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2021-01-31 16:01:48|
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起点商标网 专利名称：氮-氨甲酰基氨基酸热水解制备光学活性氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及氨基酸的制备方法，尤其涉及一种手性的化合物-光学活性D型或L型氨基酸的制备方法。
如所周知，近年来制备光学活性氨基酸的研制工作有相当进展。如从5位取代的海因衍生物出发，经过专一的海因酶开环生成氮氨甲酰基-D(或L)-氨基酸，再水解得到D(或L)-氨基酸，是近十几年开发的一条制备光学活性氨基酸的新途径〔Syldatk，C.et al，Biotechnol.Fiechter，vol.41，291-316(1990))
外消旋的海因衍生物可用廉价原料醛来合成〔Bucherer，H.T.，Steiner，W.，J.Prakt.Chem.，140，291-316(1934)).反应(1)可自发进行.反应(2)所用的海因酶，又称二氢嘧啶酶(EC3.5.2.2.)，具有D或L的底物立体专一性，在动、植物和微生物中都有发现〔Waltach，D.，Grisoloia，S.J.，biol.Chem.，226，277-288(1957)〕，目前已得到产酶活力较高的微生物〔孙万儒，微生物学报，23(2)，133-142(1983)；江宁等，微生物学报，35(5).347-350(1995)).反应(3)可通过化学法〔Takahashi，S.et al.，J.Ferment.Technol.，4，328-332(1979))或酶法〔Olivieri，R.et al，Enzyme Mirob. Technol.，1，201-204(1979))进行.其反应如下化学法 酶法 这两条合成路线对于生产非天然的D型氨基酸或代谢途径较长，用发酵法生产率不高的L型氨基酸具有重要的应用价值。
但是，这两条路线在实际应用上存在以下问题反应(3-1)使用了致癌物亚硝酸，会带来严重的环境污染。反应(3-2)使用的酶，由于微生物代谢本身的原因，其活力只有海因酶的1/100到1/10，致使反应(3)与反应(2)难于匹配，限制了这条路线的实际应用。
本发明的目的在于用一个无环境污染，又有效的反应来代替(3-1)的化学反应或(3-2)的酶反应。这个反应就是我们发现的氮氨甲酰基氨基酸热水解反应 当温度超过80℃时，反应(3-3)即可进行，并很快达到平衡，但只要维持体系在弱酸或弱碱条件下，在反应过程中不断加入3NHCl，维持体系的PH在3.0-6.0之间，使CO2不断排出 或不断加入30％NaOH，维持反应体系的PH在9.6-10.8之间，使NH3气不断排出 就可以打破平衡，使反应进行完全。
上述两个反应(3-3-1)和(3-3-2)的温度越高，反应速度越快，但考虑到设备的耐压与反应平衡，温度也不宜过高，一般以80℃-140℃为适宜，95℃-120℃更为适宜，在此种条件下反应时间一般以4-72hr.为适宜，16-48hr.更为适宜。这个反应的另一关键是控制PH，如酸性过强，氨甲酰基氨基酸将闭环成为海因衍生物，即进行反应(2)的逆反应。如碱性过强，得到的氨基酸将消旋而失去光学活性。
反应结束后，一般在10-600mmHg压力下，更好在10-200mmHg压力下减压浓缩至原体积的1/20至1/2，浓缩程度可根据反应物的初始浓度来确定。再用3NHCl或30％NaOH调PH至该氨基酸的等电点(可从有关手册查到或用实验测得)，然后，在室温或冷水浴或冰水浴或冰盐浴中冷却结晶，结晶温度为-2℃-30℃，过滤后即可得到有光学活性的氨基酸。
本发明解决了化学法的污染问题，除了调PH用的酸碱外不需任何化学试剂。其效率又比酶法有了大幅度的提高。
为了进一步更加详细地说明本发明的技术内容，举以下几个实施例实施例1在250ml圆底烧瓶中，加入4.0g氮氨甲酰基-D-(-)-苯甘氨酸，再加入100ml蒸馏水，充分混合，用30％NaOH调液体PH至10.0。
将上述烧瓶装上回流装置，于电加热套上加热至100℃沸腾后，再加热回流反应35hr.，其间不断加入30％NaOH保持PH在10.0-10.6之间，停止时反应转化率为65％。
将上述反应液于80mmHg压力减压条件下浓缩，浓缩至30ml时停止，转入烧杯中，于搅拌下加入3NHCl调PH至5.0，有大量D-(-)-苯甘氨酸晶体析出，将烧杯于冰水浴中冷却，在4℃放置结晶过液后抽滤得D-(-)-苯甘氨酸晶体，干燥后得晶体1.78g，旋光纯度80％，收率56％。
实施例2在250ml圆底烧瓶中加入4.0gN-氨甲酰基-D-(-)-苯甘氨酸，再加入100ml蒸馏水，充分混合后，用3NHCl调PH＝3.0，于热电套上加热至100℃沸腾30hr.，其间不断加入3NHCl保持PH在3.0-5.0之间，反应停止时测得转化率为90％。
上述反应液于80mmHg压力减压条件下浓缩至30ml左右，转入烧杯中，边搅拌边加入30％NaOH溶液，调PH＝5.0，有大量D-(-)-苯甘氨酸晶体析出，将烧杯于冰水浴中冷却，在4℃放置结晶过夜后，抽滤得D-(-)-苯甘氨酸晶体，干燥后得晶体2.40g，旋光纯度97％，收率75％。
实施例3在250ml烧杯中，加入4.0g消旋苯海因，并加入50ml 0.05MNaHPO4水溶液，充分混合。
将具有D-海因酶活力的微出物细胞用50ml 0.05MNaHPO4水溶液悬浮，此菌悬液与苯海因溶液合并，在35℃下搅拌反应用NaOH恒定反应液PH于8.5，8hr.以后转化率达90％以上，停止反应。
用HCl调反应液PH＝5.0，煮沸，乘热过滤，得含有3.70g氮氨甲酰基-D-(-)-苯甘氨酸的溶液。
用3NHCl调此溶液PH＝3.0，转入250ml圆底烧瓶中，于电热套上加热至100℃沸腾30hr.，其间不断加入3NHCl保持PH在3.0-5.0之间，反应转化率为90％。
将上述反应液于80mmHg压力减压条件下浓缩至30ml左右，转入烧杯中，于搅拌下用30％NaOH调PH＝5.0，有大量D-(-)-苯甘氨酸晶体析出，将烧杯于冰水浴中冷却，置于4℃结晶过夜，抽滤，晶体干燥后，得D-(-)-苯甘氨酸晶体2.17g，旋光纯度94％，收率60％。
实施例4在100ml圆底烧瓶中加入0.4g氮氨甲酰基-L-(+)-苯丙氨酸，再加入20ml蒸馏水，充分混合，用3NHCl调PH3.0，于电热套上加热至100℃沸腾，反应35hr.，其间不断加入3NHCl保持PH在3.0-5.0之间，停止时测得反应转化率为88％。
将上述反应液于80mmHg压力减压条件下浓缩至30ml左右，转化烧杯中，边搅拌边加入3NHCl调PH＝5.5，有大量L-(-)-苯丙氨酸晶体析出，将烧杯于冰水浴中冷却，置于4℃结晶过夜后，抽滤，晶体干燥后，得L-(-)-苯丙氨酸0.24g，旋光纯度97％，收率73％。
权利要求
1.一种光学活性氨基酸的制备方法，其特征在于通过氮氨甲酰基氨基酸的热水解反应，将有光学活性的氮氨甲酰基氨基酸脱去氨甲酰基，得到相应的有光学活性的氨基酸，该方法包括1)反应物氮氨甲酰基氨基酸的浓度为0.1-45％(W/V)；2)反应温度以80-140℃为适宜；3)用3NHCl或30％NaOH调节反应体系的PH，在反应过程中，使PH始终保持在弱酸PH3.0-6.0或弱碱PH9.6-10.8的范围内；4)反应时间以4-72小时为适宜；5)反应结束后，在10-600mmHg压力下减压浓缩至初始体积的1/20-1/2；6)浓缩液用30％NaOH或3NHCl调PH至该氨基酸的等电点；7)在室温或冷水浴或冰水浴或冰盐浴中冷却结晶，结晶温度为-2-30℃，即得到光学活性氨基酸。
2.如权利要求1所述的光学活性氨基酸的制备方法，其特征在于所说的光学活性氨基酸可为D型或L型，其结构为 其中R-基可以为脂肪族基团，如CH3-， ，也可以为芳香簇基团，如
3.如权利要求1所述的光学活性氨基酸的制备方法，其特征在于所说的反应温度以40-121℃更为适宜。
4.如权利要求1所述的光学活性氨基酸的制备方法，其特征在于所说的反应时间以16-48小时更为适宜。
5.如权利要求1所述的光学活性氨基酸的制备方法，其特征在于所说的压力以10-200mmHg更为适宜。
全文摘要
本发明涉及一种光学活性氨基酸的制法，其特点是通过氮氨甲酰基氨基酸的热水解反应制备具有光学活性的脂肪族和芳香族D型或L型氨基酸。反应物浓度为0.1-45％(W/V)，反应温度为80-140℃，反应过程应始终维持在弱酸pH3.0-6.0或弱碱pH9.6-10.8范围内。反应时间为4-72小时。反应结束后，在10-600mmHg压力下减压浓缩至初始体积的1/20至1/2，浓缩液用30％NaOH或3NHCl调pH至该氨基酸等电点，在室温或冷水浴等中冷却结晶，结晶温度为-2-30℃，即制得本发明的氨基酸。该制法效率高，成本低，且无污染。
文档编号C07C229/08GK1146447SQ9511683
公开日1997年4月2日 申请日期1995年9月29日 优先权日1995年9月29日
发明者江宁, 贺鹏, 孙万儒, 卢大军, 强亚静, 杨柳 申请人:中国科学院微生物研究所
技术领域：
本发明涉及氨基酸的制备方法，尤其涉及一种手性的化合物-光学活性D型或L型氨基酸的制备方法。
如所周知，近年来制备光学活性氨基酸的研制工作有相当进展。如从5位取代的海因衍生物出发，经过专一的海因酶开环生成氮氨甲酰基-D(或L)-氨基酸，再水解得到D(或L)-氨基酸，是近十几年开发的一条制备光学活性氨基酸的新途径〔Syldatk，C.et al，Biotechnol.Fiechter，vol.41，291-316(1990))
外消旋的海因衍生物可用廉价原料醛来合成〔Bucherer，H.T.，Steiner，W.，J.Prakt.Chem.，140，291-316(1934)).反应(1)可自发进行.反应(2)所用的海因酶，又称二氢嘧啶酶(EC3.5.2.2.)，具有D或L的底物立体专一性，在动、植物和微生物中都有发现〔Waltach，D.，Grisoloia，S.J.，biol.Chem.，226，277-288(1957)〕，目前已得到产酶活力较高的微生物〔孙万儒，微生物学报，23(2)，133-142(1983)；江宁等，微生物学报，35(5).347-350(1995)).反应(3)可通过化学法〔Takahashi，S.et al.，J.Ferment.Technol.，4，328-332(1979))或酶法〔Olivieri，R.et al，Enzyme Mirob. Technol.，1，201-204(1979))进行.其反应如下化学法 酶法 这两条合成路线对于生产非天然的D型氨基酸或代谢途径较长，用发酵法生产率不高的L型氨基酸具有重要的应用价值。
但是，这两条路线在实际应用上存在以下问题反应(3-1)使用了致癌物亚硝酸，会带来严重的环境污染。反应(3-2)使用的酶，由于微生物代谢本身的原因，其活力只有海因酶的1/100到1/10，致使反应(3)与反应(2)难于匹配，限制了这条路线的实际应用。
本发明的目的在于用一个无环境污染，又有效的反应来代替(3-1)的化学反应或(3-2)的酶反应。这个反应就是我们发现的氮氨甲酰基氨基酸热水解反应 当温度超过80℃时，反应(3-3)即可进行，并很快达到平衡，但只要维持体系在弱酸或弱碱条件下，在反应过程中不断加入3NHCl，维持体系的PH在3.0-6.0之间，使CO2不断排出 或不断加入30％NaOH，维持反应体系的PH在9.6-10.8之间，使NH3气不断排出 就可以打破平衡，使反应进行完全。
上述两个反应(3-3-1)和(3-3-2)的温度越高，反应速度越快，但考虑到设备的耐压与反应平衡，温度也不宜过高，一般以80℃-140℃为适宜，95℃-120℃更为适宜，在此种条件下反应时间一般以4-72hr.为适宜，16-48hr.更为适宜。这个反应的另一关键是控制PH，如酸性过强，氨甲酰基氨基酸将闭环成为海因衍生物，即进行反应(2)的逆反应。如碱性过强，得到的氨基酸将消旋而失去光学活性。
反应结束后，一般在10-600mmHg压力下，更好在10-200mmHg压力下减压浓缩至原体积的1/20至1/2，浓缩程度可根据反应物的初始浓度来确定。再用3NHCl或30％NaOH调PH至该氨基酸的等电点(可从有关手册查到或用实验测得)，然后，在室温或冷水浴或冰水浴或冰盐浴中冷却结晶，结晶温度为-2℃-30℃，过滤后即可得到有光学活性的氨基酸。
本发明解决了化学法的污染问题，除了调PH用的酸碱外不需任何化学试剂。其效率又比酶法有了大幅度的提高。
为了进一步更加详细地说明本发明的技术内容，举以下几个实施例实施例1在250ml圆底烧瓶中，加入4.0g氮氨甲酰基-D-(-)-苯甘氨酸，再加入100ml蒸馏水，充分混合，用30％NaOH调液体PH至10.0。
将上述烧瓶装上回流装置，于电加热套上加热至100℃沸腾后，再加热回流反应35hr.，其间不断加入30％NaOH保持PH在10.0-10.6之间，停止时反应转化率为65％。
将上述反应液于80mmHg压力减压条件下浓缩，浓缩至30ml时停止，转入烧杯中，于搅拌下加入3NHCl调PH至5.0，有大量D-(-)-苯甘氨酸晶体析出，将烧杯于冰水浴中冷却，在4℃放置结晶过液后抽滤得D-(-)-苯甘氨酸晶体，干燥后得晶体1.78g，旋光纯度80％，收率56％。
实施例2在250ml圆底烧瓶中加入4.0gN-氨甲酰基-D-(-)-苯甘氨酸，再加入100ml蒸馏水，充分混合后，用3NHCl调PH＝3.0，于热电套上加热至100℃沸腾30hr.，其间不断加入3NHCl保持PH在3.0-5.0之间，反应停止时测得转化率为90％。
上述反应液于80mmHg压力减压条件下浓缩至30ml左右，转入烧杯中，边搅拌边加入30％NaOH溶液，调PH＝5.0，有大量D-(-)-苯甘氨酸晶体析出，将烧杯于冰水浴中冷却，在4℃放置结晶过夜后，抽滤得D-(-)-苯甘氨酸晶体，干燥后得晶体2.40g，旋光纯度97％，收率75％。
实施例3在250ml烧杯中，加入4.0g消旋苯海因，并加入50ml 0.05MNaHPO4水溶液，充分混合。
将具有D-海因酶活力的微出物细胞用50ml 0.05MNaHPO4水溶液悬浮，此菌悬液与苯海因溶液合并，在35℃下搅拌反应用NaOH恒定反应液PH于8.5，8hr.以后转化率达90％以上，停止反应。
用HCl调反应液PH＝5.0，煮沸，乘热过滤，得含有3.70g氮氨甲酰基-D-(-)-苯甘氨酸的溶液。
用3NHCl调此溶液PH＝3.0，转入250ml圆底烧瓶中，于电热套上加热至100℃沸腾30hr.，其间不断加入3NHCl保持PH在3.0-5.0之间，反应转化率为90％。
将上述反应液于80mmHg压力减压条件下浓缩至30ml左右，转入烧杯中，于搅拌下用30％NaOH调PH＝5.0，有大量D-(-)-苯甘氨酸晶体析出，将烧杯于冰水浴中冷却，置于4℃结晶过夜，抽滤，晶体干燥后，得D-(-)-苯甘氨酸晶体2.17g，旋光纯度94％，收率60％。
实施例4在100ml圆底烧瓶中加入0.4g氮氨甲酰基-L-(+)-苯丙氨酸，再加入20ml蒸馏水，充分混合，用3NHCl调PH3.0，于电热套上加热至100℃沸腾，反应35hr.，其间不断加入3NHCl保持PH在3.0-5.0之间，停止时测得反应转化率为88％。
将上述反应液于80mmHg压力减压条件下浓缩至30ml左右，转化烧杯中，边搅拌边加入3NHCl调PH＝5.5，有大量L-(-)-苯丙氨酸晶体析出，将烧杯于冰水浴中冷却，置于4℃结晶过夜后，抽滤，晶体干燥后，得L-(-)-苯丙氨酸0.24g，旋光纯度97％，收率73％。
权利要求
1.一种光学活性氨基酸的制备方法，其特征在于通过氮氨甲酰基氨基酸的热水解反应，将有光学活性的氮氨甲酰基氨基酸脱去氨甲酰基，得到相应的有光学活性的氨基酸，该方法包括1)反应物氮氨甲酰基氨基酸的浓度为0.1-45％(W/V)；2)反应温度以80-140℃为适宜；3)用3NHCl或30％NaOH调节反应体系的PH，在反应过程中，使PH始终保持在弱酸PH3.0-6.0或弱碱PH9.6-10.8的范围内；4)反应时间以4-72小时为适宜；5)反应结束后，在10-600mmHg压力下减压浓缩至初始体积的1/20-1/2；6)浓缩液用30％NaOH或3NHCl调PH至该氨基酸的等电点；7)在室温或冷水浴或冰水浴或冰盐浴中冷却结晶，结晶温度为-2-30℃，即得到光学活性氨基酸。
2.如权利要求1所述的光学活性氨基酸的制备方法，其特征在于所说的光学活性氨基酸可为D型或L型，其结构为 其中R-基可以为脂肪族基团，如CH3-， ，也可以为芳香簇基团，如
3.如权利要求1所述的光学活性氨基酸的制备方法，其特征在于所说的反应温度以40-121℃更为适宜。
4.如权利要求1所述的光学活性氨基酸的制备方法，其特征在于所说的反应时间以16-48小时更为适宜。
5.如权利要求1所述的光学活性氨基酸的制备方法，其特征在于所说的压力以10-200mmHg更为适宜。
全文摘要
本发明涉及一种光学活性氨基酸的制法，其特点是通过氮氨甲酰基氨基酸的热水解反应制备具有光学活性的脂肪族和芳香族D型或L型氨基酸。反应物浓度为0.1-45％(W/V)，反应温度为80-140℃，反应过程应始终维持在弱酸pH3.0-6.0或弱碱pH9.6-10.8范围内。反应时间为4-72小时。反应结束后，在10-600mmHg压力下减压浓缩至初始体积的1/20至1/2，浓缩液用30％NaOH或3NHCl调pH至该氨基酸等电点，在室温或冷水浴等中冷却结晶，结晶温度为-2-30℃，即制得本发明的氨基酸。该制法效率高，成本低，且无污染。
文档编号C07C229/08GK1146447SQ9511683
公开日1997年4月2日 申请日期1995年9月29日 优先权日1995年9月29日
发明者江宁, 贺鹏, 孙万儒, 卢大军, 强亚静, 杨柳 申请人:中国科学院微生物研究所
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