一种金属磷酸钴及其制备方法和应用与流程

本发明属于纳米材料制备
技术领域：
，具体涉及一种金属磷酸钴及其制备方法和应用。
背景技术：
：磷酸钴作为一种无机金属磷酸盐材料，被广泛应用于电池、超级电容器等领域。目前公开的磷酸钴的制备方法较为繁琐且产物杂质含量较高，并且，现有公开的磷酸钴多用于电极材料，其结构紧凑，比表面积不大，难以应用于酶的固定化。β-葡萄糖苷酶(β-d-glucosidase，ec3.2.1.21)属于纤维素酶，是纤维素分解系统中重要的组成部分，在工业中具有重要的应用价值，但是在工业应用中存在酶活损失大、易变性、无法回收利用的缺陷，因此需要通过固定化酶来实现酶的回收利用，并增加酶的稳定性。常用的酶的固定化方法中，通常采用物理吸附法来固定，虽不破坏酶的二级结构且对酶活的保留程度大，但是酶与载体材料之间的作用力较弱，酶易脱落。技术实现要素：针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种金属磷酸钴及其制备方法和应用。本发明中通过调节磷酸钴的制备条件，合成了形貌稳定的球形小颗粒金属磷酸钴材料，该材料具有较大的比表面积，且分散性较好，能够在粗酶液中一步固定化纯化重组β-葡萄糖苷酶。本发明首先提供了一种金属磷酸钴，所述金属磷酸钴为球形颗粒，粒径分布在342-712.4nm之间，所述金属磷酸钴的粒径随钴离子浓度的增加而减小。本发明还提供了上述金属磷酸钴的制备方法，具体包括如下步骤：将六水合硝酸钴溶液与磷酸钠溶液混合，使得混合液中钴离子：磷酸根离子的摩尔比为3:2，静置反应，离心、洗涤、冷冻干燥，得到所述金属磷酸钴。进一步的，所述钴离子的终浓度为2.4mm~9.6mm。进一步的，所述钴离子的终浓度为7.2mm。进一步的，所述静置反应的条件为：在15~55℃下反应1h。本发明还提供了所述金属磷酸钴在一步固定化纯化粗酶液中重组β-葡萄糖苷酶中的应用，所述应用具体包括如下步骤：（1）粗酶液的制备：参照专利cn108752479a中所述的方法制备重组β-葡萄糖苷酶（pet-glh）的粗酶液。（2）磷酸钴固定化重组β-葡萄糖苷酶：向粗酶液中加入磷酸钴，重悬均匀，固定化反应，洗涤，得到纯化固定化的重组β-葡萄糖苷酶。其中，粗酶液中的蛋白质与磷酸钴的质量比为1:0.3~9；所述固定化反应条件为：在15~55℃下反应0.5~24h。本发明的有益效果：传统磷酸钴制备工艺中多会用到模板剂、络合剂、表面活性剂等辅助物质，反应成分复杂，且大多数制备过程是通过水热反应完成，具有反应条件苛刻，步骤繁多，制备周期长等缺点。相较于传统的制备工艺，本发明所使用的原料为磷酸钠和六水合硝酸钴，这两种物质价格低廉，通过将两者水溶液混合，在温和条件下静置反应一段时间，即可得到目标小颗粒形貌，制备过程简便，反应体系简单。并且，与工业上应用最广的蛋白质纯化方法硫酸铵沉淀法相比，本发明利用了重组酶上的his标签对co2+的特异性配位行为，实现了从发酵液中纯化重组酶。同时，原本通过物理吸附法制备的固定化酶，存在着酶与载体材料间吸附力较弱，酶易脱落的情况，现随着his标签的加入，加强了酶与载体材料间的相互作用力。通过该方法大大简化了酶的固定化纯化操作。现有技术制备得到的磷酸钴呈现紧密的花状结构，结构紧密且比表面积小，将其用于固定化酶中，酶的回收率仅能达到5~6%。与之相比，本发明通过调节磷酸钴的制备条件，制备了形貌稳定的小颗粒磷酸钴材料，相比规则形状的磷酸钴紧凑的结构、较小的比表面积，本发明制备的磷酸钴具有较大的比表面积，分散性较好，有着很好的物理吸附酶的效果。将本发明制备的磷酸钴应用于固定化酶中，得到的固定化酶具有似花状结构，酶的回收率可达89%，并且固定化酶具有很好的稳定性。将采用本发明所述方法制备得到的磷酸铜用于吸附粗酶，磷酸铜的回收率仅能达到50~60%，远低于本发明制备得到的磷酸钴材料，且此时所需的磷酸铜的质量为磷酸钴质量的十几倍。与其他金属磷酸盐相比，本发明所制备的磷酸钴材料具有更好的物理吸附效果。附图说明图1为不同钴离子浓度下制备的磷酸钴材料的sem图，其中a为2.4mm，b为4.8mm，c为7.2mm，d为9.6mm，e为12mm。图2为钴离子浓度为7.2mm下制备的磷酸钴的粒径分布图。图3为实施例1制备得到的重组质粒pet-glu-linker-6his结构示意图。图4为不同形貌磷酸钴材料制备的glh@磷酸钴固定化酶的sem图，其中a为2.4mm，b为4.8mm，c为7.2mm，d为9.6mm，e为12mm。图5为不同形貌磷酸钴材料制备的磷酸钴和glh@磷酸钴固定化酶的xrd图。图6为不同形貌磷酸钴材料制备的glh@磷酸钴固定化酶各项性能变化示意图。图7为不同固定化时间制备得到glh@磷酸钴固定化酶的sem图。图8为不同固定化时间制备得到glh@磷酸钴固定化酶的xrd图。图9为不同ph下游离酶和glh@磷酸钴固定化酶的酶活。图10为不同反应温度下游离酶和glh@磷酸钴固定化酶的酶活。图11为制备得到glh@磷酸钴固定化酶的热稳定性。图12为不同固定化材料制备得到的固定化酶的各项性能指数。具体实施方式下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。实施例1：磷酸钴的制备本实施例中通过改变六水合硝酸钴和磷酸钠的添加量，考察了不同浓度钴离子对磷酸钴形貌的影响。将不同浓度的六水合硝酸钴和磷酸钠分别等体积混合均匀，在在25℃下，静置反应1h，在4500rpm的转速下，离心3min，去除上清液，用去离子水洗两遍，在冷冻干燥中干燥12h，制备得到磷酸钴a~e。六水合硝酸钴和磷酸钠的浓度如表1所示：表1.不同磷酸钴中六水合硝酸钴和磷酸钠的浓度磷酸钴编号钴离子浓度（mm）磷酸钠浓度（mm）a2.41.6b4.83.2c7.24.8d9.66.4e128图1为不同钴离子浓度下制备的磷酸钴的sem图，其中，a为2.4mm，b为4.8mm，c为7.2mm，d为9.6mm，e为12mm。从图中可以看出，随着钴离子浓度的增加，磷酸钴逐渐从小颗粒转变成无定型状态，这是由于随着钴离子浓度的增加，晶体的成核速度开始超越生长速度，使得磷酸钴未能形成有序结构，向无定型结构转变。图2为钴离子浓度为7.2mm下制备的磷酸钴的粒径分布图，从图中可以看出，磷酸钴的粒径主要分布于342-712.4nm，其峰值为458.7nm，整个粒径分布范围较窄，表明制备的磷酸钴小颗粒粒径为均匀。实施例2：glh@磷酸钴固定化酶的制备（1）制备重组β-葡萄糖苷酶粗酶液编码β-葡萄糖苷酶的基因源于台湾家白蚁，用链接肽linker连接glu和his，his多肽的序列链接在linker基因的3’端，得到重组β-葡萄糖苷酶glu-linker-his（glh），采用t7表达系统，以pet28a为载体，利用全基因合成技术合成重组酶的dna，将其与空载体链接得到重组质粒pet-glu-linker-his（pet-glh）所述linker的氨基酸序列如seq.id.no.2所示；所述6his的氨基酸序列如seq.id.no.1所示。各氨基酸序列如下：seq.id.no.1（glu）：mddvdndtlvtfpddfklgaatasyqieggwdadgkgpniwdtltherphlvvdrstgdvaddsyhlyledvrllkdmgaevyrfsiswarilpeghdnnvneagieyynklidallrngiepmvtmyhwdlpqklqdlggwpnrilakyaenyarvlfsnfgdrvkqwltfnepltfmdayasdtgmapsvdtpgigdyltahtvilahaniyrlyerefreeqqgqvgialnihwcepetgspkdveaceryqqfnlgiyahpifsengdypsvlkarvdansasegyttsrlpkftpeevafvngtydflglnfytavvgrdgvegeppsryrdmgtitsqdpewpesasswlrvvpwgfrkelnwianeygnppifitengfsdyggvndtnrvlyytehlkemlkaihidgvnvigytawslidnfewlrgyterfgihavnfidpsrprtpkesarvlteifktrqiperfrdasseq.id.no.2（linker）：ggggsggggsggggselseq.id.no.3（6his）：hhhhhh将验证成功的重组质粒转入到大肠杆菌bl21（de3）感受态中，将挑选的单克隆bl21菌株在lb培养基中37℃下200rpm培养一段时间活化后，按1%的比例分别转移至100ml的lb液体培养基中扩大培养，冰上静置一段时间后，加入一定量的iptg诱导剂，在恒温震荡培养箱内200rpm继续培养，一段时间后于低温离心机3000rpm，4℃离心30min后，去除上清液，收集菌体，菌体用50mmph8.0的pbs缓冲溶液洗涤两遍以除去残余的lb培养基，保存在-80℃冰箱中，等待下一步破碎。收集菌体在超声波细胞破碎仪上进行超声破碎，向洗涤后的菌体中加入50mmph8.0pbs缓冲溶液，重悬均匀，再加入终浓度为1mm蛋白酶抑制剂。在细胞超声破碎仪内进行破碎，超声破碎总时间不超过30min，整个反应在冰水浴中进行。超声结束后，样品在低温离心机内4℃，3000rpm离心一段时间，移出上清至新的离心管中，再将上清离心一次，保证上清和沉淀分离，至此获取发酵液。图3为制备的重组质粒pet-glu-linker-6his结构的示意图，每个标签之间均加入了特异性内切酶位点。linker与6his之间用hindiii相连，6his的3’端为psti。6his的5’端与linker的3’端通过saci相连，linker的5’端与β-葡萄糖苷酶的3’端通过nhei相连，glu的5’端为spei。通过全基因合成的glu-linker-6his插入到空载体pet28a质粒内。重组质粒的总大小为6734bp。其中kanr为抗卡那霉素的基因。（2）制备glh@磷酸钴固定化酶将实施例1中制备的磷酸钴a~e分别与粗酶液混合，其中粗酶液蛋白质与磷酸钴的质量比为1:1，重悬均匀，在25℃下，静置24h，用去离子水将沉淀洗涤两遍，将吸附不牢的酶洗脱下来，得到glh@磷酸钴固定化酶a~e。图4为钴离子浓度从4.8-24mm制备得到的glh@磷酸钴固定化酶的sem图，其中，a为2.4mm，b为4.8mm，c为7.2mm，d为9.6mm，e为12mm。从图中可以看出，随着钴离子浓度的增大，glh@磷酸钴从最初的致密球形晶状结构逐渐转变成无定型结构，结合图2表明，随着酶的加入，磷酸钴材料向着有序转变，表明酶的加入对于磷酸钴的结晶起到了促进作用，同时，由于磷酸钴材料本身的形态差异，最终造成了固定化酶不同形貌。图5为钴离子浓度从4.8-24mm制备得到的磷酸钴和glh@磷酸钴固定化酶的xrd图，图中a~e分别对应实施例2中制备的磷酸钴a~e的xrd图，a1~e1为glh@磷酸钴固定化酶a~e的xrd图。从图中可以看出，随着钴离子浓度的增加，最初形成的磷酸钴材料的结晶度逐渐降低，将磷酸钴材料与glh@磷酸钴固定化酶进行对比，表明加入酶后磷酸钴的结晶度得到了增加，这与图1和图3所表述的现象相一致。图6为glh@磷酸钴固定化酶各项性能变化示意图，其中分别体现了酶活回收率、蛋白固载率和相对酶活三项性能指标。如图所示随着钴离子浓度的增加，酶活回收率先上升后下降，结合图3，随着钴离子浓度的增加，所得到的glh@磷酸钴从致密的球状结构逐渐向花状结构转变，最终形成无定型结构，这种形态的变化，使得其比表面积逐渐增大，因此，酶活先出现升高的趋势，后由于材料的无定型状态，使得部分酶被包埋在材料内部，酶活位点被包埋，表现出活性下降的变化；蛋白固载率是先上升，后达到平衡，这与材料的比表面积变化相一致，表明大的比表面积具有较强的吸附作用；相对酶活等于酶活回收率除以蛋白固载率，图中表现为先上升后下降，表明利用磷酸钴从粗酶液中吸附，对重组酶起到了一定的纯化效果。实施例3：glh@磷酸钴固定化酶的制备本实施例中考察了固定化时间对glh@磷酸钴固定化酶的影响，将实施例1中制备的磷酸钴c与实施例2中制备的粗酶液混合，使得粗酶液中的蛋白质与磷酸钴的质量比为1:1，重悬均匀，分别在25℃下固定化0.5、1、4、8、12、24h，用去离子水将沉淀洗涤两遍，将吸附不牢的酶洗脱下来，得到不同固定化时间下制备的glh@磷酸钴固定化酶。图7为不同固定化时间下制备得到glh@磷酸钴固定化酶的sem图，其中a-f分别表示固定化时间为0.5、1、4、8、12、24h得到的固定化酶。如图所示，随着固定化时间的延长，固定化酶的形貌并未出现明显的变化，均呈现橄榄球型，与图1c和图4c对比表明，酶的加入促进了磷酸钴小颗粒向大粒径的橄榄球型转变，且在固定化0.5h时，材料的形貌转变就已大致完成。图8为不同固定化时间下制备得到glh@磷酸钴固定化酶的xrd，图中a-f分别表示固定化时间为0.5、1、4、8、12、24h得到的固定化酶，如图所示，随着固定化时间的延长材料的结晶度开始上升，且在1h后其结晶度就大致保持一致，这与sem图所显示的结果一致。图9为不同ph下游离酶和glh@磷酸钴固定化酶的酶活，其中游离酶的ph测试范围为3.0-10.0，其最佳的反应ph为4.5,；固定化酶的ph测试范围为5.0-10.0，由于磷酸钴材料在酸性较强的溶液中会分解，经实验验证，磷酸钴材料在ph5.0的溶液中可稳定存在，故将溶液的反应ph定为5.0-10.0，如图所示，当反应溶液的ph为5.0时固定化酶的催化效果最佳，固定化酶的最适反应ph与游离酶相近，表明钴离子对酶的生物相容性较好，对酶性能的影响较小。图10为不同反应温度下游离酶和glh@磷酸钴固定化酶的酶活，如图所示，游离酶和固定化酶的最佳反应温度分别为50℃和55℃。图11为钴离子终浓度为7.2mm，固定化时间为1h下制备的glh@磷酸钴固定化酶的热稳定性，从图中可以看出，当温度在20-45℃区间内，游离酶与固定化酶的酶活均较为稳定，当温度高于55℃后酶的活性迅速下降，固定化酶相较于游离酶酶活下降的较慢，表明经固定化后酶的稳定性得到了提升。对比例1：glh@花状磷酸钴固定化酶的制备本对比例制备了现有技术中的花状磷酸钴，并将其用于固定重组β-葡萄糖苷酶，来探究磷酸钴形貌对glh@花状磷酸钴固定化酶性能的影响。将84g七水合硫酸钴溶于734ml水溶液，得到a液，将26.4g磷酸氢二氨溶于734ml水溶液，得到b液。将b液加入a液中，25℃，200rpm搅拌，待反应完成后，温度不变，加入氨水调节反应体系至中心，水洗两遍，在120℃下干燥24h。即得到紧凑的花状磷酸钴。按照花状磷酸钴：粗酶（质量比）为1:1.5，将花状磷酸钴加入1ml粗酶液中，分散均匀，在25℃下静置1h，即得到glh@花状磷酸钴固定化酶。从图12中可以看出，相较于本发明制备的球状小颗粒磷酸钴，将花状磷酸钴用于固定重组β-葡萄糖苷酶，得到的glh@花状在磷酶活、回收率和蛋白固载率上表现均较差，这是因为花状磷酸钴的结构过于致密，比表面积较小。对比例2：glh@磷酸铜固定化酶的制备参照实施例1，在相同的制备条件下制备磷酸铜材料，并将其用于固定重组β-葡萄糖苷酶，来探究不同种类金属磷酸盐对glh@花状磷酸盐固定化酶性能的影响。分别配制14.4mm硫酸铜溶液和9.6mm磷酸钠溶液，将硫酸铜溶液等体积加入磷酸钠溶液中混合均匀，在25℃下，静置反应1h，在400rpm的转速下，离心3min，用去离子水洗两遍，在冷冻干燥中干燥12h，制备得到磷酸铜。将磷酸铜与实施例2中制备得到的粗酶液混合，使得粗酶液中蛋白质与磷酸铜的质量比为1:15，重悬均匀，在25℃下固定化1h，用去离子水将沉淀洗涤两遍，将吸附不牢的酶洗脱下来，得到glh@磷酸铜固定化酶。从图12中可以看出，磷酸铜的回收率仅能达到50~60%，远低于本发明制备得到的磷酸钴材料，且此时所需的磷酸铜的质量为磷酸钴质量的十几倍。可见，与其他金属磷酸盐相比，本发明所制备的磷酸钴材料具有更好的物理吸附效果。所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。当前第1页1 2 3 

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