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2021-01-31 21:01:39|
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起点商标网 专利名称：利用酶催化半合成紫杉醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种酶催化下的紫杉醇半合成方法，特别是一种利用酶催化半合成紫杉醇的方法。属于分子生物工程与生物化学工程领域。
背景技术：
紫杉醇(taxol)是经FDA认证的目前最好的天然抗癌药物之一，是治疗卵巢癌的首选药物，并且对白血病、肺癌、脑癌和其他的一些实体瘤等均有很好的疗效。其抗癌基因是促进微管蛋白聚合，抑制其解聚，从而抑制癌细胞的快速分裂。紫杉醇最初发现于短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮，现在已经在多种红豆杉属植物发现了紫杉醇。由于天然红豆杉资源本就非常稀少，其中的紫杉醇含量在干重的万分之几以下，且多多数集中在树皮中，树龄为100年的红豆杉只能提供一个癌症患者所需的紫杉醇。所以通过砍伐红豆杉，然后对树皮进行提取分离的方法获得紫杉醇，导致天然红豆杉数量急剧下降，濒临灭绝，并对周围环境造成不可挽回的破坏。鉴于以上原因，我过和世界上多数国家已经将红豆杉列为国家保护植物，严禁砍伐。由于提取天然红豆杉中的紫杉醇已经不能满足临床上对紫杉醇日益增长的需要(全世界紫杉醇的需求量约为1000公斤/年，而产量却不到100公斤/年)。紫杉醇的疗效和药源的严重短缺使其价格极为昂贵，高达5000-6000美元/克。严重阻碍了对其的广泛应用。目前的植物细胞培养中紫杉醇的含量低，造成其生产成本过高，化学全合成虽然已经成功，但由于步骤冗长，产率太低；目前化学半合成法的化学反应空间选择性差，产生大量副产物，需要先保护其他非目标酰化位点，待反应后再去保护的方法，以降低副产物的出现，但步骤烦琐，收率低。在进行对本发明的主题的检索中，尚未发现有与本发明相关的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用酶催化半合成紫杉醇的方法，使其从曼地亚红豆杉中克隆到紫杉醇生物合成中最后三个酰化酶(DAT，BAPT，DBTNBT)基因，并将上述三个基因转入大肠杆菌或者酵母中，获得能够高效表达有催化活力的重组酰化酶蛋白的基因工程菌；利用该基因工程菌或者其提取物，催化10去乙酰基巴卡亭三转化为紫杉醇。本发明是通过以下技术方案实现的本发明提出并实现了紫杉醇的酶催化半合成。与化学半合成法一样，酶催化半合成也以红豆杉中含量相对丰富的10去乙酰巴卡亭三为底物，差别是在对紫杉醇三环二萜骨架修饰过程中采用酶催化的方法，而不是化学修饰的方法，紫杉醇酶催化半合成以三个重组酰化酶为催化剂，在反应器中进行三步酰化，从而合成紫杉醇。
由于酶具有高度的空间选择性，可以在不保护其他酰化位点的条件下直接对10位和13位进行特异性酰化，因此简化了反应步骤，提高紫杉醇的产率，且整个反映在温和条件下进行，不采用有机溶剂，对环境破坏性小。
本发明中所采用的三个酶为10-DAB 10位乙酰化酶(10DAB10-O-acetyltransferase，DAT)，巴卡亭三13位3’-氨基-3’-苯基丙酰化酶(Baccatin III3-amino-3-phenylpropanoyltransferase，BAPT)，N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶(3’-N-debenzoyl-2’-deoxytaxolN-benzoyltransferase，DBTNBT)。
酰化酶是通过克隆红豆杉中对应酰化酶基因，在大肠杆菌或者酵母中进行表达而产生的。
在本发明的一个方面，提供了三种分离出的DNA分子。
DNA分子A具有编码10-DAB 10位乙酰化酶(10DAB10-O-acetyltransferase，DAT)的核苷酸序列。DNA分子B具有编码巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙酰化酶(Baccatin III3-amino-3-phenylpropanoyl transferase，BAPT)的核苷酸序列。DNA分子C具有编码N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶(3-N-debenzoyl-2-deoxytaxolN-benzoyl transferase，DBTNBT)的核苷酸序列。在本发明还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。将三个酰化酶基因编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成三个酰化酶基因的表达载体。
在本发明还提供了一种用上述载体转化宿主菌，从而获得含有三个酰化酶基因的基因工程菌。在实例中该宿主菌为大肠杆菌DH5α和酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl。
在本发明还进一步提供了一种分离纯化重组酶蛋白，并在含有C-13侧链前体的中性缓冲体系中下催化10去乙酰基巴卡亭三转化为紫杉醇。
在本发明中，术语“DAT，BAPT，DBTNBT”指具有与野生型DAT，BAPT，DBTNBT相同活性的多肽，既包括野生型，也包括其变异型，为小于等于20个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加15个以内的氨基酸。
本发明中DAT，BAPT，DBTNBT的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与其野生型基因DNA杂交的DNA所编码的蛋白。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化，还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽(这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶而完成)，以及具有磷酸化氨基酸残基，如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸的序列，和被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明所涉及的“可操作地连于”是指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
本发明所涉及的“酶法紫杉醇半合成”是指利用基因工程菌产生的具有催化活力的重组酰化酶为催化剂，经过三步酰化，将10去乙酰基巴卡亭三转化为紫杉醇。
随所采用的基因工程菌和酶蛋白的分泌特性的不同，有不同的催化形式对于胞内酶，首先将基因工程菌破碎，制备无细胞提取物，作为催化剂；也可以进一步分离提纯，以纯品酶蛋白的形式进行催化，甚至将所获得的酶固定化，以固定化酶的形式进行催化。
对于胞外酶，由于具有催化能力的酶蛋白分泌到培养基中，因此可直接在培养体系中加10去乙酰基紫杉醇进行酶催化反应，或者以固定化细胞的形式产生分泌酶蛋白，催化紫杉醇的合成。
对于胞内酶，另一种方式是使培养基中的10去乙酰基紫杉醇通过基因工程菌的细胞膜，在细胞内进行催化反应，产生紫杉醇。
本发明提供的紫杉醇酶催化半合成方法，相对与目前广泛采用的化学半合成，具有自己显著的特点和明显的优势。该方法采用酶催化方法对紫杉醇骨架进行修饰，而不是化学半合成法中的纯化学修饰。由于酶催化修饰所具有的高选择性，不需要保护紫杉醇骨架上的非目的修饰位点，因此所需步骤更少，操作更简单；在很大程度上消除了立体异构和非必要修饰所产生的副产物，提高了紫杉醇合成的选择性和产率。同时该方法在人工反应器中进行紫杉醇生产，而不是采用细胞体系进行紫杉醇生产，可以突破活细胞对其中紫杉醇最大含量的限制(紫杉醇具有细胞毒性，过高将导致细胞死亡)，从而在更大规模上进行更大强度的紫杉醇生产。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、DAT酶基因的克隆的实施例1.基因克隆10-DAB 10位乙酰化酶基因由本实验室参照TaKaRa RNA PCR Kit说明书从曼地亚红豆杉的总RNA提取物中克隆。反转录用多聚T作引物，反应条件20℃，10min；42℃60min；0℃2min。PCR反应用DAT酶基因特异性引物P1和P2，扩增参数94℃5min；94℃ 30sec；63℃ 30sec；72℃2min 35个循环；72℃ 10min。反应产物进行脂糖凝胶电泳检测，获得约1.32kb的扩增片段。
DAT酶基因P15’-cgaattcatggcaggctcaacagaatttg-3’(SEQ ID NO.1)DAT酶基因P25’-cctcgagtcaaggcttagttacatatttgtttg-3’(SEQ ID NO.2)2.连接按PCR回收Kit说明书回收DAT酶基因目标片段。回收的DAT cDNA片段与pGEM-T Easy载体在T4 DNAligase作用下16℃过夜。
3.转化大肠杆菌用氯化钙法转化大肠杆菌，用蓝白斑筛选检测转化的大肠杆菌阳性克隆；4.基因的检测利用DAT酶基因特异引物对筛选的大肠杆菌阳性克隆进行PCR检测，并对PCR检测所确定的大肠杆菌阳性克隆抽取质粒DNA进一步进行测序验证。
序列分析显示DAT酶基因的全长为1320bp，根据推导该酶基因共编码439个氨基酸。将克隆的DAT酶基因全长序列及其编码蛋白质用BLAST程序在NCBI的nr数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，发现它与来自于Taxus cuspidata和Taxusbaccata的10-DAB 10位乙酰化酶基因存在很高的同源性。在核苷酸水平上，所克隆的DAT酶基因与Taxus cuspidata的10-DAB 10位乙酰化酶基因的编码序列(GenBankAccession No.AF193765)有95％的同源性；在氨基酸水平上，它与Taxus cuspidata的10-DAB 10位乙酰化酶基因的氨基酸序列有97％的同源性(GenPept Accession No.AAF27621)。
二、BAPT酶基因的克隆的实施例1.基因克隆巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙酰化酶基因由本实验室参照TaKaRa RNA PCRKit说明书从曼地亚红豆杉的总RNA提取物中克隆。反转录用多聚T作引物，反应条件20℃，10min；42℃60min；0℃2min。PCR反应用BAPT酶基因特异性引物P1和P2，扩增参数94℃5min；94℃ 30sec；60℃ 30sec；72℃2min 35个循环；72℃10min。反应产物进行脂糖凝胶电泳检测，获得约1.34kb的扩增片段。
BAPT酶基因P15’-cgaattcatgaagaagacaggttcgtttgc-3’(SEQ ID NO.3)BAPT酶基因P25’-cctcgagtcataactttgacggacacactttag-3’(SEQ ID NO.4)2.连接按PCR回收Kit说明书回收BAPT酶基因目标片段。回收的BAPT cDNA片段与pGEM-T Easy载体在T4 DNAligase作用下16℃过夜。
3.转化大肠杆菌用氯化钙法转化大肠杆菌，用蓝白斑筛选检测转化的大肠杆菌阳性克隆；4.基因的检测利用BAPT酶基因特异引物对筛选的大肠杆菌阳性克隆进行PCR检测，并对PCR检测所确定的大肠杆菌阳性克隆抽取质粒DNA进一步进行测序验证。
序列分析显示BAPT酶基因的全长为1338bp。根据推导，该酶基因共编码445个氨基酸。将克隆的BAPT酶基因全长序列及其编码蛋白质用BLAST程序在NCBI的nr数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，发现它与来自于Taxus cuspidata的巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙酰化酶基因存在很高的同源性。在核苷酸水平上，所克隆的BAPT酶基因与Taxus cuspidata的巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙酰化酶基因的编码序列(GenBank Accession No.AY082804)有90％的同源性；在氨基酸水平上，它与Taxus cuspidata的巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙酰化酶基因的氨基酸序列有92％的同源性(GenPept Accession No.AAL92459)。
三、DBTNBT酶基因的克隆的实施例1.基因克隆N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶基因由本实验室参照TaKaRa RNA PCR Kit说明书从曼地亚红豆杉的总RNA提取物中克隆。反转录用多聚T作引物，反应条件20℃，10min；42℃60min；0℃2min。PCR反应用DBTNBT酶基因特异性引物P1和P2，扩增参数94℃ 5min；94℃ 30sec；60℃ 30sec；72℃ 2min 35个循环；72℃10min。反应产物进行脂糖凝胶电泳检测，获得约1.33kb的扩增片段。
DBTNBT酶基因P15’-cgaattcatggagaaggcaggctcaacag-3’(SEQ ID NO.5)DBTNBT酶基因P25’-cctcgagtcacactttacttacatctttctc-3’(SEQ ID NO.6)2.连接按PCR回收Kit说明书回收DBTNBT酶基因目标片段。回收的DBTNBT cDNA片段与pGEM-T Easy载体在T4 DNAligase作用下16℃过夜。
3.转化大肠杆菌用氯化钙法转化大肠杆菌，用蓝白斑筛选检测转化的大肠杆菌阳性克隆；4.基因的检测利用DBTNBT酶基因特异引物对筛选的大肠杆菌阳性克隆进行PCR检测，并对PCR检测所确定的大肠杆菌阳性克隆抽取质粒DNA进一步进行测序验证。
序列分析显示DBTNBT酶基因的全长为1326bp，根据推导该酶基因共编码441个氨基酸。将克隆的DBTNBT酶基因全长序列及其编码蛋白质用BLAST程序在NCBI的nr数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，发现它与来自于Taxus canadensis的N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶基因存在很高的同源性。在核苷酸水平上，所克隆的DBTNBT酶基因与Taxus canadensis的N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶基因的编码序列(GenBank Accession No.AF466397)有85％的同源性；在氨基酸水平上，它与Taxuscuspidata的N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶基因的氨基酸序列有95％的同源性(GenBank Accession No.AAM75818)。
权利要求
1.一种利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征在于，紫杉醇的酶催化半合成以红豆杉中含量相对丰富的10去乙酰巴卡亭三为底物，对紫杉醇三环二萜骨架修饰过程中采用酶催化的方法，直接对10位和13位进行特异性酰化，且整个反映在温和条件下进行，紫杉醇酶催化半合成以三个重组酰化酶为催化剂，在反应器中进行三步酰化，从而合成紫杉醇。
2.根据权利要求1所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是，所采用的三个酶为10-DAB 10位乙酰化酶，即10DAB10-O-acetyl transferase，DAT；巴卡亭三13位3’-氨基-3’-苯基丙酰化酶，即BaccatinIII3-amino-3-phenylpropanoyltransferase，BAPT；N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶，即3’-N-debenzoyl-2’-deoxytaxolN-benzoyltransferase，DBTNBT。
3.根据权利要求2所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是，酰化酶是通过克隆红豆杉中对应酰化酶基因，在大肠杆菌或者酵母中进行表达而产生的。
4.根据权利要求1所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是，提供了一种载体，它包含以下三个DNA分子或者其中之一DNA分子A具有编码10-DAB 10位乙酰化酶10DAB10-O-acetyltransferase，DAT的核苷酸序列，DNA分子B具有编码巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙酰化酶Baccatin III3-amino-3-phenylpropanoyl transferase，BAPT的核苷酸序列，DNA分子C具有编码N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶3-N-debenzoyl-2-deoxytaxolN-benzoyl transferase，DBTNBT的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是选用的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒，将三个酰化酶基因编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成三个酰化酶基因的表达载体。
6.根据权利要求4所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是，提供了一种用上述载体转化宿主菌，从而获得含有三个酰化酶基因的基因工程菌。
7.根据权利要求4所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征在于进一步提供了一种分离纯化重组酶蛋白，并在含有C-13侧链前体的中性缓冲体系中下催化10去乙酰基巴卡亭三转化为紫杉醇。
8.根据权利要求1所述的这种利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是DAT，BAPT，DBTNBT指具有与野生型DAT，BAPT，DBTNBT相同活性的多肽，既包括野生型，也包括其变异型，为小于等于20个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加15个以内的氨基酸。
9.根据权利要求1所述的这种利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是DAT，BAPT，DBTNBT的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与其野生型基因DNA杂交的DNA所编码的蛋白。
10.根据权利要求1所述的这种利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是修饰形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化，还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽，以及具有磷酸化氨基酸残基，如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸的序列，和被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
全文摘要
一种利用酶催化半合成紫杉醇的方法属于分子生物工程与生物化学工程领域。紫杉醇的酶催化半合成以红豆杉中含量相对丰富的10去乙酰巴卡亭三为底物，对紫杉醇三环二萜骨架修饰过程中采用酶催化的方法，直接对10位和13位进行特异性酰化，且整个反应在温和条件下进行，紫杉醇酶催化半合成以三个重组酰化酶为催化剂，在反应器中进行三步酰化，从而合成紫杉醇。本发明提供的紫杉醇酶催化半合成方法，对紫杉醇骨架进行修饰，所需步骤更少，操作更简单，提高了紫杉醇合成的选择性和产率，从而在更大规模上进行更大强度的紫杉醇生产。
文档编号C07D305/00GK1460720SQ0311616
公开日2003年12月10日 申请日期2003年4月3日 优先权日2003年4月3日
发明者苗志奇, 唐克轩, 张利达 申请人:上海交通大学
技术领域：
本发明涉及一种酶催化下的紫杉醇半合成方法，特别是一种利用酶催化半合成紫杉醇的方法。属于分子生物工程与生物化学工程领域。
背景技术：
紫杉醇(taxol)是经FDA认证的目前最好的天然抗癌药物之一，是治疗卵巢癌的首选药物，并且对白血病、肺癌、脑癌和其他的一些实体瘤等均有很好的疗效。其抗癌基因是促进微管蛋白聚合，抑制其解聚，从而抑制癌细胞的快速分裂。紫杉醇最初发现于短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮，现在已经在多种红豆杉属植物发现了紫杉醇。由于天然红豆杉资源本就非常稀少，其中的紫杉醇含量在干重的万分之几以下，且多多数集中在树皮中，树龄为100年的红豆杉只能提供一个癌症患者所需的紫杉醇。所以通过砍伐红豆杉，然后对树皮进行提取分离的方法获得紫杉醇，导致天然红豆杉数量急剧下降，濒临灭绝，并对周围环境造成不可挽回的破坏。鉴于以上原因，我过和世界上多数国家已经将红豆杉列为国家保护植物，严禁砍伐。由于提取天然红豆杉中的紫杉醇已经不能满足临床上对紫杉醇日益增长的需要(全世界紫杉醇的需求量约为1000公斤/年，而产量却不到100公斤/年)。紫杉醇的疗效和药源的严重短缺使其价格极为昂贵，高达5000-6000美元/克。严重阻碍了对其的广泛应用。目前的植物细胞培养中紫杉醇的含量低，造成其生产成本过高，化学全合成虽然已经成功，但由于步骤冗长，产率太低；目前化学半合成法的化学反应空间选择性差，产生大量副产物，需要先保护其他非目标酰化位点，待反应后再去保护的方法，以降低副产物的出现，但步骤烦琐，收率低。在进行对本发明的主题的检索中，尚未发现有与本发明相关的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用酶催化半合成紫杉醇的方法，使其从曼地亚红豆杉中克隆到紫杉醇生物合成中最后三个酰化酶(DAT，BAPT，DBTNBT)基因，并将上述三个基因转入大肠杆菌或者酵母中，获得能够高效表达有催化活力的重组酰化酶蛋白的基因工程菌；利用该基因工程菌或者其提取物，催化10去乙酰基巴卡亭三转化为紫杉醇。本发明是通过以下技术方案实现的本发明提出并实现了紫杉醇的酶催化半合成。与化学半合成法一样，酶催化半合成也以红豆杉中含量相对丰富的10去乙酰巴卡亭三为底物，差别是在对紫杉醇三环二萜骨架修饰过程中采用酶催化的方法，而不是化学修饰的方法，紫杉醇酶催化半合成以三个重组酰化酶为催化剂，在反应器中进行三步酰化，从而合成紫杉醇。
由于酶具有高度的空间选择性，可以在不保护其他酰化位点的条件下直接对10位和13位进行特异性酰化，因此简化了反应步骤，提高紫杉醇的产率，且整个反映在温和条件下进行，不采用有机溶剂，对环境破坏性小。
本发明中所采用的三个酶为10-DAB 10位乙酰化酶(10DAB10-O-acetyltransferase，DAT)，巴卡亭三13位3’-氨基-3’-苯基丙酰化酶(Baccatin III3-amino-3-phenylpropanoyltransferase，BAPT)，N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶(3’-N-debenzoyl-2’-deoxytaxolN-benzoyltransferase，DBTNBT)。
酰化酶是通过克隆红豆杉中对应酰化酶基因，在大肠杆菌或者酵母中进行表达而产生的。
在本发明的一个方面，提供了三种分离出的DNA分子。
DNA分子A具有编码10-DAB 10位乙酰化酶(10DAB10-O-acetyltransferase，DAT)的核苷酸序列。DNA分子B具有编码巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙酰化酶(Baccatin III3-amino-3-phenylpropanoyl transferase，BAPT)的核苷酸序列。DNA分子C具有编码N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶(3-N-debenzoyl-2-deoxytaxolN-benzoyl transferase，DBTNBT)的核苷酸序列。在本发明还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。将三个酰化酶基因编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成三个酰化酶基因的表达载体。
在本发明还提供了一种用上述载体转化宿主菌，从而获得含有三个酰化酶基因的基因工程菌。在实例中该宿主菌为大肠杆菌DH5α和酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl。
在本发明还进一步提供了一种分离纯化重组酶蛋白，并在含有C-13侧链前体的中性缓冲体系中下催化10去乙酰基巴卡亭三转化为紫杉醇。
在本发明中，术语“DAT，BAPT，DBTNBT”指具有与野生型DAT，BAPT，DBTNBT相同活性的多肽，既包括野生型，也包括其变异型，为小于等于20个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加15个以内的氨基酸。
本发明中DAT，BAPT，DBTNBT的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与其野生型基因DNA杂交的DNA所编码的蛋白。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化，还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽(这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶而完成)，以及具有磷酸化氨基酸残基，如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸的序列，和被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明所涉及的“可操作地连于”是指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
本发明所涉及的“酶法紫杉醇半合成”是指利用基因工程菌产生的具有催化活力的重组酰化酶为催化剂，经过三步酰化，将10去乙酰基巴卡亭三转化为紫杉醇。
随所采用的基因工程菌和酶蛋白的分泌特性的不同，有不同的催化形式对于胞内酶，首先将基因工程菌破碎，制备无细胞提取物，作为催化剂；也可以进一步分离提纯，以纯品酶蛋白的形式进行催化，甚至将所获得的酶固定化，以固定化酶的形式进行催化。
对于胞外酶，由于具有催化能力的酶蛋白分泌到培养基中，因此可直接在培养体系中加10去乙酰基紫杉醇进行酶催化反应，或者以固定化细胞的形式产生分泌酶蛋白，催化紫杉醇的合成。
对于胞内酶，另一种方式是使培养基中的10去乙酰基紫杉醇通过基因工程菌的细胞膜，在细胞内进行催化反应，产生紫杉醇。
本发明提供的紫杉醇酶催化半合成方法，相对与目前广泛采用的化学半合成，具有自己显著的特点和明显的优势。该方法采用酶催化方法对紫杉醇骨架进行修饰，而不是化学半合成法中的纯化学修饰。由于酶催化修饰所具有的高选择性，不需要保护紫杉醇骨架上的非目的修饰位点，因此所需步骤更少，操作更简单；在很大程度上消除了立体异构和非必要修饰所产生的副产物，提高了紫杉醇合成的选择性和产率。同时该方法在人工反应器中进行紫杉醇生产，而不是采用细胞体系进行紫杉醇生产，可以突破活细胞对其中紫杉醇最大含量的限制(紫杉醇具有细胞毒性，过高将导致细胞死亡)，从而在更大规模上进行更大强度的紫杉醇生产。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、DAT酶基因的克隆的实施例1.基因克隆10-DAB 10位乙酰化酶基因由本实验室参照TaKaRa RNA PCR Kit说明书从曼地亚红豆杉的总RNA提取物中克隆。反转录用多聚T作引物，反应条件20℃，10min；42℃60min；0℃2min。PCR反应用DAT酶基因特异性引物P1和P2，扩增参数94℃5min；94℃ 30sec；63℃ 30sec；72℃2min 35个循环；72℃ 10min。反应产物进行脂糖凝胶电泳检测，获得约1.32kb的扩增片段。
DAT酶基因P15’-cgaattcatggcaggctcaacagaatttg-3’(SEQ ID NO.1)DAT酶基因P25’-cctcgagtcaaggcttagttacatatttgtttg-3’(SEQ ID NO.2)2.连接按PCR回收Kit说明书回收DAT酶基因目标片段。回收的DAT cDNA片段与pGEM-T Easy载体在T4 DNAligase作用下16℃过夜。
3.转化大肠杆菌用氯化钙法转化大肠杆菌，用蓝白斑筛选检测转化的大肠杆菌阳性克隆；4.基因的检测利用DAT酶基因特异引物对筛选的大肠杆菌阳性克隆进行PCR检测，并对PCR检测所确定的大肠杆菌阳性克隆抽取质粒DNA进一步进行测序验证。
序列分析显示DAT酶基因的全长为1320bp，根据推导该酶基因共编码439个氨基酸。将克隆的DAT酶基因全长序列及其编码蛋白质用BLAST程序在NCBI的nr数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，发现它与来自于Taxus cuspidata和Taxusbaccata的10-DAB 10位乙酰化酶基因存在很高的同源性。在核苷酸水平上，所克隆的DAT酶基因与Taxus cuspidata的10-DAB 10位乙酰化酶基因的编码序列(GenBankAccession No.AF193765)有95％的同源性；在氨基酸水平上，它与Taxus cuspidata的10-DAB 10位乙酰化酶基因的氨基酸序列有97％的同源性(GenPept Accession No.AAF27621)。
二、BAPT酶基因的克隆的实施例1.基因克隆巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙酰化酶基因由本实验室参照TaKaRa RNA PCRKit说明书从曼地亚红豆杉的总RNA提取物中克隆。反转录用多聚T作引物，反应条件20℃，10min；42℃60min；0℃2min。PCR反应用BAPT酶基因特异性引物P1和P2，扩增参数94℃5min；94℃ 30sec；60℃ 30sec；72℃2min 35个循环；72℃10min。反应产物进行脂糖凝胶电泳检测，获得约1.34kb的扩增片段。
BAPT酶基因P15’-cgaattcatgaagaagacaggttcgtttgc-3’(SEQ ID NO.3)BAPT酶基因P25’-cctcgagtcataactttgacggacacactttag-3’(SEQ ID NO.4)2.连接按PCR回收Kit说明书回收BAPT酶基因目标片段。回收的BAPT cDNA片段与pGEM-T Easy载体在T4 DNAligase作用下16℃过夜。
3.转化大肠杆菌用氯化钙法转化大肠杆菌，用蓝白斑筛选检测转化的大肠杆菌阳性克隆；4.基因的检测利用BAPT酶基因特异引物对筛选的大肠杆菌阳性克隆进行PCR检测，并对PCR检测所确定的大肠杆菌阳性克隆抽取质粒DNA进一步进行测序验证。
序列分析显示BAPT酶基因的全长为1338bp。根据推导，该酶基因共编码445个氨基酸。将克隆的BAPT酶基因全长序列及其编码蛋白质用BLAST程序在NCBI的nr数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，发现它与来自于Taxus cuspidata的巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙酰化酶基因存在很高的同源性。在核苷酸水平上，所克隆的BAPT酶基因与Taxus cuspidata的巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙酰化酶基因的编码序列(GenBank Accession No.AY082804)有90％的同源性；在氨基酸水平上，它与Taxus cuspidata的巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙酰化酶基因的氨基酸序列有92％的同源性(GenPept Accession No.AAL92459)。
三、DBTNBT酶基因的克隆的实施例1.基因克隆N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶基因由本实验室参照TaKaRa RNA PCR Kit说明书从曼地亚红豆杉的总RNA提取物中克隆。反转录用多聚T作引物，反应条件20℃，10min；42℃60min；0℃2min。PCR反应用DBTNBT酶基因特异性引物P1和P2，扩增参数94℃ 5min；94℃ 30sec；60℃ 30sec；72℃ 2min 35个循环；72℃10min。反应产物进行脂糖凝胶电泳检测，获得约1.33kb的扩增片段。
DBTNBT酶基因P15’-cgaattcatggagaaggcaggctcaacag-3’(SEQ ID NO.5)DBTNBT酶基因P25’-cctcgagtcacactttacttacatctttctc-3’(SEQ ID NO.6)2.连接按PCR回收Kit说明书回收DBTNBT酶基因目标片段。回收的DBTNBT cDNA片段与pGEM-T Easy载体在T4 DNAligase作用下16℃过夜。
3.转化大肠杆菌用氯化钙法转化大肠杆菌，用蓝白斑筛选检测转化的大肠杆菌阳性克隆；4.基因的检测利用DBTNBT酶基因特异引物对筛选的大肠杆菌阳性克隆进行PCR检测，并对PCR检测所确定的大肠杆菌阳性克隆抽取质粒DNA进一步进行测序验证。
序列分析显示DBTNBT酶基因的全长为1326bp，根据推导该酶基因共编码441个氨基酸。将克隆的DBTNBT酶基因全长序列及其编码蛋白质用BLAST程序在NCBI的nr数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，发现它与来自于Taxus canadensis的N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶基因存在很高的同源性。在核苷酸水平上，所克隆的DBTNBT酶基因与Taxus canadensis的N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶基因的编码序列(GenBank Accession No.AF466397)有85％的同源性；在氨基酸水平上，它与Taxuscuspidata的N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶基因的氨基酸序列有95％的同源性(GenBank Accession No.AAM75818)。
权利要求
1.一种利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征在于，紫杉醇的酶催化半合成以红豆杉中含量相对丰富的10去乙酰巴卡亭三为底物，对紫杉醇三环二萜骨架修饰过程中采用酶催化的方法，直接对10位和13位进行特异性酰化，且整个反映在温和条件下进行，紫杉醇酶催化半合成以三个重组酰化酶为催化剂，在反应器中进行三步酰化，从而合成紫杉醇。
2.根据权利要求1所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是，所采用的三个酶为10-DAB 10位乙酰化酶，即10DAB10-O-acetyl transferase，DAT；巴卡亭三13位3’-氨基-3’-苯基丙酰化酶，即BaccatinIII3-amino-3-phenylpropanoyltransferase，BAPT；N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶，即3’-N-debenzoyl-2’-deoxytaxolN-benzoyltransferase，DBTNBT。
3.根据权利要求2所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是，酰化酶是通过克隆红豆杉中对应酰化酶基因，在大肠杆菌或者酵母中进行表达而产生的。
4.根据权利要求1所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是，提供了一种载体，它包含以下三个DNA分子或者其中之一DNA分子A具有编码10-DAB 10位乙酰化酶10DAB10-O-acetyltransferase，DAT的核苷酸序列，DNA分子B具有编码巴卡亭三13位3-氨基-3-苯基丙酰化酶Baccatin III3-amino-3-phenylpropanoyl transferase，BAPT的核苷酸序列，DNA分子C具有编码N去苯甲酰基紫杉醇苯甲酰化酶3-N-debenzoyl-2-deoxytaxolN-benzoyl transferase，DBTNBT的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是选用的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒，将三个酰化酶基因编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成三个酰化酶基因的表达载体。
6.根据权利要求4所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是，提供了一种用上述载体转化宿主菌，从而获得含有三个酰化酶基因的基因工程菌。
7.根据权利要求4所述的利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征在于进一步提供了一种分离纯化重组酶蛋白，并在含有C-13侧链前体的中性缓冲体系中下催化10去乙酰基巴卡亭三转化为紫杉醇。
8.根据权利要求1所述的这种利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是DAT，BAPT，DBTNBT指具有与野生型DAT，BAPT，DBTNBT相同活性的多肽，既包括野生型，也包括其变异型，为小于等于20个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加15个以内的氨基酸。
9.根据权利要求1所述的这种利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是DAT，BAPT，DBTNBT的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与其野生型基因DNA杂交的DNA所编码的蛋白。
10.根据权利要求1所述的这种利用酶催化半合成紫杉醇的方法，其特征是修饰形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化，还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽，以及具有磷酸化氨基酸残基，如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸的序列，和被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
全文摘要
一种利用酶催化半合成紫杉醇的方法属于分子生物工程与生物化学工程领域。紫杉醇的酶催化半合成以红豆杉中含量相对丰富的10去乙酰巴卡亭三为底物，对紫杉醇三环二萜骨架修饰过程中采用酶催化的方法，直接对10位和13位进行特异性酰化，且整个反应在温和条件下进行，紫杉醇酶催化半合成以三个重组酰化酶为催化剂，在反应器中进行三步酰化，从而合成紫杉醇。本发明提供的紫杉醇酶催化半合成方法，对紫杉醇骨架进行修饰，所需步骤更少，操作更简单，提高了紫杉醇合成的选择性和产率，从而在更大规模上进行更大强度的紫杉醇生产。
文档编号C07D305/00GK1460720SQ0311616
公开日2003年12月10日 申请日期2003年4月3日 优先权日2003年4月3日
发明者苗志奇, 唐克轩, 张利达 申请人:上海交通大学
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