/He雌性大鼠各组。从第一天开始，将试验化合物的40％Encapsin溶液每日一次腹膜内给药九天。除不使用试验化合物外，对照组动物接受同样的处理。抑制百分数是通过比较第14天对照组(仅接受稀释剂)与接受试验化合物组的肿瘤重量计算而得。
结果概述于表5。
表5化合物剂量(mg/kg) 抑制百分率存活数1 5 16 5/61 10 84 6/61 20 100 3/6可以对本发明的方法和产品作出各种修饰和改变，这对于本领域技术人员是显而易见的。
如可能，本文列举的化学基团可以被取代。在一些情况下，这种可能性通过列举例如取代或未取代的C1-C3烷基而变得明确。
当本文的任何结构式中列举了一个以上的R6基团时，每一个R6均可以彼此独立地选自以上给出的可能基团。
40.根据权利要求39的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫。
41.根据权利要求39的化合物[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩酸。
42.如下结构式的化合物
43.根据权利要求42的光学活性的化合物。
44.根据权利要求43的化合物，具有如下结构
45.根据权利要求43的化合物，具有如下结构
权利要求
1.一种结构式I的化合物或其可药用的盐
其中A是氧、硫或硒；X是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R1和R2彼此独立的是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团。
2.根据权利要求1的化合物或盐，其中X是CH2、CH2CH2、NH、氧、硫、CH(CH2OH)或NCH3。
3.根据权利要求1的化合物或盐，其中Y是硫或氧，B是氢，C是氢或CH3。
4.根据权利要求3的化合物或盐，其中A是硫，Y是硫，R1和R2均是氢。
5.根据权利要求4的化合物或盐，其中X是CH2。
6.根据权利要求1的化合物或盐，其中R1和R2彼此独立地选自氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基和芳烷基。
7.根据权利要求6的化合物或盐，其中R1和R2彼此独立地选自氢或C1-C2烷基。
8.根据权利要求7的化合物或盐，其中A是硫，Y是硫，X是CH2。
9.根据权利要求8的化合物或盐，其中B是氢，C是氢，R1和R2均是氢。
10.根据权利要求1的化合物，该化合物选自(4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]2，5-噻吩氨基-L-谷氨酸)二乙酯；4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]2，5-噻吩氨基-L-谷氨酸；4-[3-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-丙基]2，5-噻吩氨基-L-谷氨酸；4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-3-甲基-2，5-噻吩氨基-L-谷氨酸；和4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-呋喃氨基-L-谷氨酸。
11.一种药物组合物，含有(i)有效量的结构式I的化合物或其药用盐
其中A是氧、硫或硒；X是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R1和R2的每一个是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团；和(ii)可药用的载体、赋性剂或稀释剂。
12.根据权利要求11的药物组合物，其中X是CH2、CH2CH2、NH、氧、硫、CH(CH2OH)或NCH3。
13.根据权利要求11的药物组合物，其中Y是硫或氧，B是氢，C是氢或CH3。
14.根据权利要求13的药物组合物，其中A是硫，Y是硫，X是CH2。
15.根据权利要求14的药物组合物，其中C是氢，R1和R2均是氢。
16.一种抑制微生物或高等生物细胞的生长或增殖的方法，包括向哺乳动物或鸟类宿主施用有效量的结构式I的化合物或其药用盐
其中A是氧、硫或硒；X是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R1和R2的每一个是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团。
17.根据权利要求16的方法，其中X是CH2、CH2CH2、NH、氧、硫、CH(CH2OH)或NCH3。
18.根据权利要求16的方法，其中Y是硫或氧，B是氢，C是氢或CH3。
19.根据权利要求18的方法，其中A是硫，Y是硫，X是CH2。
20.根据权利要求19的方法，其中C是氢，R1和R2均是氢。
21.结构式VI的化合物
其中Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R6是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团；并且R4和R5彼此独立的是氢或易脱除的氮保护基。
22.根据权利要求21的化合物，其中Y是硫；B是氢；C是氢；R6是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基；R4和R5彼此独立的是氢、叔丁氧羰基、苄氧羰基或苄基。
23.根据权利要求21的化合物其为4-N-(叔丁氧羰基)-3-羟基-1-(2-甲酯基-5-噻吩)-丁炔。
24.结构式VII″的化合物
其中X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；A是氧、硫或硒；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；R6是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团；并且R4和R5彼此独立的是氢或易脱除的氮保护基。
25.根据权利要求24的化合物，其中X’是CH2；Y是硫；B是氢；C是氢；R6是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基；R4和R5彼此独立的是氢、叔丁氧羰基、苄氧羰基或苄基。
26.根据权利要求24的化合物，其为5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-羟基)-丁基]-噻吩基-2-甲酸甲酯。
27.结构式VIII″的化合物
其中X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；R6是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团；R4和R5彼此独立的是氢或易脱除的氮保护基；并且Ac是酰基。
28.根据权利要求27的化合物，其中X’是CH2；Y是硫；B是氢；C是氢；R6是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基；R4和R5彼此独立的是氢、叔丁氧羰基、苄氧羰基或苄基。
29.根据权利要求27的化合物，其为5-[(4-N-(叔丁氧羰酰基)-氨基-3-乙酰基硫代)-丁基]-2-噻吩甲酸甲酯。
30.结构式IX″的化合物
其中A是氧、硫或硒；X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；每一个R6彼此独立的是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团；并且R4和R5彼此独立的是氢或易脱除的氮保护基。
31.根据权利要求30的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫；B是氢；C是氢；R6是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基；R4和R5彼此独立的是氢、叔丁氧羰基、苄氧羰基或苄基。
32.根据权利要求30的化合物其为5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-(二甲基丙二酰基)硫代)-丁基]-2-噻吩甲酸甲酯。33.结构式X″的化合物
其中A是氧、硫或硒；X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且每一个R6彼此独立的是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团。
34.根据权利要求33的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫；B是氢；C是氢；每一个R6彼此独立的是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基。
35.根据权利要求33的化合物，其为6-[(5-甲酯基噻吩-2-基)-乙基]-2-甲酯基-3-氧代-3，4，5，6-四氢-[ 1，4]-噻嗪。
36.结构式XI″的化合物
其中A是氧、硫或硒；X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R6是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团。
37.根据权利要求36的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫；B是氢；C是氢；R6是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基。
38.根据权利要求36的化合物，其为[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩甲酸甲酯。
39.结构式XII″的化合物
其中A是氧、硫或硒；X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基。
40.根据权利要求39的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫。
41.根据权利要求39的化合物，其为[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩酸。
全文摘要
本发明涉及化合物，例如与其4-羟基互变异构体处于平衡的化合物(1)，及其可药用的盐。这些化合物可用作甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶(GARFT)抑制剂或抗增殖药物。本发明还涉及应用这些化合物作为GARFT抑制剂或抗增殖药物的药物组合物及方法。本发明还涉及用于制备这些化合物的中间体化合物。
文档编号C07D417/06GK1159193SQ94195172
公开日1997年9月10日 申请日期1994年7月28日 优先权日1994年7月28日
发明者M·D·瓦尼, W·H·洛米尼斯, C·L·帕尔默 申请人:阿格罗尼制药公司
背景技术：
本发明涉及如下定义的结构式I的化合物，该化合物可以抑制甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶(GARFT)。本发明还涉及制备这些化合物的中间体、含有这些化合物的药物组合物、它们抑制GARFT的用途及它们抑制高等生物细胞或微生物(例如细菌、酵母和真菌)的生长及增殖的用途。这些化合物具有抗肿瘤、抗炎、治疗牛皮癣和/或免疫抑制活性。本发明还涉及所述这些化合物的制备。
在抗增殖药物的大类中包括抗代谢化合物。被称为抗叶酸药物的一类特殊的抗代谢药物是维生素叶酸的拮抗剂。一般地，抗叶酸药物与叶酸的结构非常相似并能掺入叶酸的特征性的对苯甲酰谷氨酸部分。叶酸的谷氨酸部分在生理性pH条件下带有两个负电荷。因此，该化合物及其类似物具有激活的能量驱动转运系统以穿过细胞膜并产生代谢作用。
GARFT是嘌呤的从头生物合成途径中的叶酸依赖性酶。该途径对细胞的分裂和增殖非常重要。已知切断该途径具有抗增殖的效果，具体地讲是抗肿瘤的效果。因此，已经合成了大量的叶酸类似物并对其抑制GARFT的能力进行了研究。据报道，典型的特异性牢固结合的GARFT抑制剂5，10-二去氮杂四氢叶酸具有抗肿瘤活性。参见F.M.Muggia，“嘌呤从头合成的叶酸抗代谢物抑制剂”，癌症化疗中的新药、概念和结果，KluwerAcademic Publishers，Boston(1992)，65-87。
最近，在由本申请人于1994年1月18日递交的国际申请PCT/US94/00418中公开了用作抗增殖药物或GARFT抑制剂的稠合杂环状谷氨酸衍生物。本申请通过对更有用的抗增殖药物和GARFT抑制剂的发展继续该领域内的进展。
发明概述本发明涉及如下定义的结构式I的化合物。这些化合物对抑制甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶(GARFT)和高等生物细胞或微生物(例如细菌、酵母和真菌)的生长及增殖有效。本发明进一步涉及含有这些化合物或其适当的盐的药物组合物以及这些化合物作为GARFT酶抑制剂的用途。
如上所述，本发明的化合物具有抗增殖活性，该特性可表现为抗肿瘤活性。本发明的化合物可以是活性成分本身，或是作为可在体内转变为活性化合物的前体。本发明的优选化合物对抑制GARFT酶特别有效。特别优选的化合物对抑制L1210细胞系(一种可以在组织培养液中生长的小鼠白血病细胞系)有效。本发明的化合物还对抑制细菌(例如可在培养液中生长的革兰氏阴性大肠杆菌)的生长有效。
可以将本发明的化合物及其可药用的盐制成方便的剂型，例如胶囊、片剂和可注射制剂。还可以使用固体或液体的可药用载体、稀释剂或赋性剂。
固体载体包括淀粉、乳糖、二水硫酸钙、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、盐溶液和水。
载体和稀释剂包括任何延长释放的材料，例如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，单独使用或与蜡一起使用。当使用液体载体时，制剂可以是糖浆、酏剂、乳剂、软明胶胶囊、无菌注射液(例如溶液)或者非水性或水性液体悬浮液的形式。
药物制剂按照药剂师的常规技术制备，当需要片剂剂型时包括例如混合、制粒和压片等步骤，或者包括混合、装灌和溶解成分等步骤以制得用于口服、胃肠外、局部、阴道内、鼻内、支气管内、眼内、耳内或直肠内给药的所需产品。
本发明的组合物还可以进一步含有一种或多种其它的药物活性化合物。例如，可以在组合物中含有一种如下的抗肿瘤药物有丝分裂抑制剂(例如长春花碱)；烷化剂；二氢叶酸还原酶抑制剂或TS抑制剂；抗代谢物(例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷)；嵌入型抗生素(例如阿霉素、博来霉素)；酶(例如天冬酰胺酶)；拓扑异构酶抑制剂(例如鬼臼乙叉甙)；和生物反应调节剂(例如干扰素)。本发明的组合物还可以含有其它的GARFT抑制剂或抗增殖药物，例如国际公开号WO 94/13295(1994年6月23日公开)或国际公开号WO 92/05153(1992年4月2日公开)中所记载的化合物，在此引入其公开的内容作为参考。本发明的组合物还可以含有一种或多种抗菌、抗真菌、抗寄生虫、抗病毒、抗牛皮癣或抗球虫药物。抗病毒药物的例子包括磺胺，例如磺胺甲基异恶唑、磺胺嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶和磺胺邻二甲氧嘧啶；二氢叶酸还原酶抑制剂，例如甲氧苄氨嘧啶、bromodiaprim和三甲曲沙；青霉素；头孢菌素；喹诺酮羧酸及其稠合的异噻唑类似物。
本发明的另一方面涉及抑制高等生物细胞或微生物的生长或增殖的治疗方法，该方法包括向宿主施用有效量的本发明的化合物。本发明的化合物对治疗哺乳动物宿主(例如人类宿主)和鸟类宿主特别有用。一个特别优选的治疗方法包括向宿主施用可有效抑制GARFT的剂量的本发明的化合物。
在此记载的许多抗增殖化合物及其可药用的盐可以用于本发明的治疗方法。这些化合物可以以含有上述稀释剂或载体的可药用组合物的形式进行给药。
组合物的剂量至少含有有效量的活性化合物，并且优选由一个或多个药物剂量单位组成。“有效量”是足以抑制叶酸的代谢途径并由此产生有益效果的量，例如通过施用一个或多个药物剂量单位。
用于脊椎动物宿主的示范性每日剂量包括每公斤宿主至多1克活性化合物的剂量，优选每公斤宿主体重0.5克，更为优选100毫克，最为优选大约50毫克或更少。选定的剂量可以通过任何适当的给药方法，包括局部给药，例如膏或霜；口服；直肠给药，例如栓剂；通过注射的胃肠外给药；或通过阴道内、鼻内、支气管内、耳内或眼内浸出的持续给药，向温血动物或哺乳动物(例如需要通过抑制叶酸代谢途径进行治疗的病人)进行给药。
本发明的化合物可以产生抗增殖、抗菌、抗寄生虫、抗牛皮癣、抗原生动物、抗球虫、抗炎、免疫抑制及抗真菌效果中的一种或多种效果。该化合物对于患有肿瘤的脊椎动物产生抗肿瘤效果特别有用。
发明详述具体地讲，本发明涉及结构式I的抗增殖化合物
其中A是O、S或Se；X是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是O、S或NH；B是氢或卤素(F、Cl、Br或I)；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R1和R2彼此独立的是氢或与相连的CO2一起形成易于水解的酯基的基团，例如C1-C6烷基。本发明进一步涉及结构式I的化合物的可药用的盐。本发明还涉及制备这些化合物的中间体。
尽管结构式I的化合物是以4-氧代的形式表示的，并且在整个说明书中也是以这种形式提到该化合物，但该羰基基团与相应的4-羟基基团以互变异构的平衡存在。因此，应当理解术语“结构式I的化合物”意味着以结构描述的4-氧代以及互变异构的4-羟基形式。因此，本发明还涉及结构式I所描述的4-羟基互变异构体的可药用的盐。
当X或C是取代的基团时，优选的取代基包括C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、卤素、氨基、羟基、硝基、巯基、单环的碳环、单环的杂环、稠合及非稠合的多环碳环、稠合及非稠合的多环杂环、羟基C1-C6烷基及C1-C6烷氧基C1-C6烷基。
优选X是CH2、CH2CH2、NH、氧、硫、CH(CH2OH)、或NCH3。优选Y是S或O。优选B是氢。优选C是氢或CH3。优选R1和R2是彼此独立地选自氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基和芳烷基，最为优选的是选自氢和C1-C2烷基。当A和Y均是硫并且X是CH2时特别优选。
结构式I的化合物可用作GARFT抑制剂。其中的R1和R2均是氢的结构式I的化合物是特别有效的抗肿瘤或抗增殖药物。其中的R1和R2均是与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团(优选为乙基)的结构式I的化合物，是可以形成该化合物的游离谷氨酸形式的有用的中间体，可以在体内水解从而起到前药的作用。
本发明的可药用的盐包括，例如本发明的谷氨酸化合物的碱金属盐、碱土金属盐、其它无毒的金属盐、以及铵盐和取代的铵盐。盐的例子包括，游离酸化合物的钠、钾、锂、钙、镁、吡啶和取代吡啶盐。
本发明的化合物可以如下进行制备。制备结构式I的化合物(其中X是CH2)的一个有用的起始原料是结构式II的化合物
其中B、C和X如上结构式I所定义；D是Cl、Br或I；R6是氢或与相连的CO2一起形成易于水解的酯基的基团。优选D是溴或碘。优选R6是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基，更为优选氢或C1-C2烷基。
将结构式II的化合物与结构式III的化合物反应
其中R3是取代或未取代的C1-C6烷基、或三取代的甲硅烷基。优选R3是CH2OH或三甲基甲硅烷基。
结构式II和III的化合物的反应在适当的过渡金属催化剂(优选钯或镍)和非亲核性辅助碱(优选取代的胺)的存在下、在溶剂中进行，在所述溶剂中，至少一种反应物在反应条件下是至少部分可溶的，足以生成结构式IV的化合物
其中B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义；R3如上结构式III所定义。
当R3是三取代的甲硅烷基时，优选用亲核性的碱(例如碳酸钾的甲醇或乙醇溶液)或氟化物盐(例如氟化钾、氟化铯或四丁基氟化铵)，在对至少一种反应物是至少部分可溶的溶剂中(例如甲醇、二甲基甲酰胺、乙醇、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜或异丙醇)将硅烷基脱除，生成结构式V的化合物
其中B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义。
将结构式V的化合物与亲核试剂(优选为N-保护的甘氨酸(glycinal)，更为优选N-叔丁氧羰酰基甘氨酸或二-N-叔丁氧羰酰基甘氨酸)，在碱性条件下用非亲核性的碱(优选二-三甲基甲硅烷基氨基锂、二-三甲基甲硅烷基氨基钾、二-三甲基甲硅烷基氨基钠或二异丙基氨基锂)在低温下(优选从-90℃至25℃)、在对至少一种反应物是至少部分可溶的适当溶剂(优选四氢呋喃、乙醚或二噁烷)中反应，生成结构式VI的化合物
其中B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义；R4和R5彼此独立的是氢或易于脱除的氮-保护基。优选R4和R5是氢、叔丁氧羰基、苄氧羰基或苄基。
然后将结构式VI的化合物还原，优选用氢气在适当的金属催化剂的存在下还原，制得结构式VII的化合物
其中B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义；R4和R5如上结构式VI所定义。
然后将结构式VII的化合物与酰化或磺酰化试剂(优选甲磺酰氯或对甲苯磺酰氯)在非亲核性碱(优选三乙胺或二异丙基乙基胺)的存在下、在对至少一种反应物是至少部分可溶的适当溶剂中反应，产生活化的羟基。将该活化的羟基用适当的亲核试剂(优选硫代乙酸盐，更为优选硫代乙酸钾)取代，生成结构式VIII的化合物
其中A、B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义；R4和R5如上结构式VI所定义；Ac是酰基，优选乙酰基。
或者，将结构式VII的化合物用三苯膦、氮杂二羧酸二乙酯或二甲酯、和酸性亲核试剂(优选硫代乙酸)，在适当的溶剂中经一步化学反应转变成结构式VIII的化合物。
将结构式VIII的化合物用亲核性的碱(优选碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾)在醇性溶剂(优选甲醇、乙醇或异丙醇)中，在烷基化试剂(优选氯代丙二酸二甲酯或二乙酯)的存在下处理，制得结构式IX的化合物
其中A、B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义；R4和R5如上结构式VI所定义。
将结构式IX的化合物在适当的条件下处理以部分或全部脱除R4和R5保护基，制得结构式X的化合物
其中A、B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义。当保护基是叔丁氧羰基(t-BOC)时，脱除该基团的条件优选是用三氟乙酸处理，然后中和以制备结构式X的化合物。
将结构式X的化合物与烷基化试剂(优选氧鎓四氟硼酸三甲酯或三乙酯)在适当的溶剂(优选二氯甲烷)中反应，生成内酰亚胺醚中间体。将该内酰亚胺醚中间体与胍在醇性溶剂(优选甲醇、乙醇或异丙醇)中反应，生成结构式XI的化合物
其中A、B、C和Y如上结构式I所定义；R6如上结构式II所定义。
或者，通过将结构式X的化合物与硫醇化试剂(优选P2S5或2，4-二(4-甲氧苯基)-1，3-二硫代-2，4-二磷烷(phosphetane)-2，4-二硫醚)反应生成硫代内酰胺中间体，然后用烷基化试剂(优选碘甲烷或氧鎓四氟硼酸三甲酯或三乙酯)将其烷基化，然后与胍在醇性溶剂(优选甲醇、乙醇或异丙醇)中反应，生成结构式XI的化合物。
将结构式XI的化合物在碱性条件下水解，生成结构式XII的化合物
其中A、B、C和Y如上结构式I所定义。当结构式XI的化合物中的R6是氢时，则无需进行水解反应，结构式XI的化合物如下所述进行肽的偶联。
结构式XII的化合物(或结构式XI的化合物，其中R6是氢)为游离的羧酸形式，可以通过本领域技术人员公知的方法与谷氨酸二酯的盐酸盐进行肽的偶联，生成结构式XIII的二酯
其中A、B、C和Y如上结构式I所定义；R1和R2彼此独立的是与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团，例如C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基。
最后，如需要，将结构式XIII的化合物水解为结构式I的游离的谷氨酸形式(R1和R2均是氢)。
结构式I的化合物(其中X是除CH2之外的基团)可以用结构式XIV的烯制备
其中B、C和Y如上结构式I所定义，X是如上结构式I所定义的除CH2之外的基团，R6如上结构式II所定义。
当X是硫、氧、取代或未取代的氨基时，结构式XIV的化合物通过将结构式XV的化合物烷基化来制备
其中B、C和Y如通式I定义；X是硫、氧或者取代或未取代氨基；R6如通式II定义。可用烯丙基卤完成烷基化反应，优选烯丙基溴在非亲核性碱(优选三乙胺或二异丙基乙胺)存在下而得通式XIV化合物。
当X是取代或未取代的C1-C2烷基(CH2除外)、取代或未取代的C2-C3链烯基或取代或未取代的C2-C3炔基时，通式XIV化合物是通过下式XVI醛的烯化作用而制备的
其中B、C和Y如通式I定义；X是取代或未取代的C1-C2烷基(CH2除外)、取代或未取代的C2-C3链烯基或取代或未取代的C2-C3炔基。通过ChuanShih等在药物化学杂志第35卷(1992)，1109-1116中描述的类似方法制备通式XVI醛。用亚甲基转移剂(优选亚甲基-三苯基正膦)完成该醛的烯化作用。
将通式XIV化合物与二羟基化试剂(优选四氧化锇)在适当氧化剂(优选甲基吗啉-N-氧化物)存在下反应而得通式XVII化合物
其中B、C和Y如通式I定义；X如通式I定义，只是不为CH2；R6如通式II定义。
将通式XVII化合物与磺酰化试剂(优选对苯甲磺酰氯或甲磺酰氯)在非亲核碱(优选三乙胺或二异丙基乙胺)存在下反应制备中间体单磺酰化合物。将该中间体与强碱(优选氢化钠)反应而得通式XVIII化合物
其中B、C、X、Y和R6如通式XVII定义。
将通式XVIII的环氧化物与含氮亲核试剂(优选叠氮化钠)在中度Lewis酸催化剂(优选高氯酸锂或高氯酸镁)存在下反应而得中间体叠氮化醇。优选将此中间体与氢气在金属催化剂存在下还原，然后用适当氮保护基(优选叔丁氧羰基、苄氧羰基或苄基)保护而得通式VII’化合物
其中B、C、X、Y和R6如通式XVII定义；R4和R5如通式VI定义。
然后将通式VII’化合物与酰化剂或磺酰化剂(优选甲磺酰氯或对甲苯磺酰氯)在非亲核碱(优选三乙胺或二异丙基乙胺)存在下于适当溶剂(至少一种反应物至少是部分可溶于其中)中反应而得活化羟基。用适当亲核试剂(优选硫代酸盐，更优选硫代乙酸盐)取代活化羟基而得通式VIII’化合物
其中A如通式I定义；B、C、X、Y和R6如通式XVII定义；Ac是酰基，优选乙酰基。
另外，可用三苯膦、氮杂二羧酸二乙酯或二甲酯和酸性亲核试剂(优选硫代乙酸)在适当溶剂中将通式VII’化合物一步转化为通式VIII’化合物。
用亲核碱(优选碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾)在适当醇溶剂(优选甲醇、乙醇或异丙醇)中在烷基化试剂(优选氯代丙二酸二甲酯或二乙酯)存在下处理通式VIII’化物而得通式IX’化合物
其中A如通式I定义；B、C、X、Y和R6如通式XVII定义；R4和R5如通式VI定义。
在适于除去R4和R5保护基其一或两者的条件下处理通式IX’化合物而
其中A如通式I定义；B、C、X、Y和R6如通式XVII定义。当保护基为叔丁氧羰基时，除去该基团的条件优选是先用三氟乙酸处理，然后中和而得X’化合物。
将通式X’化合物与烷化剂(优选四氟硼酸三甲基氧鎓或四氟硼酸三乙基氧鎓)在适当溶剂(优选二氯甲烷)中反应而形成中间体内酰亚胺醚。将该中间体内酰亚胺醚与胍在醇溶剂(优选甲醇、乙醇或异丙醇)中反应而形成XI’化合物
其中A如通式I定义；B、C、X、Y和R6如通式XVII定义。
另外，将通式X’化合物与硫醇试剂(优选P2S5或2，4-二(4-甲氧基苯基)-1，3-二硫-2，4-二膦烷-2，4-二硫化物)反应形成硫内酰胺中间体而使通式X’化合物转化为通式XI’化合物。然后将其先用烷化剂(优选甲基碘或四氟硼酸三甲基氧鎓或四氟硼酸三乙基氧鎓)然后用胍在醇溶剂(优选甲醇、乙醇或异丙醇)中烷化而得通式XI’化合物。
在碱性条件下将通式XI’化合物水解而形成通式XII’化合物
其中A如通式I定义；B、C、X、Y和R6如通式XVII定义。当通式XI’化合物中R6是氢时，则不必进行水解反应，然后将通式XI’化合物如下进行肽连接。
通过本领域专业人员熟知的方法用谷氨酸二酯盐酸盐将游离羧酸形式的通式XII’化合物(或者其中R6是氢的通式XI’化合物)进行肽连接而形成通式XIII’二酯
其中A如通式I定义；B、C、X和Y如通式XVII定义；R1和R2各自独立地与所连接的CO2形成易于水解的酯基，其可为如C1-C6烷基、羟基烷基、烷基芳基或芳基烷基。
最后，如果需要游离酸形式，可将通式XIII’化合物水解而得R1和R2为H的通式I化合物。
通式I优选的化合物包括(4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸)二乙酯；4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸；4-[3-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-丙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸；4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6l[1，4l噻嗪-6-基)-乙基]-3-甲基-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸；以及4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][ 1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-呋喃基氨基-L-谷氨酸。
本发明化合物含有一个或多个手性中心。本发明包括了外消旋混合物和非对映体以及光学活性化合物，例如基本上不含其它光学异构体的化合物，所述光学活性化合物可通过本领域专业人员已知的方法获得。
通式I优选化合物的详细合成方法如下实施例所述。实施例4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸(化合物1)
5-溴代-2-噻吩甲酸甲酯2的制备
按照S.Gronowitz在Ark.Kemi 8，1995，87和S.O.Lawesson在Ark.Kemi 11，1957，337中描述的方法制备化合物2(CAS Reg.No.[62224-19-5])。
5-乙炔基-2-甲酸甲酯基噻吩3的制备
在搅拌下的5克(22.7毫摩尔)溴化物3、160毫克(0.23毫摩尔)氯化三苯膦钯(II)和65毫克(0.34毫摩尔)碘化亚铜的75毫升二乙胺溶液中加入4.8毫升(34毫摩尔)三甲基甲硅烷乙炔。于25℃搅拌所得溶液。18小时后，减压除去溶剂，将粗残余物溶于300毫升乙醚中，用100毫升1N盐酸和100毫升饱和碳酸氢盐溶液提取。干燥(硫酸钠)有机层，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用5％乙醚/己烷洗脱而得4.4克(81％产率)的黄色固体状甲硅烷基保护的产物。将该产物直接用于下一步骤。
在4.4克(18.5毫摩尔)上述甲硅烷基保护的乙炔50毫升二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入3.3克(35.2毫摩尔)一水氟化钾。在25℃15分钟后，将混合物倒入500毫升乙醚中，用100毫升水提取四次(4×100毫升水)。干燥(硫酸钠)有机溶液，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用10％乙醚/己烷洗脱而得2.65克(86％产率)的橙色固体状所需产物3。 NMR(CDCl3)δ3.45(s，1H)，3.88(s，3H)，7.22(d，1H，J＝3.5Hz)，7.65(d，1H，J＝3.5Hz).
元素分析C8H6SO2理论值C，57.81；H，3.64；S，19.29实测值C，57.91；H，3.71；S，19.18。
也可用另一方法如下除去甲硅烷基。在搅拌下的3.7克(0.02摩尔)无水碳酸钾的700毫升甲醇悬浮液中加入如上制备的59.7克甲硅烷基乙炔固体。于35℃搅拌该悬浮液2小时，然后蒸发掉甲醇。将残余物加到50毫升水中，用3×150毫升乙醚提取，干燥(硫酸钠)合并的有机部分并蒸发。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用7％乙醚/己烷洗脱而得98％产率(38.72克)的所需产物3。
N-(叔丁氧羰基)-甘氨酸4的制备
于-78℃在搅拌下的2克(12.4毫摩尔)N-(叔丁氧羰基)-2-羟基-乙胺(从Sigma Chemicals获得)的80毫升二氯甲烷溶液中加入1.3毫升(18.6毫摩尔)二甲基亚砜(DMSO)和1.2毫升(13.7毫摩尔)草酰氯。5分钟后，加入5.4毫升(38.4毫摩尔)三乙胺，使溶液升温至25℃。将该混合物倒入200毫升乙醚中，用100毫升水、100毫升0.5N HCl和100毫升饱和碳酸氢盐溶液提取。干燥(硫酸钠)有机部分，减压除去溶剂。将粗醛溶于100毫升苯中，于减压下再次除去溶剂。将此不稳定的粗产物立即用于下一步骤。
4-N-(叔丁氧羰基)-3-羟基-1-(2-甲酯基-5-噻吩)-丁炔5的制备
-78℃时，在1.7克(10.2毫摩尔)乙炔3的10毫升无水四氢呋喃(THF)溶液中加入14.3毫升(14.0毫摩尔)1M的二-三甲基甲硅烷酰胺的THF溶液。10分钟后，滴加入上述粗醛4的5毫升无水THF溶液。与-78℃搅拌反应10分钟，经20分钟升温至0℃。向其中加入5毫升饱和氯化铵水溶液。将该混合物倒入200毫升乙醚中，用100毫升水和50毫升饱和氯化钠溶液洗涤。干燥(硫酸钠)有机层，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用10-40％乙酸乙酯/己烷洗脱而得0.96克(29％)淡黄色油状所需醇5。
NMR(CDCl3)δ1.46(s，9H)，3.38 and 3.58(AB，2H，J＝3，7Hz)，3.88(s，3H)，4.71(dt，1H，J＝2.9，5.2Hz)，5.05(brs，1H)，7.15(d，1H，J＝3.9Hz)，7.64(d，1H，J＝3.9Hz).IR(neat)2978.3，1729.5，1685，1523，1452，1368，1286，1167，1098，959，822，750.4cm-1.高分辨率质谱，计算值C15H19NO5SM+Cs+，458.0038.实测值458.0051.
5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-羟基)-丁基]-噻吩基-2-甲酸甲酯6的制备
在搅拌下的940毫克(2.89毫摩尔)上述乙炔5的50毫升乙酸乙酯溶液中加入320毫克5％Pd/C。将该混合物置于40psi下的氢气中，于25℃搅拌17小时。通过硅藻土过滤混合物，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用20％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱而得800毫克(84％产率)黄色油状所需醇。NMR(CDCl3)δ1.44(s，9H)，1.81(m，2H)，2.28(brs，1H)，2.99(m，2H)，3.10 and 3.29(AB，2H，J＝3，6.9Hz)，3.74(m，1H)，3.86(s，3H)，4.89(brs，1H)，6.82(d，1H，J＝3.7Hz)，7.63(d，1H，J＝3.7Hz).计算值C15H23NO5SC，54.69；H，7.04；N，4.25；S，9.73.实测值C，54.79；H，7.02；N，4.29；S，9.63.
另一制备醇6的方法使用如下二-叔丁氧羰基烯丙胺14。
二-叔丁氧羰基烯丙胺14的制备
在57.10克(1.0摩尔)的烯丙胺和1.2克(0.01摩尔)的二甲基氨基吡啶(DMAP)的500毫升乙腈溶液中加入220克(1摩尔)(t-BOC)2O的100毫升乙腈溶液，将所得混合物搅拌6小时。用甲苯(100毫升)稀释反应混合物，于60℃减压蒸发溶剂。将所得油再次溶于乙腈(40毫升)中，加入1.2克(0.01摩尔)DMAP，在此溶液中缓慢加入220克(1摩尔)(t-BOC)2O的100毫升乙腈溶液。于60℃搅拌反应混合物12小时，与60℃减压蒸发溶剂，加入稀碳酸氢钠(100毫升)。将其用3×150毫升二氯甲烷提取，合并的有机层用盐水洗涤，干燥(硫酸钠)并蒸发。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用5-20％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱而得156.9克(63％产率)澄清晶状固体所需产物14。(m.p.43-44℃)1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.5(s，18H)，4.18(dd，2H，J＝15Hz，J＝1Hz)，5.14(ddd，2H，J＝15Hz，J＝10Hz，J＝1Hz)，5.85(ddt，2H，J＝10Hz，J＝5Hz，J＝1Hz).IR(KBr)2978，2935，2860，1724，1689，1342，1130cm-1.计算值C13H23NO4C，60.68；H，9.01；N，5.44.实测值C，60.78；H，9.04；N，5.50.1-(二叔丁氧羰基氨基)-2-乙醛15的制备
在-78℃将0.60克(2.34毫摩尔)二-叔丁氧羰基烯丙胺14的20毫升二氯甲烷溶液臭氧化(40伏特，500安培，1.01/分钟，氧气@3psi)直至蓝色稳定，加入10毫升二甲硫醚，于25℃搅拌该混合物14小时。将该混合物加到稀盐水中，用二氯甲烷提取(3×50毫升)，干燥(硫酸钠)有机部分并蒸发。闪式硅胶色谱后得到603毫克(99％产率)的澄清晶状固体所需产物15(熔点37-39℃)。
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.50(s，18H)，4.38(s，2H)，9.55(s，1H).IR(KBr)2984，2935，2724，1792，1734，1699，1362，1153cm-1.计算值C12H21NO5C，55.58；H，8.16；N，5.40.实测值C，55.20；H，8.19；N，5.19.
5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-羟基)-丁基]-噻吩基-2-甲酸甲酯6的制备-78℃下在9.64克(59毫摩尔)5-乙炔基-2-甲酯基噻吩3的THF(250毫升)溶液中加入65.6毫升(60毫摩尔)六甲基二硅烷叠氮化锂(LiHMDS)，于-78℃搅拌该混合物2小时。将15.6克(60毫摩尔)1-(二叔丁氧羰基氨基)-2-乙醛15的THF(40毫升)溶液加到反应混合物中，将反应混合物于-78℃搅拌8小时。加入3.4毫升(60毫摩尔)乙酸的甲醇(10毫升)溶液骤冷，搅拌混合物10分钟升温至0℃，加入水(60毫升)。用乙酸乙酯提取(3×100毫升)，有机提取物用稀碳酸氢钠洗涤并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂得约50毫升。在此所得残余物中加入乙酸乙酯(125毫升)，将该溶液加到含有7.38克(30重量％的乙炔起始物)5％披钯碳的Parr瓶中，于55psi氢气中氢化24小时。通过硅藻土过滤粗氢化产物，滤饼用甲醇(100毫升)和乙酸乙酯(100毫升)洗涤。减压蒸发溶剂，通过硅胶过滤粗残余物，用50％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，蒸发溶剂。将残余物溶于20毫升甲醇-苯(50毫升)共沸物中，再溶于无水甲醇(20毫升)中。将该混合物加到新制的60毫升(2M)甲醇钠的甲醇溶液中。搅拌反应混合物45分钟，加入稀盐酸(0.1M，50毫升)，用乙酸乙酯提取(3×75毫升)。合并有机部分，用pH 7的缓冲液(1M)洗涤，干燥(硫酸钠)并蒸发。将粗残余物在闪式硅胶上进行色谱，用40％乙酸乙酯/己烷洗脱而得9.32克(48％产率)的所需产物6。
5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-乙酰硫代)-丁基]-2-噻吩甲酸甲酯7的制备
0℃在搅拌下的9.26克(28.1毫摩尔)醇6的100毫升THF溶液中加入5.9毫升(42毫摩尔)三乙胺(TEA)和2.4毫升(31毫摩尔)甲磺酰氯。20分钟后，加入100毫升DMF和12.8克(110毫摩尔)硫代乙酸钾，将所得溶液升温至25℃。3天后，将混合物倒入500毫升水中，用800毫升乙醚提取。有机层用200毫升水、200毫升1N盐酸、200毫升饱和碳酸氢盐溶液和100毫升饱和氯化钠溶液洗涤。干燥(硫酸镁)有机层，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用25％乙酸乙酯/己烷洗脱后而得10.3克(95％产率)黄色油状所需硫代乙酸盐7。
NMR(CDCl3)δ1.44(s，9H)，1.91 and 2.04(ABm，2H)，2.37(s，3H)，2.96(m，2H)，3.36(m，2H)，3.61(m，1H)，3.86(s，3H)，4.74(brs，1H)，6.79(d，1H，J＝3.6Hz)，7.62(d，1H，J＝3.6Hz).IR(neat)3366，2976.4，1713，1520，1462.1，1366，1290.5，1267.3，1169，1098，752，631cm-1.高分辨率质谱，计算值C17H25NO5S2M+Cs+，520.0229.实测值520.0240.
5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-(二甲基丙二酰基)硫代)-丁基]-2-噻吩甲酸甲酯8的制备
0℃在10.2克(26毫摩尔)搅拌下的上述硫代乙酸盐7的200毫升无水甲醇溶液中加入7.2克(52毫摩尔)碳酸钾和3.7毫升(29毫摩尔)氯代丙二酸二甲酯。3小时后，将混合物倒入500毫升水中，用乙醚提取(3×500毫升)。合并的有机层用500毫升水和200毫升饱和氯化钠溶液洗涤，干燥(硫酸镁)。减压除去溶剂，将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用30％乙酸乙酯/己烷洗脱而得11.46克(93％产率)淡黄色油状所需硫醚8。
NMR，(CDCl3)δ1.44(s，9H)，1.85 and 2.00(ABm，2H)，3.03 (m，3H)3.30(m，2H)，3.80(s，6H)，3.86(s，3H)，5.10(brs，1H)，6.82(d，1H，J＝3.8Hz)，7.63(d，1H，J＝3.8Hz).IR(neat)3442，2974，2955，1734，1713，1512，1460，1435，1366，1291，1267，1167，1098，1022，752cm-1.高分辨率质谱，计算值C20H29NO8S2M+Cs+，608.0389.实测值608.0370.
6-[(5-甲酯基噻吩-2-基)-乙基]-2-甲酯基-3-氧代-3，4，5，6-四氢-[1，4]-噻嗪9的制备
0℃在搅拌下的470毫克(0.99毫摩尔)上述硫醚8的12毫升二氯甲烷溶液中加入4毫升三氟乙酸(TFA)。1.5小时后，将混合物倒入50毫升饱和碳酸氢钠溶液中并用二氯甲烷提取(4×100毫升)。减压除去溶剂，将粗残余物溶于10毫升甲醇中。于25℃搅拌1.5小时后，减压除去溶剂，将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用40％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱而得298毫克(88％产率)无色油状所需内酰胺9。
NMR(CDCl3)δ1.94(m，2H)，3.01(m，2H)，3.4-3.7(m，4H)，3.80 and 3.82(s，3H)，3.87(s，3H)，6.25(brs，1H，)，6.83(d，1H，J＝3.7Hz)，7.64(d，1H，J＝3.7Hz).IR(KBr)2951，1732，1669，1462，1294，1267，1194，1157，1098，1005，752cm-1.计算值C14H17NO5S2C，48.96；H，4.99；N，4.08；S，18.67.实测值C，49.06；H，4.93；N，4.09；S，18.60.[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩甲酸甲酯10的制备
在搅拌下的上述内酰胺9的150毫升无水二氯甲烷溶液中即刻加入1.06克(7.2毫摩尔)四氟硼酸三甲基氧鎓。于25℃搅拌该溶液6小时。将所得混合物倒入50毫升10％碳酸钾水溶液中，用二氯甲烷提取(3×200毫升)。干燥(硫酸镁)合并的有机层，减压除去溶剂。将所得产物直接用于下一步骤。
将1.58克(16.6毫摩尔)无水盐酸胍置于分液瓶中。向其中加入600毫升无水甲醇。将干燥氩气通入溶液中10分钟，然后加入926毫克(17.1毫摩尔)无水甲醇钠。将上述制备的粗内酰胺醚的20毫升甲醇溶液经套管加到所得混合物中。在氩气下回流溶液20小时。用1N盐酸调节PH值至4，减压除去溶剂。将粗残余物溶于500毫升氯仿中，用2×100毫升水洗涤。干燥(硫酸镁)合并的有机层，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用5-10％甲醇/二氯甲烷洗脱而得413毫克灰白色固体。然后将此产物溶于25毫升热甲醇中，经18小时缓慢冷却至4℃。过滤收集固体而得180毫克(9％产率)淡黄色固体状所需嘧啶酮。
NMR(d6-DMSO)δ1.72(m，1H)，1.88(m，1H)，2.8-3.22(m，4H)，3.50(dt，1H，J＝2，8Hz)，5.99(brs，2H)，6.64(brs，1H)，6.98(d，1H，J＝3.8Hz)7.62(d，1H，J＝3.8Hz)，10.02(brs，1H).高分辨率质谱，计算值C14H16N4O3S2M+Na+，375.0562.实测值375.0550.
也可如下制备嘧啶酮10。在搅拌下的500毫克(1.46毫摩尔)内酰胺9的20毫升无水THF溶液中加入648毫克(1.60毫摩尔)Lawesson’s试剂(2，4-二(4-甲氧基苯基)-1，3-二硫-2，4-二磷烷-2，4-二硫醚)。于25℃搅拌混合物20小时后，将其倒入50毫升饱和碳酸氢盐溶液中，用2×200毫升乙酸乙酯提取。合并的有机层用50毫升饱和氯化钠溶液洗涤，干燥(硫酸镁)，减压除去溶剂。将粗硫内酰胺在硅胶上进行闪式色谱，用8％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱而得525毫克相应的硫内酰胺11
将该产物直接用于下一步骤。
在525毫克硫内酰胺11的10毫升无水THF和10毫升无水甲醇混合物中加入1.6毫升1N氢氧化钠。向其中加入0.1毫升(1.6毫摩尔)甲基碘而得甲基化的硫内酰胺，不必纯化而将其用于下步。将1.39克(14.6毫摩尔)无水盐酸胍置于分液瓶中。向其中加入300毫升无水甲醇。将干燥氩气通入溶液10分钟，然后加入796毫克(14.7毫摩尔)无水甲醇钠。经套管向所得混合物中加入如上制备的粗甲基化硫内酰胺。在氩气下回流溶液48小时。用1N盐酸调节PH值至4，减压除去溶剂。将粗残余物溶于500毫升氯仿中，用2×100毫升水洗涤。干燥(硫酸镁)有机层，减压除去溶剂。将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用5-10％甲醇/二氯甲烷洗脱。然后将产物溶于20毫升热甲醇中，经18小时冷却至4℃。过滤收集得131毫克(9％产率)所需嘧啶酮10。[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩甲酸12的制备
在180毫克(0.51毫摩尔)嘧啶酮10中加入5毫升1N氢氧化钠水溶液。于25℃搅拌所得溶液20小时。冷却至0℃后，用1N盐酸调节PH值至2。滤除褐色固体，用水洗涤，真空干燥得111毫克(64％产率)淡褐色固体状所需酸12。NMR(d6-DMSO)δ1.72(m，1H)，1.92(m，1H)，2.78-3.68(m)，6.07(brs，2H)，6.68(brs，1H)，6.92(d，1H，J＝3.7Hz)，7.52(d，1H，J＝3.7Hz)，10.12(brs，1H)，12.8 9(brs，1H).高分辨率质谱，计算值C13H14N4O3S2M+，338.0507.实测值338.0517.
4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸二乙酯13的制备
在搅拌下的110毫克(0.33毫摩尔)上述酸12的5毫升无水DMF溶液中加入48毫克(0.36毫摩尔)1-羟基苯并三唑水合物、62微升(0.36毫摩尔)二异丙基乙胺、86毫克(0.36毫摩尔)谷氨酸二乙酯盐酸盐和106毫克(0.36毫摩尔)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺甲基碘化物。于25℃氩气下搅拌所得溶液20小时，然后倒入50毫升水。用2×150毫升乙酸乙酯提取水层。合并的有机层用3×50毫升水和10毫升饱和氯化钠溶液反萃取，然后干燥(硫酸镁)。减压除去溶剂，将粗残余物在硅胶上进行闪式色谱，用0-10％甲醇/二氯甲烷洗脱而得120毫克(71％产率)淡黄色无定形固体状的所需酰胺13。
NMR(d6-Acetone)δ1.20(m，6H)，2.2(m，1H)，2.46(t.1H，J＝7.6Hz)，2.78(s，1H)，2.82(s，1H)，2.92-3.1(m，2H)，3.41(m，1H)，3.72(dt，1H，J＝3.0，12.7Hz)，4.02-4.2(m，4H)，4.58(m，1H)，5.90(brs，1H)，6.05(brs，1H)，6.90(d，1H，8。J＝3.8Hz)，7.58(d，1H，J＝3.8Hz)，7.78(d，1H，J＝8Hz).高分辨率质谱，计算值C22H29N5O6S2M+H+，524.1638.实测值524.1650.
4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，41噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸1的制备在上述115毫克(0.22毫摩尔)二乙酯13中加入3毫升1N氢氧化钠水溶液。将所得混合物于25℃搅拌14小时。冷却至0℃后，用盐酸水溶液调节PH值至3.5。过滤固体，用水洗涤，真空干燥而得82毫克(80％产率)灰白色固体状的所需酸。
NMR(d6-DMSO)δ1.62-2.02(m，4H)，2.27(m，2H)，2.78-3.00(m，3H)，4.27(dd，1H，J＝6，6.8Hz)，6.00(brs，2H)，6.63(brs，1H)，6.88(d，1H，J＝3.7Hz)，7.63(d，1H，J＝3.7Hz)，8.37(d，1H，J＝7.4Hz)，10.05(brs，1H)，12.85(brs，2H).IR(KBr)3371，1700，1643，1543，1345cm-1.
高分辨率质谱C18H21N5O6S2理论值M＋H+，468.1012，实测值468.1025。元素分析C18H21N5O6S2·1.5H2O理论值C，43.71；H，4.89；N14.16；S，12.97实测值C，43.50；H4.67；N14.07；S，12.72生物学和生物化学评价GAR转甲酰酶抑制常数的确定将Young等在生物化学23(1984)，3979-3986中的GAR-转甲酰酶(GARFT)分析方法修饰后用于如下。反应混合物含有人GARFT催化区、0-250nM化合物1、20uM甘氨酰胺核糖核苷酸(GAR)、10或20uMN10-甲酰基-5，8-脱氮杂叶酸(FDDF)、50mMHEPES-KOH(PH 7.5)和50mMKCl。加入酶使终浓度为11nM而启动反应，然后监测20℃在294nm的吸收增加(e294＝18.9mM-1cm-1)。
GARFT抑制常数(Ki)是由稳态催化率对抑制剂和底物浓度的依赖性所决定的。表观Ki(Ki，app)对FDDF浓度的依赖决定了抑制类型为对FDDF竞争性抑制，由下式描述Ki，app＝Ki+(Ki/Km)[FDDF]。FDDF的Michaelis常数，即Km，独立地由催化率对FDDF浓度的依赖性决定。Km和Ki数据符合非线性方法的Michaelis等式，或者竞争性抑制Michaelis等式。分析从紧密结合抑制中得到的数据，将数据代入非线性方法Morrison紧密结合等式(Biochem Biophys Acta 185(1969)，269-286)而得Ki。
细胞系使用的细胞系及其起源列于表1中。每一细胞系的生长状况和培养基要求如表2所示。将所有的培养基保持在37℃，5％空气-二氧化碳的潮湿保温箱中。
体外生长抑制在10mM碳酸氢钠水溶液中制备抑制剂储备液，于-20℃以1毫升等分试样保存以用于细胞培养实验。通过修饰后的Mosmann方法(J.Immuol.Methods 65(1983))测量细胞生长抑制。
在含有渗析后小牛血清(Hyclone Laboratories Inc.，Logan，UT)的新制RPMI生长培养基(Mediatech，washington，DC)中将每个细胞系的对数中期相细胞稀释至18500细胞/毫升，然后等分成96孔微滴定板的2至12组。第1组填充有等体积(135毫升)的无细胞新制培养基以用作空白。然后将板置于37℃、5％空气-二氧化碳的保温箱中。1至4小时后，取出板，然后在12至4组中加入化合物1(10×终浓度，15毫升/孔，二等分稀释法)。在逆向实验中，所有的药物溶液(终浓度175mM)中都含有次黄嘌呤(1.75mM)或AICA(1.75mM)。在每板上制备四份含有化合物1每个浓度的孔。将15毫升不含化合物1的培养基加到板1组的孔中。然后将细胞放入保温箱中，直至完成培养期。L1210和L1210/CI920细胞的第3天或CCRF-CEM细胞的第5天，将溶于组织培养基中的50毫升0.8mg/ml MTT((4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑；Sigma catalog no.M2128)加到所有板的每个孔中，然后再放到保温箱中。4小时后，取出板，在1200rpm离心7分钟。吸掉培养基，将150毫升DMSO加到所有板中的孔中。然后于室温暗处在涡旋混合器中缓慢混合板。于540nm在Molecular DevicesVmax动力学微板读数器上用分光光度法测量被代谢的MTT量。通过MTT代谢测定的50％抑制细胞生长所需药物的浓度通过内推法在对照O.D.(减空白)上及低于50％O.D.(减空白)确定。
表1用于体外研究的细胞系的组织起源和根源细胞系 根源 起源L1210 ATCC#小鼠，淋巴细胞白血病CCRF-CEMATCC#人，急性成淋巴细胞白血病#ATCC＝美国典型培养物中心表2微滴定分析中使用的培养基状况、板密度和培养时间细胞系 培养基 DFCS 板密度培养时间浓度(％)*(细胞/孔) (天)L1210 RPMI-1640 5 2500 3CCRF-CEM RPMI-1640 102500 5DFCS浓度*＝渗析后小牛血清浓度。
表3连续(72小时)接触后化合物1生长抑制数据化合物 GARFTKiIC50细胞培养IC50细胞培养(nM) L1210(nM)aL1210(nM)a14.5 16 4.3a平均IC50±标准偏差体内抗肿瘤活性第零天时，将6C3HED淋巴肉瘤的2mm2套针片段于腋部皮下植入到6C3H/He雌性大鼠各组。第一天开始，将试验化合物的40％Encapsin溶液每日一次腹膜内给药9天。对照组动物接受相同处理，只是没有试验化合物。下表4所示的抑制百分数是通过比较第11天对照组(仅接受稀释剂)与接受测试化合物组的肿瘤质量计算而得的。
表4化合物剂量(mg/kg) 抑制百分数存活数1 12.5100 6/61 25 100 3/61 50 毒性0/6在第零天，将C3H/BA乳腺癌的2mm2套针片段经腋部皮下植入到6C3H/He雌性大鼠各组。从第一天开始，将试验化合物的40％Encapsin溶液每日一次腹膜内给药九天。除不使用试验化合物外，对照组动物接受同样的处理。抑制百分数是通过比较第14天对照组(仅接受稀释剂)与接受试验化合物组的肿瘤重量计算而得。
结果概述于表5。
表5化合物剂量(mg/kg) 抑制百分率存活数1 5 16 5/61 10 84 6/61 20 100 3/6可以对本发明的方法和产品作出各种修饰和改变，这对于本领域技术人员是显而易见的。
如可能，本文列举的化学基团可以被取代。在一些情况下，这种可能性通过列举例如取代或未取代的C1-C3烷基而变得明确。
当本文的任何结构式中列举了一个以上的R6基团时，每一个R6均可以彼此独立地选自以上给出的可能基团。
40.根据权利要求39的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫。
41.根据权利要求39的化合物[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩酸。
42.如下结构式的化合物
43.根据权利要求42的光学活性的化合物。
44.根据权利要求43的化合物，具有如下结构
45.根据权利要求43的化合物，具有如下结构
权利要求
1.一种结构式I的化合物或其可药用的盐
其中A是氧、硫或硒；X是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R1和R2彼此独立的是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团。
2.根据权利要求1的化合物或盐，其中X是CH2、CH2CH2、NH、氧、硫、CH(CH2OH)或NCH3。
3.根据权利要求1的化合物或盐，其中Y是硫或氧，B是氢，C是氢或CH3。
4.根据权利要求3的化合物或盐，其中A是硫，Y是硫，R1和R2均是氢。
5.根据权利要求4的化合物或盐，其中X是CH2。
6.根据权利要求1的化合物或盐，其中R1和R2彼此独立地选自氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基和芳烷基。
7.根据权利要求6的化合物或盐，其中R1和R2彼此独立地选自氢或C1-C2烷基。
8.根据权利要求7的化合物或盐，其中A是硫，Y是硫，X是CH2。
9.根据权利要求8的化合物或盐，其中B是氢，C是氢，R1和R2均是氢。
10.根据权利要求1的化合物，该化合物选自(4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]2，5-噻吩氨基-L-谷氨酸)二乙酯；4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]2，5-噻吩氨基-L-谷氨酸；4-[3-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-丙基]2，5-噻吩氨基-L-谷氨酸；4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-3-甲基-2，5-噻吩氨基-L-谷氨酸；和4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-呋喃氨基-L-谷氨酸。
11.一种药物组合物，含有(i)有效量的结构式I的化合物或其药用盐
其中A是氧、硫或硒；X是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R1和R2的每一个是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团；和(ii)可药用的载体、赋性剂或稀释剂。
12.根据权利要求11的药物组合物，其中X是CH2、CH2CH2、NH、氧、硫、CH(CH2OH)或NCH3。
13.根据权利要求11的药物组合物，其中Y是硫或氧，B是氢，C是氢或CH3。
14.根据权利要求13的药物组合物，其中A是硫，Y是硫，X是CH2。
15.根据权利要求14的药物组合物，其中C是氢，R1和R2均是氢。
16.一种抑制微生物或高等生物细胞的生长或增殖的方法，包括向哺乳动物或鸟类宿主施用有效量的结构式I的化合物或其药用盐
其中A是氧、硫或硒；X是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R1和R2的每一个是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团。
17.根据权利要求16的方法，其中X是CH2、CH2CH2、NH、氧、硫、CH(CH2OH)或NCH3。
18.根据权利要求16的方法，其中Y是硫或氧，B是氢，C是氢或CH3。
19.根据权利要求18的方法，其中A是硫，Y是硫，X是CH2。
20.根据权利要求19的方法，其中C是氢，R1和R2均是氢。
21.结构式VI的化合物
其中Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R6是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团；并且R4和R5彼此独立的是氢或易脱除的氮保护基。
22.根据权利要求21的化合物，其中Y是硫；B是氢；C是氢；R6是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基；R4和R5彼此独立的是氢、叔丁氧羰基、苄氧羰基或苄基。
23.根据权利要求21的化合物其为4-N-(叔丁氧羰基)-3-羟基-1-(2-甲酯基-5-噻吩)-丁炔。
24.结构式VII″的化合物
其中X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；A是氧、硫或硒；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；R6是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团；并且R4和R5彼此独立的是氢或易脱除的氮保护基。
25.根据权利要求24的化合物，其中X’是CH2；Y是硫；B是氢；C是氢；R6是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基；R4和R5彼此独立的是氢、叔丁氧羰基、苄氧羰基或苄基。
26.根据权利要求24的化合物，其为5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-羟基)-丁基]-噻吩基-2-甲酸甲酯。
27.结构式VIII″的化合物
其中X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；R6是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团；R4和R5彼此独立的是氢或易脱除的氮保护基；并且Ac是酰基。
28.根据权利要求27的化合物，其中X’是CH2；Y是硫；B是氢；C是氢；R6是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基；R4和R5彼此独立的是氢、叔丁氧羰基、苄氧羰基或苄基。
29.根据权利要求27的化合物，其为5-[(4-N-(叔丁氧羰酰基)-氨基-3-乙酰基硫代)-丁基]-2-噻吩甲酸甲酯。
30.结构式IX″的化合物
其中A是氧、硫或硒；X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；每一个R6彼此独立的是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团；并且R4和R5彼此独立的是氢或易脱除的氮保护基。
31.根据权利要求30的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫；B是氢；C是氢；R6是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基；R4和R5彼此独立的是氢、叔丁氧羰基、苄氧羰基或苄基。
32.根据权利要求30的化合物其为5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-(二甲基丙二酰基)硫代)-丁基]-2-噻吩甲酸甲酯。33.结构式X″的化合物
其中A是氧、硫或硒；X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且每一个R6彼此独立的是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团。
34.根据权利要求33的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫；B是氢；C是氢；每一个R6彼此独立的是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基。
35.根据权利要求33的化合物，其为6-[(5-甲酯基噻吩-2-基)-乙基]-2-甲酯基-3-氧代-3，4，5，6-四氢-[ 1，4]-噻嗪。
36.结构式XI″的化合物
其中A是氧、硫或硒；X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R6是氢或与相连的CO2形成易于水解的酯基的基团。
37.根据权利要求36的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫；B是氢；C是氢；R6是氢、C1-C6烷基、羟烷基、烷芳基或芳烷基。
38.根据权利要求36的化合物，其为[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩甲酸甲酯。
39.结构式XII″的化合物
其中A是氧、硫或硒；X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氢或卤素；C是氢、卤素或取代或未取代的C1-C6烷基。
40.根据权利要求39的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫。
41.根据权利要求39的化合物，其为[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩酸。
全文摘要
本发明涉及化合物，例如与其4-羟基互变异构体处于平衡的化合物(1)，及其可药用的盐。这些化合物可用作甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶(GARFT)抑制剂或抗增殖药物。本发明还涉及应用这些化合物作为GARFT抑制剂或抗增殖药物的药物组合物及方法。本发明还涉及用于制备这些化合物的中间体化合物。
文档编号C07D417/06GK1159193SQ94195172
公开日1997年9月10日 申请日期1994年7月28日 优先权日1994年7月28日
发明者M·D·瓦尼, W·H·洛米尼斯, C·L·帕尔默 申请人:阿格罗尼制药公司
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