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2021-01-31 21:01:13|
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起点商标网 专利名称：与人类细胞逐渐死亡相关的新的肽类及其编码它的dna的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与细胞死亡有关的新的肽类及编码它的脱氧核糖核酸。
在不同种类动物的几乎所有组织中都可观察到受发育和生理状况控制的细胞的死亡。这种细胞死亡通常被看作“逐渐”死亡以区别于由病理过程引起的“意外”死亡。遭受逐渐死亡的大多数细胞已被阐明需要从头合成RNA和蛋白质。
这些事实表明即使不是特定的一种，也至少是几种基因必须被表达以导致细胞逐渐死亡。
另一方面“自然死亡”一词被用来描述一类细胞死亡的形态学特征。由自然死亡导致的死细胞中，染色质在细胞核周边的周围浓缩，而线粒体和其它细胞器不受影响。自然死亡细胞的一个独特的生化特征包括DNA断裂成寡核苷酸片段。在哺乳动物中，自然死亡在形态学和生化特征上与细胞的逐渐死亡是相关的，但是有些遭受逐渐死亡的细胞显然没有表现出自然死亡特有的性质，而且缺乏任何一种蛋白质的合成都可诱发细胞的自然死亡。
因此指出自然死亡与细胞逐渐死亡的含义不相同是至关重要的。
最近研究表明bcl-2是一种致癌基因，它存在于死亡化的B细胞中以保护细胞死亡，可见控制细胞死亡是很重要的。
至今已报道了某些与细胞逐渐死亡相关的肽类，这类肽中的一个代表是Fas抗原。(Ltoh，N.et al.，Cell.66，233(1991))人类的Fas抗原是一种含有335个氨基酸的多肽，并且它的信号肽是含有16个疏水的氨基酸的N未端，它的成熟的蛋白质的结构被分为细胞外区(157个氨基酸)，转膜区(17个氨基酸)和细胞质区(145个氨基酸)。Fas抗原被认为具有受体的功能，可接受诱导细胞死亡的因子(配体)。
本发明的目的是寻找新的多肽以替换Fas抗原所代表的多肽。
本发明中已分离出与细胞逐渐死亡密切相关的基因，并确定了它的核苷酸序列，推导出它的氨基酸序列。本发明人成功地找出了一种全新的多肽以及编码它的DNA，从而完成了本发明。
为了分离出与细胞逐渐死亡密切相关的基因，鼠的PD-1被用作探针，它是从鼠的T细胞杂种瘤2B4.11(日本专利公开号5-336973)中得到的。
通过计算机程序，将本发明中测定的多肽的氨基酸序列与国家生物医学研究基金会的数据库中所有已知的序列相比较发现除了鼠的PD-1外，没有一种多肽含有与本发明的多肽完全相同或具高度同源性的氨基酸序列。毫无疑问，这确证了此多肽与Fas抗原没有同源性。
本发明涉及与细胞逐渐死亡密切相关的多肽(以下简称为人的PD-1)。
本发明涉及含有SEQ.ID.NO.1中表示的氨基酸的基本上为纯化形式的一种多肽;还涉及此多肽的同源物或此序列的片段或片段的同源物;还涉及编码这种多肽的DNA。更具体地讲，本发明还涉及到含有SEQ.ID.NO.2或3中表示的核苷酸序列的DNA，以及含有一个可选择性地与SEQ.ID.NO.2或3中表示的核苷酸序列杂交的片段的DNA。
本发明涉及(1)一种多肽，含有SEQ.ID.NO.1中表示的氨基酸序列，(2)一种DNA，编码上述(1)所描述的多肽，(3)一种DNA，含有SEQ.ID.NO.2中表示的核苷酸序列，和(4)一种DNA，含有SEQ.ID.NO.3中表示的核苷酸序列。
基本上为纯化形式的SEQ.ID.NO.1的多肽通常含有制剂形式的多肽，其中制剂中超过90%，例如95%，98%或99%的多肽是来自SEQ.ID.NO.1。
SEQ.ID.NO.1的多肽同系物一般与SEQ.ID.NO.1的多肽至少有70%，优选至少有80%或90%，更优选至少95%的同源性，同源区域至少为20个邻近的氨基酸优选至少30，例如40，60或100或更多。这种多肽类似物在下文中提及时是称作为本发明的多肽。
通常，SEQ.ID.NO.1的片段或它的同系物的氨基酸长度至少为10个，优选至少为15个，例如20，25，30，40，50或60个，它包含在本文所用的“根据本发明的多肽”一词中。
能选择性地与SEQ.ID.NO.2或3的DNA杂交的DNA通常与SEQ.ID.NO.2或3的DNA至少具有70%的同源性，优选至少80%或90%，更优选至少95%的同源性，同源区为至少20个相邻核苷酸，优选至少30，例如40，60或100或更多。这种DNA包含在“根据本发明的DNA”一词中。
SEQ.ID.NO.2或3的DNA片段长度至少为15个核苷酸，优选至少20，例如25，30或40个，它也包含在本文所用的“根据本发明的DNA”一词中。
本发明的另一个实例是提供了含有根据本发明的DNA的复制和表达载体，这种载体可以是例如质粒、病毒或噬菌体载体，其中配备了复制起点，还可以含有或不含有用来表达所说DNA的启动子，以及含有或不含有此启动子的调节基因。此载体可含有一个或多个选择性标记基因，如氨苄西林抗性基因，此载体可用于体外实验，如制备DNA相应的RNA，或用于转染或转化宿主细胞。
本发明又一实施例提供了用载体转化或转染的宿主细胞以复制和表达本发明的DNA，包括SEQ.ID.NO.2或3的DNA或者它们的开放阅读框架。可选择与载体相容的细胞，可以是例如细菌，酵母，昆虫或哺乳动物的细胞。
本发明的再一实施例提供了生产多肽的方法，该方法包括在表达本发明多肽的有效的条件下培养本发明宿主细胞。另外，此方法进行的优选条件是使本发明的多肽被表达再从宿主细胞中产生。
本发明的DNA也可以反意义方向插入上述载体中以证实反义RNA的产生。反义RNA也可通过合成途经产生，这种反义RNA也可用于控制细胞中本发明多肽的水平的方法中。
本发明还提供了抗本发明的多肽的单克隆或多克隆抗体。本发明进一步提供了产生本发明多肽的单克隆或多克隆抗体的方法。单克隆抗体的制备可利用通常的杂交瘤技术，并使用本发明的多肽或其片段作为免疫原。多克隆抗体的制备也可用通常的方法，包括用本发明多肽接种宿主动物，如大白鼠或兔子，再回收免疫血清。
本发明还提供了含有本发明多肽或其抗体的药用组合物，它与药用可接受的稀释剂和/或载体相结合。
本发明的多肽包括那些部分氨基酸序列缺失的多肽(例如一多肽仅含SEQ.ID.NO.1氨基酸序列中揭示生命活性所必需的序列)，和那些部分氨基酸序列被其它氨基酸取代的多肽(例如那些被具有相似性质氨基酸所取代的多肽)以及由其它氨基酸加入或插入它们部分氨基酸序列中的多肽，还包括那些具有SEQ.ID.NO.1氨基酸序列的多肽。
众所周知，有1至6种密码子可作为编码一种氨基酸的密码子(例如，已知编码甲硫氨酸(Met)的有一种密码子编码，而编码亮氨酸(Leu)的有6种密码子编码)。相应地，可改变DNA的核苷酸序列以编码具有相同氨基酸序列的多肽。
在(2)中特指的本发明的DNA包括一组DNA，该DNA组中每种核苷酸序列都编码SEQ.ID.NO.1中的多肽(1)，有可能通过改变核苷酸序列来提高多肽的产量。
(3)中特指的DNA是(2)中所述DNA的具体化，是自然状态的序列。
(4)中所示的DNA是具有未转译区的(3)中特指的DNA序列。
本发明的DNA可通过基因重组、化学合成或本领域熟练人员已知的方法得到。
人的PD-1包括一系列在结构特征上与Fas抗原不相同、在哺乳动物中普遍存在的多肽。这就是说，本发明的PD-1包括本发明中公开的人的PD-1以及具很高同源性的其它哺乳动物的PD-1(这意味着免疫作用相同，可与人PD-1抗原发生交叉反应)。
以下是人的PD-1的结构特征人的PD-1被预言为膜结合型蛋白质，它含有288个氨基酸，含有两个疏水区，一个在N末端另一个在中间，可能分别担当信号肽和转膜部分的作用。
将PD-1蛋白质的N-末端序列与典型的信号肽断裂位点相比较表明信号肽位于Met1至Arg20区。因此预想的PD-1蛋白质的成熟形式含有268个氨基酸，以及含有一个细胞外区(147个氨基酸)，一个转膜区(27个氨基酸)和一个细胞质区(94个氨基酸)，在被公认的细胞外区发现了四个潜在的N-糖基化作用的位点。
将PD-1蛋白质的氨基酸序列与国家生物医学研究基金会数据库中所收录的所有序列相比较表明PD-1蛋白质的细胞外区与免疫球蛋白总库的某些成员具有同源性。根据保守的氨基酸模式和反向平行的β链的数目可将免疫球蛋白区域分为V、C1和C2三部分。在PD-1的两个半胱氨酸残基(Cys54和Cys123)之间的68个氨基酸残基与V部分序列的二硫键连接的免疫球蛋白部分很相似。而且，许多V部分序列特征性的所有四个氨基酸残基在PD-1中也是保守的。(Arg94，Phe95，Asp117和Gly119)。
预想的PD-1蛋白质的细胞质区含有共有序列的不同形式(Asp/Glu-X8-Asp/Glu-X2-Tyr-X2-Leu/Ile-X7-Tyr-X2-Leu/Ile)，这些共有序列见于与抗原受体和Fc受体相关的大多数多肽的细胞质区的后部。最近的研究表明此共有序列的一个信号单位就足够用来转换信号。
据认为其它哺乳动物的PD-1在结构特征上与人的PD-1相类似，无论如何，在它们的序列中，氨基酸的数目或种类是不相同的。
本发明中编码人的PD-1的DNA可以以下述方法制备。
一旦确定了SEQ.ID.NO.2和3所表示的核苷酸序列，本发明的DNA就可通过化学合成和PCR的方法得到，或通过利用本发明的DNA片段作为探针的杂交法得到。另外，通过将插入了本发明的DNA的载体DNA转化进合适的宿主细胞，接着培养转化子的方法就可得到所需量的本发明的DNA。
本发明的PD-1多肽(见SEQ.ID.NO.1)可按下述方法制备(1)分离和纯化生物体或经培养的细胞，(2)化学合成，或(3)利用生物技术的方法，优选的是(3)中所描述的方法。
利用生物技术制备多肽时所用的表达系统的例子如细菌、酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞的表达系统。
例如，通过在编码成熟肽类的DNA 5′端加上起始密码子(ATG)，将由此得到的DNA与适当启动子的下游相连接(如trp启动子，lac启动子，λPL启动子，T7启动子等)，再将它插入在E.Coli菌株中行使功能的载体中(如pBR322，pUC18，pUC19等)以制备一表达载体，从而实现在E.Coli中的表达。
然后将由此得到的表达载体转化一种E.Coli菌株(如E.Coli DH1菌株，E.Coli JM109菌株，E.Coli HB101菌株等)，在合适的培养基中培养此菌株以获得所需的多肽，当利用了细菌的信号肽时(如pel B的信号肽)，所需的多肽也可释放到周质中，而且与其它多肽的融合蛋白质也很容易产生。
另外，在哺乳动物细胞中也可进行表达，例如，将编码PD-1的总DNA插入适当载体(如逆转录病毒载体，乳头状瘤病毒载体，痘苗病毒载体，SV40载体等)的适当启动子的下游(如SV40启动子，LTR启动子，金属硫蛋白启动子等)以得到一表达载体，再将由此得到的表达载体转化一种适当的哺乳动物细胞(如猴的COS-7细胞，中国仓鼠CHO细胞，鼠L细胞等)，然后在适当的培养基中培养转化子以在培养基中得到所需的多肽，由此得到的多肽可通过常规的生物化学方法分离和纯化。
编码本发明所得PD-1基因的DNA可用作分离其它动物PD-1基因的探针。
可通过下述方法制备含有SEQ.ID.NO.3中所述核苷酸序列的cDNA，即(ⅰ)从产生本发明多肽的细胞系中分离出mRNA(如人的食道癌细胞系)，(ⅱ)从由此得到的mRNA制备第一条链(单链DNA)，再制备第二条链(双链DNA)(合成cDNA)(ⅲ)将由此得到的cDNA插入一合适的噬菌体载体中，(ⅳ)将由此得到的重组DNA转化宿主细胞(制备cDNA文库)(ⅴ)利用鼠PD-1的cDNA作为探针，与由上得到的cDNA文库进行噬菌斑杂交而进行筛选，(ⅵ)从所得阳性克隆中制备噬菌体DNA，亚克隆释放入质粒载体的cDNA，绘制限制性酶切图谱，和(ⅶ)测定每一个限制性酶切片段的序列，将它们连接起来就可得到完整长度的全部序列。
详细地说，步骤(ⅰ)可根据Okayama.H.et.al.的方法(见于Methods in Enzymology，Vol.154，P3，1987)来进行，即从人的细胞系中分离mRNA要先经过合适的刺激剂(如IL-1等)的刺激作用，或者不经过刺激作用。产生本发明多肽的细胞的例子优选人的细胞系YTC3。
步骤(ⅱ)，(ⅲ)和(ⅳ)是制备cDNA文库的一系列步骤，可根据Gubler & Hoffman(Gene，Vol.25.pp.263，1983)的方法进行，只需稍加改变，在步骤(ⅲ)中使用的质粒载体的例子有许多已知的质粒载体(如pBR322，pBluesciptⅡ)和噬菌体载体(如λgt10，λDASHⅡ)，优选使用噬菌体载体λgt10(43.3 kbpStratagene)。
步骤(ⅳ)中所使用的宿主细胞优选E.Coli NM514(Stratagene)。
步骤(ⅴ)和(ⅵ)可根据Molecular Cloning(Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))中所述方法进行。
步骤(ⅶ)可根据Molecular Cloning(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，编写，Cold Spring harbor Laboratory Press，1989年出版)中所述方法进行。
步骤(ⅶ)的测序可根据Maxam-Gilbert的方法或双脱氧终止法进行。
有必要检验由此得到的cDNA是否编码完整或几乎完整的长度，该验证可使用所述cDNA作为探针，通过Northern分析来进行。(见上述Molecular Cloning)，据认为如果CDNA的长度与在杂交带中所得mRNA的长度几乎相同，cDNA就几乎是完整的长度。
编码PD-1基因的DNA或者DNA片段可用作探针或引物以识别PD-1基因，因此可用于研究所述多肽和活的有机体的保护机制，免疫功能或象肿瘤这类的疾病之间的关系，或者用于诊断疾病及其类似的目的。
本发明的DNA可用作重要和必需的模板以通过常规的基因重组来制备PD-1的多肽，以及被期望有不同的用途的该多肽的片段或其衍生物。
我们期望多肽，其多肽片段及其衍生的多肽可用于治疗感染，免疫功能或肿瘤的遏制或加强。
另外，本发明多肽或多肽片段的多克隆和单克隆抗体可通过常规方法制备，它们可用于对有机体中所含的上述多肽进行定量，因此可用来研究上述多肽和疾病之间的关系，或用于诊断疾病及其类似目的。上述单克隆抗体本身，针对人的抗体的嵌合体抗体可用作治疗剂，它的多克隆和单克隆抗体的制备利用上述的多肽或其片段作为抗原可通过常规的方法来实现。
为了本发明的目的，本发明的多肽可系统地或部分地正常给药，通常是口腔或非肠给药，优选口腔、静脉内或心室内给药。
给药的剂量需由年龄、体重、症状、所需达到的治疗效果、给药途经、治疗的持续时间等来决定，对于成年人，口服给药时每人每天的剂量通常在100μg和100mg之间，每天几次服药，通过非肠道给药时，剂量为10μg和100mg之间，每天几次给药。
如上所述，所用剂量随条件不同而变化，因此，在某些病例中，使用的剂量会比上面所规定范围低或者高。
本发明的化合物给药时，对于口服而言可以是固体组合物，液体组合物或其它组合物，对于非肠道给药，可以是针剂，涂抹剂或栓剂等。
口服的固体组合物包括浓缩的药片、药丸、胶囊，分散的粉末，颗粒。胶囊包括软胶囊和硬胶囊。
在这种组合物中，一种或多种有活性的化合物与至少一种惰性稀释剂相混合(如乳糖、甘露醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微结晶的纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、镁的硅铝酸盐等)。这种组合物在常规临床使用中也可含有除惰性稀释剂外的附加物质如润滑剂(如镁的硬脂酸盐等)，崩解剂(如纤维素钙甘醇酸酯等)、稳定剂(如人的血清蛋白、乳糖等)以及用于溶解的辅剂(如精氨酸、天冬氨酸等)。
如果需要，片剂或丸剂要包裹一层胃或肠包衣材料所制的膜(如糖、明胶、羟丙基纤维素或羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯等)，或者包裹两层以上的膜，而且外膜可包括胶囊内容物中可吸收的物质，例如明胶。
口服的液体组合物包括药用可接受的乳剂、溶液、糖浆和酏剂。在这种组合物中，本领域通常使用的惰性稀释剂中含有一种或多种活性的化合物(纯化水、乙醇等)，除了惰性稀释剂，此类组合物也可含有辅药(如湿润剂、悬浮剂等)、增甜剂、调味剂、香味剂或保存剂。
口服的另一些组合物包括喷雾组合物，它可由已知方法制备，含有一种或多种活性化合物。喷雾组合物可含有附加的物质而不是惰性稀释剂如稳定剂(亚硫酸钠等)，等渗缓冲液(氯化钠，柠檬酸钠，柠檬酸等)。为了制备这种喷雾组合物，可使用例如美国专利NO.2，868，691或3，095，355中描述的方法(引入本文以供参考)。
非肠道给药的注射剂包括无菌水或非水溶液，悬浮液和乳剂。在这种组合物中，一种或多种有活性的化合物与至少与一种惰性水稀释液(注射用蒸馏水、生理盐水等)或惰性非水稀释液相混合(丙二醇，聚乙二醇、橄榄油、乙醇、POLYSOLBATE 80 TM等)。
注射液可含有附加化合物而不是惰性稀释剂、如保护剂，湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(如人的血清蛋白、乳糖等)、和辅剂，如帮助溶解的辅剂(精氨酸，天冬氨酸等)。
它们必需经过灭菌，例如通过细菌截留滤器的过滤作用，通过将灭菌剂与组合物相混合或者通过紫外照射来灭菌。它们也可以无菌固体组合物形式来制得，如冻干的形状，在使用前可在无菌水或一些其它无菌稀释液中很快溶解以用来注射。
非肠道给药的其它组合物包括外部用药的液体，和皮下涂抹剂(软膏等)、直肠给药的栓剂和阴道药栓，它含有一种或多种活性化合物，可由已知方法制得。
以下实施例阐明但并不限制本发明。
实施例1细胞培养将人的细胞系(CESS，HPB-ALL，Jarkat，TC3，CCRF-CEM，JM和MOLT-4F)培养于RPMI1640(Gibco)中，该培养基中补充了10%热灭活的小牛血清，2mM谷酰胺，50μM2-巯基乙醇，100U/ml青霉素和100μg/ml的链霉素。
实施例2Northern blot分析使用异硫氰酸胍盐抽提法(见上述(Molecular Cloning)从所指的细胞系中制备总RNA，用oligotex-dt 30<super>(DaiichiChemical Co.)从总RNA中分离出poly(A)+RNA。在1.2%甲醛琼酯糖凝胶上分离3μg Poly(A)+RNA，再转移到尼龙膜上(Biodyne A，Japan Genetic)，将膜在80℃下烘烤2小时，给含有鼠PD-1编码区的EcoRI片段(1kb)接上随机引物，用32P标记制备成探针。此探针的比活大约是9×108d.p.m。/μg。杂交在10×Denhardt′s，1MNacl，50m MTris(PH7.5).10mMEDTA，1%SDS和1mg/ml经声波处理的鲑精DNA中进行，65℃下反应15小时，将膜置于1×SSC，0.1%SDS中，65℃下洗涤10分钟，通过放射自显影照片可从淋巴细胞系YTC3中观察到杂交信号(2.3kb)。
实施例3cDNA文库的构建和人PD-1cDNA的克隆，利用5μg从使用Time saver合成试剂盒(pharmacia)YTC3细胞系中抽提到的5μg，poly(A)+RNA构建cDNA文库，用寡dT引物合成CDNA的第一条链，将双链cDNA与EcoRI-NotI接受者相连接，克隆进λgt10载体，包装进噬菌体中(Gigapack Ⅱ Gold，Stratagene)，噬菌体被铺在E.ColiNM 514菌坪的上面。从每个平板上将噬菌体DNA转染到二个重复的文库滤膜上，将滤膜在80℃下烘烤2小时，在60℃下杂交15小时，从Bluescript SK质粒载体(Stratagene)中用EcoRI切割出鼠PD-1的编码区(1kb)用作探针，将滤膜在1×SSC和0.1%SDS中，60℃下洗涤10分钟，通过放射自显影照片可在1.2×106个噬菌体中找到51个阳性信号。将这些克隆纯化至单一形式，进一步分析所检得的大约23个克隆，所观察到插入的最长的cDNA是2.1kb，这个结果与Southern Bolt分析得到的结果是一致的。
实施例4DNA序列测定将从人的cDNA文库分离得到的cDNA插入物亚克隆进Bluescript SK质粒载体(Stratagene)，使用经修饰的T7 DNA多聚酶(United States Biochemical)和[α-32P]d CTP(3000Ci/mmol，Amersham)，通过双脱氧核苷酸链终止法测定其序列。将Bluescript质粒特有的引物用作测序引物。核苷酸测序针对cDNA的两条链完整地进行，从结果看，得到了seQ.NO.2中表示的核苷酸序列，从核苷酸序列中可确定推导出的肽的序列(见SEQ.ID.NO.1)，推导出的氨基酸的总数目是288，其数目与鼠PD-1的氨基酸数目相同，互相之间具有60%的同源性。
实施例5Southern Blotting用常规方法(见上述分子克隆)从多种动物细胞中分离出基因组DNA，应用EcoR I，BamHI或HindⅢ消化DNA，接着根据制造商的说明电泳分离DNA片段(100V，0.8%琼脂糖凝胶，TEA缓冲液)，用0.25N HCl洗涤DNA片段10分钟，用0.2N NaOH/0.6M NaCl建立变性30分钟，用0.6M NaCl/0.2MTris(PH7.5)处理1小时以中和反应，将DNA片段转移到标准Southern程序所用的尼龙膜(Bidyne A)上，将此膜烘烤2小时。
给含有人PD-1编码区的EcoRI-Stul片段(900bp)接上随机引物用32P标记制成探针，探针的比活大约是9×108d.P.m/μg，杂交在10×Denhardt′s，1M Nacl，50mMTris(PH7.5)，10mMEDTA，1%SDS和1mg/ml经声波处理的鲑精DNA中进行，65℃下反应10分钟，将膜置于1×SSC，0.1%SDS中，65℃下洗涤10分钟，当克隆经过任何一种酶切割后，放射自显影照片中只能见到仅有的一条带，因此发现人的PD-1基因是作为单一拷贝存在的。
各种动物基因组DNA的Southern杂交可按与实施例2中描述的同样的条件(杂交和洗涤)，利用含鼠PD-1编码区的EcoRI片段(1kb)作为探针来完成，只能在鼠和人的基因组DNA中看到杂交信号，在果蝇、非洲爪蟾和兔的基因组DNA中看不到杂交信号。
实施例6人的PD-1基因组克隆的分离通过用Sau3A1部分消化和与BamHI位点连接，可在λDASHII载体上构建来源于食道癌细胞系的基因组DNA文库(从Dr.Nishiyama，lst Dept.of Pathology，School of Medicine，KyotoUniversity)得到，用EcoRI消化Bluescript SK载体切割得到人PD-1的总CDNA，通过与之杂交可从此文库中分离得到人的PD-1基因，通过接上随机引物，探针被32P标记，从1×106个噬菌斑中分离纯化出两个阳性克隆，用几种限制性内切酶消化，用同一种探针进行Southern杂交分析，从CISS(染色体原位抑制)中发现人的PD-1基因图谱位于2q37.3。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)姓名ONO PHARMACEUTICAL CO.，LTD.
(B)街道1-5，Doshomachi 2-chome(C)城市Chuo-ku，Osaka-shi(D)州Osaka(E)国家Japan(F)邮编(ZIP)541(A)姓名HONJO，TASUKU(B)街道Kan′Yuchi，Kitashirakawa Oiwakecno，Sakyo-ku(C)城市Kyoto-shi(D)州Kyoto(E)国家Japan(F)邮编(ZIP)606(ⅱ)发明名称与人类细胞逐渐死亡相关的一种新的肽类及其编码它的DNA(ⅲ)序列数目4
(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度288个氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1
(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度864个碱基对(B)类型核酸(C)股数单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型mRNA的cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2
(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度921碱基对(B)类型核酸(C)股数单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型mRNA的cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3
(2)SEQ ID NO4的资料(ⅰ)序列特征(A)长度921个碱基对(B)类型核酸(C)股数单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型mRNA的cDNA(ⅵ)原始来源(A)有机体Homo Sapiens(H)细胞系YTC3
(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位点25..888(C)鉴别方法P(ⅸ)特征(A)名称/关键词Sig-peptide(B)位点25..84(C)鉴别方法S(ⅸ)特征(A)名称/关键词mat-peptide(B)位点85..888(C)鉴别方法S(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.4
权利要求
1.一种基本上纯化形式的多肽，含有SEQ.ID.NO.1中所述的氨基酸序列，该多肽的同系物或者该序列的片段或者片段的同系物，
2.根据权利要求1的多肽，它含有SEQ.ID.NO.1中所述的氨基酸序列，
3.一种DNA，编码根据权利要求1的多肽，
4.根据权利要求3的DNA，含有SEQ.ID.NO.2中所述的核苷酸序列或它的，能选择性与SEQ.ID.NO.2杂交的片段，
5.根据权利要求3的DNA，含有SEQ.ID.NO.3中所述的核苷酸序列或它的，能选择性地与SEQ.ID.NO.3.杂交的片段，
6.一种复制和表达载体，含有根据权利要求3至5中任何一个的DNA，
7.用根据权利要求6的复制和表达载体转化或转染的宿主细胞。
8.一种产生多肽的方法，包括在有效表达根据权利要求1或2的多肽的条件下培养权利要求7的宿主细胞，
9.一种根据权利要求1或2的多肽的单克隆抗体或多克隆抗体，
10.一种含有根据权利要求1或2的多肽或者一种根据权利要求9的抗体的药用组合物，其中抗体或多肽与一种药用可接受的稀释剂和/或载体相结合。
全文摘要
一种新的与人的细胞逐渐死亡(PD-1)相关的膜蛋白和编码这种蛋白质的DNA，PD-1蛋白质可用于治疗不同的感染，免疫抑制或加强，或肿瘤等。
文档编号C07K14/705GK1113518SQ9510327
公开日1995年12月20日 申请日期1995年3月1日 优先权日1994年3月1日
发明者本庶佑, 石田靖雄, 篠原隆司 申请人:小野药品工业株式会社, 本庶佑
技术领域：
本发明涉及一种与细胞死亡有关的新的肽类及编码它的脱氧核糖核酸。
在不同种类动物的几乎所有组织中都可观察到受发育和生理状况控制的细胞的死亡。这种细胞死亡通常被看作“逐渐”死亡以区别于由病理过程引起的“意外”死亡。遭受逐渐死亡的大多数细胞已被阐明需要从头合成RNA和蛋白质。
这些事实表明即使不是特定的一种，也至少是几种基因必须被表达以导致细胞逐渐死亡。
另一方面“自然死亡”一词被用来描述一类细胞死亡的形态学特征。由自然死亡导致的死细胞中，染色质在细胞核周边的周围浓缩，而线粒体和其它细胞器不受影响。自然死亡细胞的一个独特的生化特征包括DNA断裂成寡核苷酸片段。在哺乳动物中，自然死亡在形态学和生化特征上与细胞的逐渐死亡是相关的，但是有些遭受逐渐死亡的细胞显然没有表现出自然死亡特有的性质，而且缺乏任何一种蛋白质的合成都可诱发细胞的自然死亡。
因此指出自然死亡与细胞逐渐死亡的含义不相同是至关重要的。
最近研究表明bcl-2是一种致癌基因，它存在于死亡化的B细胞中以保护细胞死亡，可见控制细胞死亡是很重要的。
至今已报道了某些与细胞逐渐死亡相关的肽类，这类肽中的一个代表是Fas抗原。(Ltoh，N.et al.，Cell.66，233(1991))人类的Fas抗原是一种含有335个氨基酸的多肽，并且它的信号肽是含有16个疏水的氨基酸的N未端，它的成熟的蛋白质的结构被分为细胞外区(157个氨基酸)，转膜区(17个氨基酸)和细胞质区(145个氨基酸)。Fas抗原被认为具有受体的功能，可接受诱导细胞死亡的因子(配体)。
本发明的目的是寻找新的多肽以替换Fas抗原所代表的多肽。
本发明中已分离出与细胞逐渐死亡密切相关的基因，并确定了它的核苷酸序列，推导出它的氨基酸序列。本发明人成功地找出了一种全新的多肽以及编码它的DNA，从而完成了本发明。
为了分离出与细胞逐渐死亡密切相关的基因，鼠的PD-1被用作探针，它是从鼠的T细胞杂种瘤2B4.11(日本专利公开号5-336973)中得到的。
通过计算机程序，将本发明中测定的多肽的氨基酸序列与国家生物医学研究基金会的数据库中所有已知的序列相比较发现除了鼠的PD-1外，没有一种多肽含有与本发明的多肽完全相同或具高度同源性的氨基酸序列。毫无疑问，这确证了此多肽与Fas抗原没有同源性。
本发明涉及与细胞逐渐死亡密切相关的多肽(以下简称为人的PD-1)。
本发明涉及含有SEQ.ID.NO.1中表示的氨基酸的基本上为纯化形式的一种多肽;还涉及此多肽的同源物或此序列的片段或片段的同源物;还涉及编码这种多肽的DNA。更具体地讲，本发明还涉及到含有SEQ.ID.NO.2或3中表示的核苷酸序列的DNA，以及含有一个可选择性地与SEQ.ID.NO.2或3中表示的核苷酸序列杂交的片段的DNA。
本发明涉及(1)一种多肽，含有SEQ.ID.NO.1中表示的氨基酸序列，(2)一种DNA，编码上述(1)所描述的多肽，(3)一种DNA，含有SEQ.ID.NO.2中表示的核苷酸序列，和(4)一种DNA，含有SEQ.ID.NO.3中表示的核苷酸序列。
基本上为纯化形式的SEQ.ID.NO.1的多肽通常含有制剂形式的多肽，其中制剂中超过90%，例如95%，98%或99%的多肽是来自SEQ.ID.NO.1。
SEQ.ID.NO.1的多肽同系物一般与SEQ.ID.NO.1的多肽至少有70%，优选至少有80%或90%，更优选至少95%的同源性，同源区域至少为20个邻近的氨基酸优选至少30，例如40，60或100或更多。这种多肽类似物在下文中提及时是称作为本发明的多肽。
通常，SEQ.ID.NO.1的片段或它的同系物的氨基酸长度至少为10个，优选至少为15个，例如20，25，30，40，50或60个，它包含在本文所用的“根据本发明的多肽”一词中。
能选择性地与SEQ.ID.NO.2或3的DNA杂交的DNA通常与SEQ.ID.NO.2或3的DNA至少具有70%的同源性，优选至少80%或90%，更优选至少95%的同源性，同源区为至少20个相邻核苷酸，优选至少30，例如40，60或100或更多。这种DNA包含在“根据本发明的DNA”一词中。
SEQ.ID.NO.2或3的DNA片段长度至少为15个核苷酸，优选至少20，例如25，30或40个，它也包含在本文所用的“根据本发明的DNA”一词中。
本发明的另一个实例是提供了含有根据本发明的DNA的复制和表达载体，这种载体可以是例如质粒、病毒或噬菌体载体，其中配备了复制起点，还可以含有或不含有用来表达所说DNA的启动子，以及含有或不含有此启动子的调节基因。此载体可含有一个或多个选择性标记基因，如氨苄西林抗性基因，此载体可用于体外实验，如制备DNA相应的RNA，或用于转染或转化宿主细胞。
本发明又一实施例提供了用载体转化或转染的宿主细胞以复制和表达本发明的DNA，包括SEQ.ID.NO.2或3的DNA或者它们的开放阅读框架。可选择与载体相容的细胞，可以是例如细菌，酵母，昆虫或哺乳动物的细胞。
本发明的再一实施例提供了生产多肽的方法，该方法包括在表达本发明多肽的有效的条件下培养本发明宿主细胞。另外，此方法进行的优选条件是使本发明的多肽被表达再从宿主细胞中产生。
本发明的DNA也可以反意义方向插入上述载体中以证实反义RNA的产生。反义RNA也可通过合成途经产生，这种反义RNA也可用于控制细胞中本发明多肽的水平的方法中。
本发明还提供了抗本发明的多肽的单克隆或多克隆抗体。本发明进一步提供了产生本发明多肽的单克隆或多克隆抗体的方法。单克隆抗体的制备可利用通常的杂交瘤技术，并使用本发明的多肽或其片段作为免疫原。多克隆抗体的制备也可用通常的方法，包括用本发明多肽接种宿主动物，如大白鼠或兔子，再回收免疫血清。
本发明还提供了含有本发明多肽或其抗体的药用组合物，它与药用可接受的稀释剂和/或载体相结合。
本发明的多肽包括那些部分氨基酸序列缺失的多肽(例如一多肽仅含SEQ.ID.NO.1氨基酸序列中揭示生命活性所必需的序列)，和那些部分氨基酸序列被其它氨基酸取代的多肽(例如那些被具有相似性质氨基酸所取代的多肽)以及由其它氨基酸加入或插入它们部分氨基酸序列中的多肽，还包括那些具有SEQ.ID.NO.1氨基酸序列的多肽。
众所周知，有1至6种密码子可作为编码一种氨基酸的密码子(例如，已知编码甲硫氨酸(Met)的有一种密码子编码，而编码亮氨酸(Leu)的有6种密码子编码)。相应地，可改变DNA的核苷酸序列以编码具有相同氨基酸序列的多肽。
在(2)中特指的本发明的DNA包括一组DNA，该DNA组中每种核苷酸序列都编码SEQ.ID.NO.1中的多肽(1)，有可能通过改变核苷酸序列来提高多肽的产量。
(3)中特指的DNA是(2)中所述DNA的具体化，是自然状态的序列。
(4)中所示的DNA是具有未转译区的(3)中特指的DNA序列。
本发明的DNA可通过基因重组、化学合成或本领域熟练人员已知的方法得到。
人的PD-1包括一系列在结构特征上与Fas抗原不相同、在哺乳动物中普遍存在的多肽。这就是说，本发明的PD-1包括本发明中公开的人的PD-1以及具很高同源性的其它哺乳动物的PD-1(这意味着免疫作用相同，可与人PD-1抗原发生交叉反应)。
以下是人的PD-1的结构特征人的PD-1被预言为膜结合型蛋白质，它含有288个氨基酸，含有两个疏水区，一个在N末端另一个在中间，可能分别担当信号肽和转膜部分的作用。
将PD-1蛋白质的N-末端序列与典型的信号肽断裂位点相比较表明信号肽位于Met1至Arg20区。因此预想的PD-1蛋白质的成熟形式含有268个氨基酸，以及含有一个细胞外区(147个氨基酸)，一个转膜区(27个氨基酸)和一个细胞质区(94个氨基酸)，在被公认的细胞外区发现了四个潜在的N-糖基化作用的位点。
将PD-1蛋白质的氨基酸序列与国家生物医学研究基金会数据库中所收录的所有序列相比较表明PD-1蛋白质的细胞外区与免疫球蛋白总库的某些成员具有同源性。根据保守的氨基酸模式和反向平行的β链的数目可将免疫球蛋白区域分为V、C1和C2三部分。在PD-1的两个半胱氨酸残基(Cys54和Cys123)之间的68个氨基酸残基与V部分序列的二硫键连接的免疫球蛋白部分很相似。而且，许多V部分序列特征性的所有四个氨基酸残基在PD-1中也是保守的。(Arg94，Phe95，Asp117和Gly119)。
预想的PD-1蛋白质的细胞质区含有共有序列的不同形式(Asp/Glu-X8-Asp/Glu-X2-Tyr-X2-Leu/Ile-X7-Tyr-X2-Leu/Ile)，这些共有序列见于与抗原受体和Fc受体相关的大多数多肽的细胞质区的后部。最近的研究表明此共有序列的一个信号单位就足够用来转换信号。
据认为其它哺乳动物的PD-1在结构特征上与人的PD-1相类似，无论如何，在它们的序列中，氨基酸的数目或种类是不相同的。
本发明中编码人的PD-1的DNA可以以下述方法制备。
一旦确定了SEQ.ID.NO.2和3所表示的核苷酸序列，本发明的DNA就可通过化学合成和PCR的方法得到，或通过利用本发明的DNA片段作为探针的杂交法得到。另外，通过将插入了本发明的DNA的载体DNA转化进合适的宿主细胞，接着培养转化子的方法就可得到所需量的本发明的DNA。
本发明的PD-1多肽(见SEQ.ID.NO.1)可按下述方法制备(1)分离和纯化生物体或经培养的细胞，(2)化学合成，或(3)利用生物技术的方法，优选的是(3)中所描述的方法。
利用生物技术制备多肽时所用的表达系统的例子如细菌、酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞的表达系统。
例如，通过在编码成熟肽类的DNA 5′端加上起始密码子(ATG)，将由此得到的DNA与适当启动子的下游相连接(如trp启动子，lac启动子，λPL启动子，T7启动子等)，再将它插入在E.Coli菌株中行使功能的载体中(如pBR322，pUC18，pUC19等)以制备一表达载体，从而实现在E.Coli中的表达。
然后将由此得到的表达载体转化一种E.Coli菌株(如E.Coli DH1菌株，E.Coli JM109菌株，E.Coli HB101菌株等)，在合适的培养基中培养此菌株以获得所需的多肽，当利用了细菌的信号肽时(如pel B的信号肽)，所需的多肽也可释放到周质中，而且与其它多肽的融合蛋白质也很容易产生。
另外，在哺乳动物细胞中也可进行表达，例如，将编码PD-1的总DNA插入适当载体(如逆转录病毒载体，乳头状瘤病毒载体，痘苗病毒载体，SV40载体等)的适当启动子的下游(如SV40启动子，LTR启动子，金属硫蛋白启动子等)以得到一表达载体，再将由此得到的表达载体转化一种适当的哺乳动物细胞(如猴的COS-7细胞，中国仓鼠CHO细胞，鼠L细胞等)，然后在适当的培养基中培养转化子以在培养基中得到所需的多肽，由此得到的多肽可通过常规的生物化学方法分离和纯化。
编码本发明所得PD-1基因的DNA可用作分离其它动物PD-1基因的探针。
可通过下述方法制备含有SEQ.ID.NO.3中所述核苷酸序列的cDNA，即(ⅰ)从产生本发明多肽的细胞系中分离出mRNA(如人的食道癌细胞系)，(ⅱ)从由此得到的mRNA制备第一条链(单链DNA)，再制备第二条链(双链DNA)(合成cDNA)(ⅲ)将由此得到的cDNA插入一合适的噬菌体载体中，(ⅳ)将由此得到的重组DNA转化宿主细胞(制备cDNA文库)(ⅴ)利用鼠PD-1的cDNA作为探针，与由上得到的cDNA文库进行噬菌斑杂交而进行筛选，(ⅵ)从所得阳性克隆中制备噬菌体DNA，亚克隆释放入质粒载体的cDNA，绘制限制性酶切图谱，和(ⅶ)测定每一个限制性酶切片段的序列，将它们连接起来就可得到完整长度的全部序列。
详细地说，步骤(ⅰ)可根据Okayama.H.et.al.的方法(见于Methods in Enzymology，Vol.154，P3，1987)来进行，即从人的细胞系中分离mRNA要先经过合适的刺激剂(如IL-1等)的刺激作用，或者不经过刺激作用。产生本发明多肽的细胞的例子优选人的细胞系YTC3。
步骤(ⅱ)，(ⅲ)和(ⅳ)是制备cDNA文库的一系列步骤，可根据Gubler & Hoffman(Gene，Vol.25.pp.263，1983)的方法进行，只需稍加改变，在步骤(ⅲ)中使用的质粒载体的例子有许多已知的质粒载体(如pBR322，pBluesciptⅡ)和噬菌体载体(如λgt10，λDASHⅡ)，优选使用噬菌体载体λgt10(43.3 kbpStratagene)。
步骤(ⅳ)中所使用的宿主细胞优选E.Coli NM514(Stratagene)。
步骤(ⅴ)和(ⅵ)可根据Molecular Cloning(Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))中所述方法进行。
步骤(ⅶ)可根据Molecular Cloning(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，编写，Cold Spring harbor Laboratory Press，1989年出版)中所述方法进行。
步骤(ⅶ)的测序可根据Maxam-Gilbert的方法或双脱氧终止法进行。
有必要检验由此得到的cDNA是否编码完整或几乎完整的长度，该验证可使用所述cDNA作为探针，通过Northern分析来进行。(见上述Molecular Cloning)，据认为如果CDNA的长度与在杂交带中所得mRNA的长度几乎相同，cDNA就几乎是完整的长度。
编码PD-1基因的DNA或者DNA片段可用作探针或引物以识别PD-1基因，因此可用于研究所述多肽和活的有机体的保护机制，免疫功能或象肿瘤这类的疾病之间的关系，或者用于诊断疾病及其类似的目的。
本发明的DNA可用作重要和必需的模板以通过常规的基因重组来制备PD-1的多肽，以及被期望有不同的用途的该多肽的片段或其衍生物。
我们期望多肽，其多肽片段及其衍生的多肽可用于治疗感染，免疫功能或肿瘤的遏制或加强。
另外，本发明多肽或多肽片段的多克隆和单克隆抗体可通过常规方法制备，它们可用于对有机体中所含的上述多肽进行定量，因此可用来研究上述多肽和疾病之间的关系，或用于诊断疾病及其类似目的。上述单克隆抗体本身，针对人的抗体的嵌合体抗体可用作治疗剂，它的多克隆和单克隆抗体的制备利用上述的多肽或其片段作为抗原可通过常规的方法来实现。
为了本发明的目的，本发明的多肽可系统地或部分地正常给药，通常是口腔或非肠给药，优选口腔、静脉内或心室内给药。
给药的剂量需由年龄、体重、症状、所需达到的治疗效果、给药途经、治疗的持续时间等来决定，对于成年人，口服给药时每人每天的剂量通常在100μg和100mg之间，每天几次服药，通过非肠道给药时，剂量为10μg和100mg之间，每天几次给药。
如上所述，所用剂量随条件不同而变化，因此，在某些病例中，使用的剂量会比上面所规定范围低或者高。
本发明的化合物给药时，对于口服而言可以是固体组合物，液体组合物或其它组合物，对于非肠道给药，可以是针剂，涂抹剂或栓剂等。
口服的固体组合物包括浓缩的药片、药丸、胶囊，分散的粉末，颗粒。胶囊包括软胶囊和硬胶囊。
在这种组合物中，一种或多种有活性的化合物与至少一种惰性稀释剂相混合(如乳糖、甘露醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微结晶的纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、镁的硅铝酸盐等)。这种组合物在常规临床使用中也可含有除惰性稀释剂外的附加物质如润滑剂(如镁的硬脂酸盐等)，崩解剂(如纤维素钙甘醇酸酯等)、稳定剂(如人的血清蛋白、乳糖等)以及用于溶解的辅剂(如精氨酸、天冬氨酸等)。
如果需要，片剂或丸剂要包裹一层胃或肠包衣材料所制的膜(如糖、明胶、羟丙基纤维素或羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯等)，或者包裹两层以上的膜，而且外膜可包括胶囊内容物中可吸收的物质，例如明胶。
口服的液体组合物包括药用可接受的乳剂、溶液、糖浆和酏剂。在这种组合物中，本领域通常使用的惰性稀释剂中含有一种或多种活性的化合物(纯化水、乙醇等)，除了惰性稀释剂，此类组合物也可含有辅药(如湿润剂、悬浮剂等)、增甜剂、调味剂、香味剂或保存剂。
口服的另一些组合物包括喷雾组合物，它可由已知方法制备，含有一种或多种活性化合物。喷雾组合物可含有附加的物质而不是惰性稀释剂如稳定剂(亚硫酸钠等)，等渗缓冲液(氯化钠，柠檬酸钠，柠檬酸等)。为了制备这种喷雾组合物，可使用例如美国专利NO.2，868，691或3，095，355中描述的方法(引入本文以供参考)。
非肠道给药的注射剂包括无菌水或非水溶液，悬浮液和乳剂。在这种组合物中，一种或多种有活性的化合物与至少与一种惰性水稀释液(注射用蒸馏水、生理盐水等)或惰性非水稀释液相混合(丙二醇，聚乙二醇、橄榄油、乙醇、POLYSOLBATE 80 TM等)。
注射液可含有附加化合物而不是惰性稀释剂、如保护剂，湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(如人的血清蛋白、乳糖等)、和辅剂，如帮助溶解的辅剂(精氨酸，天冬氨酸等)。
它们必需经过灭菌，例如通过细菌截留滤器的过滤作用，通过将灭菌剂与组合物相混合或者通过紫外照射来灭菌。它们也可以无菌固体组合物形式来制得，如冻干的形状，在使用前可在无菌水或一些其它无菌稀释液中很快溶解以用来注射。
非肠道给药的其它组合物包括外部用药的液体，和皮下涂抹剂(软膏等)、直肠给药的栓剂和阴道药栓，它含有一种或多种活性化合物，可由已知方法制得。
以下实施例阐明但并不限制本发明。
实施例1细胞培养将人的细胞系(CESS，HPB-ALL，Jarkat，TC3，CCRF-CEM，JM和MOLT-4F)培养于RPMI1640(Gibco)中，该培养基中补充了10%热灭活的小牛血清，2mM谷酰胺，50μM2-巯基乙醇，100U/ml青霉素和100μg/ml的链霉素。
实施例2Northern blot分析使用异硫氰酸胍盐抽提法(见上述(Molecular Cloning)从所指的细胞系中制备总RNA，用oligotex-dt 30<super>(DaiichiChemical Co.)从总RNA中分离出poly(A)+RNA。在1.2%甲醛琼酯糖凝胶上分离3μg Poly(A)+RNA，再转移到尼龙膜上(Biodyne A，Japan Genetic)，将膜在80℃下烘烤2小时，给含有鼠PD-1编码区的EcoRI片段(1kb)接上随机引物，用32P标记制备成探针。此探针的比活大约是9×108d.p.m。/μg。杂交在10×Denhardt′s，1MNacl，50m MTris(PH7.5).10mMEDTA，1%SDS和1mg/ml经声波处理的鲑精DNA中进行，65℃下反应15小时，将膜置于1×SSC，0.1%SDS中，65℃下洗涤10分钟，通过放射自显影照片可从淋巴细胞系YTC3中观察到杂交信号(2.3kb)。
实施例3cDNA文库的构建和人PD-1cDNA的克隆，利用5μg从使用Time saver合成试剂盒(pharmacia)YTC3细胞系中抽提到的5μg，poly(A)+RNA构建cDNA文库，用寡dT引物合成CDNA的第一条链，将双链cDNA与EcoRI-NotI接受者相连接，克隆进λgt10载体，包装进噬菌体中(Gigapack Ⅱ Gold，Stratagene)，噬菌体被铺在E.ColiNM 514菌坪的上面。从每个平板上将噬菌体DNA转染到二个重复的文库滤膜上，将滤膜在80℃下烘烤2小时，在60℃下杂交15小时，从Bluescript SK质粒载体(Stratagene)中用EcoRI切割出鼠PD-1的编码区(1kb)用作探针，将滤膜在1×SSC和0.1%SDS中，60℃下洗涤10分钟，通过放射自显影照片可在1.2×106个噬菌体中找到51个阳性信号。将这些克隆纯化至单一形式，进一步分析所检得的大约23个克隆，所观察到插入的最长的cDNA是2.1kb，这个结果与Southern Bolt分析得到的结果是一致的。
实施例4DNA序列测定将从人的cDNA文库分离得到的cDNA插入物亚克隆进Bluescript SK质粒载体(Stratagene)，使用经修饰的T7 DNA多聚酶(United States Biochemical)和[α-32P]d CTP(3000Ci/mmol，Amersham)，通过双脱氧核苷酸链终止法测定其序列。将Bluescript质粒特有的引物用作测序引物。核苷酸测序针对cDNA的两条链完整地进行，从结果看，得到了seQ.NO.2中表示的核苷酸序列，从核苷酸序列中可确定推导出的肽的序列(见SEQ.ID.NO.1)，推导出的氨基酸的总数目是288，其数目与鼠PD-1的氨基酸数目相同，互相之间具有60%的同源性。
实施例5Southern Blotting用常规方法(见上述分子克隆)从多种动物细胞中分离出基因组DNA，应用EcoR I，BamHI或HindⅢ消化DNA，接着根据制造商的说明电泳分离DNA片段(100V，0.8%琼脂糖凝胶，TEA缓冲液)，用0.25N HCl洗涤DNA片段10分钟，用0.2N NaOH/0.6M NaCl建立变性30分钟，用0.6M NaCl/0.2MTris(PH7.5)处理1小时以中和反应，将DNA片段转移到标准Southern程序所用的尼龙膜(Bidyne A)上，将此膜烘烤2小时。
给含有人PD-1编码区的EcoRI-Stul片段(900bp)接上随机引物用32P标记制成探针，探针的比活大约是9×108d.P.m/μg，杂交在10×Denhardt′s，1M Nacl，50mMTris(PH7.5)，10mMEDTA，1%SDS和1mg/ml经声波处理的鲑精DNA中进行，65℃下反应10分钟，将膜置于1×SSC，0.1%SDS中，65℃下洗涤10分钟，当克隆经过任何一种酶切割后，放射自显影照片中只能见到仅有的一条带，因此发现人的PD-1基因是作为单一拷贝存在的。
各种动物基因组DNA的Southern杂交可按与实施例2中描述的同样的条件(杂交和洗涤)，利用含鼠PD-1编码区的EcoRI片段(1kb)作为探针来完成，只能在鼠和人的基因组DNA中看到杂交信号，在果蝇、非洲爪蟾和兔的基因组DNA中看不到杂交信号。
实施例6人的PD-1基因组克隆的分离通过用Sau3A1部分消化和与BamHI位点连接，可在λDASHII载体上构建来源于食道癌细胞系的基因组DNA文库(从Dr.Nishiyama，lst Dept.of Pathology，School of Medicine，KyotoUniversity)得到，用EcoRI消化Bluescript SK载体切割得到人PD-1的总CDNA，通过与之杂交可从此文库中分离得到人的PD-1基因，通过接上随机引物，探针被32P标记，从1×106个噬菌斑中分离纯化出两个阳性克隆，用几种限制性内切酶消化，用同一种探针进行Southern杂交分析，从CISS(染色体原位抑制)中发现人的PD-1基因图谱位于2q37.3。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)姓名ONO PHARMACEUTICAL CO.，LTD.
(B)街道1-5，Doshomachi 2-chome(C)城市Chuo-ku，Osaka-shi(D)州Osaka(E)国家Japan(F)邮编(ZIP)541(A)姓名HONJO，TASUKU(B)街道Kan′Yuchi，Kitashirakawa Oiwakecno，Sakyo-ku(C)城市Kyoto-shi(D)州Kyoto(E)国家Japan(F)邮编(ZIP)606(ⅱ)发明名称与人类细胞逐渐死亡相关的一种新的肽类及其编码它的DNA(ⅲ)序列数目4
(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度288个氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1
(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度864个碱基对(B)类型核酸(C)股数单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型mRNA的cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2
(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度921碱基对(B)类型核酸(C)股数单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型mRNA的cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3
(2)SEQ ID NO4的资料(ⅰ)序列特征(A)长度921个碱基对(B)类型核酸(C)股数单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型mRNA的cDNA(ⅵ)原始来源(A)有机体Homo Sapiens(H)细胞系YTC3
(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位点25..888(C)鉴别方法P(ⅸ)特征(A)名称/关键词Sig-peptide(B)位点25..84(C)鉴别方法S(ⅸ)特征(A)名称/关键词mat-peptide(B)位点85..888(C)鉴别方法S(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.4
权利要求
1.一种基本上纯化形式的多肽，含有SEQ.ID.NO.1中所述的氨基酸序列，该多肽的同系物或者该序列的片段或者片段的同系物，
2.根据权利要求1的多肽，它含有SEQ.ID.NO.1中所述的氨基酸序列，
3.一种DNA，编码根据权利要求1的多肽，
4.根据权利要求3的DNA，含有SEQ.ID.NO.2中所述的核苷酸序列或它的，能选择性与SEQ.ID.NO.2杂交的片段，
5.根据权利要求3的DNA，含有SEQ.ID.NO.3中所述的核苷酸序列或它的，能选择性地与SEQ.ID.NO.3.杂交的片段，
6.一种复制和表达载体，含有根据权利要求3至5中任何一个的DNA，
7.用根据权利要求6的复制和表达载体转化或转染的宿主细胞。
8.一种产生多肽的方法，包括在有效表达根据权利要求1或2的多肽的条件下培养权利要求7的宿主细胞，
9.一种根据权利要求1或2的多肽的单克隆抗体或多克隆抗体，
10.一种含有根据权利要求1或2的多肽或者一种根据权利要求9的抗体的药用组合物，其中抗体或多肽与一种药用可接受的稀释剂和/或载体相结合。
全文摘要
一种新的与人的细胞逐渐死亡(PD-1)相关的膜蛋白和编码这种蛋白质的DNA，PD-1蛋白质可用于治疗不同的感染，免疫抑制或加强，或肿瘤等。
文档编号C07K14/705GK1113518SQ9510327
公开日1995年12月20日 申请日期1995年3月1日 优先权日1994年3月1日
发明者本庶佑, 石田靖雄, 篠原隆司 申请人:小野药品工业株式会社, 本庶佑
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