一种可生物降解的多孔硅颗粒及其在促血管化方面的用途的制作方法

本发明涉及生物材料领域，特别是一种可生物降解的多孔硅颗粒及其在促血管化方面的用途。

背景技术：

机械创伤、烧伤、慢性溃疡等会造成皮肤损坏部位缺少组织和有机物继而受到细菌侵袭，如不及时处理可能会遍及全身，严重可对人的生命构成威胁。伤口愈合延迟会导致血管网络不足，无法为受损部位提供充足的氧气和营养物质，最终导致局部缺血。尽管血管可以通过患者自身的调节生成，但此过程通常很慢(-5μm/h)，往往需要几个星期才能大面积生成以满足伤口部位需要。临床上现行的解决方案是利用一些促血管化类生长因子和细胞来加速血管化进程。但在移植和递送到伤口部位过程中存在易降解失活的问题。

目前，一些基于高分子凝胶，支架，微球的药物递送系统应运而生，但仍存在生物活性低，生物毒性大，移植后难降解等瓶颈。一些具有促血管化活性的生物材料可以在一定程度上解决上述问题。有学者研究发现硅酸盐基生物玻璃降解释放出的离子可以有效促进血管化及伤口修复，但由于生物玻璃组成成分复杂，往往含有硅，钙，磷，钠等元素，导致其促血管化机理难以解释，无法确定是单一元素起作用还是多种元素协同作用。

经电化学刻蚀单晶硅片和超声破碎的方法可以得到具有孔道结构的多孔硅颗粒，其生物相容性和降解性良好；并且其在生物体系降解产物单一(原硅酸)，有助于揭示无机离子的生物活性机制；其有序孔道也可以用于药物的递送，是一种在促血管化方面十分有前景的生物活性材料。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可生物降解的多孔硅颗粒及其在促血管化方面的用途，本发明制备出的多孔硅颗粒可有效促进伤口部位细胞的迁移和成管；刺激血管化相关基因的表达；生物安全性高，有较低的溶血率；可以有效促进活体血管生成；在促血管化方面具有多种用途，具有广阔的应用前景。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种可生物降解的多孔硅颗粒，制备的方法包括：

步骤一，通过电化学刻蚀单晶硅片的方法制备多孔硅层；

步骤二，将得到的多孔硅层的多孔硅膜进行剥离，得到多孔硅薄膜；

步骤三，将得到的多孔硅薄膜由有机溶剂置换于水溶液中1-2天，形成稳定钝化层；

步骤四，破碎处理多孔硅薄膜，获得微米级多孔硅颗粒。

前述的一种可生物降解的多孔硅颗粒，

步骤一，通过电化学刻蚀单晶硅片的方法制备多孔硅层：

将p型掺硼硅片固定在电解池中，按体积比为1:4的比例加入无水乙醇和质量浓度为40-50％的氢氟酸作为电解液，以硅片为阳极，铂电极为阴极，以电流密度为77ma·cm^-1进行恒电流电解刻蚀5-10min，得到多孔硅层。

前述的一种可生物降解的多孔硅颗粒，

步骤二，将得到的多孔硅层的多孔硅膜进行剥离，得到多孔硅薄膜：

以多孔硅层为阳极，铂电极为阴极，改变刻蚀液氢氟酸的质量浓度为3-5％，刻蚀电流密度为30-50ma·cm^-1，进行恒电流刻蚀，对多孔硅膜进行剥离5-10min得到多孔硅薄膜。

前述的一种可生物降解的多孔硅颗粒，

步骤四，破碎处理多孔硅薄膜，获得微米级多孔硅颗粒：

破碎采用超声破碎，超声破碎时间为5-10min。

一种可生物降解的多孔硅颗粒在促血管化方面的用途，多孔硅颗粒对伤口部位细胞迁移具有促进作用；多孔硅颗粒对内皮细胞体外成管有促进作用；多孔硅颗粒对内皮细胞血管化相关基因的表达有促进作用；多孔硅颗粒对活体血管有促进作用；

可生物降解的多孔硅颗粒的制备的方法包括：

步骤一，通过电化学刻蚀单晶硅片的方法制备多孔硅层；

步骤二，将得到的多孔硅层的多孔硅膜进行剥离，得到多孔硅薄膜；

步骤三，将得到的多孔硅薄膜由有机溶剂置换于水溶液中1-2天，形成稳定钝化层；

步骤四，破碎处理多孔硅薄膜，获得多孔硅颗粒。

前述的一种可生物降解的多孔硅颗粒在促血管化方面的用途，多孔硅颗粒作为促血管化生物活性材料使用。

前述的一种可生物降解的多孔硅颗粒在促血管化方面的用途，多孔硅颗粒作为敷料使用。

前述的一种可生物降解的多孔硅颗粒在促血管化方面的用途，多孔硅颗粒作为促血管化的生物活性药物载体。

本发明的有益之处在于：

按照本发明的方法制备出来的多孔硅颗粒，生物降解性好，细胞毒性低，可有效促进伤口部位细胞的迁移和成管；刺激血管化相关基因的表达；可以有效促进活体血管生成，可作为促血管化生物活性材料；

多孔硅颗粒的应用方向多样，可作为敷料，也可作为移植材料；

材料丰富的孔道可用作伤口治疗药物的递送，在伤口修复方面有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明的实验一中多孔硅颗粒的实时降解曲线及颗粒形态随时间变化的示意图；

图2是本发明实验二中可降解多孔硅颗粒对伤口部位内皮细胞和成纤维细胞毒性的测试结果示意图；

图3是本发明实验三中多孔硅颗粒对内皮细胞和成纤维细胞的迁移作用测试结果；

图4是本发明实验四中多孔硅颗粒对内皮细胞体外成管化的影响测试结果；

图5是本发明实验五中多孔硅颗粒对内皮细胞血管化相关基因表达的影响测试结果；

图6是本发明实验六中多孔硅颗粒的溶血性能测试结果；

图7是本发明实验七中以鸡胚尿囊膜为模型对多孔硅颗粒的活体血管促进效果评价结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

按照如下的方法制备可降解多孔硅颗粒：

(1)将p型掺硼硅片固定在电解池中，按体积比为1:4的比例加入无水乙醇和质量浓度为40％的氢氟酸作为电解液，以硅片为阳极，铂电极为阴极，以电流密度为77ma·cm^-1进行恒电流电解10min，得到多孔硅；需要说明的是：电解液的配比只是一种最优实施例，并非唯一，在此不再穷举，只要是能够得到多孔硅的电解液都在本发明的保护范围内。

(2)以多孔硅层为阳极，铂电极为阴极，改变刻蚀液氢氟酸的质量浓度为3.3％，刻蚀电流密度为30ma·cm^-1，进行恒电流刻蚀，5min后得到经剥离后的多孔硅薄膜。需要说明的是：刻蚀液的质量浓度、刻蚀电流密度和刻蚀时间只是一种最优实施例，并非唯一，在此不再穷举，只要是能够得到多孔硅薄膜都在本发明的保护范围内。

(3)将步骤(2)得到的多孔硅薄膜置于水溶液中，1天后得到表面钝化稳定的多孔硅薄膜。

(4)超声破碎处理10min，获得微米级多孔硅颗粒。

将得到的微米级多孔硅颗粒做如下实验：

实验一，对多孔硅颗粒的降解性能评价，具体测试过程如下；

将多孔硅颗粒置于37℃模拟体液中孵育，在6小时，1天，3天和7天的时间点取上清液稀释后用电感耦合等离子体发射光谱仪进行硅含量定量检测，绘制降解曲线；用光学显微镜观察7天后硅颗粒的形态变化。

实验结果：图1是本发明中多孔硅颗粒的实时降解曲线及颗粒形态随时间变化的示意图。

结果分析：由图1可知，本发明所制备的多孔硅降解速率快，在1天之内快速释放原硅酸，达到降解平台，一周后其颗粒数量和形态发生明显变化，表明其作为可降解生物材料的优势。

实验二，对多孔硅颗粒的细胞毒性评价，具体测试过程如下；

使用内皮细胞(huvecs)和成纤维细胞(nih3t3)作为皮肤部位模型细胞，采用transwell小室细胞培养板，在小室中放入多孔硅颗粒，小室的存在可以有效测试降解产生的原硅酸对细胞活性的影响。细胞毒性测试方法为：在细胞培养瓶中分别培养细胞至贴壁后，用胰酶将细胞消化并传入24孔transwell小室细胞培养板中，每孔约2×10⁴个细胞将孔板置于37℃、5％co2的培养箱内过夜培养使其完全贴壁，去除上清液，之后放置载有不同数量多孔硅颗粒的transwell小室于每孔上方，继续接触培养24h和48h后，去除上清，向每个孔中加入100μlcelltiterglo试剂，静置10min后使用酶标仪检测每个孔的生物发光信号并计算细胞存活率。

实验结果：图2是本发明中可降解多孔硅颗粒对伤口部位内皮细胞和成纤维细胞毒性的测试结果示意图。

结果分析：由图2可知，在1至10mg范围内，多孔硅颗粒对huvec细胞和nih3t3细胞的毒性均很低(细胞存活率均大于75％)，由此证明，在正常作用浓度下，本发明的多孔硅降解产物对细胞无明显毒性。

实验三，对多孔硅颗粒对伤口部位细胞迁移作用评价。迁移作用通过细胞划痕实验进行验证；

具体过程包括：将培养的nih3t3细胞和huvec细胞转入24孔板中，每个孔约加入10⁵个细胞，将孔板置于37℃、5％co2的培养箱内过夜，培养后使其汇合度达到90％以上。第二天用移液枪头垂直与细胞平面在细胞层上进行划痕，使用无菌pbs冲洗，洗去不贴壁的细胞，然后更换新鲜无血清培养基，与负载多孔硅颗粒的transwell小室共孵育。将细胞放入培养箱中继续培养。在培养的0，6，24小时取出孔板，显微镜下观察并拍照记录划痕处的细胞图像，使用imagej软件处理图片计算划痕的平均面积与原始划痕对比。

实验结果：图3是本发明对多孔硅颗粒和对伤口部位细胞迁移的促进作用的测试结果示意图。

结果分析：由图3的结果可知，与对照组相比，6h后，多孔硅颗粒对于划痕部位nih3t3细胞和huvec细胞的迁移有一定的促进效果，且多孔硅颗粒量的增加会使迁移效果的明显提高；24h后，含有多孔硅颗粒的实验组划痕基本完全愈合，而对照组迁移不完全。

实验四，对多孔硅颗粒对内皮细胞成管化作用评价。

实验方法为：预先在孔板上涂覆一层基质胶，随后将孔板放于37℃下使基质胶凝固，将huvec细胞以10⁴/孔的密度接种到基质胶上，随后加入培养基，放置载有不同量多孔硅颗粒的transwell小室，培养6h后在光学显微镜下观察细胞体外成管情况。用imagej软件分析处理照片，统计定量血管节点数，环数，总长度等。

实验结果：图4是本发明中多孔硅颗粒对huvec细胞体外成管化促进作用的示意图。

结果分析：由图4可知，与对照组相比，可降解的多孔硅颗粒对内皮细胞体外成管有一定的促进作用，且量越大促进效果越明显。相应地，血管节点数，环数，总长度也相应提高。

实验五，对多孔硅颗粒对内皮细胞基因表达作用评价。主要检测与血管化表达相关的基因(vegf，hif1α，kdr)；

步骤如下：样本处理；细胞样品totalrna的抽提；用逆转录酶reversetranscriptasem-mlv(d2640a,takara)进行逆转录合成cdna；realtimepcr扩增体系和反应条件；数据分析。

实验结果：图5是本发明中多孔硅颗粒对huvec细胞体外成管化促进作用的示意图。

结果分析：由图5可知，与对照组相比，可降解的多孔硅颗粒对内皮细胞血管化相关基因的表达有一定的促进作用，且量越大促进效果越明显。

实验六，对多孔硅溶血性能评价。

具体过程如下：取新鲜的红细胞用等渗磷酸盐缓冲液(1×pbs)清洗3次，2000rpm，离心30分钟，4％重悬到1×pbs中。取1ml红细胞混悬液分别加入5种不同浓度的多孔硅颗粒，轻混后置37℃的恒温箱中温浴。阴性对照组用1×pbs，阳性对照组用蒸馏水，处理同上。3h后离心，取上清，测545nm处吸光值，溶血率(％)＝(试验管吸光度-阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度-阴性对照管吸光度)×100％，结果如图6所示。

结果分析：由图6可知，多孔硅颗粒的溶血活性非常低，表明其具有较好的生物安全性。

实验七，对多孔硅颗粒在活体组织中促血管化水平评价。

采用鸡胚尿囊膜模型；

步骤如下：培养新鲜种蛋于培养箱中，第7天在大头端用注射器注入多孔硅颗粒，继续孵育1天后，开窗观察血管生成情况，采用软件定量分析血管长度，节点数，分支数，结果如图7所示。

结果分析：由图7可知，多孔硅颗粒对活体血管有明显的促进作用，且移植材料后未发现溶血现象，表明其在作为促血管化生物活性材料方面的优越性。

综上的实验可知，本发明的多孔硅颗粒具有良好的生物降解性，生物相容性，低细胞毒性，可有效促进伤口部位细胞的迁移和成管，刺激血管化相关基因的表达，有较低的溶血率和生物安全性，可以有效促进活体血管生成。此外，材料丰富的孔道可用作伤口治疗药物的递送，也可直接作为敷料使用，在市场上有广阔的应用前景。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

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