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2021-01-31 21:01:35|
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起点商标网 专利名称：一种制备纤维结合蛋白的方法
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本发明属生物化学，血液学，生物制品学领域，具体涉及一种制备纤维结合蛋白的方法。
纤维结合蛋白的提纯开始于70年代。1970年Mosesson MW等以冷沉淀为原料，用磷酸缓冲液溶解，分别加甘氨酸和乙醇沉淀后，再溶解，通过DEAE-纤维素柱，磷酸缓冲液洗脱获得纤维结合蛋白。所得的纤维结合蛋白含有纤维蛋白原，产生白色絮状沉淀，使制品的稳定性较差，得率较低，纯度较差。1971年Axen用抗纤维结合蛋白的抗体的亲和层析柱直接从新鲜血浆中吸附纤维结合蛋白，用盐酸-甘氨酸洗脱获得。这种方法首先需要纤维结合蛋白的专一抗体，其成本非常大，不适用于大规模生产。1973年Allen等用硫酸铵沉淀血浆，分离的沉淀物溶解后进行肝素-sepharose亲和层析，用氯化钠溶液洗脱获得纤维结合蛋白，此法获得的纤维结合蛋白纯度较差，稳定性不高。1977年Eva Engvall等根据纤维结合蛋白和明胶结合的特性，发展了明胶-sepharose 4B亲和层析分离纤维结合蛋白的较简单的方法，其利用纤维结合蛋白分子中可与明胶结合的功能区域，将明胶以共价键偶联在Sepharose 4B上，血浆或冷沉淀溶解液直接过柱，进行亲和层析后，再用起始缓冲液洗涤明胶柱，最后用尿素将纤维结合蛋白洗脱。但存在如下缺陷尿素洗脱液中由于含有多量纤维蛋白原(Fg)，而Fg是极不稳定的蛋白，在纯化的过程中，温度或其他因素的影响，会不断促使Fg变为纤维蛋白而析出，使样品出现白色絮状沉淀，将亲和柱堵塞，影响纯化过程。其次，因Fg和Fn相互结合，所以，当Fg变为纤维蛋白析出时，会使Fn以共沉淀的形式，形成Fn和Fg白色絮状沉淀，从而使Fn的回收率降低。第三，明胶-Sephorose4B亲和柱对纤维结合蛋白的吸附不专一，对Fg，等等也有吸附作用，同时，由于Fg与Fn的相互作用，使最终制品的纯度不高。最终制品中不能完全去除Fg，在含有Fg的Fn制品中，因Fg变为纤维蛋白，使制品溶液出现沉淀，会严重影响制品质量。第四，尿素对制品的生物活性有影响，高浓度的尿素会影响Fn的某些生物活性。
本发明通过下述步骤进行，1、用Tris-HCl缓冲液溶解冷沉淀，所述缓冲液其PH为7.0-8.5，含有柠檬酸三钠0.5-2.0％，氯化钠0.50-2.0％，溶解比例为1∶3-1∶20，溶解温度为5-40℃，溶解时间为1-3小时。
2、酒精沉淀将冷沉淀溶解液离心，转速为1000-4000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精溶液(含有柠檬酸三钠0.5-2.0％，氯化钠0.5-2.0％，0～-30℃)至浓度为3-30％，冰浴中搅拌30-60min，然后静置2-5h，低温离心，转速3000-7000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)，含有柠檬酸三钠0.5-2.0％，氯化钠0.50-2.0％，溶解至原体积，溶解液可控制在0-30℃。
3、第一步PEG沉淀酒精沉淀溶解液中加入浓度为40％的PEG溶液，至终浓度为4-15％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度在10-25℃之间，控制系统的PH在7.0-8.5之间，室温搅拌30分钟，静置30-60分钟后离心，转速3000-5000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀(此沉淀溶解即为纤维蛋白原制剂)。
4、第二步PEG沉淀第一步PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入5-25mlPEG溶液，控制系统的PH在7.0-8.5之间，温度在10-25℃之间，室温下搅拌30分钟，静置30-60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000-5000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)进行溶解至原体积。
5、离子交换层析取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)平衡QAE凝胶层析系统。共需要Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)三个柱床体积。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，上样流速为10-40ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)进行洗涤，其中氯化钠浓度为(0.05-0.14M)，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)进行洗脱，其中氯化钠浓度为(0.16-1.0M)，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
本发明所述实验材料及试剂冷沉淀为上海生物制品研究所提供，乙醇，聚乙二醇(MW4000)，QAE胶，兔抗人纤维结合蛋白血清，甘氨酸(Gly)，纤维结合蛋白标准品均为市购。
结果证实，用本发明提供的提纯方法，得到的纤维结合蛋白的纯度可达90％左右(紫外薄层扫描法)，其得率可达30.00％以上。表1为纤维结合蛋白纯化结果。
表1原液 酒精沉淀 PEG沉淀 PEG沉淀 QAE层析12Fn浓度 1.250.93 0.60 0.49 2.02mg/ml体积(ml) 50 50 5750 12得率(％) 100.0 74.4 54.72 39.238.78纯度(％) 11 19 5071 90本发明方法建立的工艺路线可以从冷沉淀中得到纤维结合蛋白。制备的纤维结合蛋白制剂其冻干制品的外观为白色，溶解度高，透明澄清。本方法确立了可用于规模化生产的制备纤维结合蛋白的工艺。本方法具有下述优点1)本发明提高最终制品的纯度及稳定性，能将病毒灭活处理步骤结合于其中。2)本方法适用于规模化生产，中间步骤少，简单易操作。3)本发明方法提供的提纯纤维结合蛋白的制备，周期短，有利于生产过程中无菌控制。4)本方法引入了阴离子层析路线，与已有亲和层析制备技术相比，本发明利用强阴离子柱QAE，其吸附纤维结合蛋白的能力明显高于明胶亲和柱；本发明所得的纤维结合蛋白纯度高；活性高；本发明因不采用溴化氰等活化剂活化Sepharose 4B，故对环境无污染。5)本方法同时可以制得纤维结合蛋白制剂和纤维蛋白原制剂，提高了冷沉淀的利用度，节约成本。本方法采用酒精沉淀纤维蛋白原和纤维结合蛋白后，再用PEG分离纤维蛋白原和纤维结合蛋白，同时可以制得纤维结合蛋白制剂和纤维蛋白原制剂。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(0℃)至浓度为4％，冰浴中搅拌40min，然后静置3h，低温离心，转速5000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.0，含有柠檬酸三钠0.60％，氯化钠0.50％进行溶解至原体积，溶解液温度为0℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为5％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为12℃，系统的PH控制在7.0，室温搅拌30分钟，静置30分钟，离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入7mlPEG溶液，系统的PH控制在7.0，温度控制在12℃，然后室温下搅拌30分钟，静置30分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.0，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.0，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为10ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.0，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.0进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.05M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.0进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.16M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例2从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀100g以1∶5溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.10，含有柠檬酸三钠0.70％，氯化钠0.90％，溶解温度为8℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为2000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-3℃)至浓度为6％，冰浴中搅拌40min，然后静置2h，低温离心，转速6000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.10，含有柠檬酸三钠0.70％，氯化钠0.90％进行溶解至原体积，溶解液温度为3℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为7％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为10℃，系统的PH控制在7.10，然后室温搅拌30分钟，静置40分钟，离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入9mlPEG溶液，系统的PH控制在7.10，温度控制在10℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.10，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.10，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为12ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.10，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.10进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.06M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.10进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.18M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例3从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀100g以1∶7溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.20，含有柠檬酸三钠1.00％，氯化钠0.90％，溶解温度为37℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-5℃)至浓度为8％，冰浴中搅拌40min，然后静置4h，低温离心，转速6000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.20，含有柠檬酸三钠1.00％，氯化钠0.90％进行溶解至原体积，溶解液温度为5℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为8％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为14℃，系统的PH控制在7.2，然后室温搅拌30分钟，静置60分钟，离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入10mlPEG溶液，系统的PH控制在7.2，温度控制在14℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.20，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.20，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为15ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.20，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.20进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.07M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.20进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.20M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例4从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶9溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.30，含有柠檬酸三钠1.00％，氯化钠1.00％，溶解温度为35℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-8℃)至浓度为10％，冰浴中搅拌50min，然后静置3h，低温离心，转速6000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.30，含有柠檬酸三钠1.00％，氯化钠1.00％进行溶解至原体积，溶解液温度为6℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为9％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为15℃，系统的PH控制在7.3，然后室温搅拌30分钟，静置40分钟，离心，转速4000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入11mlPEG溶液，系统的PH控制在7.3，温度控制在15℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.30，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.30，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为20ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.30，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.30进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.08M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.30进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.25M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例5从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶11溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.40，含有柠檬酸三钠1.30％，氯化钠1.20％，溶解温度为20℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-9℃)至浓度为12％，冰浴中搅拌40min，然后静置3h，低温离心，转速5000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.40，含有柠檬酸三钠1.30％，氯化钠1.20％进行溶解至原体积，溶解液温度为7℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40PEG％溶液，至终浓度为10％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为16℃，系统的PH控制在7.40，然后室温搅拌30分钟，静置50分钟，离心，转速4000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入12mlPEG溶液，系统的PH控制在7.40，温度控制在16℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.40，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.40，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为30ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.40，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.40进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.09M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.40进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.28M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例6从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶13溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.50，含有柠檬酸三钠1.50％，氯化钠1.0％，溶解温度为20℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-10℃)至浓度为14％，冰浴中搅拌50min，然后静置3h，低温离心，转速5000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，含有柠檬酸三钠1.50％，氯化钠1.00％进行溶解至原体积，溶解液温度为10℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为11％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为18℃，系统的PH控制在7.50，然后室温搅拌50分钟，静置50分钟，离心，转速4000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入14mlPEG溶液，系统的PH控制在7.50，温度控制在20℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为40ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.50进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.10M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.50进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.33M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例7从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶15溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.60，含有柠檬酸三钠1.30％，氯化钠1.50％，溶解温度为9℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-12℃)至浓度为16％，冰浴中搅拌30min，然后静置3h，低温离心，转速4000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.60，含有柠檬酸三钠1.30％，氯化钠1.50％进行溶解至原体积，溶解液温度为15℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为12％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为20℃，系统的PH控制在7.60，然后室温搅拌30分钟，静置40分钟，离心，转速4000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入16mlPEG溶液，系统的PH控制在7.60，温度控制在25℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.60，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.60，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为35ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.60，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.60进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.11M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.60进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.35M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例8从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶17溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.70，含有柠檬酸三钠1.10％，氯化钠1.00％，溶解温度为40℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-16℃)至浓度为18％，冰浴中搅拌40min，然后静置3h，低温离心，转速3000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.70，含有柠檬酸三钠1.10％，氯化钠1.00％进行溶解至原体积，溶解液温度为20℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为13％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为20℃，系统的PH控制在7.70，然后室温搅拌30分钟，静置50分钟，离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入18mlPEG溶液，系统的PH控制在7.70，温度控制在10℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速4000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.7，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.70，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为25ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.70，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.70进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.12M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.70进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.40M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例9从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶19溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.50，含有柠檬酸三钠1.70％，氯化钠0.80％，溶解温度为14℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-20℃)至浓度为20％，冰浴中搅拌40min，然后静置3h，低温离心，转速4000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，含有柠檬酸三钠1.70％，氯化钠0.80％进行溶解至原体积，溶解液温度为18℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为15％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为22℃，系统的PH控制在7.50，然后室温搅拌30分钟，静置50分钟，离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入20mlPEG溶液，系统的PH控制在7.50，温度控制在22℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为30ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.50进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.13M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.50进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.35M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例10
从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶20溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH8.00，含有柠檬酸三钠1.60％，氯化钠1.60％，溶解温度为17℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-22℃)至浓度为21％，冰浴中搅拌40min，然后静置3h，低温离心，转速4000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH8.00，含有柠檬酸三钠1.60％，氯化钠1.60％进行溶解至原体积，溶解液温度为17℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为14％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为25℃，系统的PH控制在8.0，然后室温搅拌40分钟，静置50分钟，离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入17mlPEG溶液，系统的PH控制在8.0，温度控制在25℃，然后室温下搅拌40分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH8.00，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH8.00，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为40ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH8.00，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH8.0进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.14M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH8.0进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.45M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
权利要求
1.一种制备纤维结合蛋白的方法，其特征是按下述步骤进行，1)用Tris-HCl缓冲液溶解冷沉淀，2)酒精沉淀，3)第一步PEG沉淀，4)第二步PEG沉淀，5)阴离子交换层析。
2.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的任一步骤可单独进行或其中1、2、3、5步骤可任意组合进行。
3.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的冷沉淀溶解缓冲液含柠檬酸三钠和氯化钠，其PH为7.0-8.5，冷沉淀溶解比例为1∶3-1∶20，溶解温度为5-40℃，溶解时间为1-3小时。
4.按权利要求3所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的冷沉淀溶解缓冲液的柠檬酸三钠浓度为0.50-2.0％，氯化钠浓度为0.50-2.0％。
5.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的酒精沉淀中酒精溶液含柠檬酸钠和氯化钠，其酒精终浓度为3-30％，酒精溶液温度0～-30℃，PH为7.0-8.5。
6.按权利要求5所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的酒精溶液中柠檬酸钠浓度为0.5-2.0％，氯化钠浓度为0.5-2.0％。
7.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的酒精沉淀溶解液含柠檬酸钠和氯化钠，溶解液温度为0-30℃，PH为7.0-8.5。
8.按权利要求7所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的酒精沉淀溶解液中柠檬酸钠浓度为0.5-2.0％，氯化钠浓度为0.5-2.0％。
9.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的第一步PEG沉淀中的PEG浓度为4-15％，操作温度为10-25℃，PH为7.0-8.5。
10.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的步骤4的第二步PEG沉淀中，在第一步PEG沉淀的上清加入浓度40％的PEG，加入量为每100ml上清中加入5-25ml，操作温度为10-25℃，PH7.0-8.5，沉淀溶解缓冲液为Tris-HCl，PH7.0-8.5。
11.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述阴离子交换层析采用的系统是QAE，其中平衡缓冲液、洗涤液和洗脱液是Tris-HCl，PH7.0-8.5。
12.按权利要求11所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述第二次洗涤液含氯化钠，其浓度为0.05-0.14M，洗脱液含氯化钠，其浓度为0.16-1.0M。
全文摘要
本发明属生物化学，血液学，生物制品学领域，具体涉及一种制备纯化纤维结合蛋白的方法。本发明采用酒精沉淀，PEG沉淀，阴离子层析方法联用制备纤维结合蛋白，同时制得纤维结合蛋白制剂和纤维蛋白原制剂，提高冷沉淀的利用度和最终制品的纯度及稳定性。本发明制备工艺简单，操作过程短，节约成本，适用于大生产。
文档编号C07K14/435GK1438243SQ0311578
公开日2003年8月27日 申请日期2003年3月13日 优先权日2003年3月13日
发明者王小倩, 朱威 申请人:上海生物制品研究所
技术领域：
本发明属生物化学，血液学，生物制品学领域，具体涉及一种制备纤维结合蛋白的方法。
纤维结合蛋白的提纯开始于70年代。1970年Mosesson MW等以冷沉淀为原料，用磷酸缓冲液溶解，分别加甘氨酸和乙醇沉淀后，再溶解，通过DEAE-纤维素柱，磷酸缓冲液洗脱获得纤维结合蛋白。所得的纤维结合蛋白含有纤维蛋白原，产生白色絮状沉淀，使制品的稳定性较差，得率较低，纯度较差。1971年Axen用抗纤维结合蛋白的抗体的亲和层析柱直接从新鲜血浆中吸附纤维结合蛋白，用盐酸-甘氨酸洗脱获得。这种方法首先需要纤维结合蛋白的专一抗体，其成本非常大，不适用于大规模生产。1973年Allen等用硫酸铵沉淀血浆，分离的沉淀物溶解后进行肝素-sepharose亲和层析，用氯化钠溶液洗脱获得纤维结合蛋白，此法获得的纤维结合蛋白纯度较差，稳定性不高。1977年Eva Engvall等根据纤维结合蛋白和明胶结合的特性，发展了明胶-sepharose 4B亲和层析分离纤维结合蛋白的较简单的方法，其利用纤维结合蛋白分子中可与明胶结合的功能区域，将明胶以共价键偶联在Sepharose 4B上，血浆或冷沉淀溶解液直接过柱，进行亲和层析后，再用起始缓冲液洗涤明胶柱，最后用尿素将纤维结合蛋白洗脱。但存在如下缺陷尿素洗脱液中由于含有多量纤维蛋白原(Fg)，而Fg是极不稳定的蛋白，在纯化的过程中，温度或其他因素的影响，会不断促使Fg变为纤维蛋白而析出，使样品出现白色絮状沉淀，将亲和柱堵塞，影响纯化过程。其次，因Fg和Fn相互结合，所以，当Fg变为纤维蛋白析出时，会使Fn以共沉淀的形式，形成Fn和Fg白色絮状沉淀，从而使Fn的回收率降低。第三，明胶-Sephorose4B亲和柱对纤维结合蛋白的吸附不专一，对Fg，等等也有吸附作用，同时，由于Fg与Fn的相互作用，使最终制品的纯度不高。最终制品中不能完全去除Fg，在含有Fg的Fn制品中，因Fg变为纤维蛋白，使制品溶液出现沉淀，会严重影响制品质量。第四，尿素对制品的生物活性有影响，高浓度的尿素会影响Fn的某些生物活性。
本发明通过下述步骤进行，1、用Tris-HCl缓冲液溶解冷沉淀，所述缓冲液其PH为7.0-8.5，含有柠檬酸三钠0.5-2.0％，氯化钠0.50-2.0％，溶解比例为1∶3-1∶20，溶解温度为5-40℃，溶解时间为1-3小时。
2、酒精沉淀将冷沉淀溶解液离心，转速为1000-4000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精溶液(含有柠檬酸三钠0.5-2.0％，氯化钠0.5-2.0％，0～-30℃)至浓度为3-30％，冰浴中搅拌30-60min，然后静置2-5h，低温离心，转速3000-7000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)，含有柠檬酸三钠0.5-2.0％，氯化钠0.50-2.0％，溶解至原体积，溶解液可控制在0-30℃。
3、第一步PEG沉淀酒精沉淀溶解液中加入浓度为40％的PEG溶液，至终浓度为4-15％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度在10-25℃之间，控制系统的PH在7.0-8.5之间，室温搅拌30分钟，静置30-60分钟后离心，转速3000-5000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀(此沉淀溶解即为纤维蛋白原制剂)。
4、第二步PEG沉淀第一步PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入5-25mlPEG溶液，控制系统的PH在7.0-8.5之间，温度在10-25℃之间，室温下搅拌30分钟，静置30-60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000-5000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)进行溶解至原体积。
5、离子交换层析取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)平衡QAE凝胶层析系统。共需要Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)三个柱床体积。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，上样流速为10-40ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)进行洗涤，其中氯化钠浓度为(0.05-0.14M)，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液(PH7.0-8.5)进行洗脱，其中氯化钠浓度为(0.16-1.0M)，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
本发明所述实验材料及试剂冷沉淀为上海生物制品研究所提供，乙醇，聚乙二醇(MW4000)，QAE胶，兔抗人纤维结合蛋白血清，甘氨酸(Gly)，纤维结合蛋白标准品均为市购。
结果证实，用本发明提供的提纯方法，得到的纤维结合蛋白的纯度可达90％左右(紫外薄层扫描法)，其得率可达30.00％以上。表1为纤维结合蛋白纯化结果。
表1原液 酒精沉淀 PEG沉淀 PEG沉淀 QAE层析12Fn浓度 1.250.93 0.60 0.49 2.02mg/ml体积(ml) 50 50 5750 12得率(％) 100.0 74.4 54.72 39.238.78纯度(％) 11 19 5071 90本发明方法建立的工艺路线可以从冷沉淀中得到纤维结合蛋白。制备的纤维结合蛋白制剂其冻干制品的外观为白色，溶解度高，透明澄清。本方法确立了可用于规模化生产的制备纤维结合蛋白的工艺。本方法具有下述优点1)本发明提高最终制品的纯度及稳定性，能将病毒灭活处理步骤结合于其中。2)本方法适用于规模化生产，中间步骤少，简单易操作。3)本发明方法提供的提纯纤维结合蛋白的制备，周期短，有利于生产过程中无菌控制。4)本方法引入了阴离子层析路线，与已有亲和层析制备技术相比，本发明利用强阴离子柱QAE，其吸附纤维结合蛋白的能力明显高于明胶亲和柱；本发明所得的纤维结合蛋白纯度高；活性高；本发明因不采用溴化氰等活化剂活化Sepharose 4B，故对环境无污染。5)本方法同时可以制得纤维结合蛋白制剂和纤维蛋白原制剂，提高了冷沉淀的利用度，节约成本。本方法采用酒精沉淀纤维蛋白原和纤维结合蛋白后，再用PEG分离纤维蛋白原和纤维结合蛋白，同时可以制得纤维结合蛋白制剂和纤维蛋白原制剂。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(0℃)至浓度为4％，冰浴中搅拌40min，然后静置3h，低温离心，转速5000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.0，含有柠檬酸三钠0.60％，氯化钠0.50％进行溶解至原体积，溶解液温度为0℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为5％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为12℃，系统的PH控制在7.0，室温搅拌30分钟，静置30分钟，离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入7mlPEG溶液，系统的PH控制在7.0，温度控制在12℃，然后室温下搅拌30分钟，静置30分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.0，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.0，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为10ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.0，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.0进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.05M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.0进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.16M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例2从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀100g以1∶5溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.10，含有柠檬酸三钠0.70％，氯化钠0.90％，溶解温度为8℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为2000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-3℃)至浓度为6％，冰浴中搅拌40min，然后静置2h，低温离心，转速6000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.10，含有柠檬酸三钠0.70％，氯化钠0.90％进行溶解至原体积，溶解液温度为3℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为7％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为10℃，系统的PH控制在7.10，然后室温搅拌30分钟，静置40分钟，离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入9mlPEG溶液，系统的PH控制在7.10，温度控制在10℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.10，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.10，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为12ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.10，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.10进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.06M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.10进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.18M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例3从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀100g以1∶7溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.20，含有柠檬酸三钠1.00％，氯化钠0.90％，溶解温度为37℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-5℃)至浓度为8％，冰浴中搅拌40min，然后静置4h，低温离心，转速6000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.20，含有柠檬酸三钠1.00％，氯化钠0.90％进行溶解至原体积，溶解液温度为5℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为8％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为14℃，系统的PH控制在7.2，然后室温搅拌30分钟，静置60分钟，离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入10mlPEG溶液，系统的PH控制在7.2，温度控制在14℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.20，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.20，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为15ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.20，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.20进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.07M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.20进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.20M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例4从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶9溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.30，含有柠檬酸三钠1.00％，氯化钠1.00％，溶解温度为35℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-8℃)至浓度为10％，冰浴中搅拌50min，然后静置3h，低温离心，转速6000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.30，含有柠檬酸三钠1.00％，氯化钠1.00％进行溶解至原体积，溶解液温度为6℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为9％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为15℃，系统的PH控制在7.3，然后室温搅拌30分钟，静置40分钟，离心，转速4000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入11mlPEG溶液，系统的PH控制在7.3，温度控制在15℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.30，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.30，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为20ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.30，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.30进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.08M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.30进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.25M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例5从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶11溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.40，含有柠檬酸三钠1.30％，氯化钠1.20％，溶解温度为20℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-9℃)至浓度为12％，冰浴中搅拌40min，然后静置3h，低温离心，转速5000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.40，含有柠檬酸三钠1.30％，氯化钠1.20％进行溶解至原体积，溶解液温度为7℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40PEG％溶液，至终浓度为10％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为16℃，系统的PH控制在7.40，然后室温搅拌30分钟，静置50分钟，离心，转速4000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入12mlPEG溶液，系统的PH控制在7.40，温度控制在16℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.40，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.40，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为30ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.40，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.40进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.09M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.40进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.28M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例6从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶13溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.50，含有柠檬酸三钠1.50％，氯化钠1.0％，溶解温度为20℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-10℃)至浓度为14％，冰浴中搅拌50min，然后静置3h，低温离心，转速5000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，含有柠檬酸三钠1.50％，氯化钠1.00％进行溶解至原体积，溶解液温度为10℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为11％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为18℃，系统的PH控制在7.50，然后室温搅拌50分钟，静置50分钟，离心，转速4000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入14mlPEG溶液，系统的PH控制在7.50，温度控制在20℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为40ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.50进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.10M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.50进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.33M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例7从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶15溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.60，含有柠檬酸三钠1.30％，氯化钠1.50％，溶解温度为9℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-12℃)至浓度为16％，冰浴中搅拌30min，然后静置3h，低温离心，转速4000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.60，含有柠檬酸三钠1.30％，氯化钠1.50％进行溶解至原体积，溶解液温度为15℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为12％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为20℃，系统的PH控制在7.60，然后室温搅拌30分钟，静置40分钟，离心，转速4000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入16mlPEG溶液，系统的PH控制在7.60，温度控制在25℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.60，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.60，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为35ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.60，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.60进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.11M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.60进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.35M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例8从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶17溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.70，含有柠檬酸三钠1.10％，氯化钠1.00％，溶解温度为40℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-16℃)至浓度为18％，冰浴中搅拌40min，然后静置3h，低温离心，转速3000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.70，含有柠檬酸三钠1.10％，氯化钠1.00％进行溶解至原体积，溶解液温度为20℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为13％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为20℃，系统的PH控制在7.70，然后室温搅拌30分钟，静置50分钟，离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入18mlPEG溶液，系统的PH控制在7.70，温度控制在10℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速4000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.7，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.70，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为25ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.70，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.70进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.12M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.70进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.40M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例9从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶19溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH7.50，含有柠檬酸三钠1.70％，氯化钠0.80％，溶解温度为14℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-20℃)至浓度为20％，冰浴中搅拌40min，然后静置3h，低温离心，转速4000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，含有柠檬酸三钠1.70％，氯化钠0.80％进行溶解至原体积，溶解液温度为18℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为15％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为22℃，系统的PH控制在7.50，然后室温搅拌30分钟，静置50分钟，离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入20mlPEG溶液，系统的PH控制在7.50，温度控制在22℃，然后室温下搅拌30分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为30ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH7.50，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.50进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.13M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH7.50进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.35M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
实施例10
从冷沉淀中纯化纤维结合蛋白1.冷沉淀200g以1∶20溶解在Tris-HCl缓冲液中，PH8.00，含有柠檬酸三钠1.60％，氯化钠1.60％，溶解温度为17℃，溶解时间约为1小时。
2.将冷沉淀溶解液离心，转速为3000rpm，得到上清，去掉沉淀。上清中加入低温酒精(-22℃)至浓度为21％，冰浴中搅拌40min，然后静置3h，低温离心，转速4000rpm，离心30min。弃去上清，得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH8.00，含有柠檬酸三钠1.60％，氯化钠1.60％进行溶解至原体积，溶解液温度为17℃。
3.酒精沉淀溶解液中加入40％PEG溶液，至终浓度为14％。沉淀时调整酒精沉淀溶解液及PEG的温度为25℃，系统的PH控制在8.0，然后室温搅拌40分钟，静置50分钟，离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。取出上清，弃去沉淀。
4.第一次PEG沉淀处理得到的上清液中加入40％PEG溶液，每100ml上清液中加入17mlPEG溶液，系统的PH控制在8.0，温度控制在25℃，然后室温下搅拌40分钟，静置60分钟，进行第二次PEG沉淀处理。离心，转速3000rpm，离心时间30分钟。弃去上清，取沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液，PH8.00，溶解至原体积。
5.取QAE凝胶装柱，用Tris-HCl缓冲液，PH8.00，平衡QAE凝胶层析系统。将第二次PEG沉淀得到的沉淀溶解液，上样，流速为40ml/h，进行QAE阴离子层析；然后再用Tris-HCl缓冲液，PH8.00，洗涤QAE阴离子层析系统，用三个柱床体积；第二次洗涤用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH8.0进行洗涤，其中氯化钠浓度为0.14M，洗掉杂蛋白；再用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液PH8.0进行洗脱，其中氯化钠浓度为0.45M，得到的蛋白即为纤维结合蛋白，透析去掉氯化钠。
权利要求
1.一种制备纤维结合蛋白的方法，其特征是按下述步骤进行，1)用Tris-HCl缓冲液溶解冷沉淀，2)酒精沉淀，3)第一步PEG沉淀，4)第二步PEG沉淀，5)阴离子交换层析。
2.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的任一步骤可单独进行或其中1、2、3、5步骤可任意组合进行。
3.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的冷沉淀溶解缓冲液含柠檬酸三钠和氯化钠，其PH为7.0-8.5，冷沉淀溶解比例为1∶3-1∶20，溶解温度为5-40℃，溶解时间为1-3小时。
4.按权利要求3所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的冷沉淀溶解缓冲液的柠檬酸三钠浓度为0.50-2.0％，氯化钠浓度为0.50-2.0％。
5.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的酒精沉淀中酒精溶液含柠檬酸钠和氯化钠，其酒精终浓度为3-30％，酒精溶液温度0～-30℃，PH为7.0-8.5。
6.按权利要求5所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的酒精溶液中柠檬酸钠浓度为0.5-2.0％，氯化钠浓度为0.5-2.0％。
7.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的酒精沉淀溶解液含柠檬酸钠和氯化钠，溶解液温度为0-30℃，PH为7.0-8.5。
8.按权利要求7所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的酒精沉淀溶解液中柠檬酸钠浓度为0.5-2.0％，氯化钠浓度为0.5-2.0％。
9.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的第一步PEG沉淀中的PEG浓度为4-15％，操作温度为10-25℃，PH为7.0-8.5。
10.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述的步骤4的第二步PEG沉淀中，在第一步PEG沉淀的上清加入浓度40％的PEG，加入量为每100ml上清中加入5-25ml，操作温度为10-25℃，PH7.0-8.5，沉淀溶解缓冲液为Tris-HCl，PH7.0-8.5。
11.按权利要求1所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述阴离子交换层析采用的系统是QAE，其中平衡缓冲液、洗涤液和洗脱液是Tris-HCl，PH7.0-8.5。
12.按权利要求11所述的制备纤维结合蛋白的方法，其特征是所述第二次洗涤液含氯化钠，其浓度为0.05-0.14M，洗脱液含氯化钠，其浓度为0.16-1.0M。
全文摘要
本发明属生物化学，血液学，生物制品学领域，具体涉及一种制备纯化纤维结合蛋白的方法。本发明采用酒精沉淀，PEG沉淀，阴离子层析方法联用制备纤维结合蛋白，同时制得纤维结合蛋白制剂和纤维蛋白原制剂，提高冷沉淀的利用度和最终制品的纯度及稳定性。本发明制备工艺简单，操作过程短，节约成本，适用于大生产。
文档编号C07K14/435GK1438243SQ0311578
公开日2003年8月27日 申请日期2003年3月13日 优先权日2003年3月13日
发明者王小倩, 朱威 申请人:上海生物制品研究所
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